CN101498727A - 一种新疆出血热病毒免疫层析快速检测试纸 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种新疆出血热病毒免疫层析快速检测试纸。本发明的一种新疆出血热病毒免疫层析快速检测试纸包括支撑固定粘衬层，在所述支撑固定粘衬层上依次交叠粘附有样品吸附层、金标结合垫、纤维素膜层和吸水材料层，在所述纤维素膜层上印制新疆出血热病毒核衣壳蛋白的单克隆抗体作为检测印迹带。该新疆出血热病毒免疫层析快速检测试纸的纤维素膜层上印制羊抗鼠IgG抗体溶液作为对照印迹带。该检测试纸的金标结合垫上吸附有胶体金标记的新疆出血热病毒核衣壳蛋白的单克隆抗体。本发明的一种新疆出血热病毒免疫层析快速检测试纸有效快速检测新疆出血热病毒。

Description

一种新疆出血热病毒免疫层析快速检测试纸

技术领域

本发明涉及免疫学检测方法，特别涉及一种新疆出血热病毒免疫层析快速检测试纸。

背景技术

克里米亚-刚果出血热病毒(Crimean-Congo hemorrhagic fever virus，CCHFV)是经蜱传播的虫媒病毒，属于布尼亚病毒科(Bunyaviridae)内罗病毒属(Nairovirus)。CCHFV的基因组为分节段、单股、负链RNA，由小(S)、中(M)、大(L)3个节段组成，分别编码核蛋白(NP)、糖蛋白(GP)及RNA聚合酶(RNA-dependentpolymerase)。CCHFV引起的克里米亚-刚果出血热(CCHF)是一种流行于中国新疆南部、俄国北部、中东、南部欧亚大陆及非洲撒哈拉地区的烈性传染性疾病，其平均病死率在10％～50％。中国的CCHF于1965年首次诊断于南部新疆，后在北疆地区亦查出抗体，故称新疆出血热(XHF)。

CCHFV NP抗原位点亦呈线性分布且性质稳定，是病毒诱导机体产生早期体液免疫和细胞免疫的主要抗原，这是利用NP进行抗体检测的理论基础。

CCHFV的检测技术主要包括病毒的分离与鉴定、血清学检查和分子生物学检测。病毒分离要求的生物安全级别高，需在生物安全三级实验室操作；血清学检测主要使用反向间接血凝抑制试验(RPHI)、酶联免疫法(ELISA)、免疫荧光(IFA)等技术检测CCHF患者的IgG和IgM抗体；分子生物学主要检测CCHFV的核酸，其操作需要专业的技术人员和PCR仪以及荧光定量PCR仪等仪器。

目前，临床诊断技术的发展方向为简便快捷，操作简单，不需要特定仪器设备辅助在短时间内即可操作解读。这些技术中目前应用较广的是免疫层析检测试纸技术，该技术与其他方法比较，优势在于：检测过程中样品处理简单，不需要专门仪器和人员培训，非专业技术人员按照说明书即可操作，并可迅速观察结果，易于在中小型企业、基层普及与推广应用，同时适于现场快速检测。而目前还没有将新疆出血热病毒核衣壳蛋白的单克隆抗体应用于免疫层析试纸检测新疆出血热病毒的报道。

发明内容

本发明提供了一种新疆出血热病毒免疫层析快速检测试纸。

为实现本发明的目的，采用如下的技术方案：

本发明的一种新疆出血热病毒免疫层析快速检测试纸，包括支撑固定粘衬层，在所述支撑固定粘衬层上依次交叠粘附有样品吸附层、金标结合垫、纤维素膜层和吸水材料层，在所述纤维素膜层上印制新疆出血热病毒核衣壳蛋白的单克隆抗体作为检测印迹带。

上述新疆出血热病毒免疫层析快速检测试纸，在所述纤维素膜层上印制羊抗鼠IgG抗体溶液作为对照印迹带。

上述新疆出血热病毒免疫层析快速检测试纸，在所述金标结合垫上吸附有胶体金标记的新疆出血热病毒核衣壳蛋白的单克隆抗体。

本发明的新疆出血热病毒核衣壳蛋白的单克隆抗体有中和新疆出血热病毒的特性，其效价大于1:625000，其检测核衣壳蛋白的线性范围为1ng～20ng，检测灵敏度为1ng。

上述新疆出血热病毒核衣壳蛋白的单克隆抗体的制备方法包括如下步骤：

(1)构建表达质粒：将新疆出血热病毒核衣壳蛋白基因克隆到表达载体上；

(2)重组核衣壳蛋白的诱导表达及其纯化；

(3)将步骤(2)得到的重组核衣壳蛋白免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合，间接ELISA筛选阳性孔杂交瘤细胞，取阳性孔杂交瘤细胞，用有限稀释法进行克隆化，得到杂交瘤细胞株，用阳性的杂交瘤细胞注入小鼠腹腔，获小鼠腹水。

上述方法进一步包括如下步骤：将得到的腹水使用ProteinG柱纯化，得到核衣壳蛋白的单克隆抗体。

上述方法步骤(1)中的核衣壳蛋白基因为GenBank登录号为NC_005302的核苷酸序列中的S基因。表达载体为pET30a(+)载体。

上述方法步骤(2)中的诱导表达采用IPTG诱导表达，纯化采用Ni柱纯化。

本发明建立了一种新疆出血热病毒免疫层析快速检测试纸，与流行性出血热无交叉反应，可检测0.07mg/ml的NP蛋白，有效快速检测新疆出血热病毒。

附图说明

图1为新疆出血热NP蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中的诱导表达的SDS-PAGE电泳的一个优选实施例的结果图；

图2为重组NP蛋白的纯化的SDS-PAGE电泳的一个优选实施例的结果图；

图3为单克隆抗体与重组NP蛋白的Western blot分析的一个优选实施例的结果图；

图4为胶体金检测卡的特异性试验的一个优选实施例的结果图；

图5为胶体金检测卡的灵敏度试验的一个优选实施例的结果图；

图6为媒介模拟样品的免疫胶体金检测的一个优选实施例的结果图。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。

实施例一：新疆出血热病毒核衣壳蛋白的单克隆抗体的制备

(1)构建含新疆出血热病毒核衣壳蛋白基因的重组质粒：

根据CCHFV毒株(GenBank登录号NC_005302)核苷酸序列合成全长的1458bp S基因片段，基因的5’端和3’分别添加BamH1和XhoI酶切位点。将该片段克隆到同样酶切回收的pET30a(+)载体上，获得重组质粒pENP。

(2)重组核衣壳蛋白的诱导表达及其纯化：

将重组质粒pENP转化BL21(DE3)感受态细胞，挑取单菌落于5ml的LB培养基(25g/ml的卡那霉素抗性)，37℃培养到OD600约为0.6左右，加入IPTG使终浓度到1mmol/L，25℃诱导培养3h，收集菌体，处理样品经SDS-PAGE电泳分析，观察重组蛋白的表达情况。图1中第一泳道至第三泳道分别为蛋白质分子量标准、诱导前后的大肠杆菌和诱导后的大肠杆菌的电泳条带，结果图显示重组E.coliBL21(pENP)诱导3h后出现一条大小约59kDa蛋白条带，与预期大小一致，这表明CCHFV的NP蛋白在BL21(DE3)中获得了较好表达。

对重组蛋白进行可溶性分析，取1ml诱导液离心，沉淀重悬于500μlPBS缓冲液，并冰浴超声波(功率为400W，超声2s，间隔6s，共15个循环)裂解菌液。离心，保留上清，沉淀重悬于500μl的ddH₂O。取等体积的上清和沉淀进行SDS-PAGE，分析目的重组蛋白的可溶性情况。将含有可溶性目的蛋白的上清和含有不可溶蛋白的沉淀进行SDS-PAGE分析，图1中第四泳道和第五泳道分别为超声波破碎后的上清及超声波破碎后的沉淀电泳条带，结果显示重组蛋白在上清和沉淀中均有诱导条带，但主要以不可溶的包涵体存在。

对重组NP蛋白的包涵体进行纯化和复性。诱导表达的重组菌株离心收集菌体，每7.7g沉淀中加入77ml PBS重悬并置冰浴中超声波裂解，离心，2.5g沉淀用8M尿素(50mM Tris.Cl，200mM NaCl，pH8.0)溶解，上Ni柱，25mM咪唑(50mMTris.Cl，200mM NaCl，8M尿素，pH8.0)冲洗去除杂蛋白，250mM咪唑(50mM Tris.Cl，200mMNaCl，8M尿素，pH8.0)洗脱目的抗原蛋白。2ml洗脱液用2M尿素(50mM Tris.Cl，200mM NaCl，pH8.0)透析，然后再用缓冲液(50mM Tris.Cl，200mM NaCl，pH8.0)透析，得到重组蛋白的可溶产物。SDS-PAGE结果表明洗脱液中的NP蛋白的纯度较高，纯化的蛋白浓度为0.4mg/ml，见图2，图2是重组NP蛋白的纯化的SDS-PAGE的电泳图，第一泳道为蛋白质分子量标准的电泳条带，第二泳道为Ni-NTA纯化的NP蛋白的电泳条带。

(3)将步骤(2)得到的重组核衣壳蛋白免疫BALB/c小鼠，将抗原注射免疫6-8周龄的BALB/c小鼠小鼠10只，初次为颈背部和腹腔注射，其它为腹腔注射免疫，抗原(重组蛋白)剂量为50g/只，免疫3-5次，免疫间隔14天。取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合，对细胞上清采用间接ELISA进行检测，测得阳性的克隆采用有限稀释法，进行3次亚克隆。筛选得到的阳性杂交瘤细胞免疫小鼠后，制备腹水。

(4)将步骤(3)得到的腹水使用ProteinG柱纯化，得到核衣壳蛋白的单克隆抗体。

实施例二：新疆出血热病毒核衣壳蛋白的单克隆抗体的Western blot特性鉴定

CCHFV重组NP蛋白经SDS-PAGE电泳后，转印至硝纤膜上，分别以稀释后的10B12和3G5的腹水单克隆抗体为一抗，以HRP-羊抗鼠IgG为二抗进行Western blot鉴定，同时设pET30a(+)空载体菌液作对照。图3为3G5的单克隆抗体与重组NP蛋白的Western blot分析结果图，第一泳道到第三泳道分别为单克隆抗体1:200稀释、单克隆抗体1:1000稀释及单克隆抗体1:2000稀释的Western blot的检测条带；该结果显示，10B12和3G5均能特异性地识别59kDa的NP重组蛋白。

实施例三：新疆出血热病毒核衣壳蛋白的单克隆抗体的间接免疫荧光试验特性鉴定

制备表达NP蛋白的重组杆状病毒感染的昆虫细胞抗原片，在检测孔中分别加入10B12和3G5的单克隆抗体作一抗(1:50稀释)，37℃反应30min，PBS洗3次，加入FITC标记的羊抗鼠IgG，37℃反应60min，PBS洗3次，荧光显微镜下观察。结果，10B12和3G5的单克隆抗体均与Ac-NP感染的细胞反应，出现明显的绿色荧光，阴性对照无绿色荧光。

实施例四：新疆出血热病毒核衣壳蛋白的单克隆抗体的配对实验

用双抗体夹心ELISA法对筛选的单克隆抗体进行配对。根据初期的配对结果，选择最佳的一对抗体(10B12和3G5)进行优化实验。ELISA结果显示，使用25g/ml的10B12作为一抗包被过夜，HRP标记的3G5作为二抗按照1:1000稀释，检测的重组NP蛋白的线性范围为1ng～20ng，检测灵敏度为1ng的NP蛋白。

实施例五：杂交瘤细胞株的筛选及单克隆抗体效价的测定

用间接ELISA法筛选，得到10株能分泌抗CCHFV的NP蛋白抗体的杂交瘤细胞株，免疫小鼠后采集腹水进行单克隆抗体的配对试验。其中两个细胞株产生的单克隆抗体配对结果较好，分别命名为10B12和3G5。用间接ELISA法测定小鼠腹水单克隆抗体效价，结果显示，小鼠腹10B12和3G5的小鼠腹水单克隆抗体效价均大于1:625000。

实施例六：胶体金标记蛋白条件的优化

采用粒径为25-30nm的胶体金溶液进行蛋白标记试验。调节胶体金溶液的pH值为7.5，分装成10管，每管1ml。将待标记抗体以5μg/ml～25μg/ml作系列稀释后，分别取1ml加入1管胶体金溶液内。对照管加1ml稀释液。当加入的蛋白量达到或超过胶体金的最低稳定量时，胶体金溶液保持红色不变；若加入的蛋白量少于胶体金的最低稳定量时，胶体金溶液将出现由红变蓝的聚沉现象。则在所有呈现红色的管中，选择蛋白含量最低的一管为含稳定1ml胶体金所需的抗体量。并将标记好的金标抗体(金子)分别按10cm²/ml、20cm²/ml、30cm²/ml、40cm²/ml、50cm²/ml均匀地铺在玻璃纤维膜上，在温度在30～35℃，湿度在10％～30％条件下恒温干燥。选择质控品(阳性与阴性)显色最好的情况下的金标物的制备条件为使用参数。参数确定为：胶体金粒径为25～30nm；与蛋白质标记的量为10～15μg蛋白/ml胶体金；胶体金结合物(金标垫)稀释参数为15～20cm²/ml。

实施例七：膜工艺条件优化

膜工艺条件优化，包括对膜孔径与材质的优化、缓冲系统的选择优化、质控线(C线)的选择、金标记条件优化等方面。最后确定使用膜135和PBS缓冲液，羊抗鼠血清作为质控(C线)。金标记条件优化结果表明当包被6.2mg/ml 10B12单抗，3G5单抗标记胶体金作为金标结合物时的显色反应最佳。

实施例八：制备胶体金检测卡

以上述摸索的最佳条件进行胶体金检测卡的制备。1.1mg/ml和2mg/ml的NP纯化蛋白作用10min内均有较强条带产生，且前者产生的条带颜色较深，见图4。图4为胶体金检测卡的特异性试验。1为正常人的血清，2～4为流行性出血热阳性人血清，5为兔血清，6和7分别为2mg/ml和1.1mg/ml的NP纯化蛋白检测结果。稀释2倍、3倍和5倍的检测蛋白(浓度分别0.55mg/ml、0.37mg/ml和0.22mg/ml)均可显现阳性条带，见图5，图5为胶体金检测卡的灵敏度试验。1～3分别为1.1mg/ml NP纯化蛋白稀释2倍、3倍和5倍的试验结果。该检测卡与人血清、流行性出血热阳性人血清、兔血清、生理盐水、鼠血清等均无交叉反应。

实施例九：媒介模拟标本的验证

将媒介用PBS研磨，加入纯化的NP蛋白作为阳性模拟样本。结果显示，当模拟样本中含有0.55mg/ml、0.28mg/ml和0.14mg/ml的NP蛋白时，可看到明显的阳性条带。媒介中NP蛋白浓度为0.07mg/ml时，10min后肉眼可观察到弱检测带，结果见图6。图6为媒介模拟样品的免疫胶体金检测结果图，其中，各标号分别代表：1，北京幼蜱研磨液；2，抚远幼蜱研磨液；3和4，北京幼蜱研磨液+0.55mg/mlNP蛋白；5和6，抚远幼蜱研磨液+0.55mg/ml NP蛋白；7，北京幼蜱研磨液+0.28mg/ml NP蛋白；8，抚远幼蜱研磨液+0.28mg/ml NP蛋白；9，北京幼蜱研磨液+0.14mg/ml NP蛋白；10，抚远幼蜱研磨液+0.14mg/ml NP蛋白；11，北京幼蜱研磨液+0.07mg/ml NP蛋白；12，抚远幼蜱研磨液+0.07mg/ml NP蛋白。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (3)

1.一种新疆出血热病毒免疫层析快速检测试纸，包括支撑固定粘衬层，在所述支撑固定粘衬层上依次交叠粘附有样品吸附层、金标结合垫、纤维素膜层和吸水材料层，其特征在于：在所述纤维素膜层上印制新疆出血热病毒核衣壳蛋白的单克隆抗体作为检测印迹带。

2.根据权利要求1所述的一种新疆出血热病毒免疫层析快检速测试纸，其特征在于：在所述纤维素膜层上印制羊抗鼠IgG抗体溶液作为对照印迹带。

3、根据权利要求1所述的一种新疆出血热病毒免疫层析快速检测试纸，其特征在于：在所述金标结合垫上吸附有胶体金标记的新疆出血热病毒核衣壳蛋白的单克隆抗体。

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