CN105112375B - 杂交瘤细胞株zjed0-02、抗埃博拉病毒gp蛋白单克隆抗体及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及杂交瘤细胞株ZJED0‑02、抗埃博拉病毒GP蛋白单克隆抗体及其制备和应用。本发明杂交瘤细胞株ZJED0‑02可用于分泌抗埃博拉病毒GP蛋白单克隆抗体。该单克隆抗体与博拉病毒GP蛋白的第411‑490位氨基酸序列抗原肽具有高的特异性和灵敏性，可应用于制备埃博拉病毒GP蛋白检测试剂。本发明还完成了对单克隆抗体的测序，为单克隆抗体序列的人源化改造，研发具有中和埃博拉病毒的中和抗体，为后期发展成为临床治疗埃博拉病毒病抗体奠定物质基础。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及杂交瘤细胞株ZJED0-02、抗埃博拉病毒GP蛋白单克隆抗体及其制备和应用。
背景技术
埃博拉病毒病是由埃博拉病毒感染引起的致死性出血热。1976年，埃博拉病毒在扎伊尔首次暴发，后陆续在中非地区小规模暴发，截止2013年，共造成2387人发病，死亡1310例，病死率54.9％。2014年埃博拉病毒再次爆发，席卷西非，并跨越大洲，美国、英国、西班牙相继发生埃博拉病例。截止2015年5月27日，共有26969例病例，病死11135例，病死率仍高达41.3％。从埃博拉首次爆发至今，已经过去了将近40年，目前国际上仍然没有特异的治疗手段和可供临床使用的疫苗。埃博拉病毒病已经成为国际性重大传染病，埃博拉病毒的快速、有效诊断和治疗方法的探索对埃博拉病毒病的控制以及对人类的安全至关重要。
经典埃博拉病毒感染的诊断依赖定量PCR技术，但是在埃博拉疫源地，由于经济条件落后，不是每个国家和地区都能负担相应仪器的费用，因而该诊断方法的适用范围有限，不能适用于全部地区。因而开发一种快速、灵敏、廉价的埃博拉病毒检测的单克隆抗体产品，就可以广泛运用于疫源地，能够更早更广泛地发现埃博拉感染，提早进行隔离治疗，减少埃博拉病毒的扩散。
埃博拉病毒病目前仍然没有特效的治疗方法。到目前为止没有找到一种特效的抗埃博拉病毒药物。虽然国际上已经研制出三种抗体混合的药物ZMapp，但是治疗效果仍然有限且不确切。如果该抗体在临床I期缺乏有效性和安全性，那么人们将面临再一次无药可用的境地，甚至缺少了可备用的药物。因而埃博拉单克隆抗体的继续开发，为埃博拉病毒病治疗提供更多的备选抗体，就能大大地增大治疗埃博拉病毒病的可能性。
综上所述，发展一种快速、灵敏的埃博拉病毒诊断抗体及发展一种有望用于临床治疗的埃博拉抗体迫在眉睫。
发明内容
本发明第一个目的是提供杂交瘤细胞株ZJED0-02，该杂交瘤细胞株已由中 国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏；地址：中国武汉武汉大学；保藏日期：2015年6月3日；保藏编号为：CCTCC NO：C201584。其具有序列表中SEQ ID NO:1所示的抗埃博拉病毒GP蛋白单克隆抗体重链编码基因序列(其中，1-57为前导区，58-147为框架区1，148-162为互补决定区1，163-204为框架区2，205-255为互补决定区2，256-351为框架区3，352-363为互补决定区3，364-396为框架区4)和序列表中SEQ ID NO:2所示的抗埃博拉病毒GP蛋白单克隆抗体轻链编码基因序列(其中，1-60为前导区，61-129为框架区1，130-177为互补决定区1，178-222为框架区2，223-243为互补决定区2，244-339为框架区3，340-366为互补决定区3，367-396为框架区4)。
本发明第二个目的是提供一种抗埃博拉病毒GP蛋白单克隆抗体，它是由保藏编号为：CCTCC NO：C201584的杂交瘤细胞株ZJED0-02分泌。其重链氨基酸序列如序列表中SEQID NO:3所示，轻链氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:4所示。该单克隆抗体亚型为IgG2a、κ型，与埃博拉病毒GP蛋白的抗原肽具有高的特异性和灵敏性，所述抗原肽为埃博拉病毒GP蛋白的第411-490位氨基酸序列，如SEQ ID NO:5所示：ADNDSTASDTPPATTAAGPLKAENTNTSKSADSLDLATTTSPQNYSETAGNNNTHHQDTGEESASSGKLGLITNTIAGVA。
本发明第三个目的是提供上述抗埃博拉病毒GP蛋白单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：
(1)小鼠免疫：选择6周龄的BALB/C小鼠，以埃博拉病毒GP蛋白的抗原肽(埃博拉病毒GP蛋白的第411-490氨基酸序列：ADNDSTASDTPPATTAAGPLKAENTNTSKSADSLDLATTTSPQNYSETAGNNNTHHQDTGEESASSGKLGLITNTIAGVA)对小鼠进行免疫；每只小鼠以100ug的抗原肽混合佐剂后大腿内侧肌肉注射免疫，第21天后再免疫一次；第3次加强免疫3天后用于融合；
(2)小鼠骨髓瘤细胞SP2/0的培养：培养小鼠骨髓瘤细胞SP2/0并使其保持良好的生长状态用于杂交瘤细胞融合；
(3)细胞融合：采用聚乙二醇细胞融合法，以BALB/C小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，在融合前一天，接种BALB/C小鼠腹腔巨噬细胞于96孔培养板， 含20％FCS的HAT培养基培养一天，将步骤(1)中备好的小鼠处死，获取脾脏淋巴细胞；收集步骤(2)中的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0，将上述两种细胞混合离心，然后以聚乙二醇介导细胞融合，融合后的细胞适当稀释，接种至饲养细胞培养板，适当条件培养；
(4)杂交瘤细胞的筛选：培养上述培养物，在细胞集落长到大小合适时，吸取细胞培养上清液做抗体鉴定，筛选阳性克隆；
(5)杂交瘤细胞的克隆化：以有限稀释法克隆阳性的杂交瘤细胞，将稀释到一定密度的细胞接种至96孔细胞培养板，使每孔只有一个细胞生长；形成细胞集落的孔取培养上清液做酶联免疫吸附检测(ELISA)，筛选和鉴定阳性克隆；重复克隆若干次，直到杂交瘤细胞的阳性孔率达到100％；
(6)诱生腹水：在接种杂交瘤细胞前1周，给BALB/C小鼠腹腔注射降植烷每只0.5ml，然后每只接种生长良好的5×106个阳性杂交瘤细胞，10天后收集腹水离心，测定抗体效价；
(7)单克隆抗体的纯化：利用Protein G亲和纯化法纯化腹水中的单克隆抗体。
经单克隆抗体免疫球蛋白亚型分析显示该杂交瘤细胞产生的抗体类型为IgG2a、κ型。
本发明第四个目的是提供杂交瘤细胞株ZJED0-02在产抗埃博拉病毒GP蛋白单克隆抗体中的应用。本发明由免疫的BALB/C小鼠脾脏淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0经融合、筛选、克隆后获得的产生抗埃博拉病毒GP蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株ZJED0-02，经3次克隆化，持续培养六月余，分泌抗体稳定。该细胞株经液氮冻存，复苏后生长良好，抗体分泌未见衰退。ELISA间接法测得ZJED0-02培养上清效价为1:320，腹水效价为1:25600。ZJED0-02已在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号是：CCTCC No.C201584。
本发明第五个目的是提供上述抗埃博拉病毒GP蛋白单克隆抗体在制备埃博拉病毒GP蛋白检测试剂中的应用，该检测试剂在装载埃博拉病毒GP蛋白的埃博拉疫苗培养液中或其它产生埃博拉病毒GP蛋白的体液或培养液中检测，通过下述途径实现：
①以抗埃博拉病毒GP蛋白单克隆抗体为探针，用SDS-PAGE电泳通过免疫 印迹方法(Western Blot)，对装载埃博拉病毒GP蛋白的埃博拉疫苗培养液中GP蛋白的情况进行鉴定。
②以抗埃博拉病毒GP蛋白单克隆抗体作为检测抗体，通过酶联免疫吸附试验(ELISA)对装载埃博拉病毒GP蛋白的埃博拉疫苗培养液中GP蛋白表达水平进行定性和定量分析。
本发明的有益效果：
1、本发明杂交瘤细胞株ZJED0-02，经3次克隆化，持续培养六月余，分泌抗埃博拉病毒GP蛋白单克隆抗体稳定；该细胞株经液氮冻存，复苏后生长良好，抗体分泌未见衰退。
2、本发明抗埃博拉病毒GP蛋白单克隆抗体与埃博拉病毒GP蛋白的抗原肽具有高的特异性和灵敏性，可用于制备对临床和实验室的埃博拉培养物进行定性和定量检测的检测试剂，检测结果为临床提供实验室诊断依据。本发明还完成了对单克隆抗体的测序，为单克隆抗体序列的人源化改造，研发具有中和埃博拉病毒的中和抗体，为后期发展成为临床治疗埃博拉病毒病抗体奠定物质基础。
保藏信息
保藏的培养物名称：杂交瘤细胞株ZJED0-02；
保藏单位全称：中国典型培养物保藏中心；
保藏单位简称：CCTCC；
保藏地址：中国武汉武汉大学；
保藏日期：2015年6月3日；
保藏编号：CCTCC NO：C201584。
附图说明
图1为单克隆抗体的免疫球蛋白亚型分析。
图2为单克隆抗体检测埃博拉病毒GP蛋白的western图。
图3为单克隆抗体检测埃博拉病毒GP蛋白的灵敏度。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做更进一步地解释。下列实施例仅用于说明本发明，但并不用来限定本发明的实施范围。
实施例1抗埃博拉GP蛋白的单克隆抗体的制备
(1)小鼠的免疫：选择6周龄的BALB/C小鼠进行免疫，首次免疫，将交联KLH的埃博拉病毒GP蛋白的80肽(埃博拉病毒GP蛋白第411-490位氨基酸序列：ADNDSTASDTPPATTAAGPLKAENTNTSKSADSLDLATTTSPQNYSETAGNNNTHHQDTGEESASSGKLGLITNTIAGVA)与QuickAntibody-mouse5W按体积1:1混合均匀。每只BALB/C小鼠0.1ml(埃博拉GP蛋白的20肽100ug)，大腿内侧肌肉注射。第21天按同样方式加强免疫一针。第35天采微量尾血进行ELISA测定，抗体效价达到1:32000，随即尾静脉注射加强免疫一次，于3天后进行细胞融合。
其中，埃博拉病毒GP蛋白的80肽通过固相法合成，在美国ABI公司的多肽合成仪(431A)上进行，采用Fmoc(9-芴甲氧羰基)方案，合成步骤按照ABI公司的多肽合成操作手册进行。经高效液相色谱纯化，纯度>95％，序列鉴定通过质谱分析。
(2)小鼠骨髓瘤细胞SP2/0的培养：把来自BALB/C小鼠的SP2/0骨髓瘤细胞株以含10％FBS-DMEM培养基培养传代，在含5％CO2饱和湿度的37℃孵箱中培养。融合前一天传代以保证融合时细胞进入对数生长期。
(3)细胞融合：以BALB/C小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，在融合前一天，接种BALB/C小鼠腹腔巨噬细胞于96孔培养板，含20％FCS的HAT培养基培养一天。次日将(1)中备好的小鼠处死，取脾脏，采用压力注水法分离脾脏淋巴细胞，离心洗涤细胞1～2次后用无血清RPMI1640培养液重悬。收集(2)中小鼠骨髓瘤细胞SP2/0，离心，洗涤2次后用无血清RPMI1640培养液重悬，作为待融合的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0。以1.0×108个免疫小鼠脾脏淋巴细胞与1.0×107个小鼠骨髓瘤细胞SP2/0混合，在50％PEG6000作用下融合。两种细胞混合后洗涤一次，离心弃上清，轻弹管壁悬开细胞(勿加液体)，用37℃预温的50％PEG6000(pH8.0)0.8ml于60～90秒内逐滴加入细胞沉淀中，其间轻轻振摇离心管，但勿吹打，静置1分钟，然后按先慢后快的原则，于第1分钟内加完1ml无血清RPMI 1640，于第2分钟内加完2ml无血清RPMI 1640，于第3分钟内加完7ml无血清RPMI 1640，以后1分钟内逐渐加入37℃预温的无血清RPMI164030～40ml。800转/分钟低速离心5～10分钟。然后加入20％FCS的 HAT培养基，分别接种到加有饲养细胞的96孔培养板，一般每次融合的细胞铺4块板，置37℃5％CO2孵箱中培养。
(4)杂交瘤细胞的筛选：每隔4天换1/2培养液(HAT)一次，10天后改用含HT的选择性培养液。融合后的杂交瘤细胞在含HT的选择性培养液中大约持续培养两周。在细胞集落长到适当大小时(在10倍物镜下观察，细胞克隆大小以占满一个视野为宜)，吸取培养液上清，适当稀释后做ELISA，筛选阳性克隆。采用ELISA间接法筛选阳性杂交瘤克隆。主要步骤：①0.01M pH9.6碳酸盐缓冲液稀释埃博拉GP蛋白的20肽，浓度1000ng/ml，分别于96孔酶标板加入0.1ml/孔包板，4℃过夜；②0.01M pH7.4PBS-Tween 20洗板三次；③用2％BSA-0.01MpH 7.2的PBS封闭2小时；④同上洗板；⑤加入1:5稀释的杂交瘤培养上清，0.1ml/孔，同时设阳性对照(免疫小鼠的血清)、阴性对照(SP2/0培养上清液)和空白对照，室温反应2小时；⑥洗板；⑦加1:5000稀释的羊抗小鼠Ig(G+M)-HRP，0.1ml/孔，室温反应1小时；⑧洗板；⑨加入底物(TMB)室温避光反应5～10分钟；⑩2M H2SO4终止反应；450nm测定其OD值，以P/N≥2.1为阳性。
(5)杂交瘤细胞的克隆化：杂交瘤细胞的克隆化培养按有限稀释法进行，选择抗体检测阳性(合成的埃博拉GP蛋白的80肽阳性)的杂交瘤孔细胞作适当增殖后，准确计数细胞。用完全1640培养液稀释成10个/ml的细胞悬液接种到已有饲养细胞(此处饲养细胞仍是BALB/C小鼠腹腔巨噬细胞)的96孔培养板中，每孔0.1ml，7-10天后观察细胞生长情况，并检测上清液中抗体水平，选择5个抗体效价最高的，呈单个克隆细胞生长的培养孔，作再次克隆化培养。此方法可重复多次，直至杂交瘤细胞的阳性孔率为100％。获得杂交瘤细胞株ZJED0-02。
(6)诱生腹水：在接种杂交瘤细胞前1周，给BALB/C小鼠腹腔注射降植烷每只0.5ml，然后每只接种5.0×106个阳性杂交瘤细胞，10天后收集腹水离心，测定抗体效价。
(7)单克隆抗体的纯化：采用亲和纯化法(Protein G交联的Sepharose)纯化腹水中单克隆抗体。①腹水用冷Binding Buffer(结合缓冲液)稀释3倍后，于4℃10000rpm离心15分钟去除沉淀物。②将预装有Sepharose-Protein G的亲和纯化柱用10倍柱床体积的Binding Buffer充分流洗。③将稀释的腹水上柱，控制流 速8～10滴/分钟。④将流穿的腹水重复上柱一次。⑤用20倍柱床体积的Binding Buffer充分洗涤，直至流穿液A280吸光值小于0.01。⑥用Elution Buffer(洗脱缓冲液)洗脱结合的单克隆抗体，控制流速8～10滴/分钟，收集洗脱液于预加有0.1ml的磷酸钾缓冲液(pH7.9，0.5M)的收集管中，每管收集0.5ml含抗体的洗脱液，共收集20管以上。⑦于A280nm检测每管洗脱液的吸光度，并收集吸光值大于0.2的洗脱液。⑧将收集的洗脱液置于透析卡中，并于0.1MpH7.0的PBS中透析。每隔6小时换液一次，共透析24小时。⑨将透析后的抗体溶液稀释(1:100)后，于280nm测蛋白含量。⑩将纯化的抗体分装于小管中，置于低温冰箱备用。
(8)单克隆抗体的亚型鉴定:采用Serotec公司的小鼠单克隆抗体免疫球蛋白分型试剂盒分析。将纯化的单抗作适当稀释后进行检测，操作严格按试剂盒说明书进行。试验结果如图1所示，杂交瘤细胞株ZJED0-02分泌的单克隆抗体为IgG2a、κ型，与埃博拉病毒GP蛋白的抗原肽(第411-490位氨基酸序列)具有高的特异性和灵敏性。杂交瘤细胞株ZJED0-02已由中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏；地址：中国武汉武汉大学；保藏日期：2015年6月3日；保藏编号为：CCTCC NO：C201584。
实施例2用该单克隆抗体进行埃博拉病毒GP蛋白的鉴定(定性)检测
实施例1制备的抗埃博拉GP蛋白单克隆抗体可以用来鉴定的(定性检测)，鉴定方法可以通过下述方法实现：
免疫印迹法Western Blotting：装载埃博拉病毒GP蛋白的埃博拉腺病毒重组疫苗在HEK-293细胞中培养，培养细胞裂解液用该单抗进行Western Blotting检测，在相应位置呈现目的条带，表明检测到埃博拉病毒GP蛋白的表达。具体步骤：
(1)SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳:方法参见F.奥斯伯等《精编分子生物学实验指南》(科学出版社1998)。采用10％分离胶和5％浓缩胶，电泳条件为电压150V，溴酚蓝染料带距离胶底边1.5厘米左右终止电泳。
(2)电转移：方法参见F.奥斯伯等《精编分子生物学实验指南》(科学出版社1998)。用电转移方式将其转移至PVDF(0.45um)膜上。
(3)免疫印迹：电转膜结束后，膜在5％脱脂奶粉封闭液中室温封闭1小时后，用本发明制备的单抗(1ug/ml)作为一抗，室温孵育2小时或4℃反应过夜， 用TBST(TBS加入0.5％Tween-20)洗涤3次，每次10min。以辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgM作为二抗，室温反应2h，用上述方法洗涤后用ECL作用1min，于全自动化学发光成像仪(Bio-Rad VersaDoc5000MP)曝光成像。
结果见图2，GP-293为埃博拉GP基因转染的HEK-293细胞裂解蛋白。293为未基因转染的HEK-293细胞裂解蛋白，做对照用。
实施例3单克隆抗体检测埃博拉病毒GP蛋白的灵敏度
实施例1制备的抗埃博拉病毒GP蛋白单克隆抗体可以用来定量检测各种表达的埃博拉病毒GP蛋白的水平，可以通过下述方法实现：
间接ELISA法：
①将检测样本适当稀释于0.01M pH9.6碳酸盐缓冲液包被液中，100ul/孔，室温孵育2h或4℃包被过夜。
②倒空液体并拍干残留液体，用0.01M pH7.4PBS-Tween 20洗液洗板三次。
③用2％BSA-0.01M pH 7.2的PBS封闭1小时。
④同上洗板3次。
⑤加入1:100倍比稀释的单克隆抗体，0.1ml/孔，室温反应2小时。
⑥同上洗板3次后，加羊抗小鼠IgM-HRP，0.1ml/孔，室温反应1小时。
⑦用洗涤液浸泡板5min后，同上洗板4次后，加入底物(TMB)室温避光反应5～10分钟。
⑧2M H2SO4终止反应，450nm测定其OD值。
⑩确定单克隆抗体检测埃博拉病毒GP蛋白的灵敏度。
结果见图3和表1。图3和表1一一对应。第一列表示稀释倍数，第二列表示以未基因转染的HEK-293细胞裂解蛋白作为包被抗原，用实施例1制备的单克隆抗体作为检测抗体在各稀释度下的OD值，第三列表示以埃博拉GP基因转染的HEK-293细胞裂解蛋白作为包被抗原，用实施例1制备的单克隆抗体作为检测抗体，在各稀释度下的OD值。第四列表示以埃博拉GP基因转染的HEK-293细胞裂解蛋白作为包被抗原，以mIgG作为检测抗体在各稀释度下的OD值。实验结果表明实施例1制备的单克隆抗体检测GP蛋白的灵敏度达到1:10000以上。
表1
| 稀释倍数 | 实施例1制备的单 | 实施例1制备的单 | mIgG(一抗) |
| 克隆抗体(一抗) | 克隆抗体(一抗) | ||
| 293(抗原) | GP-293(抗原) | GP-293(抗原) | |
| 1:100 | 0.03 | 0.797 | 0.035 |
| 1:200 | 0.034 | 0.631 | 0.028 |
| 1:400 | 0.031 | 0.48 | 0.026 |
| 1:800 | 0.027 | 0.323 | 0.026 |
| 1:1600 | 0.026 | 0.219 | 0.025 |
| 1:3200 | 0.025 | 0.142 | 0.025 |
| 1:6400 | 0.027 | 0.076 | 0.028 |
| 1:12800 | 0.025 | 0.054 | 0.026 |
实施例4杂交瘤细胞株ZJED0-02、抗埃博拉病毒GP蛋白单克隆抗体序列测定
提取杂交瘤细胞株ZJED0-02的总RNA，用通用引物反转录成cDNA，再扩增抗体的轻链和重链，把轻链和重链分离出来，克隆到标准克隆载体上表达，单菌落PCR鉴定轻链和重链，挑选5个轻链和重链长度正确的单菌落进行测序，5次测序结果几乎相同，则认为是抗体的真实序列。(测序过程和抗体大量表达委托南京金斯瑞生物科技公司完成)杂交瘤细胞株ZJED0-02得到的基因序列结果：抗埃博拉病毒GP蛋白单克隆抗体重链编码基因序列长396bp，序列如SEQ ID NO:1所示，其中，1-57为前导区，58-147为框架区1，148-162为互补决定区1，163-204为框架区2，205-255为互补决定区2，256-351为框架区3，352-363为互补决定区3，364-396为框架区4；抗埃博拉病毒GP蛋白单克隆抗体轻链编码基因序列长396bp，序列如SEQ ID NO:2所示，其中，1-60为前导区，61-129为框架区1，130-177为互补决定区1，178-222为框架区2，223-243为互补决定区2，244-339为框架区3，340-366为互补决定区3，367-396为框架区4。根据所获得的基因序列推导出该基因序列所编码的重链由132个氨基酸组成，序列如SEQ ID NO:3所示；轻链由132个氨基酸组成，序列如SEQ ID NO:4所示。
应理解，本发明是结合最佳实施例进行描述的，然而在阅读了本发明的上述内容后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (5)
1.杂交瘤细胞株ZJED0-02，其特征在于，其保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为：CCTCC NO ：C201584。
2.抗埃博拉病毒GP蛋白单克隆抗体，其特征在于，其由权利要求1 所述的保藏编号为：CCTCC NO ：C201584的杂交瘤细胞株ZJED0-02 产生。
3.权利要求1所述的杂交瘤细胞株ZJED0-02在产抗埃博拉病毒GP蛋白单克隆抗体中的应用。
4.权利要求2所述的抗埃博拉病毒GP蛋白的单克隆抗体在制备埃博拉病毒GP蛋白检测试剂中的应用。
5.根据权利要求4所述的抗埃博拉病毒GP蛋白单克隆抗体在制备埃博拉病毒GP 蛋白检测试剂中的应用，其特征在于，所述检测试剂通过免疫印迹法、酶联免疫吸附试验检测样本中埃博拉病毒GP 蛋白的表达。
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