CN112717127B

CN112717127B - 细粒棘球绦虫抗原b在制备预防或治疗免疫介导疾病的产品中的应用

Info

Publication number: CN112717127B
Application number: CN201910972245.3A
Authority: CN
Inventors: 张文宝; 包建玲; 李军; 孙畅; 齐文静; 郭刚; 郭宝平; 齐新伟; 任远
Original assignee: First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University
Current assignee: First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University
Priority date: 2019-10-14
Filing date: 2019-10-14
Publication date: 2023-05-09
Anticipated expiration: 2039-10-14
Also published as: CN112717127A

Abstract

本发明公开了一种细粒棘球绦虫抗原B在制备预防或治疗免疫介导疾病的产品中的应用。本发明首先公开了细粒棘球绦虫抗原B在制备预防或治疗动物免疫介导疾病的产品中的应用。本发明进一步公开了活性成分为细粒棘球绦虫抗原B的产品。本发明细粒棘球绦虫抗原B的大量释放参与宿主的免疫调节，产生对炎症性肠病、哮喘等疾病的保护作用，从而为免疫介导疾病的预防和治疗提供新途径。

Description

细粒棘球绦虫抗原B在制备预防或治疗免疫介导疾病的产品中的应用

技术领域

本发明属于药物应用技术领域，具体涉及细粒棘球绦虫抗原B在制备预防或治疗免疫介导疾病的产品中的应用。

背景技术

由环境因素引发的免疫功能障碍是炎症性肠病(IBD)、哮喘和慢性阻塞性肺气肿(COPD)等免疫介导疾病共同的发病机理。

炎症性肠病(IBD)是一组以遗传或环境因素异常引发过度免疫反应导致的肠道粘膜损伤及炎症，表现为肠道慢性炎症性反应。哮喘是一种支气管气道的慢性炎症疾病，其特征是可逆性气道阻塞，粘液分泌增加，并伴随嗜酸性粒细胞、气道中性粒细胞、肥大细胞和T淋巴细胞等炎症细胞浸润，已成为当今世界最常见的慢性炎症疾病，给各国政府、家庭及患者带来十分沉重的经济负担。

抗原B(AgB)属于疏水配体结合蛋白，具有高免疫原性，是细粒棘球绦虫分泌蛋白，具备低聚物结构，由大量7-10kd的螺旋亚单位构成，已观察到抗原B(AgB)低聚物在150-230kDa的分子质量范围内聚集度较高。抗原B(AgB)是细粒棘球绦虫成囊阶段高表达蛋白，在细粒棘球幼虫囊液中含量最多，在虫体与宿主的免疫应答方面起着重要的作用。目前关于细粒棘球绦虫分泌蛋白抗原B(AgB)的研究主要集中在诊断领域，而相关功能性研究较少。

发明内容

本发明要解决的技术问题为如何有效的预防或治疗免疫介导疾病。

为解决上述问题，本发明首先提供了细粒棘球绦虫抗原B在制备预防或治疗动物免疫介导疾病的产品中的应用。

上述应用中，所述免疫介导疾病为动物炎症性肠病和/或哮喘。

上述应用，所述产品可为药物、试剂或疫苗等。

上述应用中，所述细粒棘球绦虫抗原B可为序列2或序列3所示的重组细粒棘球绦虫抗原B或天然细粒棘球绦虫抗原B。

本发明进一步提供了上述细粒棘球绦虫抗原B的应用为如下至少一种：

A1)在降低动物腹腔中的M1型巨噬细胞比例的产品中的应用；

A2)在调节动物肠道中M2型巨噬细胞比例的产品中的应用；

A3)在提高动物脾脏中T淋巴细胞活化比例的产品中的应用；

A4)在调节动物肺组织中辅助性T淋巴细胞分泌的细胞因子表达的产品中的应用；

A5)在降低动物肺组织中嗜酸性粒细胞的比例的产品中的应用；

A6)在降低动物肺组织中粘液分泌的产品中的应用。

上述应用，所述产品可为药物、试剂或疫苗等。

本发明进一步提供了一种产品。

本发明所述产品的活性成分为细粒棘球绦虫抗原B，所述产品具有如下用途：

B1)预防或治疗动物免疫介导疾病

B2)预防或治疗动物炎症性肠病；

B3)预防或治疗动物哮喘；

B4)降低动物腹腔中M1型巨噬细胞比例；

B5)调节动物肠道中M2型巨噬细胞比例；

B6)提高动物脾脏中T淋巴细胞活化比例；

B7)调节动物肺组织中辅助性T淋巴细胞分泌的细胞因子表达；

B8)降低动物肺组织中嗜酸性粒细胞的比例；

B9)降低动物肺组织中粘液分泌。

上述产品可为药物、试剂或疫苗等。

上述产品中，还可含有辅料。

本文中，所述动物可为哺乳动物，所述哺乳动物包括人。

本发明首次公开了细粒棘球绦虫抗原B(AgB)在免疫介导疾病中的预防和/或治疗应用。一方面，细粒棘球绦虫抗原B能预防和/或治疗炎症性肠病：通过动物学实验数据可知，高纯度的天然抗原B和重组抗原B能够改善葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的肠炎症状，病理学数据显示抗原B能够减轻炎症性肠病模型中结肠局部炎性细胞的浸润，起到炎症保护作用。通过分析各组小鼠腹腔中巨噬细胞比例，结果发现腹腔注射抗原B后可以显著降低腹腔中M1型巨噬细胞比例，同时取结肠固有层淋巴细胞，结果发现腹腔注射抗原B后可以显著升高肠道中M2型巨噬细胞比例；进一步通过RT-PCR检测M1、M2型巨噬细胞指标，结果也表明M1型因子表达被抗原B抑制，而M2指标相应升高。另一方法，细粒棘球绦虫抗原B能预防和/或治疗哮喘：通过试验证明棘球绦虫抗原B显著增加肺组织中辅助性T淋巴细胞2因子的水平，下调哮喘诱导剂诱发的气道炎症反应，降低嗜酸性粒细胞的募集和减少粘液生产，降低气道高反应性。

因此，本发明细粒棘球绦虫抗原B(AgB)的大量释放参与宿主的免疫调节，产生对炎症性肠病、过敏性哮喘等疾病的保护作用，从而为免疫介导疾病的预防和治疗提供新途径。

附图说明

图1为天然AgB的浓度及纯度鉴定。图中，a为提取及纯化蛋白过程中聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)监测：泳道1为囊液抗原(HCF)，泳道2为0.005M醋酸钠(pH5.0)溶液透析过夜离心后的上清，泳道3为含nAgB蛋白的粗提物，泳道4为纯化的nAgB蛋白；b为提取及纯化蛋白过程中Western Blotting检测：泳道1为囊液抗原(HCF)，泳道2为0.005M醋酸钠(pH5.0)溶液透析过夜离心后的上清，泳道3为含nAgB蛋白的粗提物，泳道4为纯化的nAgB蛋白；c为纯化的nAgB蛋白的飞行质谱检测；d为蛋白定量曲线。

图2为小鼠的体重检测结果。

图3为小鼠的结肠长度测量结果。

图4为小鼠结肠切片的HE染色结果。

图5为小鼠结肠切片的病理学评分结果。

图6为小鼠腹腔中M1型巨噬细胞(F4/80⁺CD11c⁺)比率。

图7为小鼠结肠固有层淋巴细胞中M2型巨噬细胞(F4/80⁺CD206⁺)比率。

图8为流式细胞术检测炎症性肠病模型小鼠脾脏中活化的杀伤性T细胞(CD3⁺CD8⁺CD69⁺)比率。

图9为RT-PCR检测小鼠结肠M1指标iNOS、M2指标Fizzl。

图10为肺脏切片的HE染色结果。

图11 RT-PCR检测小鼠肺组织中IFNγ、IL2、IL5、IL10的mRNA相对表达水平。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1天然Antigen B(nAgB)和重组AgB(rAgB)的获得

一、nAgB蛋白的提取

获得感染细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)的新鲜绵羊肝脏，流水冲洗干净，75％乙醇水溶液表面消毒。用50ML注射器吸取囊液，离心2000转/分钟×15分钟，收集上清，四层纱布过滤后，得到囊液抗原(HCF)，-80℃冰箱冻存备用；取5L囊液抗原冰水浴解冻、混匀，离心3000转/分钟×10分钟，取上清；装入透析袋内，埋入蔗糖中过夜后，将透析袋转至大于20倍体积的0.005M醋酸钠(pH5.0)溶液中，在醋酸钠(pH5.0)溶液中加入搅拌子并放置在磁力搅拌器上于4℃冰箱中涡旋透析，其中更换新的醋酸钠溶液至少三次，透析过夜后，将透析带内液体取出，离心10000转/分钟×60分钟，弃上清；将沉淀物用20mL 0.2M磷酸缓冲液(pH8.0)悬起溶解后在沸水中煮15分钟，离心15000转/分钟×60分钟，取上清，即得含nAgB蛋白的粗提物。

二、nAgB蛋白的纯化

将步骤一得到的含nAgB蛋白的粗提物分装，以4ml/瓶，分装于8ml冷冻干燥玻璃瓶中，再将冷冻干燥玻璃瓶放入冷冻干机干燥仓内的隔板上；确认真空泵的排水阀和充气阀完全关闭后打开真空泵，开启制冷系统和控温系统，调整仓内温度为-10℃，进行真空冷冻干燥后，取出冷冻干燥玻璃瓶，-80℃冰箱冻存备用；

将装有含nAgB蛋白的粗提物的冷冻干燥玻璃瓶加入1ml水，混匀，过滤后，采用固定金属离子亲和色谱(IMAC，Immobilized Metal-ion affinity chromatography)方法洗脱收集目的蛋白，即得纯化的nAgB蛋白。

对提取及纯化过程中蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，结果如图1中a所示，结果显示最终得到的纯化的nAgB蛋白的分子量在8Kd大小左右，纯度较高。

对提取及纯化过程中蛋白进行免疫印迹试验(Western Blotting)检测，结果如图1中b所示，确认本发明得到的抗原为AgB抗原。具体步骤如下：将蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后的凝胶转至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)后，首先用脱脂奶粉封闭1小时，再将膜与1∶500的小鼠来源抗AgB抗体4℃孵育过夜，使用PBST缓冲液洗涤5分钟×3次，与辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠二抗孵育，4-氯-1-萘酚显色。

将纯化的nAgB蛋白进行梅里埃VITEK MS飞行质谱检测，结果如图1中c所示，蛋白纯度达95％以上。具体步骤如下：将2μL AgB蛋白滴至靶板小孔，待风干后再重复滴定2次，每次2μL，小孔内样本完全干燥后滴加1μLα-氰基-4-4羟基肉桂酸基质液，完全干燥后上机测试。

绘制蛋白定量曲线，检测纯化的AgB蛋白的浓度，最终测定纯化的AgB蛋白的含量为1.2mg/ml。具体步骤如下：采用Pierce BCA蛋白定量分析试剂盒：(1)分别配制100μL以下终浓度的BSA标准品：2000μg/ml、1000μg/ml、500μg/ml、250μg/ml、1500μg/ml、750μg/ml、0μg/ml；(2)在96孔板每孔中加入200μL工作液，加入标准品/样品每孔25μL，每个标本2个复孔；(3)37℃孵育箱中避光30分钟；(4)酶标仪562nm处检测吸光度值(OD)，以标准品浓度及吸光度值分别为横纵坐标，绘制标准曲线(图1中d)，再通过标准曲线计算样本最终蛋白浓度。

以上结果表明，本发明采用上述简单易行、低成本的分离和纯化方法获得了高质量的nAgB蛋白，纯度可达95％以上，浓度达到1mg/ml，能够满足实验及其他应用需求。

三、重组AgB(rAgB)的提取及纯化

1.EgAgB/pET28a的构建

根据GenBank上已经发表的EgAgB2/1基因编码序列和pET28a原核表达载体上的多克隆位点，设计并合成特异性引物用于扩增EgAgB目的基因片段，为了便于定向克隆，在上、下游引物的5’端分别引入了一个酶切位点EcoR I和XhoI，并在两条引物的端部加上保护性碱基。引物序列为：

Primer-F1(下划线部分为EcoR I的识别序列)：

5’-cgGAATTCAAAGATGAGCCAAAAGCACAC-3’；

Primer-R1(下划线部分为Xho I的识别序列)：

5’-ccCTCGAGCTTTGAATCATCATCTTTTTC-3’

引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。以细粒棘球绦虫幼虫cDNA(提取幼虫总RNA后，经反转录后得到cDNA)为模板进行PCR扩增(反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃延伸7min，4℃保存)得到含有EgAgB基因片段的PCR产物，1％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定后进行纯化。

将纯化后的PCR产物和表达载体pET28a分别经EcoR I和XhoI双酶切之后回收，连接，转入大肠杆菌BL21，转化菌涂布于含卡那霉素(50μg/ml)的LB培养板，于37℃培养箱倒置培养过夜；挑取单克隆活化进行PCR鉴定，提取阳性克隆质粒再通过EcoR I和XhoI双酶切鉴定，初筛阳性菌株送至华大基因公司进行测序鉴定。

经测序表明在pET28a的酶切位点EcoR I和XhoI之间插入序列l所示EgAgB基因片段的重组质粒，将该质粒命名为EgAgB/pET28a，该质粒表达序列3所述的重组rAgB蛋白，其中所述EgAgB基因片段编码序列表中序列2所示的rAgB蛋白。

2、rAgB蛋白的纯化

将构建的测序鉴定正确的含有重组质粒EgAgB/pET28a的大肠杆菌BL21阳性克隆接种于含卡那霉素(50μg/mL)的LB培养基中，于37℃，220rpm(每分钟转速)振荡培养过夜，得到过夜培养物；取过夜培养物，按10％(体积分数)重新接种于含相同浓度卡那霉素的LB培养基中，37℃，220rpm培养至OD600为0.6左右时，加IPTG至终浓度为0.2mmol/L，继续振荡培养5h，得到培养物。取培养物离心，收集大肠杆菌BL21沉淀，用预冷的蛋白结合缓冲液重悬沉淀，一边冰浴，一边先用细胞破碎仪处理大肠杆菌BL21菌体，再用超声仪破碎裂解菌体(功率400W，时间5s，间歇5s，总时长为2min)，离心后分别取上清，采用固定金属离子亲和色谱(IMAC，Immobilized Metal-ion affinity chromatography)方法纯化，得到纯化的rAgB蛋白。

实施例2细粒棘球绦虫抗原B(AgB)对炎症性肠病的作用及机理

一、干预炎症性肠病(IBD)小鼠模型

选取8-10周的健康状态良好的Balb/c雌性小鼠40只，体重18-20克/只，随机分为4组(每组10只)，即干预组1(即nAgB+3.5％DSS)、干预组2(即rAgB+3.5％DSS)、模型组(即PBS+3.5％DSS)和对照组(即Blank)。干预组1给予Balb/c小鼠腹腔注射实施例1制备的nAgB抗原溶液(溶剂是PBS)，200μg nAgB抗原/只小鼠，连续注射5天停2天；干预组2给予Balb/c小鼠腹腔注射实施例1制备的rAgB抗原溶液(溶剂是PBS)，200μg rAgB抗原/只小鼠，连续注射5天停2天；模型组不进行抗原腹腔注射处理，只注射等体积的溶剂。第8天进行肠炎模型的建立，即将干预组1-2和模型组的Balb/c小鼠饮用水改为重量百分浓度为3.5％的DSS溶液，自由饮水7天，每两天换一次DSS；对照组不进行抗原和/或溶剂腹腔注射处理且一直饮用水。

二、AgB对结肠炎症症状的影响

饮用DSS溶液后采用盲法每天观察粪便性状，每日固定时间段称量小鼠体重，并肉眼观察干预组1、干预组2、模型组和对照组小鼠大便性状(包括粪便松软、拉稀等症状)和出血情况(包括便上带血和肛周出血)，根据粪便评分标准结合体重进行DAI评估，DAI指标为体重损失、大便一致性、有无出血情况三项相加得数。

结果显示：模型组小鼠饮用DSS溶液三天后开始逐渐出现体重减轻、腹泻、血便等急性肠炎的表现，小鼠DAI指标开始逐渐升高，并且随着时间延长，升高程度愈加明显，干预组1和干预组2也出现相应症状，但是显著低于模型组(图2，图中模型组用“PBS+3.5％DSS”表示、干预组1用“nAgB+3.5％DSS”表示、干预组2用“rAgB+3.5％DSS”表示)，说明nAgB和rAgB均能够抑制DSS导致的体重降低、腹泻、血便等肠炎症状。

三、AgB对结肠炎症反应的保护

1、结肠内粪粒、出血情况和结肠长度

处死干预组1、干预组2、模型组和对照组的小鼠，分出盲肠，剪去以上部分，向下延伸至肛门剪断，注意不要牵拉，剪下结肠后，观察结肠内粪粒和出血情况并用直尺量结肠长度。

结果显示：与对照组相比，模型组小鼠结肠内粪粒减少，盲肠至结肠内均有不同程度的充血，结肠长度明显变短，而干预组1、干预组2也出现结肠出血、粪粒减少和结肠长度降低的情况，但与模型组相比，干预组1和干预组2的结肠出血、粪粒减少、结肠变短程度明显降低(图3，图中模型组用“PBS+3.5％DSS”表示、干预组1用“nAgB+3.5％DSS”表示、，干预组2用“rAgB+3.5％DSS”表示、对照组用“Blank”表示)，说明rAgB和nAgB均能明显降低DSS诱导的结肠症状。

2、结肠组织病理学评分

将步骤1中用镊子将剪下的结肠靠近盲肠处夹住吸入生理盐水到10ML注射器，反复冲洗结肠至少三次，见尾部流出液体清亮为止；最后一遍用冰的PBS冲洗后，剪取结肠上段1.5-2cm；投入4％多聚甲醛，室温放置浸泡4小时后，在盛自来水的烧杯中轻轻冲洗3分钟，投入30％蔗糖溶液，放入4℃冰箱过夜，次日见组织沉底后用OTC进行低温下包埋，切片；进行HE染色：将切片浸入无水乙醇、95％的乙醇I、95％的乙醇II、80％的乙醇的梯度酒精中各5秒，水缸中自来水洗2遍，投入苏木素染液染色2分钟后自来水冲洗3次，盐酸乙醇分化5秒钟后自来水冲洗3次，PBS中返蓝1分钟，伊红染液40秒自来水冲洗3次，依次浸入85％的乙醇、95％的乙醇II、95％的乙醇I、无水乙醇梯度酒精中进行脱水各5秒，依次放入环保透明液I及环保透明液II中各10秒钟透明，室温下干燥及封片，显微镜下观察；结肠组织病理学评分如下，将三项得数相加为结肠组织的病理学评分。

隐窝破坏：无-0分小于等于1/3-1分大于1/3小于等于2/3-2分大于2/3至完全破坏但上皮完整-3分隐窝完全破坏和上皮完全丢失-4分

上皮异常：无-0分黏膜层-1分黏膜下层-2分透壁-3分

炎症细胞浸润：无-0分轻微-1分中等-2分严重-3分

结果显示：与对照组相比，模型组小鼠结肠上段隐窝炎症明显，表现为隐窝脓肿、隐窝减少或炎性细胞浸润入粘膜，病理学评分得数升高，有非常显著性差异；干预组1和干预组2相对于模型组小鼠结肠局部炎性细胞的浸润得到显著改善，病理学评分相对于模型组明显降低，但与模型组无统计学差异(图4，图5，图中模型组用“PBS+3.5％DSS”表示、干预组1用“nAgB+3.5％DSS”表示、干预组2用“rAgB+3.5％DSS”表示、对照组用“Blank”表示)，说明rAgB和nAgB均能够减轻炎症性肠病模型中结肠局部炎性细胞的浸润，起到炎症保护作用。

四、细粒棘球绦虫抗原B对炎症性肠病的作用机理

1、为确定小鼠腹腔中巨噬细胞有无表型变化，收集小鼠腹腔中游离细胞，并用巨噬细胞Marker对应流式下述抗体进行标记：PerCP/Cy5.5-CD11b、PE-F4/80、FITC-CD11c。结果显示干预组1相对于模型组和对照组显著降低腹腔中F4/80⁺和CD11c⁺的M1型巨噬细胞，而模型组和对照组腹腔中F4/80⁺和CD11c⁺的M1型巨噬细胞比率无显著性差异(图6，图中模型组用“PBS+3.5％DSS”表示、干预组1用“nAgB+3.5％DSS”表示、对照组用“Blank”表示)，表明nAgB(或rAgB)能降低腹腔中M1型巨噬细胞比例。

其中，腹腔灌洗液的采集及流式标记具体方法如下：

处死干预组1、模型组和对照组小鼠后剪开腹部皮肤，暴露出腹部，将出血点用纱布擦干净，用镊子将腹膜正中靠近胸壁的部分夹住提起，10ML注射器吸取8ML冰浴的PBS快速、用力打入腹腔冲开肠道，按摩腹腔3-5分钟，将注射器再次扎入腹腔，回收约6ML左右浑浊液体，得到腹腔灌洗液；将吸出的腹腔灌洗液200目过滤网过滤入15ML离心管，1500转/分钟×5分钟，弃上清，1mL PBS悬起细胞沉淀；镜下计数细胞，调整浓度至1×10⁶个/Ep管；将Ep管离心，4℃，6000转/分钟×2分钟，吸去上清，用30μL封闭液悬起，得到的细胞悬液在4℃冰箱孵育15分钟；细胞悬液加入30μL荧光单抗(即PerCP/Cy5.5-CD11b、PE-F4/80、FITC-CD11c)表面染色，4℃冰箱避光孵育30分钟；1ml PBS悬起，4℃，6000转/分钟×2分钟离心，弃上清液；300μL PBS悬起，200目过滤网过滤入上样管，冰上避光、上机。

2、为了解肠道局部巨噬细胞极化状态，将干预组1、干预组2、模型组和对照组小鼠解剖，分离肠道固有层淋巴细胞后，用巨噬细胞Marker对应以下流式抗体进行标记：PerCP/Cy5.5-CD11b、PE-F4/80、APC-CD206。结果显示模型组中M2巨噬细胞标志F4/80⁺和CD206⁺细胞比率与对照组相比无明显差异，但是干预组1和干预组2中肠道固有层淋巴细胞中M2巨噬细胞标志F4/80⁺、CD206⁺双阳性细胞比率升高(图7，图中模型组用“PBS+3.5％DSS”表示、干预组1用“nAgB+3.5％DSS”表示、干预组2用“rAgB+3.5％DSS”表示、对照组用“Blank”表示)，说明nAgB和rAgB均能影响巨噬细胞极化状态，提高肠道局部M2细胞比率，并参与对肠炎的保护。

其中，肠道固有层淋巴细胞的分离及流式标记具体方法如下：采用酶消化法分离肠道固有层淋巴细胞，即将干预组1、干预组2、模型组和对照组的小鼠眼球取血后快速分离结肠，将剪下的结肠放置冰上，用注射器吸冰的生理盐水反复冲洗干净，见尾部流出液体清亮为止；最后一遍用冰的PBS冲洗后，将结肠组织顺着结肠走型用剪刀剪开，剪碎成约0.5cm小段，吸入5ml预消化液；将组织置于37℃摇床，2200rpm/中震荡15分钟，取出涡旋15秒，200目滤网过滤留滤网上的组织；加入5ml预消化液重复此步骤1次，200目滤网过滤后加入5ml含胶原酶IV的消化液，将其放入37℃摇床恒温振荡1小时，每隔20分钟吸取少量细胞在显微镜下观察一次；以200目滤网过滤消化的细胞悬液，15ml离心管收集滤液后1500转/分×5分钟，弃上清；以6ml40％Percoll悬浮细胞沉淀，倾斜45°角缓慢加在3ml 70％Percoll液面之上；以1500转/分×25分钟进行密度梯度离心(离心升速设为2、减速设置为0)，离心过程中温度控制在18-22℃；离心完毕后小心吸出中间层(环状乳白色淋巴细胞层)细胞约1-2ml，加入PBS缓冲液洗涤沉淀，1500转/分×5分钟，吸去上清；1ml PBS悬浮细胞，镜下观察，4％台盼蓝鉴定细胞活力并计数，用30μLPBS悬浮1×10⁶个细胞流式备用。

细胞流式：(1)将细胞调整浓度至1×10⁶个/管；(2)4℃离心，6000转/分钟×2分钟，吸去上清，用30μL封闭液悬起，4℃冰箱孵育15分钟；(3)细胞悬液加入30μL荧光单抗(即PerCP/Cy5.5-CD11b、PE-F4/80、APC-CD206)表面染色，4℃冰箱避光孵育30分钟；(4)lmlPBS悬起，4℃、6000转/分钟×2分钟离心，弃上清液；(5)300μL PBS悬起，200目过滤网过滤入上样用放免管，冰上避光，上机。

3、为确定小鼠系统免疫中T淋巴细胞表型变化，分离并收集脾脏淋巴细胞进行流式分析，并用T淋巴细胞亚群抗体进行标记：APC/Cy7-CD3、PE/Cy7-CD8、FITC-CD69。正常状态下脾脏T细胞的活化启动免疫反应清除外来微生物等感染，起到免疫防御作用，结果显示模型组中小鼠给予葡聚糖硫酸钠(DSS)明显抑制了机体系统免疫中CD8⁺杀伤性T细胞的活化，这是肠炎症状严重的原因之一，而干预组1和干预组2预先给予nAgB和rAgB干预，使得CD8⁺杀伤性T细胞活化的比例升高从而提高了一定的免疫防御能力，使得肠道炎症减轻(图8，图中模型组用“PBS+3.5％DSS”表示、干预组1用“nAgB+3.5％DSS”表示，干预组2用“rAgB+3.5％DSS”表示)。

其中，脾脏淋巴细胞的分离及流式标记的具体方法如下：采用研磨法收集脾脏细胞：即将干预组1、干预组2、模型组和对照组分离得到的脾脏组织浸泡在盛有干净的PBS溶液的培养皿中，放置冰上；取两块载玻片的磨砂面相对，将脾脏组织通过磨砂面的研磨分离出细胞，用PBS冲洗至皿中，200目滤网过滤至15ml离心管中；1500转/分×5分钟，弃上清，加红细胞裂解液2ml，重悬4℃冰箱避光10分钟；离心1500转/分×5分钟，弃上清，5ml PBS悬起，取10μL细胞悬液在显微镜下行细胞活力检测及计数，用30μLPBS悬浮1×10⁶个细胞流式备用。

流式步骤：(1)将细胞调整浓度至1×10⁶个/管；(2)4℃离心，6000转/分钟×2分钟，吸去上清，用30μL封闭液悬起，4℃冰箱孵育15分钟；(3)细胞悬液加入30μL荧光单抗(即APC/Cy7-CD3、PE/Cy7-CD8、FITC-CD69)表面染色，4℃冰箱避光孵育30分钟；(4)1ml PBS悬起，4℃、6000转/分钟×2分钟离心，弃上清液；(5)300μL PBS悬起，200目过滤网过滤入上样用放免管，冰上避光，上机。

4、为明确肠道局部巨噬细胞的极化情况，从分子水平进行了进一步验证，取干预组1、模型组的小鼠结肠上段组织，提取RNA，进行RT-PCR检测。结果显示，模型组中小鼠给予DSS明显提高了结肠组织中M1型巨噬细胞iNOS的变化倍数，而干预组1预先给予nAgB使得M1型巨噬细胞iNOS的变化倍数降低，差异显著；而M2巨噬细胞表型的结果显示，干预组1预先给予nAgB使得M2型巨噬细胞Fizzl的变化倍数相较模型组有升高趋势，差异非常显著(图9，图中模型组用“PBS+3.5％DSS”表示、干预组1用“nAgB+3.5％DSS”表示)，因此，nAgB显著抑制了M1型巨噬细胞相关的分子表达，而相反提高了M2型巨噬细胞相关的分子表达。

具体方法如下：

结肠组织总RNA提取：将研钵高温干烤处理后自然冷却，倒入液氮，取出预先超低温保存的结肠组织约50-100mg置于研钵中，迅速倒入液氮碾磨至粉末；将粉末刮入一新的无RNase的1.5mL EP管中，加1mL Trizol，上下颠倒混匀，室温静置10min；加200μL氯仿，颠倒混匀，置室温孵育3min，4℃条件下离心，12000转/分钟×10分钟，小心吸上层水相约200μL至另一个新的无RNase的1.5mLEP管中；加200μL异丙醇，轻轻混匀后室温静置10min；4℃条件下12000转/分钟×10分钟离心；用移液器吸去上清，加入1ml70％的乙醇将沉淀悬起，4℃离心，12000转/分钟×10分钟；小心吸去上清，室温干燥10分钟；加入20μL DEPC水溶解沉淀，得到总RNA；分别取2μL提取的总RNA使用核酸蛋白分析仪测定提取纯度和浓度以及甲醛变性凝胶电泳分析总RNA的完整性。

反转录：根据Takara反转录试剂盒说明书操作如下：

1)去除基因组DNA，反应体系如表1和反应程序如下，得到去除基因组DNA的RNA；

表1去除基因组DNA的反应体系

去除基因组DNA的反应程序：42℃反应2分钟。

2)反转录反应，反应体系如表2和反应程序如下，得到cDNA；

表2反转录的反应体系

反转录反应程序：37℃15分钟，85℃5秒，4℃

3)PCR反应：在冰上配制PCR反应液，反应体系如表3和反应程序如下：

表3 PCR反应体系

表4结肠组织PCR引物

PCR反应条件：轻轻混匀后短暂离心按以下条件进行

1：94℃3min

2：94℃30sec

60℃30sec

72℃30sec

35cycles

3：72℃5min

4℃终止反应，扩增后的PCR产物行琼脂糖凝胶电泳。

综上，通过动物学实验数据可知，高纯度的天然抗原B(nAgB)和重组抗原B(rAgB)蛋白能够改善葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的肠炎症状，病理学数据显示抗原B能够减轻炎症性肠病模型中结肠局部炎性细胞的浸润，起到炎症保护作用；通过分析各组小鼠腹腔中巨噬细胞比例，结果发现腹腔注射抗原B后可以显著降低腹腔中M1型巨噬细胞比例，同时取结肠固有层淋巴细胞，结果发现腹腔注射抗原B后可以显著升高肠道中M2型巨噬细胞比例，进一步通过RT-PCR检测M1、M2型巨噬细胞指标，结果也表明M1型因子表达被抗原B抑制，而M2指标相应升高。另外，通过分析脾脏中T淋巴细胞的比例，结果发现腹腔注射抗原B后可使得活化的T淋巴细胞比例有升高趋势。

因此，通过以上试验表明：细粒棘球绦虫抗原B能预防和/或治疗炎症性肠病。

实施例3细粒棘球绦虫抗原B(AgB)对哮喘的作用及作用机理

一、哮喘小鼠模型

选取8-10周的健康状态良好的Balb/c雌性小鼠40只，体重18-20克/只，随机分为4组(每组10只)，即干预组2(即nAgB)、干预组3(即nAgB+OVA)、模型组4(即OVA)和对照组(即Blank)。

干预组2和干预组3在造模前4周开始给予AgB(溶剂为PBS)皮下注射50μg/只，每两周注射一次，共三次，模型组4不进行AgB皮下注射处理，只注射等体积的溶剂PBS，在第5周干预组3和模型组4开始造哮喘小鼠模型。对照组不进行任何处理。

哮喘小鼠模型的造模过程分致敏和激发两个阶段：将小鼠分别在第1、15天两次腹腔注射200μL致敏剂溶液(100μg鸡卵白蛋白(OVA)和1mg氢氧化锅溶于200μL的PBS混悬液)进行致敏；第21天开始在雾化吸入箱内连续对小鼠给予5％鸡卵白蛋白(OVA)激发刺激(雾化吸入箱规格为30cm×18cm×13cm的透明塑料容器，容器一头连接超声雾化器，经超声振荡产生的鸡卵白蛋白(OVA)气雾剂进入容器，在容器另一头有一个小孔，便于气体流通)，每天1次，每次30min，连续雾化3天。

小鼠解剖后用灭菌的生理盐水清洗残留血渍，将左肺置于4％的多聚甲醛中固定，右肺分成两部分经液氮速冻后，置于80℃保存备用。

左肺肺组织HE染色：将肺组织投入4％多聚甲醛，放置4℃冰箱过夜后，对左肺进行常规的修块、脱水、透明、包埋、切片，行HE染色，检测肺组织的病理改变。结果显示模型组4小鼠肺组织炎性细胞浸润严重，主要是嗜酸性粒细胞浸润进入支气管周围和血管周围肺部区域，气管狭窄，管壁增厚，使得粘液分泌严重；而相比模型组4，干预组3在支气管周围的嗜酸性粒细胞浸润很少，管壁明显变薄，管腔明显变大，粘液分泌减少；干预组2与对照组相比，小鼠肺支气管上皮细胞结构完整，未见明显病理变化(图10，图中模型组4以“OVA”表示，干预组2以“nAgB”表示，干预组3以“nAgB+OVA”表示，对照组以“Blank”表示)，以上结果说明AgB的干预可以减轻哮喘引发的炎性反应及症状。

右肺组织细胞因子的RT-PCR：

为进一步明确AgB对肺组织局部免疫产生的影响，提取肺组织的总RNA，采用实时荧光定量PCR的方法对2型辅助性T细胞(Th2细胞)分泌的细胞因子(IL5、IL10)和1型辅助性T细胞(Th1细胞)分泌的细胞因子(IFNγ、IL-2)进行检测，结果显示与对照组相比，干预组2中细胞因子IFNγ，IL2，IL5以及IL10的表达均升高，但干预组3中IFNγ和IL-2的含量明显高于模型组4，两组间IL-5和IL10无明显变化(图11)。

从结果看出，AgB干预后Th2细胞因子(IL5、IL10)和Th1细胞因子(IFNγ、IL-2)均显著升高，形成新的免疫平衡状态。因为OVA诱导也产生Th2占优势的免疫反应，nAgB产生了较强的Th2反应，两者结合会进一步加强Th2反应，从而加重哮喘症状。然而，结果显示干预组3的Th2因子未如预期明显升高，相反IL5 mRNA水平有所降低，而AgB引发的Th1细胞因子(IFNγ、IL-2)的升高对哮喘症状的减轻也很有意义。

其中，右肺组织的RT-PCR检测同实施例2中结肠组织的RT-PCR检测方法，其中，肺组织PCR引物如表5所示：

表5肺组织PCR引物

综上，棘球绦虫抗原B(AgB)明显减少气道炎症的严重程度包括降低嗜酸性粒细胞浸润和减少粘液分泌，降低气道高反应性，肺组织细胞因子的RT-PCR结果表明因为AgB的干预，调节IFNγ和IL-2的mRNA表达而抑制或减轻哮喘症状。

因此，通过以上试验表明：细粒棘球绦虫抗原B能预防和/或治疗哮喘。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

SEQUENCE LISTING

<110> 新疆医科大学第一附属医院

<120> 细粒棘球绦虫抗原B在制备预防或治疗免疫介导疾病的产品中的应用

<130> GNCFY191747

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 210

<212> DNA

<213> 细粒棘球绦虫（Echinococcus granulosus）

<400> 1

aaagatgagc caaaagcaca catggggcaa gtggtaaaaa aaagatgggg tgaacttcga 60

gacttcttta gaaatgatcc actgggtcaa agacttgtcg ctcttggcaa tgacctaact 120

gccatttgcc agaagctgca attgaagatt cgtgaggtgc tgaagaagta tgttaagaat 180

ttggtggaag aaaaagatga tgattcaaag 210

<210> 2

<211> 70

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Lys Asp Glu Pro Lys Ala His Met Gly Gln Val Val Lys Lys Arg Trp

1 5 10 15

Gly Glu Leu Arg Asp Phe Phe Arg Asn Asp Pro Leu Gly Gln Arg Leu

20 25 30

Val Ala Leu Gly Asn Asp Leu Thr Ala Ile Cys Gln Lys Leu Gln Leu

35 40 45

Lys Ile Arg Glu Val Leu Lys Lys Tyr Val Lys Asn Leu Val Glu Glu

50 55 60

Lys Asp Asp Asp Ser Lys

65 70

<210> 3

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

1 5 10 15

Arg Gly Ser His Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg

20 25 30

Gly Ser Glu Phe Lys Asp Glu Pro Lys Ala His Met Gly Gln Val Val

35 40 45

Lys Lys Arg Trp Gly Glu Leu Arg Asp Phe Phe Arg Asn Asp Pro Leu

50 55 60

Gly Gln Arg Leu Val Ala Leu Gly Asn Asp Leu Thr Ala Ile Cys Gln

65 70 75 80

Lys Leu Gln Leu Lys Ile Arg Glu Val Leu Lys Lys Tyr Val Lys Asn

85 90 95

Leu Val Glu Glu Lys Asp Asp Asp Ser Lys Leu Glu His His His His

100 105 110

His His

Claims

1.细粒棘球绦虫抗原B在制备预防或治疗动物免疫介导疾病的产品中的应用；所述免疫介导疾病为动物炎症性肠病和/或哮喘；

所述细粒棘球绦虫抗原B为天然细粒棘球绦虫抗原B或序列2或序列3所示的重组细粒棘球绦虫抗原B。

2.细粒棘球绦虫抗原B在如下至少一种中的应用：

A1）在制备降低动物腹腔中M1型巨噬细胞比例的产品中的应用；

A2）在制备调节动物肠道中M2型巨噬细胞比例的产品中的应用；

A3）在制备提高动物脾脏中T淋巴细胞活化比例的产品中的应用；

A4）在制备调节动物肺组织中辅助性T淋巴细胞分泌的细胞因子表达的产品中的应用；

A5）在制备降低动物肺组织中嗜酸性粒细胞的比例的产品中的应用；

A6）在制备降低动物肺组织中粘液分泌的产品中的应用；

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述产品为药物。

4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述产品为试剂。

5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述产品为疫苗。

6.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述动物为哺乳动物。

7.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述动物为人。