CN102539782B - 检测囊型包虫病和泡型包虫病的免疫层析试条 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物工程领域，公开了一种检测囊型包虫病和泡型包虫病的免疫层析试条，包括一个背板，背板的上侧的一端设置有一个样品垫，另外一端设置有一个吸水垫，在样品垫和吸水垫之间设置有一个纤维素膜，在样品垫和纤维素膜之间设置有一个金标垫，在所述纤维素膜上设置第一检测线、第二检测线、质控线，第一检测线含有针对囊型包虫病的纯化粗抗原，第二检测线含有针对泡型包虫病的重组抗原，质控线含有能与胶体金标记探针特异性结合的抗体或抗抗体。本发明还提供了上述的一种检测囊型包虫病和泡型包虫病的免疫层析试条的制备方法，本发明的免疫层析试条具有简便性、敏感性、特异性和快速性的优点，适于临床和现场使用。

Description

检测囊型包虫病和泡型包虫病的免疫层析试条

技术领域

本发明涉及生物工程领域，尤其涉及一种免疫层析试条及制备方法，具体来说是一种检测囊型包虫病和泡型包虫病的免疫层析试条及制备方法。 

背景技术

棘球蚴病(echinococcosis)又称包虫病(Hydatid disease或Hydatidosis)，是由棘球属绦虫的幼虫寄生于人、畜体内引起的一种人畜共患寄生虫病，能感染人类的棘球属绦虫有4种：细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus，Eg)、多房棘球绦虫(EEchinococcus multilocularis，Em)、少节棘球绦虫(E.oligarthrus)和伏氏棘球绦虫(E.vogeli)。这4种棘球绦虫的成虫和幼虫期形态不同，可引起不同类型的棘球蚴病。我国有两种棘球蚴病即细粒棘球蚴病(cystic echinococ-cosis，CE)又称囊型包虫病，和多房棘球蚴病(alveolar echinococcosis，AE)又称泡型包虫病。 

包虫病是一个重要的世界性公共卫生问题，广泛流行于欧、亚、非和地中海区域沿岸国家，以及澳洲和南美。在我国，包虫病主要流行于西部等12个省、自治区的牧区和农牧区，其中新疆、青海、甘肃、宁夏、西藏、内蒙和四川西部最为严重，是世界上包虫病患病率最高的地区。此外，吉林、陕西、云南、贵州和河南等省局部地区也有小范围流行。包虫病流行区受威胁人口约7000万。卫生部《全国人体重要寄生虫病现状调查》报告显示，这12省(区)包虫病患病率为1.084％，据此推算，目前流行区约有病人38万人。由于B超诊断结果有一定的 漏检率，实际患病人数可能达60万人以上。血清学检查发现人群的感染率平均为11.98％，感染人数约为700万人，受威胁人口约7000万。 

包虫病需要手术或长期服药治疗，效果有限。其中囊型包虫病包囊破裂可导致过敏休克而致患者死亡。泡型包虫病被称为“恶性包虫病”是一种致死性寄生虫病，10-15年的病死率高达90％以上。漏诊的包虫病患者失去治疗时机而危及生命。包虫病不但给患者带来极大的痛苦和沉重的医疗负担，且发病的高峰为20-50岁的青壮年，严重的患者失去劳动力，给社会带来极大的压力，系西部农牧区群众因病致贫，因病返贫的重要原因。此外，由于包虫病在牛羊的感染率相当高(可达90％)，每年因包虫病也给我国畜产品造成的经济损失达数十亿。因此包虫病不但严重危害人民的生命健康，而且严重影响社会和经济发展、边疆稳定。 

包虫病的感染可长期(数年或十多年)无症状，一旦症状显现，药物治疗效果差(因有两层厚实的囊包裹使药物难以进入达到有效浓度)，而不得不进行手术治疗，甚至要反复进行手术。因此，研究合适有效的免疫诊断技术用于早期诊断，以提高药物治疗效果，是最有效的降低发病率和死亡率的根本途径，是包虫病防治中亟待解决的问题。 

目前对包虫病的诊断极大地依赖影像学方法，如X光检查、B型超声诊断、CT扫描、核磁共振等物理诊断方法。但这些方法不能进行早期诊断(影像学诊断出的包虫病人已不太适合药物治疗)，且对有些囊肿、脓肿或肿块不能进行有效鉴别而误诊。由于影像检查设备携带不便，加之昂贵，且对操作人员的技术要求较高，在疾病诊断与流行病学调查中(特别在边远地区连电力供应都受到限制)的应用受到限制。 

免疫学方法在包虫病诊断上的应用越来越受到重视，最有效的免疫学诊断方法是应用纯化天然抗原或重组抗原检测包虫病人特异抗体，常用检测方法有间接血凝法(Indirect haemagglutination assay；IHA)、酶联免疫吸附法(ELISA)、酶联免疫电转移印渍法(Enzyme-linked immunoelectrotransfer blot assay 

；EITBA)，以及金标免疫点印渍法(Gold-labelled dot blotting；GDB；俗称膜法或渗滤法)。但这些方法或费时费力、或需要冷链系统保存试剂、或对仪器设备及操作人员的要求较高而不适合现场使用。 

在上述免疫方法中抗原的使用直接决定了检测的敏感性和特异性。包虫病免疫诊断抗原的研究经历了粗抗原、纯化抗原和重组抗原三个阶段。 

细粒棘球蚴包囊液粗抗原(HCF)广泛应用于囊型包虫病的诊断，其特点是检测的敏感性较高，可达75％-95％，但易于其他疾病如囊虫病等发生交叉反应。针对这一问题许多学者采用不同的方法对囊液粗抗原进行分离和纯化，显著提高了检测的敏感性和特异性。 

Em18抗原是泡球蚴种特异性抗原组分，有报道表明将纯化的天然Em18抗原用于泡型包虫病的诊断，敏感性和特异性分别高达90.91％和93.80％，阳性预期值和阴性预期值分别为83.33％和96.80％，还能在一定程度上区分活动性和非活动性病灶，因而是一种具有诊断和免疫随访意义的诊断抗原，但天然Em18是从人工感染的泡球蚴原头节中提取的，提取难度大、产量少，不能满足诊断需要，因而人工合成的重组EM18抗原成为一种在泡型包虫病鉴别诊断和病程随访中有应用价值的特异性诊断抗原。 

发明内容

本发明的目的是提供一种检测囊型包虫病和泡型包虫病的免疫 层析试条及制备方法，所述的这种检测囊型包虫病和泡型包虫病的免疫层析试条及制备方法要解决现有技术中的检测囊型包虫病和泡型包虫病的方法复杂，而且不能早期诊断的技术问题。 

本发明提供了一种检测囊型包虫病和泡型包虫病的免疫层析试条，包括一个背板，所述的背板的上侧的一端设置有一个样品垫，所述的背板的上侧的另外一端设置有一个吸水垫，在所述的样品垫和吸水垫之间设置有一个纤维素膜，所述的吸水垫和纤维素膜紧密连接，在所述的样品垫和所述的纤维素膜之间设置有一个金标垫，所述的样品垫、金标垫和纤维素膜之间紧密连接，在所述纤维素膜上远离金标垫的一端设置质控线，在所述的质控线和金标垫之间的纤维素膜上设置第一检测线和第二检测线，所述的第一检测线由囊型包虫病的纯化粗抗原组成，所述的第二检测线由重组的泡型包虫病的抗原Em18组成，所述的金标垫上设置有胶体金标记的探针，所述的胶体金标记的探针是以人IgG为抗原免疫动物获得的抗体或金黄色葡萄球菌A蛋白或G群链球菌细胞表面蛋白，所述的质控线含有能与胶体金标记探针特异性结合的抗体或抗抗体。 

进一步的，所述的纤维素膜的一端设置在所述的金标垫的下侧，所述的金标垫的一端设置在所述的样品垫的下侧。 

进一步的，所述金标垫中的胶体金标记探针是以人IgG作为抗原免疫小鼠获得的单克隆抗体，所述质控线含有羊抗鼠抗抗体。 

进一步的，所述金标垫中的胶体金标记探针可以为金黄色葡萄球菌A蛋白或G群链球菌细胞表面蛋白，所述质控线含有抗金黄色葡萄球菌A蛋白抗体或抗G群链球菌细胞表面蛋白抗体。 

进一步的，囊型包虫病的纯化粗抗原蛋白的浓度为0.1～10mg/mL，喷涂量为8-12μL/cm；重组的泡型包虫病的抗原Em18的蛋白浓度为0.1～10mg/mL，喷涂量为8-12μL/cm；胶体金标记探针的浓 度以蛋白浓度计为1～5mg/15～20mL。 

进一步的，羊抗鼠抗抗体溶液的浓度为0.1～5mg/mL，喷涂量为8-12μL/cm。 

进一步的，抗金黄色葡萄球菌A蛋白抗体或抗G群链球菌细胞表面蛋白抗体溶液浓度为0.1～5mg/mL，喷涂量为8-12μL/cm。 

进一步的，所述的维素膜选自硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜，所述支持胶体金标记探针的金标垫选自玻璃纤维膜或聚脂膜，所述样品垫选自滤血膜、玻璃纤维或吸水纸，所述吸水垫为吸水纸。 

本发明还提供了一种上述的检测囊型包虫病和泡型包虫病的免疫层析试条的制备方法，包括一个制备囊型包虫病的纯化粗抗原的步骤、一个制备重组的泡型包虫病的抗原Em18的步骤、一个制备标记的抗人IgG的探针的步骤和一个制备与胶体金标记探针特异结合的抗抗体的步骤，在上述步骤完成之后，将囊型包虫病的纯化粗抗原溶液喷涂到纤维素膜上形成第一检测线，将重组的泡型包虫病的抗原Em18溶液喷涂到纤维素膜上形成第二检测线，所述的第一检测线和所述的第二检测线相邻设置，将能与胶体金标记探针特异结合的抗体或抗抗体溶液喷涂到靠近吸水垫的纤维素膜上形成质控线，将喷涂有第一检测线、第二检测线、质控线的纤维膜在相对湿度40％以下的环境中干燥1～2小时，然后进行制备金标垫的步骤，在所述的制备金标垫的步骤中，将玻璃纤维膜或聚脂膜浸入胶体金标记的探针溶液中，取出后将金标垫在相对湿度40％以下的环境中干燥1～2小时，将所述纤维素膜粘贴在一个背板的中部，吸水垫粘贴在所述纤维素膜的靠近质控线的一端，将金标垫粘贴在纤维素膜的靠近检测线的一端，将样品垫粘贴于金标垫的远离纤维素膜的一端，得到检测囊型包虫病和泡型包虫病的免疫层析试条。 

本发明还提供了一种试剂盒，由一个盒体构成，将上述的检测囊 型包虫病和泡型包虫病的免疫层析试条设置在一个所述的盒体中，所述的盒体的一个侧面上设置有一个加样孔和一个观察孔，所述的加样孔位于样品端吸水垫的上方，所述的观察孔位于所述的检测线和质控线的上方。 

本发明还提供了一种检测囊型包虫病和泡型包虫病的试剂，包括以下组分： 

1)囊型包虫病的纯化粗抗原； 

2)重组的泡型包虫病的抗原Em18，所述的重组的泡型包虫病的抗原Em18的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示； 

3)标记的抗人IgG的探针。 

进一步的，所述的囊型包虫病的抗原B按如下方法制备：取新鲜羊肝包囊液，离心后吸上清液入透析袋，用缓冲液于1-8℃下透析过夜，再离心后弃上清以除去白蛋白，沉淀用PBS缓冲液溶解，再加饱和硫酸铵，离心除去沉淀球蛋白，即得纯化的囊液粗抗原。 

进一步的，所述的重组的泡型包虫病的抗原Em18按如下方法制备：将感染泡型包虫病的羊肝多房棘球蚴原头节用试剂盒进行原头节总RNA的抽提，以反转录试剂盒进行反转录合成cDNA第一链，上游引物序列如SEQ ID NO：1所示，下游引物序列如SEQ ID NO：2所示，在上游引物中引入了BamHI位点，在下游引物中引入了EcoRI酶切位点，以合成cDNA第一链为模板，RT-PCR方法扩增目的基因片段。 

进一步的，所述的标记的抗人IgG的探针是利用人IgG免疫动物获得的多抗或单克隆抗体，或者金黄色葡萄球菌A蛋白或G群链球菌细胞表面蛋白。 

进一步的，所述的标记为酶标记、染料或者胶体金标记。 

进一步的，所述的标记的抗人IgG的探针是鼠抗人IgG的单克隆抗体。 

进一步的，所述的标记的抗人IgG的探针是金黄色葡萄球菌A蛋白。 

进一步的，所述的标记的抗人IgG的探针是G群链球菌细胞表面蛋白。 

能感染人类的棘球属绦虫的4种棘球绦虫的成虫和幼虫期形态不同，可引起不同类型的棘球蚴病。包虫病患者体内血液中含有能特异性结合所感染的棘球蚴抗原的抗棘球蚴抗体，检测受试者体内血液中是否含有抗棘球蚴抗体，可作用受试者是否患有包虫病的指标。 

本发明的检测包虫病以及病原体种属的免疫层析试条适用于从囊型包虫病或泡型包虫病患者体内抽取的全血样品和血清样品。对于全血样品，本发明的检测囊型包虫病和泡型包虫病以及病原体种属的免疫层析试条中的样品垫采用滤血膜样品垫；如果仅检测血清样品，本发明的检测囊型包虫病和泡型包虫病以及病原体种属的免疫层析试条中的样品垫可采用玻璃纤维或吸水纸样品垫。 

本发明将包虫抗原固定在纤维素膜等支持物上作为固相抗原，用以捕获受试者者血样中的抗棘球蚴抗原抗体。本发明将我国常见的纯化囊型包虫病的纯化粗抗原固定在纤维膜上形成第一检测线，该固相抗原可以捕获受试者血样中相应的抗纯化天然囊型包虫病粗抗原的抗体；将重组的泡型包虫病的抗原Em18固定在纤维膜上形成第二检测线，该固相抗原可以捕获受试者血样中相应的抗泡型包虫抗原EM18抗体，在检测线位置形成抗原抗体复合物沉淀。 

包虫病患者体内血液中含有的抗棘球蚴抗体的优势抗体类型为IgG抗体。胶体金标记探针采用抗人IgG抗体或金黄色葡萄球菌A蛋白或G群链球菌细胞表面蛋白制备，该抗人IgG抗体或金黄色葡萄球菌A蛋白或G群链球菌细胞表面蛋白可以是购买的商品化抗体，或按照常规方法自行制备。本发明的一个优选的方案中采用胶体金标记G群链 球菌细胞表面蛋白为检测探针，该胶体金标记抗体附着于金标垫上。检测过程中，复溶的胶体金标记抗体可与受试者血样中的人IgG抗体结合，从而当受试者血样中存在包虫病特异性抗体时在检测线位置形成色带。 

胶体金标记抗体不限于金黄色葡萄球菌A蛋白或G群链球菌细胞表面蛋白也可采用鼠抗人IgG的单抗或多抗，或者采用其他动物如兔抗人IgG抗体，同样能实现本发明的发明目的，这是本领域的一般技术人员都知晓的。 

本发明将与胶体金标记探针特异性结合的抗体或抗抗体固定在纤维素膜上作为质控线。在本发明一个优选的方案中，胶体金标记探针是G群链球菌细胞表面蛋白，相应的，质控线采用鸡抗SPG的IgY抗体。无论待检样品中是否含有抗棘球蚴抗体，本发明的检测囊型包虫病以及病原体种属的免疫层析试条中质控线位置总能形成色带，该条色带是判定检测过程是否正常和免疫层析试条是否变质的标准。 

质控线不限于鸡抗SPG的IgY抗体，只要能与选定的胶体金标记探针特异性结合，同样能实现本发明的发明目的，这是领域的一般技术人员都知晓的。 

本发明的检测原理是：测定时将样本血清或全血加在滤血膜样品垫上，1分钟后滴一滴(约50μL)样本稀释液，稀释液带动样品按样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫的方向移动，流经金标垫时使金标垫上的胶体金标记抗体复溶，并带动其向硝酸纤维素膜、吸水垫移动。胶体金标记探针可与样品中的抗体或抗体亚类结合，形成免疫复合物。此免疫复合物流至第二检测线时，若标本中有针对抗原EM18的抗体或抗体亚类(抗泡型包虫病抗原的抗体)，即被第二检测线的特异性固相抗原所捕获，在硝酸纤维素膜上的第二检测线位置显出红色检测线条；若标本中有针对纯化粗抗原的抗体或抗体亚类(抗囊型 包虫病抗原的抗体)，即被第一检测线的特异性固相抗原所捕获，第一检测线位置显出红色检测线条此免疫复合物流经质控线时，即被质控线的固相抗体所捕获，在硝酸纤维素膜上的质控线位置显出红色质控线条。阳性标本既显示检测线，又显示质控线；阴性标本没有检测线，仅显示质控线。如果质控线不显示，则表示试条失效。 

本发明的免疫层析试条具有以下优点：(1)敏感性及特异性高：实验室考核结果显示，本发明的免疫层析试条检测囊型包虫病患者血清的敏感性可达89.89％(囊型阳性例数/囊型总例数)，特异性为91％(非包虫病患者阴性例数/非包虫病患者总例数)，检测泡型包虫病患者血清的敏感性为94％(泡型阳性例数/泡型总例数)，特异性为100％(非包虫病患者阴性例数/非包虫病患者总例数)；(2)本发明的检测试条可以区别诊断囊型包虫病和泡型包虫病；(3)检测方法简单、快速：检测过程中标本处理简单，血清或全血都可以直接使用，无需处理，不需要专门仪器和人员培训，非专业技术人员按照说明书即可操作，并可迅速观察结果，标本中的抗体经10分钟左右的层析后，即可出现肉眼可见的检测线，从而为包虫病人的治疗争取了时间，很适合现场和基层使用；(4)制备方法简单，成本低廉，易于进行工业化生产。本发明将在包虫病的检测及其相关疾病的诊断和治疗中发挥重要作用，应用前景广阔。 

附图说明

图1是检测囊型包虫病和泡型包虫病的免疫层析试条的正面结构示意图。 

图2是检测囊型包虫病和泡型包虫病的免疫层析试条的纵截面结构示意图。 

其中： 

1为样品垫；2为金标垫；3为纤维素膜；4为吸水垫； 

5为第二检测线；6为第一检测线；7为质控线；8为背板。 

具体实施方式

以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所述百分含量如无特别说明均为质量/体积百分含量或体积/体积百分含量。 

实施例1 

本发明一种检测囊型包虫病和泡型包虫病的免疫层析试条，包括一个背板8，所述的背板8的上侧的一端设置有一个样品垫1，所述的背板8的上侧的另外一端设置有一个吸水垫4，在所述的样品垫1和吸水垫4之间设置有一个纤维素膜3，所述的吸水垫4和纤维素膜3紧密连接，在所述的样品垫1和所述的纤维素膜3之间设置有一个金标垫2，所述的样品垫1、金标垫2和纤维素膜3之间紧密连接，在所述纤维素膜3上远离金标垫2的一端设置质控线7，在所述的质控线7和金标垫2之间的纤维素膜3上设置第一检测线6和第二检测线5，所述的第一检测线6由囊型包虫病的纯化粗抗原组成，所述的第二检测线5由重组的泡型包虫病的抗原Em18组成，所述的金标垫2上设置有胶体金标记的探针，所述的胶体金标记的探针是以人IgG为抗原免疫动物获得的抗体或金黄色葡萄球菌A蛋白或G群链球菌细胞表面蛋白，所述的质控线7含有能与胶体金标记探针特异性结合的抗体或抗抗体。 

进一步的，所述的纤维素膜3的一端设置在所述的金标垫2的下侧，所述的金标垫2的一端设置在所述的样品垫1的下侧。 

进一步的，所述金标垫2中的胶体金标记探针是以人IgG作为抗原免疫小鼠获得的单克隆抗体，所述质控线7含有羊抗鼠抗抗体。 

进一步的，所述金标垫2中的胶体金标记探针可以为金黄色葡萄球菌A蛋白或G群链球菌细胞表面蛋白，所述质控线7含有抗金黄色葡萄球菌A蛋白抗体或抗G群链球菌细胞表面蛋白抗体。 

实施例2检测囊型包虫病和泡型包虫病的免疫层析试条的制备 

1、囊型包虫病的纯化粗抗原的制备 

取新疆源新鲜羊肝包囊液，以1000g离心30min，吸上清液入透析袋，用pH5.0的5mM乙酸缓冲液于4℃下透析过夜，50000g离心30min，弃上清以除去白蛋白。沉淀用pH8.0的0.2M PBS溶解，加饱和硫酸铵至40％，离心除去沉淀球蛋白，即得纯化囊液粗抗原。 

2、重组的泡型包虫病的抗原Em18按如下方法制备 

2.1目的基因的克隆、转化 

在新疆采集自然感染的羊肝多房棘球蚴原头节。用试剂盒(E.Z.N.A Kit I)进行原头节总RNA的抽提。以反转录试剂盒(PROMEGA)进行反转录合成cDNA第一链。根据文献设计引物，为便于定向克隆在引物中分别引入了BamHI(上游引物)和EcoRI(下游引物)酶切位点(斜体字母表示)。引物序列如下：Em18 F(5’-GC 

AAGGAGTCTGACTTAGCGGA-3’)和Em18 R(5’-GC 

GGCTTCACTTTCATCATCCTG-3’)，引物由上海生工公司合成。以合成cDNA第一链为模板，RT-PCR方法扩增目的基因片段，所述的重组的泡型包虫病的抗原Em18的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。采用HiFi DNA Amplification Kit(BBST)试剂盒，聚合酶为Pfu。扩增条件：反应在50ul.体系中进行，循环参数为94℃变性3min，94℃30s，50℃45s，72℃60s，共35个循环，72℃延伸10min。 扩增的产物用1％琼脂糖凝胶电泳检查。将酶切产物分别进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下将凝胶中的目的片段(～380bp)和pGEX-3X表达载体(～5000bp)切下，用Solarbio公司的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化，将目的基因和表达载体用T4连接酶连接，连接体系如下： 

连接反应条件：16℃下过夜连接 

取5μL连接产物转化E.coli DH5a细胞，具体方法为：将5μL的连接产物与200μL E.coli DH5a感受态细胞混匀，冰浴30分钟，之后于42℃水浴热休克90秒钟，再置于冰上1-2分钟，然后加入800μL预热的SOC培养基，37℃，200rpm震荡培养45分钟，取200μL菌液涂LB+Amp平板，倒置于37℃温箱过夜培养。 

在平板中挑取5-10个单菌落，分别置于5mLLB+Amp液体培养基中，37℃，200rpm过夜震荡培养，送生工生物技术有限公司测序检测连接是否成功，将连接成功的重组载体，用OMEGA公司的PlasmidMini Kit I抽提质粒，取1μL质粒照以上方法转化E.coli BL21(DE3)细胞。同时取1μL PGEX-3X空载体转化E.coli DH5a细胞。 

2.2重组蛋白的表达和纯化 

2.2.1.重组蛋白的小量表达 

分别取转化重组载体及含有PGEX-3X空载体的E.coli BL21(DE3)单菌落于3mLLB(含100μg/mL Amp)培养基，37℃，200rpm 振荡培养过夜，而后将1mL菌液加入到2mL新鲜LB(含100μg/mLAmp)培养基中，37℃，200rpm振荡培养2h，而后加入IPTG至终浓度为1mM，37℃，200rpm诱导表达3h。离心收集菌体，用PBS溶液洗两次，将两者同时进行10％SDS-PAGE电泳，观察重组蛋白是否表达。 

2.2.2.重组蛋白的大量表达 

取确定表达的E.coli BL21(DE3)单菌落于100mLLB(含100μg/mLAmp)培养基，37℃，200rpm振荡培养过夜，而后将100mL菌液加入到1000mL新鲜LB(含100μg/mL Amp)培养基中，37℃，200rpm振荡培养2h，而后加入加入IPTG至终浓度为1mM，28℃，200rpm诱导表达4h。离心收集菌体，用PBS溶液洗两次，而后在液氮和37℃水浴中反复冻融三次，加入20倍压积的PBS溶液，超声8次(每次30s，间隔1min)，而后加入4mL 20％TritonX-100溶液至终浓度为1％，冰上搅拌1h后，20000g离心30min，收集上清和沉淀，进行10％SDS-PAGE电泳，以检验蛋白的溶解性。 

2.2.3.重组蛋白的纯化 

由于该蛋白存在于上清中，故用GE Healthcare公司的Glutathione Sepharose 4B纯化柱纯化上清获得重组蛋白，具体操作方法按照纯化柱的说明书进行，获得重组蛋白的浓度为2.6mg/mL。 

3、G群链球菌细胞表面蛋白可以购买获得。 

4、制备免疫胶体金探针及金标垫 

用下述方法制备G群链球菌细胞表面蛋白标记的免疫胶体金探针及金标垫： 

1)采用柠檬酸盐还原法制备胶体金颗粒，具体方法为：将HAuCl₄(沪试牌购于上海国药集团化学试剂有限公司)配制成0.01％水溶液，取100mL加热至沸腾，搅动下准确加入1.6mL的1％的柠檬酸三 钠水溶液，待液体颜色稳定成葡萄酒红色，得到胶体金溶液。 

2)确定胶体金偶联探针饱和浓度 

用0.2M K₂CO₃调节步骤1)制备的胶体金溶液的pH值至6.0，准备5支洁净试管，分别加入1mL胶体金溶液。将步骤1)制备的经纯化的G群链球菌细胞表面蛋白稀释为1mg/mL，分别向4支试管中加入20μL、25μL、30μL、35μL，另一支为空白对照，混匀后于室温下放置5分钟，加入10％NaCl水溶液，混匀，静置10-20分钟后观察液体颜色。胶体金溶液颜色不变时所含最少量即为稳定1mL胶体金溶液所需蛋白的最适浓度，以此为基础增加20％蛋白量即为胶体金探针饱和溶液。结果：维持胶体金溶液颜色不变的蛋白量为20μL，即探针浓度为20μg/mL。 

3)G群链球菌细胞表面蛋白(SPG)标记的免疫胶体金探针及金标垫的制备 

取取50mL胶体金溶液，用0.2M K₂CO₃调节pH值为6.0，按25μg/mL加入已纯化的金黄色葡萄球菌A蛋白，得到含有浓度为25μg/mLG群链球菌细胞表面蛋白的免疫胶体金探针溶液50mL，搅拌1小时，再加入终浓度为0.05％PEG20000，搅拌1小时，10000rpm离心30分钟，弃上清，用20mM硼酸缓冲液洗涤沉淀，并将其保存于10mL含15％蔗糖的10mM HEPES缓冲液中，得到G群链球菌细胞表面蛋白标记的胶体金探针溶液。取5mL G群链球菌细胞表面蛋白标记的胶体金探针溶液均匀加在玻璃纤维膜上，相对湿度40％下干燥1小时，得到金标垫。 

4、检测囊型包虫病和泡型包虫病的免疫层析试条的制备 

该试条的制备方法包括以下步骤： 

1)NC膜的包被 

纯化天然AgB：用0.01M pH7.4PBS稀释实施例1制备的纯化粗抗原至终浓度为0.2mg/mL，用于包被第一检测线6； 

重组抗原EM18：用0.01M pH7.4PBS稀释实施例1制备的重组抗原EM18至终浓度为0.5mg/mL，用于包被第二检测线5； 

质控抗体鸡抗SPG IgY的包被：用0.01M pH7.4PBS稀释羊抗鼠IgG至终浓度为0.5mg/mL，用于包被质控线； 

BIODOT公司XZ1000喷膜机将分别喷于300mm长、25mm宽的硝酸纤维素膜(购自Sartorius公司)上，喷涂量为10μL/cm，形成上下两条检测线和一条质控线，相对湿度40％下，干燥2小时。 

2)检测囊型包虫病和泡型包虫病的免疫层析试条的制备 

用一块单面涂了不干胶的PVC背板8，中间粘贴上处理好的NC膜3；NC膜3靠近质控线7的一端紧密粘贴吸水垫4(购于MILLIPORE公司)；NC膜3远离质控线7的一端紧密粘贴金标垫2；金标垫2另一端紧密粘贴滤血膜样品垫1(购自WHATMAN公司)。得到检测囊型包虫病和泡型包虫病的免疫层析试条母板，可按所需大小进行切割，加干燥剂后密封保存。 

5、检测囊型包虫病和泡型包虫病的免疫层析试剂盒的制备 

为了方便使用，将上述制备的检测包虫病的免疫层析试条装入试剂盒体中，加干燥剂后密封保存。所述的盒体的一个侧面上设置有一个加样孔和一个观察孔，所述的加样孔位于样品端吸水垫的上方，所述的观察孔位于所述的检测线和质控线的上方。 

实施例3、检测囊型包虫病和泡型包虫病的免疫层析试剂盒免疫层析试条的制备 

用购买自上海业力生物科技有限公司的羊抗人IgG制备胶体金标记检测探针，用购买自捷宁生物公司的兔抗羊IgG包被质控线，其他步骤同实施例1。 

实施例4、检测囊型包虫病和泡型包虫病的免疫层析试条的实验 室考核 

1、检测方法 

于实施例2制备的免疫层析试条的滤血膜样品垫加入待测血清，1分钟后加入样本稀释液(PBS)1滴(约50μL)，5分钟后开始观察结果，15分钟观察终止。结果判定：如果检测线6和质控线7均出现红色条带，即判为囊型包虫病，如果检测线5和质控线7均出现红色条带，即判为泡型包虫病，如果仅有质控线7出现红色条带，即判为阴性，如果质控线没有红色条带，即试条失效。 

2、实验结果 

用本发明实施例2制备的检测囊型包虫病和泡型包虫病的免疫层析试条进行实验室考核结果如表2所示。上述检测结果表明本发明的免疫层析试条可用于囊型包虫病和泡型包虫病的快速检测。 

表2本发明检测囊型包虫病和泡型包虫病的免疫层析试条的实验室考核结果 

用本发明实施例2制备的检测囊型包虫病和泡型包虫病的免疫层析试条进行实验室考核，结果与表2所示结果没有统计学差异。 

本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只作为阐明本发明各个方面的单个例子，本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。 

Claims (3)

1.一种检测囊型包虫病和泡型包虫病的免疫层析试条，包括一个背板，其特征在于：所述的背板的上侧的一端设置有一个样品垫，背板的上侧的另外一端设置有一个吸水垫，在所述的样品垫和吸水垫之间设置有一个纤维素膜，吸水垫和所述的纤维素膜紧密连接，在样品垫和纤维素膜之间设置有一个金标垫，所述的样品垫、金标垫和纤维素膜之间紧密连接，在纤维素膜上靠近吸水垫的一端设置质控线，在所述的质控线和金标垫之间的纤维素膜上设置第一检测线和第二检测线，所述的第一检测线含有囊型包虫病的纯化囊液粗抗原，所述的第二检测线含有重组的泡型包虫病的抗原Em18，所述的金标垫上设置有胶体金标记的探针，所述的纤维素膜的一端设置在所述的金标垫的下侧，所述的金标垫的一端设置在所述的样品垫的下侧，所述的金标垫中的胶体金标记探针是以人IgG作为抗原免疫小鼠获得的单克隆抗体、或者金黄色葡萄球菌A蛋白、或者G群链球菌细胞表面蛋白，所述的质控线含有羊抗鼠抗抗体、或者含有抗金黄色葡萄球菌A蛋白抗体、或者含有抗G群链球菌细胞表面蛋白抗体，囊型包虫病的纯化粗抗原蛋白的浓度为0.1～10mg/mL，喷涂量为8～12μL/cm，重组的泡型包虫病的抗原Em18的蛋白浓度为0.1～10mg/mL，喷涂量为8～12μL/cm，胶体金标记探针的浓度以蛋白浓度计为 1～5mg/ 15～20mL，所述的羊抗鼠抗抗体溶液、或者抗金黄色葡萄球菌A蛋白抗体、或者抗G群链球菌细胞表面蛋白抗体溶液的浓度为0.1～5mg/mL，喷涂量为8～12μL/cm，所述的纤维素膜选自硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜，所述的支持胶体金标记探针的金标垫选自玻璃纤维膜或聚脂膜，所述样品垫选自滤血膜、玻璃纤维或吸水纸，所述吸水垫为吸水纸。

2.一种试剂盒，由一个盒体构成，其特征在于：将权利要求1所述的检测囊型包虫病和泡型包虫病的免疫层析试条设置在所述的盒体中，所述的盒体的一个侧面上设置有一个加样孔和一个观察孔，所述的加样孔位于样品垫的上方，所述的观察孔位于所述的检测线和质控线的上方。

3.一种检测囊型包虫病和泡型包虫病的试剂，其特征在于包括以下组分：

1）囊型包虫病的纯化粗抗原，所述的囊型包虫病的纯化粗抗原按如下方法制备：取新鲜羊肝包囊液，离心后吸上清液入透析袋,用缓冲液于1-8℃下透析过夜,再离心后弃上清以除去白蛋白，沉淀用PBS缓冲液溶解，再加饱和硫酸铵，离心除去沉淀球蛋白，即得纯化的囊液粗抗原；

2）重组的泡型包虫病的抗原Em18，所述的重组的泡型包虫病的抗原Em18的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示,所述的重组的泡型包虫病的抗原Em18按如下方法制备：将感染泡型包虫病的羊肝多房棘球蚴原头节用试剂盒进行原头节总RNA的抽提，以反转录试剂盒进行反转录合成cDNA第一链，上游引物序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物序列如SEQ ID NO:2所示，在上游引物中引入了BamHI位点，在下游引物中引入了EcoRI酶切位点，以合成cDNA第一链为模板，RT-PCR方法扩增目的基因片段；

3）标记的抗人IgG的探针，所述的标记的抗人IgG的探针是鼠抗人IgG的单克隆抗体。

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