CN106188286B - 一种中和埃博拉病毒的纳米抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种中和埃博拉病毒的纳米抗体ebo7c2及其在制备预防或治疗埃博拉病毒感染的药物中的应用，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，编码ebo7c2的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。该纳米抗体以人抗体IgG1的CH2结构域m01s为骨架，其氨基酸与m01s的氨基酸序列在3个loop区有差异。ebo7c2能够与埃博拉病毒囊膜蛋白相结合。ebo7c2分子量较小，具有更好的组织渗透性和结合存在位阻效应的抗原表位的能力；具有m01s骨架，能够和FcRn的结合，它的血浆半衰期可能达到10个小时；ebo7c2可在原核表达系统进行表达，生产成本低、周期短。

Description

一种中和埃博拉病毒的纳米抗体
技术领域
本发明属于生物医药工程技术领域，具体涉及一种针对埃博拉病毒囊膜蛋白的抗病毒纳米抗体。
背景技术
治疗性单克隆抗体(monoclonal antibody，单抗)由于可精确地攻击靶分子，且毒副作用较小而成为人们期望中的理想药物。目前，国内外的单抗药物主要应用于治疗肿瘤、免疫性疾病和病毒感染等方面。例如用于治疗呼吸道合胞病毒RSV的帕利珠单抗(Palivizumab、Synagis)。
传统的单克隆抗体的制备方法是杂交瘤技术。随着基因工程技术的迅速发展，治疗性单抗已从鼠源单抗，到嵌合抗体、人源化抗体，直至近年的全人抗体，逐步消除了异源性抗体的免疫原性问题。但随着研究的不断深入，人们发现全长抗体的分子量较大(～150kD)，使它们的组织渗透性较差，也难以结合一些空间上有位阻效应的关键表位，从而影响活性。解决的策略之一是将全长抗体进行小型化，由此开发了一系列具有结合功能的抗体片段：如Fab(50-60kD)、单链抗体(scFv，20-30kD)、重链可变区抗体(VH，12-15kD)(单域抗体)等小型化抗体。这些抗体片段相对于全长单抗，具有更好的组织渗透性和结合存在位阻效应的抗原表位的能力。
然而，无论是Fab，scFv还是VH，由于它们都缺少Fc段，从而无法和Fc受体(比如neonatal Fc receptor，FcRn)等相结合。目前观点认为IgG在体内具有较长半衰期(一周到数周)的原因是IgG可以通过Fc段在酸性pH(pH 6.0)和FcRn结合，在中性pH(pH 7.4)被释放(该结合称为pH依赖的结合)，从而完成其循环再生的过程。由于缺少这种结合，Fab、scFv和VH在体内的半衰期通常只有几分钟到几十分钟，这就限制了它们进一步的应用。因此需要继续研发分子量小，血浆半衰期长的骨架用于抗体库的构建和针对特异抗原的筛选。
最近，一种新的基于抗体Fc段CH2结构域的骨架被认为有希望用来研发新型的单域抗体，称为纳米抗体(nanoantibody,nAbs)(Dimitrov DS,mAbs.,2009)。CH2(～12kDa)的结构(PDB：1HZH)(Prabakaran P,et al.,Acta Crystallogr D Biol Crystallogr.,2008)与VH相似，主要由七个β-折叠(A到G)所组成，由三个loop和两个α-helix所连接，并含有一对天然的二硫键。三个loop区与VH的三个互补决定区(complementarity determiningregion,CDR)相似，可以引入突变而进行抗体库的构建。由于是Fc的一部分，CH2含有的Fc与Fc受体(如neonatal Fc receptor，FcRn)等的部分位点结合,因此，经过改造后的CH2骨架，就有可能和FcRn相互结合。基于这种CH2骨架筛选到的纳米抗体会具有双效价：既能够结合抗原，又能够结合如FcRn等分子(延长血浆半衰期)，从而实现(或部分实现)全长抗体的功能。这也是CH2骨架相比其它分子量相似的骨架(如VH)的主要优势。
CH2的稳定性较弱，需要进行优化。通过引入一对二硫键得到一个CH2的突变体m01，相对CH2，其Tm值提高近20℃(Gong R,et al.,J Biol Chem.,2009)；通过截去CH2的N-端的七个处于无规则状态的氨基酸，得到一个截短的突变体CH2s，相对CH2，CH2s的抗聚集能力得到显著提高(Gong R,et al.,Mol Pharm.,2013)。将这两者结合之后得到一个新的突变体m01s(Gong R,et al.,J Biol Chem.,2011)(图1)，它的Tm值比CH2的Tm值高30℃，具有更好的可溶表达与蛋白酶抗性。更为重要的是，相对于CH2，m01s具有更好的依赖于pH的与人FcRn的结合能力，在不同动物模型中的血浆半衰期可达10小时左右，远远长于与其分子量相似的其它结构域(如VH的血浆半衰期仅有几分钟)(Gehlsen K,et al.,MAbs,2012)。因此，m01s可以作为一个理想的骨架用于抗体库的构建和筛选。
埃博拉是迄今为止传染性最高、致命性最强的病毒之一，具有潜伏期长、传播途径广、感染种群复杂等特点，多次在全球爆发，尤其2014年在西非暴发的疫情，已导致上万人死亡。目前，有几种针对埃博拉的候选抗体药物都是全长的IgG蛋白，都需要在真核细胞内表达，所以其表达量低，生产成本高。
假病毒是由非病毒自身核酸被病毒衣壳蛋白或包膜蛋白包裹所形成的具有感染性的病毒样颗粒。我们利用基因工程改造的水泡性口炎病毒(缺失囊膜蛋白基因，因此不能组装出新的完整病毒颗粒，只能一次性感染细胞；带有绿色荧光蛋白基因，感染细胞后在细胞内大量表达，使被感染的细胞呈绿色)和埃博拉病毒的囊膜蛋白基因一起，组装出带有埃博拉病毒囊膜蛋白的水泡性口炎病毒颗粒。该埃博拉假病毒可较好的替代野生的埃博拉病毒，应用于抗体中和病毒的研究中(Michael A.Whitt，JVM,2010)。
近几年噬菌体展示技术广泛用于抗体研发。噬菌体展示技术是将被展示基因与噬菌体自身蛋白基因(gIII或gVIII)融合在一起而展示于噬菌体的表面。可以构建大容量(1010～1011)的展示库进行筛选，以其速度快、周期短等独特的优点而越来越被人们所重视。
发明内容
为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种针对埃博拉病毒囊膜蛋白的抗病毒纳米抗体ebo7c2，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，编码ebo7c2的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明提供的纳米抗体ebo7c2，是一种针对埃博拉病毒囊膜蛋白的抗病毒抗体，该纳米抗体的氨基酸与m01s的氨基酸序列(如SEQ ID NO：3所示)在3个loop区有所差异，其Loop BC的基因序列为Seq ID No.4，氨基酸序列为Seq ID No.5；编码Loop DE的基因序列为Seq ID No.6，氨基酸序列为Seq ID No.7；编码Loop FG的基因序列为Seq ID No.8，氨基酸序列为Seq ID No.9。
本发明提供的上述针对埃博拉病毒囊膜蛋白的纳米抗体，是通过以下方法得到(Gong R,et al.,Plos One,2012)：首先构建以m01s为骨架的噬菌体展示库，然后以哺乳动物细胞表达的埃博拉病毒囊膜蛋白胞外域为抗原(图2)，经过7轮筛选得到一个富集的克隆。通过随机突变对这个富集的克隆进行亲和力成熟，得到一个高亲和力的特异性结合的克隆。表达纯化该克隆(图3)，进行鉴定，即得到一种中和埃博拉病毒的抗体ebo7c2，并对其进行鉴定分析。
通过ELISA对ebo7c2的结合性进行了鉴定，以m01s(骨架)为对照。ELISA实验证明ebo7c2能够与筛选用抗原相结合(图4)，病毒中和试验证明ebo7c2能够抑制埃博拉假病毒感染BHK-21细胞(图5)，因此，该抗体具有中和埃博拉病毒的作用。
在另一个方面，本发明提供一种载体，其包含SEQ ID NO：2。
在另一个方面，本发明提供一种细胞，其包含以上所提到的核酸SEQ ID NO：2或纳米抗体ebo7c2。
在一个实施方案中，本发明提供一种药物组合物，其至少包含ebo7c2或上述偶联抗体、融合抗体的任意一种。
在另一个实施方案中，该药物组合物进一步包含药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。
本发明提供上述纳米抗体在制备预防或治疗埃博拉病毒感染的药物中的应用。
在另一个方面，本发明提供一种用于检测生物样品中的埃博拉病毒囊膜蛋白的试剂盒，其包含纳米抗体ebo7c2。
在另一个方面，本发明提供一种偶联抗体，其包含纳米抗体ebo7c2。该偶联抗体是指纳米抗体ebo7c2和其它分子偶联，包括但不仅限于放射性同位素、毒素，形成的偶联抗体。
进一步地，该偶联抗体在制备预防或治疗埃博拉病毒感染的药物中的应用。
进一步地，本发明提供一种用于检测生物样品中的埃博拉病毒囊膜蛋白的试剂盒，其包含上述偶联抗体。
在另一个方面，本发明提供一种融合抗体，其包含纳米抗体ebo7c2。该融合抗体是指纳米抗体ebo7c2和其它多肽，此处所指的多肽从数个氨基酸的肽段到蛋白质，融合后的融合抗体。
进一步地，该融合抗体在制备预防或治疗埃博拉病毒感染的药物中的应用。
进一步地，本发明提供一种用于检测生物样品中的埃博拉病毒囊膜蛋白的试剂盒，其包含上述融合抗体。
噬菌体展示技术目前广泛应用于抗体筛选及其它领域。它是将外源基因(即本发明中的基于m01s的库)同丝状噬菌体的外壳蛋白P3基因(或P8)基因融合后导入噬菌体基因组，表达产生的外源肽与外壳蛋白P3(或P8)形成融合蛋白，展示在噬菌体的表面。导入了各种各样外源基因的一群噬菌体，就构成一个展示各种各样外源蛋白的噬菌体展示库。当用一个抗原(埃博拉病毒囊膜蛋白的胞外域)去筛查一个噬菌体展示库时，就会选择性地同与其有相互作用的某个外源蛋白相结合。经过多轮筛选，那些能结合抗原的的克隆(即本发明中的ebo7c2)被富集，然后可以通过测序、表达进行鉴定。
本发明使用的术语“纳米抗体”，指基于抗体恒定区CH2结构域的一类抗体，是单域抗体的一种。相对于全长单抗，纳米抗体具有更好的组织渗透性和结合空间上存在位阻效应的抗原表位的能力；相对于同等分子量的基于抗体重链可变区VH结构域的单域，纳米抗体的血浆半衰期较长。
本发明与现有技术相比，具有以下的主要突出效果和优点：本发明的创新在于从人IgG1恒定区CH2结构域的一个突变体m01s为骨架的噬菌体展示库中，以哺乳动物细胞表达的埃博拉病毒囊膜蛋白为抗原，筛选得到一种中和埃博拉病毒的纳米抗体ebo7c2。本发明提供的这种纳米抗体，是一种病毒中和抗体，其优点在于：首先，相对于全长单抗(分子量～150kD)，ebo7c2分子量较小(～14kD)，具有更好的组织渗透性和结合存在位阻效应的抗原表位的能力，甚至能够开发成口服药；其次，ebo7c2由于其所基于的m01s骨架具有与FcRn的结合能力，它的血浆半衰期也可能达到10个小时，远长于基于VH等其它骨架的单域抗体的血浆半衰期(一般是几分钟到十几分钟)；最后，ebo7c2可在原核表达系统进行表达，生产成本低、周期短。
附图说明
图1为m01s的结构示意图；
m01s是CH2的突变体，所含的三个loop区分别是Loop BC，Loop DE和Loop FG，它们可以用来引入突变从而构建抗体库(三个区的每一个氨基酸都可以突变)。
图2为埃博拉病毒囊膜蛋白的表达纯化；
泳道M为分子量标准，泳道Gp449为目的蛋白。
图3为纯化后的纳米抗体ebo7c2经SDS-PAGE检测；
泳道M为分子量标准，泳道7c2为目的蛋白。
图4为ELISA测定的ebo7c2和埃博拉病毒囊膜蛋白的结合；
ebo7c2(◆)与抗原蛋白的结合浓度EC50为30nM，骨架m01s(▲)为阴性对照。
图5为ebo7c2中和埃博拉假病毒实验；
ebo7c2(◆)中和病毒的浓度IC50为300nM，骨架m01s(▲)为阴性对照。
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室指南》(New York:Cold Spring Harborlaboratory Press,2001)中所述的条件进行。
【实施例1】表达并纯化埃博拉病毒囊膜蛋白
根据埃博拉病毒的基因序列(GenBank No.AY354458)，分析其氨基酸序列，合成其囊膜蛋白的胞外域(氨基酸33-311,463-632)的基因Gp499，将基因与载体pSecTag2A连接、转化，构建载体pSecTag2A-Gp449。转染前1天将293F细胞(控制细胞密度为5～×105个/ml)40mL接种于125mL悬浮细胞培养瓶。将40μg质粒(pSecTag2A-Gp449)稀释于4mL培养基中轻轻浑匀，再将120μL PEI(polyethylenimine)稀释于培养液中，轻轻浑匀。室温孵育20分钟后将它们逐滴加入细胞中。将细胞放入悬浮培养箱中，250转/分钟，37℃悬浮培养。
144小时后收集培养基上清，用鼠源anti-His作为一抗(所用载体在所表达蛋白的C端提供6×His Tag标签用于检测)通过蛋白免疫印迹(Western Blot)检测囊膜蛋白的表达。
在检测到目的蛋白表达后，扩大细胞培养与转染规模，大量表达囊膜蛋白。收集培养基上清，用Ni-NTA填料纯化目的蛋白，随后用截留分子量为3kD的超滤离心管超滤置换缓冲液，经SDS-PAGE验证其纯度。
【实施例2】噬菌体展示库的构建以筛选
以m01s为骨架，按照已有的文献构建噬菌体库(Gong R,et al.,PLoS ONE,2012)，以哺乳动物细胞表达的抗原进行筛选。将纯化后的抗原在96孔板中4℃孵育过夜时后，用噬菌体库进行淘选，特异性的噬菌体被抗原所捕获，用PBS+0.05％Tween-20清洗，经过7轮筛选，得到一个富集的克隆，命名为ebo7。以ebo7为骨架，对其基因序列进行随机突变，从突变体中得到了一个特异性的高亲和力克隆，命名为ebo7c2。
【实施例3】ebo7c2的表达纯化
按照已有文献(Gong R,et al.,Methods Mol Biol.,2012)对ebo7c2进行表达和纯化。构建原核ebo7c2表达载体，转化入E.coli HB2151中。再接种菌种于含100μg/ml氨苄的SB培养基(1L培养基中含30g胰蛋白胨、20g酵母提取物和10g MOPS，pH值用NaOH调至7.0)中，待OD600达到0.7～1.0时加入IPTG至终浓度为200μg/ml，于37℃、220rpm的条件下进行诱导表达14～16h。4℃、6000rpm、15min离心收集菌体，弃培养基，沉淀重悬于Buffer A(50mMTris-HCL，450mM NaCL，pH 8.0)中，再经多粘菌素B(polymyxin B)处理1小时后离心收集上清。用Ni-NTA填料纯化，经SDS-PAGE验证其纯度。随后用截留分子量为3kD的超滤离心管超滤浓缩，所得到的ebo7c2的C-末端含6×His标签和FLAG标签。
【实施例4】ELISA测定ebo7c2和囊膜蛋白的结合
将囊膜蛋白(2μg/mL)包被在ELISA板上，4℃孵育过夜后用PBS+3％milk于37℃封闭1h。加入系列稀释的ebo7c2，37℃孵育2小时后用PBST(PBS+0.05％Tween 20)洗四次，再加辣根过氧化物酶(HRP)标记的鼠抗FLAG单克隆抗体于37℃孵育1小时后，用PBST洗四次，再加入ABTS进行检测。骨架m01s作为阴性对照。ebo7c2和埃博拉病毒囊膜蛋白结合的EC50为30nM，m01s不能与囊膜蛋白结合，如图4所示。
【实施例5】在BKH-21细胞中ebo7c2抗体中和埃博拉假病毒。
以埃博拉假病毒(EBOV)作为抗体中和的病毒目标，以水泡性口炎重组病毒(VSVG)为阴性对照病毒，检测候选抗体能否特异性的抑制埃博拉假病毒的感染，同时不能影响对照组病毒(Sven Moller-Tank，et al.，J Virol，2013)。将100μL的BHK-21(1×105个/ml)细胞接种96孔板，培养14～16h。将ebo7c2抗体加入到埃博拉假病毒中，ebo7c2终浓度最高为15000nM，依次三倍稀释，最低浓度为205.7nM(稀释36倍)37℃孵育30分钟。弃96孔板中的细胞培养基，用病毒和抗体混合液感染细胞，37℃孵育2小时。弃病毒液后，用PBS清洗3次，除去残留的病毒液，加入含有2％胎牛血清的培养基，于37℃孵育。第二天在荧光显微镜下统计绿色细胞的个数，抗体100％中和效率即无绿色细胞。被病毒感染的细胞在荧光显微镜下观察，能够发射绿色荧光，没有感染病毒的细胞不发光。随着抗体浓度的降低，呈现绿色BHK-21细胞逐渐增加，表明被埃博拉假病毒的感染的细胞数目增加，即表示ebo7c2可以特异性的中和埃博拉假病毒，中和效率IC50位300nM。作为阴性对照，ebo7c2未检测到抑制水泡性口炎的感染，如图5所示。

Claims (14)

1.一种针对埃博拉病毒囊膜蛋白的抗病毒纳米抗体ebo7c2，其特征在于，纳米抗体ebo7c2的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.如权利要求1所述抗病毒纳米抗体ebo7c2的编码基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.一种载体，其特征在于，包含SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
4.一种细胞，其特征在于，包含SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列或权利要求1所述的纳米抗体ebo7c2。
5.一种用于检测生物样品中的埃博拉病毒囊膜蛋白的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的纳米抗体ebo7c2。
6.权利要求1所述的纳米抗体ebo7c2在制备预防或治疗埃博拉病毒感染的药物中的应用。
7.一种偶联抗体，其特征在于，包含权利要求1所述的纳米抗体ebo7c2。
8.权利要求7所述的偶联抗体在制备预防或治疗埃博拉病毒感染的药物中的应用。
9.一种用于检测生物样品中的埃博拉病毒囊膜蛋白的试剂盒，其特征在于，包含权利要求7所述的偶联抗体。
10.一种融合抗体，其特征在于，包含权利要求1所述的纳米抗体ebo7c2。
11.权利要求10所述的融合抗体在制备预防或治疗埃博拉病毒感染的药物中的应用。
12.一种用于检测生物样品中的埃博拉病毒囊膜蛋白的试剂盒，其特征在于，包含权利要求10所述的融合抗体。
13.一种药物组合物，其特征在于，至少包含如权利要求1、7、10所述的抗体的任意一种。
14.根据权利要求13所述的药物组合物，其特征在于，还包含药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。
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Title
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