CN102943308B - 细粒棘球绦虫发育阶段表达分泌蛋白的基因芯片 - Google Patents

Abstract

一种细粒棘球绦虫发育阶段表达分泌蛋白的基因芯片，其在载体上组合有分离出的细粒棘球绦虫原头蚴、囊泡、六钩蚴、成虫四个发育阶段分泌蛋白cDNA表达序列标签的序列，该cDNA序列具有SEQIDNo.1～SEQIDNo.30所示的序列。本发明的优点是：具有许多商用价值和科研价值。可以利用这些新的表达序列标签绘制基因图谱。对分泌蛋白基因表达的研究具有重要的作用。表达序列标签还可进行抗囊型包虫病的药物靶点的筛选，筛选出最佳的抗包虫药物分子。可用于囊型包虫病诊断标志物的筛选，以研发具有高特异性的包虫病诊断试剂盒。应用该基因芯片还可用于囊型包虫病保护性抗原的筛选，以研发可用于畜牧业和宠物犬的包虫病疫苗研制。

Description

细粒棘球绦虫发育阶段表达分泌蛋白的基因芯片

技术领域

本发明涉及生物芯片技术领域，是一种细粒棘球绦虫发育阶段表达分泌蛋白cDNA表达序列标签所组成的基因芯片，尤其涉及细粒棘球绦虫原头蚴、囊泡、六钩蚴、成虫四个发育阶段表达分泌蛋白cDNA表达序列标签及其构成的基因芯片。

背景技术

生物基因组中可转录表达的序列（即基因）仅占总序列的3-5%，对这部分序列进行测定，将直接导致新基因的发现，并获取基因组中与产业化关系最为密切的信息。Eg的全基因组大小约150Mb，预测基因数量在10000个左右，少于日本血吸虫的基因数量（15000个）。迄今为止，仅获得若干基因的信息，对于基因转录组信息的了解几乎空白。表达序列标签的概念最早是由Adams等在1992年提出来的(Nature，355，642-644)。1992年Sikela和Matsubara(Sikela,et al.Nucleic Acids Res. 19,1837·1843; Matsubara,et al,Nature Genetics, 2, 173-179)针对获得大量信使核糖核酸(mRNA)序列的迫切需要，提出大规模互补脱氧核糖核酸( cDNA)测序的研究战略。随后Venter创立了大规模表达序列标签技术。其基本特征就是从以质粒为载体，构建完成的目的组织互补脱氧核糖核酸(Complementary DNA，简称cDNA)文库中，随机选择许多cDNA克隆，利用质粒上携带的通用引物对cDNA两端进行一轮脱氧核糖核酸序列测定，所获得的来自3’端或5’端的几百个碱基的非载体短脱氧核糖核酸(DNA)序列。简而言之，表达序列标签是来自表达基因片段3’端或5’端的短脱氧核糖核酸序列，代表一个表达基因的部分转录片段。

生物芯片技术是随着"人类基因组计划"（Human Genome Project, HGP）的进展而发展起来的，是90年代中期以来影响最深远的重大科技进展之一。它融微电子学、生物学、物理学、化学、计算机科学为一体的高度交叉的新技术，具有重大的基础研究价值，又具有明显的产业化前景。生物芯片是指能储藏大量生物信息或快速并行处理多个生物样品的微型器件，它的制作往往需要运用微电子芯片工业中所采用的各种加工方法，又因为处理的对象是生物样品，故称之为生物芯片。自从Fodor 等1991 年在Science上提出生物芯片的概念后，近15 年以来，生物芯片技术得到了迅猛的发展，目前已有多种不同功能的芯片问世，这些芯片中有的已经在生命科学研究中开始发挥重要作用。生物芯片可以把成千上万的生物信息集成在一张很小的芯片上，对核酸、蛋白质和细胞进行高通量的并行分析。美国商界权威刊物Fortune 在1997 年3 月刊中对生物芯片作了如下阐述: “微处理器在本世纪使我们的经济结构发生了根本改变，给人类带来了巨大的财富，改变了我们的生活方式。然而，生物芯片给人类带来的影响可能会更大，它可能从根本上改变医学行为和我们的生活质量，从而改变世界的面貌”。由于生物芯片技术领域的飞速发展，美国科学促进协会（AAAS）于1998 年底在Science 上将生物芯片评为98 年的十大科技突破之一。现在，生物芯片已被公认将会给生命科学和医学研究带来一场革命，并已成为各国学术界和工业界所瞩目的一个热点研究领域。

根据芯片上固定的生物分子的不同，生物芯片传统上可以分为基因芯片、蛋白芯片、细胞芯片、组织芯片以及高度整合的lab-on-chip芯片实验室系统。其中，基因芯片是目前发展时间最长，技术最成熟，应用最广泛的芯片技术。

针对目前基因组序列已知的模式生物，如人、小鼠、酵母、线虫、拟南芥等，基因芯片的类型已经开发得相当完整。如针对基因表达水平的表达谱芯片，针对基因启动子区域的启动子芯片，针对基因外显子区域的外显子芯片，以及针对全基因组序列的tiling芯片。但是对于没有进行全基因组测序的生物，如本课题中的绦虫类，目前国际上的芯片开发就相当匮乏。若进行大规模高通量的分析检测，常规做法就是从cDNA文库出发，通过测序分析后构建微阵列芯片，也可以利用公开的测序数据进行芯片构建。

发明内容

本发明提供了一种细粒棘球绦虫发育阶段表达分泌蛋白cDNA表达序列标签所组成的基因芯片，该基因芯片可以最大限度地利用公开的表达序列标签数据库信息，大大缩短抗包虫药物靶点、囊型包虫病诊断标志物、囊型包虫病保护性抗原的筛选的周期并可减少筛选的成本，为抗包虫药物、包虫病诊断试剂盒和包虫病疫苗的提供有利条件。

本发明的技术方案是通过以下方式得到的：一种细粒棘球绦虫发育阶段表达分泌蛋白的基因芯片，其特征在于：在载体上组合有分离出的细粒棘球绦虫原头蚴、囊泡、六钩蚴、成虫四个发育阶段表达分泌蛋白cDNA表达序列标签的序列，该cDNA序列具有SEQ ID No. 1～SEQ ID No.30所示的序列。

下面是对上述技术方案的进一步优化和/或选择：

上述cDNA序列具有SEQ ID No.1～SEQ ID No.30所示的序列中的一条或数条的组合。

上述cDNA序列包括SEQ ID No. 1～SEQ ID No.30所示的序列中每条序列的互补序列或同源序列。

上述cDNA序列包括SEQ ID No. 1～SEQ ID No.30所示的每条序列中的8～100个连续核苷酸为探针的序列或其互补序列。

在上述载体上结合有SEQ ID No. 1～SEQ ID No.30所示的序列、同源序列或其互补序列的核酸分子。

上述载体为固相载体或液相载体。

上述固相载体为玻片、硅片、尼龙膜、硝酸纤维膜、凝胶。

上述核酸分子为脱氧核糖核酸、核糖核酸和多聚寡核苷酸。

本发明所述的基因芯片是应用于生物功能的检测；所说的生物包括动物以及它们的细胞、组织器官及其系统；所说的生物功能的检测包括包括抗囊型包虫病的药物靶点的筛选、囊型包虫病诊断标志物的筛选、细粒棘球绦虫与宿主（中间宿主和终末宿主）的相互作用机制的分析、病原体的检测和诊断、生物物种的鉴定，包括动物和微生物。

本发明的优点是：

1．用获得的新的表达序列标签制成表达序列标签芯片具有许多商用价值和科研价值：（1）应用该基因芯片也可用于抗囊型包虫病的药物靶点的筛选，筛选出最佳的抗包虫药物分子。（2）应用该基因芯片也能用于对囊型包虫病诊断标志物的筛选，以研发具有高特异性的包虫病诊断试剂盒。（3）应用该基因芯片还可用于囊型包虫病保护性抗原的筛选，以研发可用于畜牧业和宠物犬的包虫病疫苗研制。（4）应用该基因芯片还可用于细粒棘球绦虫与宿主（中间宿主和终末宿主）的相互作用机制研究，利于对发现治疗囊性包虫病的新方法。（5）应用该基因芯片还可用于细粒棘球绦虫发育机制研究，为发现寄生虫发育调控机制提供重要的理论依据。（6）应用该基因芯片还可以运用基因转染细粒棘球绦虫研究该寄生虫中胞间和胞内信号转导，为发现寄生虫中的基因功能和生理代谢途径提供重要的理论依据。 （7）该基因芯片能够作为一种商品，广泛应用于临床，医药行业以及实际生产中。

2．可以利用这些新的表达序列标签绘制基因图谱。如果一个表达序列标签在基因组中只出现一次，那么它可以做为序列标签位点(STS)。由表达序列标签构建的物理图谱叫表达图或转录图(expression or transcript maps)。利用表达序列标签进行基因图制作，可以加快序列标签位点的制作和新基因的染色体定位。

3．表达序列标签序列可以作为基因特异性探针，对组织特异性基因表达的研究具有重要的作用。

4．这些新的表达序列标签丰富了表达序列标签数据库，并可以最大限度地利用公开的表达序列标签数据库信息，大大缩短克隆新的全长互补脱氧核糖核酸的周期并可减少克隆的成本，加快寄生虫的生物信息积累较薄弱的基因克隆进度。

5．表达序列标签还可进行新基因的遗传进化关系分析。表达序列标签可以对所有动植物的基因作为一种标签库，通过不同的序列比较可以获得保守序列片段，从而获得基因的遗传进化图谱。

附图说明

附图1为本发明中的细粒棘球绦虫表达谱芯片上点阵的分布示意图；Y1-Y8:外标，No.1-No.2:细粒棘球绦虫基因，H：阳性对照，K：阴性对照，B：空白。

附图2为本发明中的细粒棘球绦虫原头蚴（cy5）和生发层（cy3）比较cDNA芯片的双通道激光扫描图。

具体实施方式

本发明不受下述实施例的限制，可根据上述本发明的技术方案和实际情况来确定具体的实施方式。

下面结合实施例对本发明作进一步论述：

实施例1, cDNA文库的构建

利用Clontech公司提供的Creator SMART cDNA文库构建试剂盒，参照其说明书进行Eg cDNA文库的构建。

一、总RNA的提取

采用了Chomezynski和Sacchi(1988)的方法准备总RNA和为poly(A)+RNA 进行寡聚dT纤维素层析（Sambrook et a1．，1989）。

从患囊型包虫病的新鲜羊肝组织中提取细粒棘球绦虫原头蚴，液氮冻存。取出l00mg组织，液氮中磨成粉末后，加1 ml Trizol液研磨，研磨液室温放置5分钟，移至2mL玻璃套管中（DEPC处理过的），冰上匀浆20次后，移入1.5mL EP管中，然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒,12000g 10min。取上层水相于一新的离心管，按每ml Trizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟，12000g离心10分钟。弃去上清液，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，涡旋混匀，4℃下7500g离心5分钟。小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟。自然干燥后将RNA溶于DEPC处理过的水中，分装置于-70℃保存备用。

二、带poly(A)+的RNA的分离

(1)用3倍柱床体积的灭菌水冲洗柱床体积为0.5～l.0 ml的一次性oligo(dT)-纤维素层析柱柱床。

(2)用灭菌的1×层析柱加样缓冲液(20mmol/LTris．HCl(pH7.6)，0.5mol/LNaCl，Immol/L EDTA(pH8.0)，0.1%十二烷基肌氨酸钠）冲洗柱床直至流出的液体的pH值小于8.0。

(3)用灭菌水溶解RNA，于65℃温育5分钟后使其迅速冷却至室温，加等体积的2×层析柱加样缓冲液，上样，立即用灭菌的试管收集洗出液，再用1倍柱床体积的l×层析柱加样缓冲液，继续收集洗出液。

(4)将收集的全部溶液置于65℃温育5分钟，重新上样，并收集流出液。

(5)用5～10倍柱床体积的l×层析柱加样缓冲液洗柱，分部收集洗出液，每份lml，并测定OD值。

(6)用2～3倍柱床体积的灭菌的无RNA酶的洗脱缓冲液(l0 mmol/L Tris.HCl (pH7.6),Immol/L EDTA (pH8.0,0.05% SDS))洗脱poly(A)+RNA，以1/3～1/2柱床体积分部收集洗脱液。

(7)测定收集液的OD值。

(8)在poly(A)+RNA溶液中加入3mol/L乙酸钠(pH5.2)至终浓度为0.3mol/L 并混匀。加2.5倍体积的冰乙醇，混匀冰浴至少30分钟。

(9)4℃l0000g离心15分钟回收poly(A)+RNA，小心弃去上清液，用70 %乙醇沉淀，离心片刻，空气中晾干。

(10)用少量水重溶RNA，测定OD值。

(11)将poly(A)+RNA溶液置于聚丙烯离心管中，加3倍体积乙醇，混匀于-70℃保存备用。

三、cDNA的制备

(1)第一链的合成

将0.5 μg poly(A)+RNA、1μl SMART Ⅳ 寡核苷酸和1μl CDS Ⅲ/3’PCR引物混匀，加无菌水至终体积为5 μl。轻轻混匀后，将试管放入72℃孵育2～3分钟，并快速放在冰上冷却2分钟。按照下列顺序加入试剂：2 μl第一链buffer(5×)、1 μ l dNTP混合物(每种l0mM)、1 μl二硫苏糖醇(20 mM DTT)和1 μl SMARTScribe MMLV反转录酶(200U/u l)。混匀后42℃孵育1小时。置于冰上终止反应。

(2) 长距离PCR法扩增cDNA

取2 μ l第一链反应混合物，加入80μl去离子水、10μl高级2PCR buffer(10×)、 2 μ l 50× dNTP Mix、2 μ l 5’ PCR引物、2 μ l CDSⅢ/3’PCR 引物和2 μ l 50×高级2聚合酶混合物。混匀后按照下面程序反应：95℃ 1分钟 1个循环，（95℃ 15秒，68℃ 6分钟）22个循环。

（3）蛋白酶消化

取50μ l 双链cDNA，加入2μ l （20μ g/μ l）蛋白酶K，混匀后在45℃孵育20分钟。加入50 μl去离子水，加入100μl氯仿/异丙醇，混匀1-2分钟后，14000转/分离心5分钟。转移水相到一干净的0.5 ml离心管中。加入10 μl 3M 醋酸钠、1.3 μl糖原（20 μg/μl）和260 μl 室温的95%乙醇，14000转/分 室温离心20分钟。移除上清，80%乙醇洗涤沉淀，空气干燥后，加入79μl去离子水溶解沉淀。

（4）Sfil 限制性内切酶消化

在一干净的0.5ml 离心管中加入79μl cDNA、10μl 10×Sfi 缓冲液、10μl Sfil 限制性内切酶和1μl 100×牛血清白蛋白。混匀后，在50℃孵育2小时。加入2μl 1%二甲苯蓝染色液，混匀。

（5）cDNA片段化

往试剂盒提供的预制好的CHROMA SPIN-400 离心柱，加入700μl柱缓冲液。当缓冲液流尽，加入100μl Sfil 限制性内切酶消化好的cDNA。直到cDNA溶液被完全吸收，加入100μl柱缓冲液，直到缓冲液流尽。将离心柱放在第一个离心管中，加入600μl 柱缓冲液，用16个干净的1.5ml 离心管收集流出液，每管约35μl。每个离心管取3μl液体在1.1%溴化乙锭染色琼脂糖凝胶电泳，150伏电泳10分钟。收集前3管含cDNA的溶液，并混合在一起。加入1/10体积的3M乙酸钠、1.3μl 20mg/ml糖原和2.5倍体积-20℃ 95%乙醇，混匀后在-20℃放置1小时。14000转/分 室温离心20分钟，吸弃上清，室温干燥10分钟，加入7μl 超纯水溶解沉淀。

四、连接双链cDNA到pDNR-LIB质粒

按照连接反应配方表（即表1连接反应配方表）配制连接反应液，16℃孵育过夜。每管分别加入95μl 无RNA酶水、1.5μl糖原和280μl冰浴冷的95%乙醇，-70℃孵育2小时，15000转/分室温离心20分，小心移除上清，每管添加5μl无RNA酶水。

五、连接产物转化大肠杆菌

在A、B、C三管连接产物中，分别加入25μl感受态细胞，转移到0.1cm电击杯中，电击后，转移到聚丙烯酰胺管中并加入970μl LB培养基，225转/分 37℃孵育1小时。孵育后，取1μl孵育液，加入50μl LB培养基，并涂布在含30μg/ml的90mmLB固体培养基上37℃培养过夜。将三个固体平板上的菌混合在一起，形成未扩增文库。

六、文库滴度计数

取1μl 未扩增文库加入1ml LB培养基，标记为稀释液A（1:10³）。取1μl 稀释液A加入1ml LB培养基，标记为稀释液B（1:10⁶）。取1μl稀释液A加入50μl LB培养液涂布在含30μg/ml的90mmLB固体培养基上。取50μl和100μl稀释液B分别涂布在含30μg/ml的90mmLB固体培养基上。37℃培养过夜。计数平板上生长出的菌落。

七、质粒文库的扩增

将未扩增文库涂布在含30μg/ml的LB固体培养基上，37℃培养18-20小时，加入5ml 含25%甘油的LB培养液，洗涤培养基上的菌落。-80℃培养过夜。

实施例2, cDNA文库测序

一、 菌落PCR鉴定

（1）随机挑选40000个cDNA文库单菌落，于5mL LB培养液中，培养过夜。分别从每管取出l μl菌液作为模板，以M13通用引物（正向引物为5’-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3’，反向引物为5’-ACGGATAATTTCACACAGG-3’）为引物进行PCR扩增，以证实克隆是否有目的片段插入及是否为单一产物。

（2）按表2(即表2 PCR反应配方表)条件建立PCR反应混合物 (MasterMix)

（3）混匀，短暂离心。

（4）进行PCR反应，反应参数如下： 94℃ 30秒 1个循环，（94℃ 30秒，68℃ 3分钟）35个循环，68℃ 5分钟 1个循环。

（5）循环结束时分别取5ul产物，在 l×TAE缓冲液2.0%琼脂糖/EB凝胶上电泳观察产物情况，条带大于700bp被认为有克隆序列，根据电泳结果去除无条带或有多条带的菌种及PCR产物。

二、插入片段测序:

根据菌液PCR结果，随机选取30000个插入片段大小的单一性克隆，测序由北京标凯科技有限公司代理。所用测序仪器为 ABI pRISM3730。测序引物为载体上的通用测序引物M13序列。用非冗余序列对公共表达序列标签数据库进行检索，将其分类，获得9065个单基因EST序列。

三、基因序列信息注释

以美国国立生物技术信息中心（NCBI）、欧洲生物信息学中心（ebi）的InterPro和京都基因与基因组百科全书（KEGG）等数据库的序列信息为库文件，利用Blast2Go软件对文库测序获得的9065个单基因EST序列信息进行注释。根据注释结果，选择具有信号肽且与药物靶点、诊断抗原和保护性抗原相关的30个分泌蛋白的cDNA序列，作为本基因芯片的探针。

实施例3 基因芯片的制备

一、对新的表达序列标签进行重新扩增

选择SEQ ID No.1～SEQ ID No.30的PCR产物为模板，稀释100倍后分别进行PCR扩增（DNAengine PCR仪-美国伯乐公司），引物为通用引物M13（正向引物为5’-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3’，反向引物为5’-AGCGGATAATTTCACACAGG-3’），每l00 μl的反应体系包括：10×PCR buffer 10 μl；25 mmol/L MgCl₂ 7 μl；100 ng/μl的正反向引物各1 μl，20 mmol/L dNTP l μl,3 U的Tag DNA Polymerase (Promega,USA)和约10 ng 的质粒模板。PCR扩增流程：94℃预变性4 min，每个循环于94℃变性30 s，58℃退火60 s，72℃延伸120 s；36-40个循环后，72℃延伸10 min。

二、PCR产物处理

加200μl（2倍体积）的乙醇或100μl的异丙醇至100 μl 的PCR扩增产物中混匀，-20℃ 30 min。在4℃和12000 rpm下离心5 min沉淀DNA样品，然后加100μl 75%乙醇洗一次，12000 rpm离心5 min，小心倾覆去上清，真空抽干余液，加10 μl灭菌水重溶。再取0.5μl电泳检测是否在回收过程中有DNA的丢失，-20℃保藏。

三、芯片制备

分别取5μlSEQ ID No.1～SEQ ID No.30的PCR产物纯化产物，加5μl 2×DNA点样液至384孔板中。样品浓度为0.05 - 0.2 μg/μl，用博奥生物有限公司的SmartArrayer-136型点样仪点样，microarray载体为博奥生物有限公司制备并提供的三维氨基基片。同时点在玻片上的样品还包括博奥生物有限公司提供的外标对照Y1 - Y8序列、Hex阳性固定以及阴性对照。

细粒棘球绦虫基因芯片由1个点阵组成。每个点阵的排列方式为7×18，除空白点外，每个点重复3次。第一行分别为外标Y1～Y6，第二行分别为外标Y7～Y8，阳性对照（标记有荧光染料HEX的核酸）和阴性对照（空白点样液），最后6个点为空白点，第三行开始为细粒棘球绦虫的30个基因。点阵的排布图见图1所示。

实施例4 基因芯片的检测

一、 RNA的提取

（1） 取100mg细粒棘球绦虫组织，在液氮中磨成粉末后，加入1ml美国invitrogen公司提供的 Trizol液研磨，室温放置5分钟，移至2mL玻璃套管中（DEPC处理过的）。

（2） 冰上匀浆20次后，移入1.5mL EP管中，然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒，12000g离心10分钟。

（3） 取上层水相于一新的离心管，按每mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟，12000g离心10分钟。

（4） 弃去上清液，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，涡旋混匀，4℃下7500g离心5分钟。

（5） 小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于水中，必要时可55℃-60℃水溶 10分钟。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。

（6） 电泳：取0.5μg的RNA，加入4 μl RNA加样缓冲液，65℃加热5 min，冰上骤冷， RNA样品中加入1.0 mg/mL的溴化乙锭（EtBr），1.2%的甲醛变性胶先在1×甲醛变性胶电泳缓冲液中预电泳15-30 min。RNA样品40V电压降下电泳1 h。紫外凝胶成像仪中观察，当5s条带RNA较少，RNA条带单一没有降解时，质量合格，可用于后续试验。

二、 RNA标记具体步骤

取1μgRNA按表3（即表3. 反转录合成1st-strand cDNA）步骤加入所有试剂，42℃反应2 h，冰上骤冷5 min，瞬时离心。

按表4（即表4. 合成2nd-strand cDNA）将各试剂轻轻混匀，16℃反应2 h，反应结束后立即纯化。cDNA纯化：使用Nucleospin® Extract Ⅱ( MN公司,cat# 740.609.250 )试剂盒。

（1） 按表5（即表5. 体外转录合成cRNA）将各试剂轻轻混匀，短暂离心将溶液收集于管底，37℃反应4-14 h。反应完后在产物溶液中加入60 μl无核酸酶水，使用Nucleospin® RNA Clean-up ( MN公司，Ｃat# 740.948.250 ) 试剂盒纯化cRNA。

（2） 按表6（即表6. 反转录）将各试剂轻轻混匀，短暂离心将溶液收集于管底。25℃反应10 min，37℃反应1.5 h。反应结束后，加入Terminate solution 5 μl，混匀。65℃反应10 min，冰浴5 min，加入Neutralize solution 1 μl，加入无核酸酶水24 μl，混匀，准备纯化。使用Nucleospin® Extract Ⅱ纯化。

（3） 按表7(即表7. 标记反应)将各试剂轻轻混匀。37℃反应1.5小时，70℃反应5分钟，冰浴5分钟。反应结束后，加入无核酸酶水25 μl，准备纯化。使用Nucleospin® Extract Ⅱ( MN公司，Ｃat# 740.609.250 )试剂盒。

三、 芯片杂交

（1） 杂交体系的配制与变性过程 杂交体积为80 μl，按表8（即表8. 杂交液体系配制）所述体系配制杂交液，将溶液转移到0.2 ml的离心管中，短暂离心。95℃热变性3 min，冰浴骤冷2-3 min，用于杂交。

（2） 杂交盒与杂交 然后把贴好围栏的含有30基因探针的基因芯片放入杂交盒内，点有探针的一面朝上。将80μl杂交液点在芯片上，然后轻轻盖上盖玻片，避免产生过多气泡。快速把玻片放入杂交盒内（杂交盒内的凹槽内预先加入150 μl蒸馏水），盖紧杂交盒盖，再将杂交盒放入BioMixerⅡ芯片杂交清洗仪中，42℃，杂交12- 14 h。

四、 芯片洗涤

（1） 先后将洗液I、洗液II放在微波炉中预热至42℃，转置到清洗盒中。

（2） 杂交结束后，将芯片转移到盛放洗液的清洗盒中，去除盖片，杂交面朝上，放在水平摇床上缓慢清洗。清洗步骤如表10（即表10. 三维氨基芯片的洗液配制及清洗条件）

（3） 芯片清洗后，放在50 ml锥形离心管中，2000 rpm离心1分钟，除去玻片表面的液体，此时的芯片可以用于扫描。

五、 芯片扫描

细粒棘球绦虫基因芯片使用博奥公司生产的LuxScan 10K- A双通道激光共聚焦扫描仪扫描

（1） 启动LuxScan 10K- A应用程序。程序开始搜索扫描仪和系统自检，系统自检无误后，应用程序进入主界面。

（2） 打开红色、绿色2个激光器进行预热（约10 min），将芯片平稳放置在托架小片上，水平轻缓地推入扫描仪仓口，载入芯片，设定扫描区域和扫描参数。

（3） 双通道扫描，在扫描第二个通道时，会同时产生合成图像，是两个通道图像叠加后的结果。合成图是伪彩渲染的图像，仅供直观显示。

（4） 在进行扫描操作时要以外标Y1-Y4所在位置进行Cy3和Cy5荧光通道的平衡，选择合适的激光功率（Laser Power）和光电倍增系数（PMT Gain）设置使其Cy5和Cy3信号的比值约为1.0，此过程也叫硬件归一化。以荧光交换实验中的芯片相对应的block为例，平衡后的扫描条件是，Cy5和Cy3通道激光强度分别为82和75。Cy5和Cy3通道的光电倍增系数（PMT Gain）分别为800和720。分别截取相应单一点阵的扫描图片及假色重叠图。

原头蚴和生发层基因差异性表达的伪彩色重叠图见图2。红色表示原头蚴中高表达的基因的，绿色表示生发层中高表达的基因，黄色表示热激条件下该基因表达水平不变。

利用LuxScan3.0提数后就可以进行lowess归一化处理，计算归一化之后的荧光强度比值（本实验中就是Cy5/Cy3的比值）。

本发明的SEQ ID No. 1～SEQ ID No.30序列详见序列表。

Claims (4)

1. 一种细粒棘球绦虫发育阶段表达分泌蛋白的基因芯片，其特征在于：在载体上组合有分离出的细粒棘球绦虫原头蚴、囊泡、六钩蚴、成虫四个发育阶段分泌蛋白cDNA表达序列标签的序列，该cDNA序列由SEQ ID No. 1～SEQ ID No.30所示的序列组成。

2. 根据权利要求1所述的基因芯片，其特征在于cDNA序列由SEQ ID No.1～SEQ ID No.30所示的序列中的30条组合。

3. 根据权利要求1或2所述的基因芯片，其特征在于载体为固相载体或液相载体。

4. 根据权利要求3所述的基因芯片，其特征在于固相载体为玻片、硅片、尼龙膜、硝酸纤维膜、凝胶。