CN106188285B - 一种中和新疆出血热病毒的单域抗体 - Google Patents

一种中和新疆出血热病毒的单域抗体 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种中和新疆出血热病毒的单域抗体XHF4RC8及其在制备预防或治疗新疆出血热病毒感染的药物中的应用，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，编码XHF4RC8的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。该单域抗体以人抗体IgG1的VH结构域m0为骨架。XHF4RC8能够与新疆出血热病毒囊膜蛋白Gc结构域III相结合；并具有病毒中和作用。XHF4RC8分子量较小，具有更好的组织渗透性和结合存在位阻效应的抗原表位的能力；XHF4RC8可在原核表达系统进行表达，生产成本低、周期短。XHF4RC8在临床上具有治疗新疆出血热病毒的潜在功能，或者可以与其他抗体联用达到理想的治疗效果。

Description

一种中和新疆出血热病毒的单域抗体
技术领域
本发明属于生物医药工程技术领域，具体涉及一种针对新疆出血热病毒囊膜蛋白的抗病毒单域抗体。
背景技术
治疗性单克隆抗体(monoclonal antibody，单抗)由于可精确地攻击靶分子，且因毒副作用较小而成为人们期望中的理想药物。目前，国内外的单抗药物主要应用于治疗肿瘤、免疫性疾病和病毒感染等方面。例如用于治疗呼吸道和包病毒RSV的帕利珠单抗(Palivizumab、Synagis)。
传统的单克隆抗体的制备方法是杂交瘤技术。随着基因工程技术的迅速发展，治疗性单抗已从鼠源单抗，到嵌合抗体、人源化抗体，直至近年的全人抗体，逐步消除了异源性抗体的免疫原性问题。但随着研究的不断深入，人们发现全长抗体的分子量较大(～150kD)，使它们的组织渗透性较差，也难以结合一些空间上有位阻效应的关键表位，从而影响活性。解决的策略之一是将全长抗体进行小型化，由此开发了一系列具有结合功能的抗体片段：如Fab(50-60kD)、单链抗体(scFv，20-30kD)、重链可变区抗体(VH，12-15kD)(单域抗体)等小型化抗体。这些抗体片段相对于全长单抗，具有更好的组织渗透性和结合存在位阻效应的抗原表位的能力。
新疆出血热病毒(Xinjiang hemorrhagic fever virus，XHFV)是迄今为止传染性最高、致命性最强的病毒之一，具有传播途径广、感染种群复杂等特点，爆发区域呈扩大趋势。目前，尚没有针对新疆出血热的候选抗体药物。
假病毒是由非病毒自身核酸被病毒衣壳蛋白或包膜蛋白包裹所形成的具有感染性的病毒样颗粒。我们利用基因工程改造的水泡性口炎病毒(缺失囊膜蛋白基因，因此不能组装出新的完整病毒颗粒，只能一次性感染细胞；带有绿色荧光蛋白基因，感染细胞后在细胞内大量表达，使被感染的细胞呈绿色)和新疆出血热病毒的囊膜蛋白基因一起，组装出带有新疆出血热病毒囊膜蛋白的水泡性口炎病毒颗粒。该新疆出血热假病毒可较好的替代野生的新疆出血热病毒，应用于抗体中和病毒的研究中。
近几年噬菌体展示技术广泛用于抗体研发。噬菌体展示技术是将被展示基因与噬菌体自身蛋白基因(gIII或gVIII)融合在一起而展示于噬菌体的表面。可以构建大容量(1010～1011)的展示库进行筛选，以其速度快、周期短等独特的优点而越来越被人们所重视。
发明内容
为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种针对新疆出血热病毒囊膜蛋白的抗病毒单域抗体XHF4RC8，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明的第二方面，提供一种DNA分子，它编码选自下组的蛋白质：本发明所述的针对新疆出血热病毒囊膜蛋白的抗病毒单域抗体XHF4RC8。
优选的，所述的DNA分子，其特征在于，它具有选自如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
本发明提供的单域抗体XHF4RC8，是一种针对新疆出血热囊膜蛋白的抗病毒抗体，该单域抗体的互补决定簇分别为CDR1、CDR2和CDR3。编码CDR1的基因序列为seq ID No.3，氨基酸序列为Seq ID No.4；编码CDR2的基因序列为Seq ID No.5，氨基酸序列为seq IDNo.,6；编码CDR3的基因序列为Seq IDNo.7，氨基酸序列为Seq ID No.8。
本发明提供的上述针对新疆出血热病毒囊膜蛋白的单域抗体，是通过以下方法得到：首先构建以VH(m0)为骨架的噬菌体表面展示文库(W Chen,et al.,Methods Mol Biol,2009:81-99)，然后以原核表达的新疆出血热病毒囊膜蛋白Gc结构域III为抗原(图2)，经过4轮筛选得到一个高亲和力的特异性结合的克隆。表达纯化该克隆(图3)，进行鉴定，即得到一种中和新疆出血热病毒的抗体XHF4RC8，并对其进行鉴定分析。
通过ELISA对XHF4RC8的结合性进行了鉴定，用建库骨架m0为对照。ELISA实验证明XHF4RC8能够与筛选用抗原特异性结合(图4)，病毒中和试验证明XHF4RC8能够抑制新疆出血热假病毒感染293T细胞(图5)，因此，该抗体具有中和新疆出血热病毒的作用。
在另一个方面，本发明提供一种载体，其包含SEQ ID NO：2。
在另一个方面，本发明提供一种宿主细胞，其含有SEQ ID NO：2或含有SEQ ID NO：2的载体。
本发明提供上述单域抗体在制备预防或治疗新疆出血热病毒感染的药物中的应用。
在另一个方面，本发明提供一种用于检测生物样品中的新疆出血热病毒囊膜蛋白的试剂盒，其包含单域抗体XHF4RC8。
在另一个方面，本发明提供一种偶联抗体，其包含单域抗体XHF4RC8。该偶联抗体是指单域抗体XHF4RC8和其它分子偶联，包括但不仅限于放射性同位素、毒素，形成的偶联抗体。
进一步地，该偶联抗体在制备预防或治疗新疆出血热病毒感染的药物中的应用。
进一步地，本发明提供一种用于检测生物样品中的新疆出血热病毒囊膜蛋白的试剂盒，其包含上述偶联抗体。
在另一个方面，本发明提供一种融合抗体，其包含单域抗体XHF4RC8。该融合抗体是指单域抗体XHF4RC8和其它多肽，此处所指的多肽从数个氨基酸的肽段到蛋白质，融合后的融合抗体。
进一步地，该融合抗体在制备预防或治疗新疆出血热病毒感染的药物中的应用。
进一步地，本发明提供一种用于检测生物样品中的新疆出血热病毒囊膜蛋白的试剂盒，其包含上述融合抗体。
在一个实施方案中，本发明提供一种药物组合物，其至少包含XHF4RC8或上述偶联抗体、融合抗体的任意一种。
在另一个实施方案中，该药物组合物进一步包含药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。
噬菌体展示技术目前广泛应用于抗体筛选及其它领域。它是将外源基因(即本发明中的基于VH的文库)同丝状噬菌体的外壳蛋白P3基因(或P8)基因融合后导入噬菌体基因组，表达产生的外源肽与外壳蛋白P3(或P8)形成融合蛋白，展示在噬菌体的表面。导入了各种各样外源基因的一群噬菌体，就构成一个展示各种各样外源蛋白的噬菌体展示库。当用一个抗原(即本发明中的新疆出血热病毒囊膜蛋白Gc结构域III)去筛查一个噬菌体展示库时，就会选择性地同与其有相互作用的某个外源蛋白相结合。经过多轮筛选，那些能结合抗原的克隆(即本发明中的XHF4RC8)被富集，然后可以通过测序、表达进行鉴定。
本发明使用的术语“单域抗体”，指基于人源抗体IgG1的VH结构域的一类抗体，如图1所示。相对于全长单抗，单域抗体具有更好的组织渗透性和结合空间上存在位阻效应的抗原表位的能力。
本发明与现有技术相比，具有以下的主要突出效果和优点：本发明的创新在于从人IgG1的VH结构域为骨架的噬菌体表面展示文库中，以原核表达的新疆出血热病毒囊膜蛋白Gc结构域III为抗原，筛选得到一种中和新疆出血热病毒的单域抗体XHF4RC8。本发明提供的这种单域抗体，是一种病毒中和抗体，其优点在于：首先，相对于全长单抗(分子量～150kD)，XHF4RC8分子量较小(～14kD)，具有更好的组织渗透性和结合存在位阻效应的抗原表位的能力，甚至能够开发成口服药；其次，XHF4RC8可在原核表达系统进行表达，生产成本低、周期短。
附图说明
图1为VH的结构示意图；
图2为新疆出血热病毒囊膜蛋白Gc结构域III的表达纯化；
泳道M为分子量标准，泳道1为目的蛋白。
图3为纯化的单域抗体XHF4RC8经SDS-PAGE检测；
泳道M为分子量标准，其余泳道为咪唑浓度梯度洗脱的目的蛋白。
图4为ELISA测定的XHF4RC8和新疆出血热病毒囊膜蛋白的结合；
XHF4RC8(■)与抗原蛋白的结合浓度EC50为450nM，骨架m0(●)为阴性对照。
图5为XHF4RC8中和新疆出血热假病毒实验；
(A)添加1000nM浓度XHF4RC8对假病毒抑制效果；(B)添加100nM浓度XHF4RC8对假病毒抑制效果；(C)重组水疱性口炎病毒VSVG作阴性对照；(D)空细胞培养板孔对照。
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室指南》(New York:Cold Spring Harborlaboratory Press,2001)中所述的条件进行。
【实施例1】表达并纯化新疆出血热病毒囊膜蛋白
根据新疆出血热病毒的基因序列(GenBank No.gi|16271971)，分析其氨基酸序列，合成其囊膜蛋白Gc的结构域III(氨基酸406-521)，将基因与载体pET22b连接、转化，构建载体pET22b-Gc Domain III。将100ng质粒(pET22b-Gc DomainIII)转化入BL21(DE3)感受态细胞。再接种菌种于含100μg/ml氨苄的LB培养基(1L培养基中含10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和10g NaCl)中，待OD600达到0.6～1.0时加入IPTG至终浓度为0.1mmol/ml，于30℃、220rpm的条件下进行诱导表达16～20h。4℃、6000rpm、15min离心收集菌体，弃培养基，沉淀重悬于Buffer A(50mM Tris-HCL，450mM NaCL，pH 8.0)中，再经多粘菌素B(polymyxin B)处理1小时后离心收集上清。用Ni-NTA填料纯化，经SDS-PAGE验证其纯度。随后用截留分子量为3kD的超滤离心管超滤浓缩。所得到的是C-末端含6×His标签的新疆出血热病毒囊膜蛋白Gc结构域III蛋白。
用鼠源anti-His作为一抗(所用载体在所表达蛋白的C端提供6×His Tag标签用于检测)通过蛋白免疫印迹(Western Blot)检测其囊膜蛋白Gc的结构域III的表达，如图2所示。
在检测到其囊膜蛋白Gc的结构域III表达后，扩大培养与诱导规模，大量表达其囊膜蛋白Gc的结构域III蛋白。Ni-NTA Resin纯化目的蛋白，随后用截留分子量为3kD的超滤离心管超滤置换缓冲液，经SDS-PAGE验证其纯度。
【实施例2】噬菌体展示库的构建以及筛选
以m0为骨架，按照已有的文献构建噬菌体库(W Chen,et al.,Methods MolBiol,2009:81-99)，以大肠杆菌表达的抗原进行了筛选。将纯化后的抗原在96孔板中4℃孵育过夜时后，用噬菌体库中进行淘选，特异性的噬菌体被抗原所捕获，用PBS+0.05％Tween-20清洗，经过4轮筛选，得到一个富集的克隆，命名为XHF4RC8。
【实施例3】XHF4RC8的表达纯化
按照已有文献(Gong R,et al.,Methods Mol Biol.,2012)对XHF4RC8进行表达和纯化。构建原核XHF4RC8表达载体，转化入E.coli HB2151感受态细胞中。再接种菌种于含100μg/ml氨苄的SB培养基(1L培养基中含30g胰蛋白胨、20g酵母提取物和10g MOPS，pH值用NaOH调至7.0)中，待OD600达到0.7～1.0时加入IPTG至终浓度为200μg/ml，于37℃、220rpm的条件下进行诱导表达14～16h。4℃、6000rpm、15min离心收集菌体，弃培养基，沉淀重悬于Buffer A(50mM Tris-HCL，450mM NaCL，pH 8.0)中，再经多粘菌素B(polymyxin B)处理1小时后离心收集上清。用Ni-NTA填料纯化，经SDS-PAGE验证其纯度。随后用截留分子量为3kD的超滤离心管超滤浓缩。所得到的XHF4RC8的C-末端含6×His标签和FLAG标签，如图3所示。
【实施例4】ELISA测定XHF4RC8和囊膜蛋白的结合
将囊膜蛋白结构域III蛋白(2μg/mL)包被在ELISA板上，4℃孵育过夜后用PBS+3％milk于37℃封闭1h。加入系列稀释的XHF4RC8，37℃孵育2小时后用PBST(PBS+0.05％Tween20)洗四次，再加辣根过氧化物酶(HRP)标记的鼠抗FLAG单克隆抗体于37℃孵育1小时后，用PBST洗四次，再加入ABTS进行检测。骨架m0作为阴性对照。XHF4RC8和新疆出血热病毒囊膜蛋白结合的EC50为450nM，m0不能与囊膜蛋白结合，如图4所示。
【实施例5】在293T细胞中XHF4RC8抗体中和新疆出血热假病毒。
以新疆出血热假病毒作为抗体中和的病毒目标，以水泡性口炎重组病毒(VSVG)为阴性对照病毒，检测候选抗体能否特异性的抑制新疆出血热假病毒的感染，同时不能影响对照组病毒。将100μL的293T(1×105个/ml)细胞接种96孔板，培养14～16h。将XHF4RC8抗体加入到新疆出血热假病毒中，XHF4RC8终浓度最高为1000nM，依次10倍稀释，最低浓度为100nM(稀释10倍)37℃孵育30分钟。弃96孔板中的细胞培养基，用病毒和抗体混合液感染细胞，37℃孵育2小时。弃病毒液后，用PBS清洗3次，加入含有2％胎牛血清的培养基，于37℃孵育。第二天在荧光显微镜下统计绿色细胞的个数，抗体100％中和效率即无绿色细胞。被病毒感染的细胞在荧光显微镜下观察，能够发射绿色荧光，没有感染病毒的细胞不发光。随着抗体浓度的增加，呈现绿色的293T细胞逐渐减少，表明被新疆出血热假病毒感染的细胞数目减少，即表示XHF4RC8可以中和新疆出血热假病毒。作为阴性对照，未检测到抑制水泡性口炎的感染。

Claims (15)

1.一种针对新疆出血热病毒囊膜蛋白的抗病毒单域抗体XHF4RC8，其特征在于，单域抗体XHF4RC8的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种DNA分子，其特征在于，它编码选自下组的蛋白质：权利要求1所述的针对新疆出血热病毒囊膜蛋白的抗病毒单域抗体XHF4RC8。
3.如权利要求1所述抗病毒单域抗体XHF4RC8的编码基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
4.一种载体，其特征在于，包含SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
5.一种宿主细胞，其特征在于，含有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列或含有权利要求4所述的载体。
6.权利要求1所述的单域抗体在制备预防或治疗新疆出血热病毒感染的药物中的应用。
7.一种用于检测生物样品中的新疆出血热病毒囊膜蛋白的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的单域抗体XHF4RC8。
8.一种偶联抗体，其特征在于，包含权利要求1所述的单域抗体XHF4RC8。
9.权利要求8所述的偶联抗体在制备预防或治疗新疆出血热病毒感染的药物中的应用。
10.一种用于检测生物样品中的新疆出血热病毒囊膜蛋白的试剂盒，其特征在于，包含权利要求8所述的偶联抗体。
11.一种融合抗体，其特征在于，包含权利要求1所述的单域抗体XHF4RC8。
12.权利要求11所述的融合抗体在制备预防或治疗新疆出血热病毒感染的药物中的应用。
13.一种用于检测生物样品中的新疆出血热病毒囊膜蛋白的试剂盒，其特征在于，包含权利要求11所述的融合抗体。
14.一种药物组合物，其特征在于，至少包含如权利要求1、8、11所述的抗体的任意一种。
15.根据权利要求14所述的药物组合物，其特征在于，还包含药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。
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