CN109762070B

CN109762070B - 用于检测包虫病的融合抗原、其编码基因、宿主细胞和试剂盒

Info

Publication number: CN109762070B
Application number: CN201910068027.7A
Authority: CN
Inventors: 张雪飞; 王虎; 马俊英; 高琦; 刘佳; 郄霜; 蔡辉霞; 刘培运; 王威; 雷雯
Original assignee: Beijing Hotgen Biotech Co ltd; QINGHAI INSTITUTE FOR ENDEMIC DISEASE PREVENTION AND CONTROL
Current assignee: Beijing Hotgen Biotech Co ltd; QINGHAI INSTITUTE FOR ENDEMIC DISEASE PREVENTION AND CONTROL
Priority date: 2019-01-24
Filing date: 2019-01-24
Publication date: 2020-08-11
Anticipated expiration: 2039-01-24
Also published as: CN109762070A

Abstract

本发明公开用于检测包虫病的融合抗原、其编码基因、宿主细胞和试剂盒。其中，用于检测包虫病的融合抗原包括囊型包虫抗原部分A、泡型包虫抗原部分B以及位于所述抗原部分A和所述抗原部分B之间的间隔序列，所述抗原部分A包括多表位且位于所述融合抗原的N端，所述抗原部分B为单表位，且位于所述融合抗原的C端，所述间隔序列将所述抗原部分A和所述抗原部分B化学连接，从而实现融合。本发明的融合抗原具有更高的灵敏性和特异性。

Description

用于检测包虫病的融合抗原、其编码基因、宿主细胞和试剂盒

技术领域

本发明涉及包虫病的检测，具体涉及用于检测包虫病的融合抗原、其编码基因、宿主细胞和试剂盒。

背景技术

包虫病(hydatidosis,hydatid disease)是棘球绦虫的幼虫感染引起的一种人畜共患的寄生虫病。细粒棘球坳的终末宿主是狗、狼、狐等，羊、鼠、马等为中间宿主，成熟的棘球蚴在终末宿主小肠里产卵，并随粪便排出，被中间宿主吞吃后，经消化液作用，幼虫脱壳而出成六钩蚴，这些动物被终末宿主吞吃后完成棘球蚴的生命周期。

囊型包虫在体内主要分布在肝脏中，占75％-78％，在肺中占8.5％-14.5％，其它如脑、脾、肾、骨骼与女性盆腔器官较少见。视其体积的大小、寄生部位和数量多少，可出现不同程度的脏器压迫或阻塞，囊液外溢被人体大量吸收，可引起休克。

泡型包虫多寄生于肝、肺、脑等脏器，其发病率远低于囊性包虫病，但泡状棘球蚴如同肿瘤呈浸润性、外生性生长，常向远处器官转移，所以有“虫癌”之称。在没有治疗的情况下，这种疾病是致命的，10年死亡率可达94％以上。

目前包虫病的诊断常用方法：B超、X射线、放射性核素肝扫描、免疫学方法等。其中，B超、X射线、CT、放射性核素肝扫描方法等费用昂贵、操作复杂，且受到感染部位的限制；而免疫学方法以其费用低、操作简便、特异性高而作为辅助诊断手段，成为目前包虫病诊断中的重要血清学检测方法。

目前使用的免疫学诊断试剂主要以ELISA、斑点杂交等为主，操作较复杂，灵敏度和特异性均较低，且检测时间较长。其中免疫学诊断指标主要为抗原5(Ag5)，其为棘球蚴囊液和原头蚴的主要抗原成分，Ag5是一种大小为67ku的热稳定脂蛋白，含24ku和38ku两个亚基，而这两个亚基可能都来自8ku的单体，进行Ag5表位重组表达，选取大小为38KD。14-3-3蛋白由细粒棘球绦虫成虫的顶突腺产生和分泌的，可作为囊型包虫病的检测指标。

另外，现有技术中还公开了多种包虫病的诊断技术。例如，CN2395277Y公开了一种组合抗原包虫病快速诊断反应板，其包括上盖和底座，在上盖上有检测孔，上盖的检测孔与底座之间有纤维薄膜，纤维薄膜上包被有四种抗原，第一种抗原为部分纯化细粒棘球蚴囊液抗原，第二种抗原为部分纯化细粒棘球蚴头节抗原，第三种抗原为纯化囊液抗原，第四种抗原为纯化的泡状棘球蚴抗原。

再例如，CN102539782A公开了一种检测囊型包虫病和泡型包虫病的免疫层析试条，其包括一个背板，背板的上侧的一端设置有一个样品垫，另外一端设置有一个吸水垫，在样品垫和吸水垫之间设置有一个纤维素膜，在样品垫和纤维素膜之间设置有一个金标垫，在所述纤维素膜上设置第一检测线、第二检测线、质控线，第一检测线含有针对囊型包虫病的纯化粗抗原，第二检测线含有针对泡型包虫病的重组抗原，质控线含有能与胶体金标记探针特异性结合的抗体或抗抗体。

还例如，CN106397610A公开了一种诊断细粒棘球蚴病的多表位融合抗原蛋白及其制备方法和应用，其将抗原表位按照一定顺序串联，构建含有多表位融合抗原基因Eg-meAg1，并在大肠杆菌中表达，得到具有诊断价值的强反应原性的重组抗原蛋白Eg-meAg1。

综上所述，虽然用于检测包虫病抗原类型很多，但是在检测时一般使用单一抗原，或者多种不同抗原的组合，其检测的特异性和灵敏度提高程度受到一定限制。

发明内容

针对现有技术中存在的至少部分技术问题，本发明提供高灵敏性和特异性的包虫病的检测方案。具体地，本发明包括以下内容。

本发明的第一方面，提供一种用于检测包虫病的融合抗原，包括囊型包虫抗原部分A、泡型包虫抗原部分B以及位于所述抗原部分A和所述抗原部分B之间的间隔序列，所述抗原部分A包括多表位且位于所述融合抗原的N端，所述抗原部分B为单表位，且位于所述融合抗原的C端，所述间隔序列将所述抗原部分A和所述抗原部分B化学连接，从而实现融合。

优选地，所述抗原部分A包括来自原头节的表位和来自囊液的表位。

优选地，所述来自囊液的表位的序列如SEQ ID NO:1所示，所述来自原头节的表位的序列如SEQ ID NO:2所示。

优选地，所述抗原部分B的序列如SEQ ID NO:3所示。

优选地，所述间隔序列如SEQ ID NO:4所示。

优选地，用于检测包虫病的融合抗原的序列如SEQ ID NO:5所示。

本发明的第二方面，提供一种编码用于检测包虫病的融合抗原的基因，其序列如SEQ ID NO:6所示。

本发明的第三方面，提供一种用于生产用于检测包虫病的融合抗原的宿主细胞，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.16711。

本发明的第四方面，提供一种用于检测包虫病的试剂条，其包括样品垫、试剂垫、分析膜、吸水垫和粘性低衬。其中，所述样品垫、所述试剂垫、所述分析膜和所述吸水垫在所述粘性低衬依次排列，其中所述样品垫和所述试剂垫部分重叠，所述试剂垫和所述分析膜部分重叠，所述分析膜和所述吸水垫部分重叠，所述分析膜设置有检测区和质控区；

其中，所述试剂垫含有能够自由移动的UCP颗粒标记抗原，所述检测区固定有包被抗原，所述质控区固定有抗包虫抗体，所述UCP颗粒标记抗原以及所述包被抗原各自为本发明的融合抗原。优选地，所述分析膜为硝酸纤维素膜。

本发明通过将多种不同抗原进行融合，同时通过结构设计避免不同抗原之间的影响，使不同抗原之间协同作用，提高了不同类型包虫病检测的灵敏性和特异性。

附图说明

图1是SDS-PAGE鉴定小量试表达后的表达图。其中1是指4种抗原的联合，2是指超声离心后上清，3是指超声离心后沉淀，M表示marker。

图2是SDS-PAGE鉴定大量表达的图。其中，流穿为上样时流穿Ni柱穿过缓冲液；平衡为使用裂解缓冲液组分的Buffer进行平衡柱子的穿过Buffer；50-1、50-2分别为洗杂缓冲液洗的第一管、第二管；400-6、400-7、400-13、400-14、400-15为洗脱缓冲液洗的第6管、第7管、第13管、第14管、第15管；最终选取的为13-15管洗脱液进行合并。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。除非另有说明，否则“％”为基于重量的百分数。

[融合抗原]

本发明的第一方面提供一种用于检测包虫病的融合抗原。本发明的融合抗原包括囊型包虫和泡型包虫两种不同的抗原作为其部分。具体地，本发明的融合抗原包括囊型包虫抗原部分A、泡型包虫抗原部分B以及位于所述抗原部分A和所述抗原部分B之间的间隔序列，所述抗原部分A包括多表位且位于所述融合抗原的N端，所述抗原部分B为单表位，且位于所述融合抗原的C端，所述间隔序列将所述抗原部分A和所述抗原部分B化学连接。即，抗原部分A和抗原部分B通过间隔序列而融合为一种抗原分子。优选地，融合抗原的序列如SEQID NO:5所示。

抗原部分A

抗原部分A是囊型包虫特异的抗原部分。在某些实施方案中，本发明的抗原部分A包括来自原头节的表位和来自囊液的表位。优选地，来自囊液的表位位于抗原部分A的N端，来自原头节的表位位于抗原部分A的C端。本发明的来自原头节的表位是指在原头蚴的粗提取物中分离得到的水溶性蛋白的多肽片段。本发明的来自囊液的表位是指从棘球蚴的囊液分离的脂蛋白的多肽片段。囊液中包含糖蛋白、脂蛋白、碳水化合物等多种物质。通常，原头节抗原与感染了其他绦虫和线虫的狗的血清有交叉反应。囊液粗抗原的敏感性在75％-95％之间，但是特异性不是很高，常与其他绦虫(89％)、线虫(39％)和吸虫(30％)有交叉反应(参见，安晓雪等，细粒棘球蚴病诊断抗原研究进展)。本发明通过选择其中特定的脂蛋白的片段，并将其与原头蚴的粗提取物中分离得到的水溶性蛋白的多肽片段结合，由此得到抗原部分A，其不仅保持甚至提高了敏感性，更为重要的是大大提高了特异性，可达95％以上。

在某些实施方案中，来自囊液的表位优选具有SEQ ID NO:1所示的序列。来自原头节的表位优选具有SEQ ID NO:2所示的序列。

抗原部分B

抗原部分B是指特异性检测泡型棘球蚴病的抗原指标。在某些实施方案中，抗原部分B使用分子量为18KD的人工合成Em18抗原。此类抗原具有优异的种特异性，但是敏感性较低(参见，林仁勇等，EM18.3重组蛋白的表达及其免疫诊断特性的研究)。更优选地，本发明的抗原部分B具有SEQ ID NO:3所示的序列。本发明发现通过使用具有SEQ ID NO:3所示序列的抗原部分B可以高灵敏度和特异性检测泡型棘球蚴病。例如，敏感性可达90％以上，特异性可达93％以上。

间隔序列

本发明的间隔序列用于使抗原部分A和抗原部分B在空间上保持相对独立，避免可能的不利的相互影响。间隔序列一般为柔性分子，由此使两个抗原部分在空间上不会影响彼此的功能。优选地，间隔序列为多个氨基酸残基组成的短序列。例如2-80个、优选5-20个氨基酸残基组成的短序列。通常使用亮氨酸-甘氨酸、甘氨酸-丙氨酸或丝氨酸-丙氨酸，或由甘氨酸和/或丙氨酸组成的长度为4-6个氨基酸的短氨基酸序列。更优选地，间隔序列如SEQ ID NO:4所示。

[编码融合抗原的基因]

本发明的第二方面，提供一种编码用于检测包虫病的融合抗原的基因。只要能够编码本发明的融合抗原，则该基因的具体序列不特别限定，并且可根据需要而进行调整。例如，可根据宿主细胞的类型而选择使用偏好性密码子对基因进行改造得到的基因。在某些实施方案中，本发明的编码基因的序列如SEQ ID NO:6所示。

[宿主细胞]

本发明的第三方面，提供一种宿主细胞，其用于生产本发明的用于检测包虫病的融合抗原。优选地，本发明的宿主细胞包含本发明第二方面所述的基因，并能够进行基因的翻译。还优选地，本发明的宿主细胞通过例如转录等能够产生本发明第二方面的基因，并进行基因翻译。

宿主细胞的类型不特别限定，例如可以动物细胞和微生物细胞等。微生物细胞的实例包括但不限于细菌、真菌、病毒等。优选细菌。例如，大肠杆菌等。本发明通过基因操作技术得到了一株可高效、大量产生融合抗原的大肠杆菌，并于2018年11月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC No.16711。因此，本发明的宿主细胞优选保藏号为CGMCC No.16711的菌株。

[用于检测包虫病的试剂条]

本发明的第四方面，提供一种用于检测包虫病的试剂条。本发明的试剂条采用上转发光(UCP)双抗原夹心免疫层析原理而设计。用于检测定性检测人血清、全血及末梢血。

本发明的试剂条包括样品垫、试剂垫、分析膜、吸水垫和粘性低衬。样品垫、试剂垫、分析膜和吸水垫在所述粘性低衬依次排列，其中样品垫和试剂垫部分重叠，试剂垫和所述分析膜部分重叠，分析膜和吸水垫部分重叠，分析膜设置有检测区和质控区。

本发明中，试剂垫含有能够自由移动的UCP颗粒标记抗原，检测区固定有包被抗原，质控区固定有抗包虫抗体，UCP颗粒标记抗原以及包被抗原各自为本发明的融合抗原。优选地，分析膜为硝酸纤维素膜(NC膜)。

测试时，将样本加入检测卡加样处上，液体在毛细管效应下进行层析，样本中的待检物在层析过程中先与UCP颗粒上的标记抗原结合，然后继续层析，随后结合物会被包被在T线上的抗原结合，在T线位置会形成固相UCP颗粒-包虫病标记抗原-包虫病抗体-包虫病包被抗原复合物，在C线则形成固相抗包虫抗体-标记抗原-UCP复合物。最后，通过对上转发光颗粒的发射光信号进行检测得到检测结果。

实施例1

本实施例为融合抗原的制备例。

1.合成得到融合抗原的基因，其序列如SEQ ID NO:6所示。利用下述反应体系扩增反应：

50ul体系

其中:

引物1的序列为：CGCGGATCCATGAAAGATGAGCCAAAAGCA，其包含BamHI酶切位点；

引物2的序列为：CCCTCGAGTTATTTGAGGTTGGCCAGCT，其包含XhoI酶切位点。

PCR扩增条件为：

反应过程35个循环：

94℃：7min

94℃：30s

60℃：30s

72℃：2min

72℃：10min

4℃：for eve。

2.双酶切鉴定

双酶切鉴定的反应体系和条件如下：

体系40ul：

37℃反应两小时。

3.质粒甘油菌活化：

条件为pET30a，K+37℃、200rpm、5ml LB培养基、过夜培养、甘油菌/LB＝1/1000。

4.质粒双酶切：

体系40ul：

在37℃下反应两小时。

5.质粒-基因连接：

连接条件：

Gene：8ul

Vector：4ul

T4酶：1ul 25℃，10min

10*buffer：1.5ul

纯化水：0.5ul

6.转化：

(1)DH5α感受态细胞冰浴融化

(2)15ul连接产物加入到DH5α感受态细胞中混匀、冰浴30min。

(3)42℃热激90s，后冰浴3min

(4)在超净工作台中，200ul LB培养基，37℃，200rpm。

(5)涂固体培养基平板并标记信息

(6)37℃烘箱培养过夜。

7.鉴定连接正确性：

挑点：每个克隆挑取8个点，扩增5ml。37℃，200rpm，5h。

菌液PCR鉴定：

94℃：7min

94℃：30s

60℃：30s 35个循环

72℃：2min

72℃：10min

4℃：foreve

琼脂糖凝胶电泳鉴定。

8.质粒提取：

质粒菌液收集，按说明书进行质粒抽提，琼脂糖凝胶电泳鉴定。

9.转化：

BL21(DE3)感受态细胞冰浴融化

15ul连接产物加入到BL21(DE3)感受态细胞中混匀、冰浴30min。

42℃热激90s，后冰浴3min

在超净工作台中，200ul LB培养基，37℃，200rpm。

涂固体培养基平板并标记信息

37℃烘箱培养过夜。

10.小量试表达：

挑点，每个平板2个单克隆菌点，5ml，37℃，200rpm，6h。

保菌400ul 50％甘油+800ul菌液，并做好标记。-20℃暂存。

诱导表达，37℃，200rpm，4h，1mM IPTG。

收菌，12000rpm，1min。

悬菌，裂解缓冲液：150mM NaCl；30mM Tris-HCl pH7.5；800ul体积悬菌。

破碎，200Hz，1min，冰浴，并做样40ul+10ul Loading buffer，标记“全”。

离心，12000rpm，1min，并做样40ul+10ul Loading buffer，标记“上”。

4联抗原大小59.3Kda，pET32a-4联有目的条带出现，有表达SDS-PAGE鉴定小量表达。

11.大量表达纯化

甘油菌活化，20ml，37℃，200rpm，过夜。

扩大培养，37℃，200rpm，4h，500ml。

诱导表达，37℃，200rpm，4h，0.2mM IPTG。

收菌，12000rpm，1min。

悬菌，裂解缓冲液：150mM NaCl；30mM Tris-HCl pH7.5；20ml体积悬菌。

上样，穿过做样。

洗杂：150mM NaCl；30mM Tris-HCl pH7.5；30mM咪唑。50ml体积。做样。

洗脱：150mM NaCl；30mM Tris-HCl pH7.5；250mM咪唑。50ml体积。做样。

处理柱子。洗脱Ni、-20℃保存。

12.纯化条件：

抗原纯化

试剂：裂解缓冲液(500mM NaCl，30mM Tris pH8.0)，洗杂缓冲液(500mM NaCl，30mM Tris pH8.0，50mM咪唑)，洗脱缓冲液(500mM NaCl，30mM Tris pH8.0，400mM咪唑)

过程：

(1)用0.45μm滤器分别过滤破碎上清液、裂解缓冲液、洗脱缓冲液。

(2)上样：将破碎上清液缓慢加入处理好的Ni-NTA抗原纯化柱中，流穿完全。

(3)洗杂：用50ml洗杂缓冲液平衡填料，流穿完全。

(4)洗脱：用洗脱缓冲液洗脱目的抗原。

透析

试剂：裂解缓冲液。

仪器设备：磁力搅拌器；展示柜。

过程：

(1)MD25透析袋浸润在裂解缓冲液中2min。

(2)转移原至透析袋中，用透析夹封闭透析袋。

(3)将含有抗原的透析袋放入2L裂解缓冲液中。

(4)在展示柜中，磁力搅拌器搅拌透析，600rpm、2-8℃、16h。

(5)透析完毕后，收集目的抗原至15ml离心管中，2-8℃暂存。

抗原浓度测定

试剂：1×考马斯亮蓝染色液；0.5mg/ml BSA标准品；裂解缓冲液。

仪器设备：紫外分光光度计。

过程：

(1)将0.5mg/ml的BSA标准品用裂解缓冲液分别稀释至0.4mg/ml、0.3mg/ml、0.2mg/ml、0.1mg/ml，每种浓度BSA标准品体积150μl。

(2)分别取0.5mg/ml、0.4mg/ml、0.3mg/ml、0.2mg/ml、0.1mg/ml 100μl加入至900μl 1×考马斯亮蓝显色液中，混匀。室温静置10min。

(3)抗原溶液用裂解缓冲液稀释10倍，稀释后抗原溶液体积为150μl，取稀释后的抗原溶液100μl加入900μl 1×考马斯亮蓝染色液中，混匀。室温静置10min。

(4)紫外分光光度计分别检测6个样品OD595值，并记录测量值。

(5)用excel软件制作LCA标准品浓度曲线，将目的抗原测定值带入，计算出抗原浓度。

实施例2

本实施例为试剂条的制备及使用例。具体地，在检测卡的NC膜上检测区(T线)用实施例1的包虫病抗原包被，质控区(C线)用抗包虫抗体包被。

(1)包被：将实施例1的融合抗原稀释到0.2mg/ml，作为T线包被液，将抗包虫抗体稀释到2mg/ml，作为C线包被液。通过喷膜机，将T线包被液和C线包被液包被到硝酸纤维素膜上。晾干。

(2)UCP标记抗原：本试剂盒中的UCP标记抗原通过以下步骤获得：

a)称取10mg UCP颗粒置于锥形瓶中；

b)加入10ml pH＝7.2 0.20M PB；

c)UCP颗粒悬浊液中加入0.5mg实施例1的抗原，再加入无水戊二醛至终浓度1％，37℃搅拌过夜；

d)12000rpm，4℃，离心15min，弃上清；

e)UCP沉淀物中加入10ml pH＝7.2 0.20M PB，吹打混匀；

f)12000rpm，4℃，离心15min，弃上清；

g)UCP沉淀物收集待用；

(3)冻干结合垫的制备：

a)将50ml UCP标记物悬浊液，12000rpm，4℃，离心30min，弃上清；

b)加入45ml的冻干液(pH＝7.2 0.20M PB，含2％BSA，3％蔗糖)；

d)将UCP标记物悬浊液按5cm2/ml加于玻璃纤维上；

e)真空冻干11h；

(4)裁剪结合垫；将冻干的结合垫裁剪成1cm宽的长条。

(5)组装试纸条；依次将分析膜、吸水垫、试剂垫和样品垫贴到粘性低衬上，粘贴方式为样品垫、试剂垫、分析膜和吸水垫均在粘性低衬依次排列，其中样品垫和试剂垫部分重叠，试剂垫和分析膜部分重叠，分析膜和吸水垫部分重叠，然后切成4.0mm宽的纸条，即为定量检测试剂条。

(6)装塑料卡；将4.0mm宽的试纸条装到塑料卡底壳中，盖上塑料卡上壳，压紧，即为定量检测试剂，将定量检测试剂装入铝箔袋，并加入干燥剂密封保存。

(7)样本稀释液配制；样本稀释液成分为pH＝4.5的0.05M柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液，1％Tween 20。

实施例3

本实施例为试剂条的应用例。测试时，将样本加入检测卡加样处上，液体在毛细管效应下进行层析，样本中的待检物在层析过程中先与UCP颗粒上的标记抗原结合，然后继续层析，随后结合物会被包被在T线上的抗原结合，在T线位置会形成固相UCP颗粒-包虫病标记抗原-包虫病抗体-包虫病包被抗原复合物，在C线则形成固相抗包虫抗体-标记抗原-UCP复合物。最后，通过对上转发光颗粒的发射光信号进行检测得到检测结果。

表1-包虫病血清抗体检测结果

包虫病血清抗体检测试剂与市售试剂进行比较检测：

综合评价108例包虫病阳性样本(ELISA)以及162例正常人血清样本，结果如表2所示。

表2

检测方法	阳性样本(例)	阴性样本(例)	特异性(％)	灵敏度(％)
					本发明方法	108	162	95.06	91.67
ELISA	108	162	94.70	76.87

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

SEQUENCE LISTING

<110> 青海省地方病预防控制所

北京热景生物技术股份有限公司

<120> 用于检测包虫病的融合抗原、其编码基因、宿主细胞和试剂盒

<130> BHBP180175

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 70

<212> PRT

<213> 棘球绦虫

<400> 1

Lys Asp Glu Pro Lys Ala His Met Gly Gln Val Val Lys Lys Arg Trp

1 5 10 15

Gly Glu Leu Arg Asp Phe Phe Arg Asn Asp Pro Leu Gly Gln Arg Leu

20 25 30

Val Ala Leu Gly Asn Asp Leu Thr Ala Ile Cys Gln Lys Leu Gln Leu

35 40 45

Lys Ile Arg Glu Val Leu Lys Lys Tyr Val Lys Asn Leu Val Glu Glu

50 55 60

Lys Asp Asp Asp Ser Lys

65 70

<210> 2

<211> 284

<212> PRT

<213> 棘球绦虫

<400> 2

Met Ala Ala Val Val Gly Lys Leu Ala Pro Ser Phe Thr Cys Lys Ala

1 5 10 15

Leu Val Asp Gly Glu Leu Lys Asp Val Ser Leu Ser Asp Tyr Arg Gly

20 25 30

Lys Tyr Val Ile Leu Phe Phe Tyr Pro Met Asp Phe Thr Phe Val Cys

35 40 45

Pro Thr Glu Ile Ile Ala Phe Asn Asp Arg Ala Asp Glu Phe His Gln

50 55 60

Arg Gly Cys Gln Leu Leu Ala Cys Ser Thr Asp Ser Gly Tyr Cys His

65 70 75 80

Leu Ala Trp Asn Asn Val Ser Arg Lys Glu Gly Gly Val Gln Gly Met

85 90 95

Arg Ile Pro Met Leu Ala Asp Thr Asn His Lys Ile Ser Arg Asp Tyr

100 105 110

Gly Val Leu Ile Glu Asp Gln Gly Ile Ala Leu Arg Gly Leu Phe Ile

115 120 125

Ile Asp Asp Lys Gly Val Leu Arg Gln Ile Thr Ile Asn Asp Leu Pro

130 135 140

Val Gly Arg Ser Val Asp Glu Ala Leu Arg Leu Leu Asp Ala Phe Gln

145 150 155 160

Phe Thr Asp Lys His Gly Glu Val Cys Pro Ala Asn Trp Gln Pro Gly

165 170 175

Ser Lys Thr Phe Lys Pro Ser Ala Gly Asp Leu Lys Ser Phe Met Ser

180 185 190

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

195 200 205

Cys Val Cys Arg Ser Cys Arg Thr Met Ser Leu Gln Lys Thr Val Glu

210 215 220

Lys Leu Phe Asp Glu Leu Asp Lys Asp Lys Ser Gly Lys Ile Ser Cys

225 230 235 240

Ala Glu Leu Lys Ser Ala Leu Gln Ser Cys Ser Ala Glu Pro Leu Asp

245 250 255

Asp Asp His Val Lys Ala Phe Leu Asp Lys Leu Asp Ser Asn Lys Asp

260 265 270

Gly Glu Leu Ser Leu Asp Glu Leu Met Ala Leu Phe

275 280

<210> 3

<211> 160

<212> PRT

<213> 棘球绦虫

<400> 3

Lys Glu Ser Asp Leu Ala Asp Met Lys Asn Lys Ala Ser Ala Tyr Glu

1 5 10 15

Ser Lys Ile Ala Glu Leu Glu Met Leu Leu Gln Gln Glu Arg His Ala

20 25 30

Arg Glu Ser Leu Gln Lys Ser Gln Asp Lys Leu Ala Glu Met Asn Arg

35 40 45

Lys Leu Lys Glu Glu Thr Ala Ala Ser Ala Glu Glu Arg Asp Arg Leu

50 55 60

Met Ala Gln Arg Asp Glu Val Gln Arg Glu Val Glu Ala Gln Lys Val

65 70 75 80

Ala Met Ala Lys Lys Glu Ala Glu Lys Ala Gln Ala Glu Ala Glu Leu

85 90 95

Arg Arg Met Arg Glu Lys His Asp Ala Lys His Lys Ser Gln Val Asn

100 105 110

Gly Ser Gly Asp Ala Ala Ser Gln Asp Asp Glu Ser Glu Ala Lys Glu

115 120 125

Leu Glu Val Ile Pro Asn Val Arg Arg Thr Glu Glu Ser Arg Val Thr

130 135 140

Ala Val Ser Lys Asn Glu Thr Leu Gln Thr Lys Leu Ala Asn Leu Lys

145 150 155 160

<210> 4

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 5

<211> 544

<212> PRT

<213> 棘球绦虫

<400> 5

Lys Asp Glu Pro Lys Ala His Met Gly Gln Val Val Lys Lys Arg Trp

1 5 10 15

Gly Glu Leu Arg Asp Phe Phe Arg Asn Asp Pro Leu Gly Gln Arg Leu

20 25 30

Val Ala Leu Gly Asn Asp Leu Thr Ala Ile Cys Gln Lys Leu Gln Leu

35 40 45

Lys Ile Arg Glu Val Leu Lys Lys Tyr Val Lys Asn Leu Val Glu Glu

50 55 60

Lys Asp Asp Asp Ser Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

65 70 75 80

Gly Gly Gly Gly Ser Met Ala Ala Val Val Gly Lys Leu Ala Pro Ser

85 90 95

Phe Thr Cys Lys Ala Leu Val Asp Gly Glu Leu Lys Asp Val Ser Leu

100 105 110

Ser Asp Tyr Arg Gly Lys Tyr Val Ile Leu Phe Phe Tyr Pro Met Asp

115 120 125

Phe Thr Phe Val Cys Pro Thr Glu Ile Ile Ala Phe Asn Asp Arg Ala

130 135 140

Asp Glu Phe His Gln Arg Gly Cys Gln Leu Leu Ala Cys Ser Thr Asp

145 150 155 160

Ser Gly Tyr Cys His Leu Ala Trp Asn Asn Val Ser Arg Lys Glu Gly

165 170 175

Gly Val Gln Gly Met Arg Ile Pro Met Leu Ala Asp Thr Asn His Lys

180 185 190

Ile Ser Arg Asp Tyr Gly Val Leu Ile Glu Asp Gln Gly Ile Ala Leu

195 200 205

Arg Gly Leu Phe Ile Ile Asp Asp Lys Gly Val Leu Arg Gln Ile Thr

210 215 220

Ile Asn Asp Leu Pro Val Gly Arg Ser Val Asp Glu Ala Leu Arg Leu

225 230 235 240

Leu Asp Ala Phe Gln Phe Thr Asp Lys His Gly Glu Val Cys Pro Ala

245 250 255

Asn Trp Gln Pro Gly Ser Lys Thr Phe Lys Pro Ser Ala Gly Asp Leu

260 265 270

Lys Ser Phe Met Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

275 280 285

Gly Gly Gly Gly Ser Cys Val Cys Arg Ser Cys Arg Thr Met Ser Leu

290 295 300

Gln Lys Thr Val Glu Lys Leu Phe Asp Glu Leu Asp Lys Asp Lys Ser

305 310 315 320

Gly Lys Ile Ser Cys Ala Glu Leu Lys Ser Ala Leu Gln Ser Cys Ser

325 330 335

Ala Glu Pro Leu Asp Asp Asp His Val Lys Ala Phe Leu Asp Lys Leu

340 345 350

Asp Ser Asn Lys Asp Gly Glu Leu Ser Leu Asp Glu Leu Met Ala Leu

355 360 365

Phe Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

370 375 380

Lys Glu Ser Asp Leu Ala Asp Met Lys Asn Lys Ala Ser Ala Tyr Glu

385 390 395 400

Ser Lys Ile Ala Glu Leu Glu Met Leu Leu Gln Gln Glu Arg His Ala

405 410 415

Arg Glu Ser Leu Gln Lys Ser Gln Asp Lys Leu Ala Glu Met Asn Arg

420 425 430

Lys Leu Lys Glu Glu Thr Ala Ala Ser Ala Glu Glu Arg Asp Arg Leu

435 440 445

Met Ala Gln Arg Asp Glu Val Gln Arg Glu Val Glu Ala Gln Lys Val

450 455 460

Ala Met Ala Lys Lys Glu Ala Glu Lys Ala Gln Ala Glu Ala Glu Leu

465 470 475 480

Arg Arg Met Arg Glu Lys His Asp Ala Lys His Lys Ser Gln Val Asn

485 490 495

Gly Ser Gly Asp Ala Ala Ser Gln Asp Asp Glu Ser Glu Ala Lys Glu

500 505 510

Leu Glu Val Ile Pro Asn Val Arg Arg Thr Glu Glu Ser Arg Val Thr

515 520 525

Ala Val Ser Lys Asn Glu Thr Leu Gln Thr Lys Leu Ala Asn Leu Lys

530 535 540

<210> 6

<211> 1650

<212> DNA

<213> 棘球绦虫

<400> 6

ggatccatga aagatgagcc aaaagcacac atggggcaag tggtaaaaaa aagatggggt 60

gaacttcgag acttctttag aaatgatcca ctgggtcaaa gacttgtcgc tcttggcaat 120

gacctaactg ccatttgcca gaagctgcaa ttgaagattc gtgaggtgct gaagaagtat 180

gttaagaatt tggtggaaga aaaagatgat gattcaaagg gtggtggtgg ttctggcggt 240

ggtggttcag gcggcggcgg cagtatggct gctgttgttg gaaagctcgc gccaagtttc 300

acgtgcaagg ctcttgtcga cggtgaactc aaggatgttt ctttgtcgga ctaccgaggg 360

aaatatgtga ttctcttctt ctatccgatg gatttcacct tcgtctgtcc cactgagata 420

atcgctttta acgaccgtgc tgatgagttt catcagcgtg ggtgccagct ccttgcctgt 480

tcaacggatt ccggctactg tcacttggcg tggaacaacg tgagccgaaa ggagggtggt 540

gttcaaggta tgaggattcc gatgcttgcc gataccaacc acaaaatctc acgcgactac 600

ggcgtactga tcgaggatca aggcattgcc ctccgcggcc tttttatcat cgatgacaag 660

ggagttctgc gtcaaatcac catcaatgat ttgcccgtcg gccgctctgt ggatgaggct 720

ctgcgcctct tggacgcctt tcagttcacg gacaagcatg gtgaggtttg cccagcaaat 780

tggcaacctg gatcaaaaac cttcaaaccg agtgcgggtg atttgaagtc gttcatgagc 840

tcgggtggtg gtggttctgg cggtggtggt tcaggcggcg gcggcagttg cgtttgtcgt 900

tcctgccgta ctatgagtct tcagaaaact gttgagaagc ttttcgatga gttggacaag 960

gacaagtcgg gcaagattag ctgtgccgag cttaaatccg cactacagtc gtgctcagca 1020

gagcctctcg atgacgacca tgtgaaggct ttcttagata agctcgactc caacaaggac 1080

ggcgaattaa gcctagatga gttaatggct ctcttcggtg gtggtggttc tggcggtggt 1140

ggttcaggcg gcggcggcag taaggagtct gacttagcgg atatgaagaa taaggcatct 1200

gcctatgaga gtaagattgc ggagctggag atgctgctac agcaggagcg acatgcgcgt 1260

gagagtcttc agaagagcca agacaaactg gcggagatga acagaaagct gaaggaggag 1320

actgcggcat cagccgaaga gcgcgaccgt ctgatggccc agcgtgacga agtgcaacgc 1380

gaagttgagg ctcagaaggt cgccatggcc aagaaggaag ctgaaaaggc tcaggctgaa 1440

gctgagcttc gcagaatgcg tgagaaacac gatgcaaagc acaagtccca ggtcaatggc 1500

agtggtgacg ctgcttcgca ggatgatgaa agtgaagcca aggaacttga ggtgatacca 1560

aatgtgaggc ggacggagga atcgagggtg acggccgtct ctaagaatga gacactccag 1620

acgaagctgg ccaacctcaa ataactcgag 1650

Claims

1.一种用于检测包虫病的试剂条，其特征在于，包括样品垫、试剂垫、分析膜、吸水垫和粘性低衬，所述试剂条装到塑料卡底壳中，并且塑料卡底壳上盖有塑料卡上壳；

其中，所述样品垫、所述试剂垫、所述分析膜和所述吸水垫在所述粘性低衬依次排列，其中所述样品垫和所述试剂垫部分重叠，所述试剂垫和所述分析膜部分重叠，所述分析膜和所述吸水垫部分重叠，所述分析膜设置有检测区和质控区；

其中，所述试剂垫含有能够自由移动的UCP颗粒标记抗原，所述检测区固定有包被抗原，所述质控区固定有抗包虫抗体，所述UCP颗粒标记抗原以及所述包被抗原各自为序列如SEQ ID NO:5所示的融合抗原或序列如SEQ ID NO:6所示的基因编码的融合抗原；

所述UCP颗粒标记抗原通过以下步骤获得：

a)称取10 mg UCP颗粒置于锥形瓶中；

b)加入10 ml pH=7.2 0.20M PB；

c)UCP颗粒悬浊液中加入0. 5 mg 所述融合抗原，再加入无水戊二醛至终浓度1%，37℃搅拌过夜；

d)12000rpm，4℃，离心15min，弃上清；

e)UCP沉淀物中加入10ml pH=7.2 0.20M PB，吹打混匀；

f)12000rpm，4℃，离心15min，弃上清；

g) UCP沉淀物收集待用。

2.根据权利要求1所述的用于检测包虫病的试剂条，其特征在于，所述分析膜为硝酸纤维素膜。

3.根据权利要求1所述的用于检测包虫病的试剂条，其特征在于，所述检测区为T线，所述质控区为C线，将所述融合抗原稀释到0.2mg/ml，作为T线包被液，将抗包虫抗体稀释到2mg/ml，作为C线包被液，通过喷膜机，将T线包被液和C线包被液包被到硝酸纤维素膜上，晾干得到T线和C线。