JP2003061666A - 多段階差次的クローニング技術と細胞増殖制御遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 特定の生理現象にある細胞において特異的に
発現する遺伝子を簡便かつ確実にクローニングする方法
と、この方法によって同定された細胞増殖制御遺伝子を
提供する。 【解決手段】 異なる生理現象を示す細胞ＸおよびＹに
おいてそれぞれに発現する遺伝子のライブラリーから共
通に発現する遺伝子を削除する操作を３回以上繰り返
し、細胞Ｘで特異的に発現する20〜500個の遺伝子を特
定することを特徴とする多段階差次的クローニング方法
と、細胞周期静止期のヒト細胞で特異的に発現し、その
cDNAが、特定の塩基配列を有する細胞増殖制御遺伝子。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この出願の発明は、特定の生
理現象を示す細胞において特異的に発現する遺伝子（発
現特化型遺伝子）を高効率でクローニングする方法と、
この方法を用いて単離したヒト細胞増殖制御遺伝子（あ
るいはヒト静止期発現特化型遺伝子）とその発現タンパ
ク質に関するものである。これらの遺伝子や発現タンパ
ク質は、多彩な病気の診断や治療のための方法や薬剤の
開発に有用である。

【０００２】

【従来の技術】生体の構造や生理現象に関与する遺伝子
を特定する方法として、ゲノム遺伝子から転写されるmR
NAから合成されるcDNAを単離する方法が広く用いられて
いる。cDNAの単離法として従来採用されてきた方法は、
相同クローニング法、相互作用クローニング法、機能ク
ローニング法の３つに大別できるが、これら従来のクロ
ーニング法は基本思想が一本釣りであるため包括的な解
析が不可能である。例えば、最初に開発されたdifferen
tial hybridization法や近年PCRを利用して開発されたd
ifferential display法は、いずれも転写誘導の差が大
きいハウス・キーピング遺伝子が繰り返し単離される確
率が高いため、実際に単離できる遺伝子の総数は限られ
ており、よほどの幸運に恵まれない限り現象の本質に迫
れる重要な遺伝子に遭遇することがなかった。そこで一
網打尽にcDNAがクローニングできるのみでなく、機能に
まで迫れるタイプの新たな方法論が望まれてきた。

【０００３】ヒトの全ゲノム塩基配列が決定されたポス
トゲノム時代に入って、約３万種類存在するといわれる
mRNA（cDNA）を全て貼り付けたcDNAマイクロアレイを作
成すれば発現特化型cDNAを単離することが原理的には可
能となった。しかしながら、この実行には非常に高額な
費用と手間がかかること、データの読み取りや解析に高
価な機器の設置と多大な時間と費用が必要なこと、ハイ
ブリダイゼーションの強弱を基本としたデータは厳しく
再現性をテストする必要があるため、最終的にはノーザ
ン解析による確認が必要なこと、などの理由からもっと
高効率で安価に実行可能な技術の開発が望まれてきた。

【０００４】一方、抗癌剤は数多くあるが、その多くが
通常は静止期（G0期）にある正常細胞よりも、静止期に
入ることができず常に増殖を続けている癌細胞が正常細
胞よりも増殖が早いという期待のもとに、癌細胞に優先
的に取り込ませて殺傷する薬剤である。しかし実際には
それらは増殖している正常細胞にも取り込まれるため副
作用が強い。静止期(G0)にある細胞は、細胞周期を離れ
た状態にあり、一切の増殖が停止した状態にある。その
状態を維持するには何らかの強力な増殖抑制因子が発現
し、機能している可能性が以前より指摘されていた。し
かし、細胞周期における静止期の研究は遅れており、静
止期特異的に発現誘導を受ける遺伝子の報告はごく僅か
である。細胞が増殖を停止している状態としては、静止
期(G0)の他に老化細胞がある。老化細胞特異的に発現上
昇の認められる遺伝子に関しては、現在までに多数の報
告があり、その中には癌抑制遺伝子の候補である可能性
が示唆されているものも含まれている。従って、癌細胞
では静止期(G0)で特異的に発現が誘導される遺伝子群の
中で、強力な増殖抑制因子として機能しているものが失
われている可能性がある。その様な遺伝子群を単離する
ことができれば、未知の癌抑制遺伝子の発見につながる
ことが十分に期待できる。臨床的な視点からみても、以
下のような利点が考えられる。 1) 現在の癌治療の主流である化学・放射線治療等は、
癌細胞のみならずその周囲の正常細胞までも損傷させて
しまうため、患者に対する副作用等の負担が大きいが、
G0期特異的な増殖抑制因子の発現を促すという方法に基
づいた治療法であれば、多くの癌細胞の増殖を有効的に
抑制する。 2) もともと静止期にある周囲の正常細胞にはほとんど
悪影響(副作用)を与えない。 3) 癌抑制遺伝子p53による遺伝子治療が既に行われて
いることからも、新規癌抑制遺伝子の発見が新たな遺伝
子治療や遺伝子診断に繋がっていく。 4) 従来の抗癌剤では癌細胞を全て殺すことはできない
ため少数の悪性化が進んだ癌のみが残り、生存競争して
いた普通の癌細胞が殺されたあとで一層活動的な転移癌
となって広がってゆくという過程をとることが多い。ま
たエンドスタチンのような血管新生を阻害して兵糧責め
により癌を大きく増やさない薬物も開発されている。し
かし、これとて癌を根元的に撲滅するわけではないた
め、新しい癌増殖抑制剤の開発が望まれていた。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】前記のとおり、細胞静
止期には増殖を阻害する因子が転写誘導されることが期
待されるが、実際の静止期における増殖阻害に決定的な
役割を果たすヒト遺伝子は特定されておらず、また当然
のことながら静止期特異的なヒト遺伝子も特定されてい
なかった。その理由の一つとして、特定の生理現象にあ
る細胞（例えば細胞静止期）において特異的に発現する
遺伝子を高効率でクローニングする方法が存在していな
いことが挙げられる。

【０００６】この出願の発明は、以上のとおりの事情に
鑑みてなされたものであって、特定の生理現象にある細
胞において特異的に発現する遺伝子を簡便かつ確実にク
ローニングする方法を提供することを課題としている。

【０００７】またこの出願の発明は、癌細胞は静止期に
入れないという特徴を持つという事実を利用して、腫瘍
診断や治療に有用な細胞増殖制御遺伝子と、その発現タ
ンパク質、並びにこのタンパク質に対する抗体を提供す
ることを課題としてもいる。

【０００８】さらにまた、この出願の発明は、前記の遺
伝子材料を利用した診断等のための手段を提供すること
を課題としている。

【０００９】

【課題を解決するための手段】この出願は、前記の課題
を解決するものとして、以下の(1)〜(14)の発明を提供
する。 (1) 異なる生理現象を示す細胞ＸおよびＹにおいてそ
れぞれに発現する遺伝子のライブラリーから共通に発現
する遺伝子を削除する操作を３回以上繰り返し、細胞Ｘ
で特異的に発現する20〜500個の遺伝子を特定すること
を特徴とする多段階差次的クローニング方法。 (2) 細胞Ｘが細胞周期静止期のヒト細胞であり、細胞
Ｙが細胞周期増殖期のヒト細胞である前記発明(1)の多
段階差次的クローニング方法。 (3) 前記発明(2)の方法によってクローニングされた遺
伝子であって、細胞周期静止期のヒト細胞で特異的に発
現している細胞増殖制御遺伝子。 (4) cDNAが、配列番号１−４０の奇数配列番号のいず
れかの塩基配列を有する細胞増殖制御遺伝子またはそれ
らの集合。 (5) 前記発明(4)の細胞増殖制御遺伝子のゲノムDNA、m
RNA、cDNAまたはそれらの相補配列から精製されたポリ
ヌクレオチド。 (6) 前記発明(4)の細胞増殖制御遺伝子または前記発明
(5)のポリヌクレオチドにハイブリダイズする、10塩基
対以上の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。 (7) 前記発明(5)のポリヌクレオチドを保有する組換え
ベクター。 (8) 前記発明(7)の組換えベクターによる形質転換体細
胞。 (9) 前記発明(3)の細胞増殖制御遺伝子の発現産物であ
るヒト細胞増殖抑制タンパク質。 (10) 前記発明(4)の細胞増殖制御遺伝子の発現産物で
あって、配列番号１−４０の偶数配列番号のいずれかの
アミノ酸配列を有するヒト細胞増殖抑制タンパク質また
はそれらの集合。 (11) 前記発明(8)の形質転換体細胞によって産生され
る前記発明(10)のヒト細胞増殖抑制タンパク質。 (12) 配列表の偶数配列番号のいずれかのアミノ酸配列
における連続５アミノ酸残基以上のアミノ配列からなる
ペプチド。 (13) 前記発明(9)または(10)のヒト細胞増殖抑制タン
パク質を認識する抗体。 (14) 前記発明(5)のポリヌクレオチドの少なくとも
１、または前記発明(6)のオリゴヌクレオチドの少なく
とも１と、担体とからなる組成物。 (15) 前記発明(14)の組成物を備えた検索・診断キッ
ト。

【００１０】すなわち、前記発明(1)の方法によれば、
特定の生理現象を示す細胞Ｘにおいて特異的に発現する
遺伝子20〜500種を同定することができる。そして、細
胞Ｘとして静止期にある細胞を対象とすることによっ
て、前記発明(3)の細胞増殖制御遺伝子（以下、「TIGA
遺伝子」と記載することがある）が単離された。このTI
GA遺伝子（群）は増殖抑制を引き起こすことから、これ
らを癌に導入して大量発現させれば癌を強制的に静止期
に導入し、癌細胞の増殖を抑止することが可能となる。
また、こららTIGA遺伝子の大量発現と同じ状態を実現で
きる薬剤を新たに開発すれば、正常細胞は元来個体の中
で静止期にあることを考えると副作用の無い抗癌剤とし
て用いることができると期待される。

【００１１】一方、癌細胞は本来は静止期に入れないこ
とを考えると、癌細胞はTIGA遺伝子群のうちのいずれか
が欠損していることが考えられる。実際、単離した既知
の塩基配列を持つTIGA遺伝子の幾つかは、すでに癌抑制
遺伝子として機能していることが知られている遺伝子で
あった。そこで前記発明(14)の組成物（具体的にはDNA
マイクロアレイ、DNAチップ）を用いて患者の癌細胞に
おける発現遺伝子を調べ、どのTIGA遺伝子の発現が欠失
しているかどうか診断することで、個別な癌細胞に合わ
せたテーラーメード（tailormade）な抗癌剤の選択によ
る癌治療を行う道が開ける。

【００１２】この出願の発明は、以上のとおりの新規ヒ
ト遺伝子およびその発現タンパク質を基礎とするもので
ある。なお、前記の発明において、「ポリヌクレオチ
ド」および「オリゴヌクレオチド」は特定塩基数の断片
を意味するものでなく、一応の目安として100bp以上の
断片をポリヌクレオチド、100bp未満の断片をオリゴヌ
クレオチドとするが、例外も存在する。同様に、オリゴ
ペプチドについても特定範囲のアミノ酸残基数に限定さ
れるものではない。

【００１３】以下、この出願の発明について、実施形態
を詳しく説明する。

【００１４】

【発明の実施の形態】発明(1)の遺伝子クローニング方
法の原理は、対象となる２つの生物現象を示す細胞Ｘと
Ｙにおいて、サブトラクション（差分化）を段階的に繰
り返すことで、細胞Ｘでのみ発現する（あるいはmRNA存
在量が格段に異なる）mRNA（現実にはcDNA）分子を高効
率に短期間で全てクローニングすることである。その手
順を簡略に説明すると以下のようになる（図１参照）。
まず対象となる２つの生物現象の両方からmRNAを調整す
る。ＸとＹを並べた小さなノーザンブロットを100枚く
らい作製してノーザン解析に用いる。まず差分化される
方（Ｘ）についてcDNAライブラリーを作製する。つぎに
差し引きたい方（Ｙ）のmRNAをビオチン化し、ｆ１ヘル
パーファージを用いて単鎖化したＸのcDNAライブラリー
と加熱徐冷結合（ハイブリダイズ）させ、類似の塩基配
列を持つために塩基対を形成したDNA/mRNA混合物をビオ
チンと結合して複合体を作るアビジンと混ぜ、遠心によ
って取り除く。上澄みには、相補mRNAが存在しないか、
または相補mRNAが極めて少ないために単鎖のままのcDNA
が残存する。この残った単鎖cDNAをプライマー存在下で
DNAポリメラーゼを働かせることにより２重鎖とし、大
腸菌コンピテントセルに導入することで差分化cDNAライ
ブラリー（一次差分化cDNAライブラリー）を作製する。

【００１５】次に、一次差分化cDNAライブラリーから無
作為に数100クローンを選んでプラスミドDNAを調製す
る。これらすべてに番号をつけて、制限酵素切断によっ
て挿入cDNAを切り出す。得られたcDNAsの半量を用いて
サザンブロットを作製する（図２）。実験の効率を上げ
るため１枚のアガロースゲル電気泳動において80サンプ
ルくらいは載せられるような微小な泳動溝を持つアガロ
ースゲルを作製し、順番にサンプルを載せ、泳動も４段
に重ねてミクロな解析を行う。これによって数枚のサザ
ンプロットを作製するだけで数百すべてのクローンが解
析できる。このうち10から30クローン、好ましくは約20
クローンを無作為に選び、残り半分のサンプルから調製
用アガロースゲル電気泳動により、そのcDNAの挿入部分
を切り出す。これを³²Ｐで標識してプローブとする。こ
のプローブの半分をノーザン解析（２つのサブトラクシ
ョン系での転写量の違いを検索するため）に、残りをサ
ザン解析（重複クローンを除外するため）に用いる。ノ
ーザン解析によればこの一次差分化cDNAライブラリーの
うち何％がＸにおいてＹよりも転写量が増加している目
的のクローンなのかの推測ができる。一方、サザン解析
によってはハイブリダイズしなかったクローンを順番ど
うりさらに約20クローンを無作為に選び、再びcDNAの挿
入部分を切り出して、³²Pで標識してプローブとする。
これを再びノーザン解析およびサザン解析にかける。こ
のステップを数百すべてのクローンの解析が終了するま
で繰り返す。ただし、繰り返してゆくうちに重複クロー
ンは解析から除外されるために解析クローンが激減して
くるので、数回このステップを繰り返すだけで数百すべ
てのクローンの解析は終了する。

【００１６】以上のステップによって単離される目的と
するクローン（ＸとＹでのmRNA存在量が格段に異なるも
の）はノーザン解析によって以下の３種類に分類される
（図３）。 TYPE I：Ｙではほとんど発現されておらず、Ｘでは劇的
にｍＲＮＡ存在量が増加するもの。 TYPE II：Ｙでも少し発現がみられ、Ｘでは数倍程度の
発現量上昇が観察されるもの。 TYPE III：ノーザンブロットにおいて二本以上のバンド
が見られ、そのうち一つのみがＸにおいてTYPE I様のmR
NA存在量変化を示すもの。

【００１７】この結果は逐一プロットしてゆく。原理的
には図４に示すような曲線を描くと期待される。すなわ
ち、横軸には数百すべてのクローンの番号をプロット
し、縦軸にはその番号に至るまでに分かった目的とする
クローン（ＸとＹでのmRNA存在量が格段に異なるもの）
の数をプロットする。各プロットを結んでゆくと曲線が
描けるが、その形から数百以上は解析するクローンの数
をふやして同様な解析を続けても重複クローンばかりが
出てくるようになって効率が悪くなる。そこで以下のと
おりの二次差分化cDNAライブラリーを作製することによ
って解析の効率を向上させる。

【００１８】すなわち、前記のノーザン解析によって目
的とするクローンであると同定したcDNAについては、5'
末端および3'末端（ポリＡ側）から1,000bpずつの塩基
配列を決定する。使用するベクター（pAP3neo：宝酒
造）は、クローニングサイトの5'末端にはT7RNAポリメ
ラーゼのプロモーター配列が、3'末端にはT3RNAポリメ
ラーゼのプロモーター配列が組み込んである。これらに
対するプライマーの存在下でLi-Cor社製のシークェンサ
ーを用いれば１レーンの解読のみで1,000bpずつの塩基
配列決定が可能であり効率は良い。そして、既存のデー
タベース（FASTA、BLAST等）よるホモロジー解析によ
り、これらcDNAが新規遺伝子由来であるか否か、既存タ
ンパク質の持つ機能モチーフを持つか否かなどを検索す
る。得られたデータを整理して目的とするクローンの全
カタログを作成する。

【００１９】数百クローン以上のノーザン解析・サザン
解析を続けても重複クローンばかりが出てくるようにな
った時点で、解析済みの全てのcDNAクローンを集めてT7
RNAポリメラーゼを作用させてcDNAをRNA化し、ビオチン
標識する。一方、一次差分化cDNAライブラリーもｆ１ヘ
ルパーファージを用いて単鎖化しておく。これらを混
ぜ、上述と同様な手法でハイブリダイズし、ビオチン・
アビジンの結合を利用してサブトラクションを行う（図
５）。これを二次差分化cDNAライブラリーと称する。こ
こからまた数百クローンを無作為に選別してプラスミド
DNAを調製し、上述のようにしてノーザン解析・サザン
解析を継続する。プロットや塩基配列決定も同様に行
う。そして、cDNAライブラリー中に含まれるクローンが
30種類以下となるまで、３回以上の解析、差分化を繰り
返す。

【００２０】以上の方法によって、特定の生理現象を示
す細胞において特異的に発現する遺伝子（TYPE I遺伝
子）を同定することが可能となる。そして、細胞静止期
にあるヒト細胞を対象とすることによって（発明2）、
ヒト静止期特異的に転写誘導されるヒトTYPE I TIGA遺
伝子群（発明3）をクローニングすることが可能とな
る。

【００２１】この出願の発明は、これらのTIGA遺伝子と
して具体的に発明(4)の遺伝子20種類を提供する。

【００２２】すなわち、この出願の発明者らは、血清飢
餓状態において培養することで増殖を停止させた状態に
あるヒト初代培養繊維芽細胞から細胞抽出したmRNAを用
いて作成したcDNAライブラリーから、通常の血清量を加
えて増殖状態に置いて培養したヒト初代培養繊維芽細胞
から細胞抽出したmRNAを差し引く（subtraction）こと
で静止期特異的に転写誘導される遺伝子群（TIGA）から
転写されたmRNAが濃縮されたサブトラクティッド（subt
racted）cDNAライブラリーを作成した。そして、前記発
明(1)の方法によってcDNAライブラリーに含まれる静止
期特異的mRNA（cDNA）を実質的に全て単離した。その段
階的サブトラクション曲線を図６に示す。さらに、こら
らの遺伝子群から、TIGA3−TIGA22と名付けた20種類の
新規なヒト遺伝子を単離した。これらTIGA遺伝子はノー
ザンブロット解析の結果、いずれも血清飢餓状態に入っ
てから急激に転写誘導を受ける。これらTIGA遺伝子がコ
ードする蛋白質のアミノ酸配列数に関するデータは表１
にまとめて示す。

【００２３】

【表１】

【００２４】前記のとおり、発明(4)の新規TIGA遺伝子
は、そのcDNAが配列番号１−40の奇数配列番号の塩基配
列を有することを特徴とするゲノム遺伝子である。こら
らの遺伝子は、それぞれ配列番号１−４０の偶数配列番
号のアミノ酸配列を有するヒト細胞増殖抑制タンパク質
（以下、「Tigaタンパク質」と記載することがある）を
コードしている(表１)。

【００２５】この発明(4)の遺伝子TIGAは、後記する発
明(5)のポリヌクレオチド作製のために有用であり、さ
らには各種のヒト悪性腫瘍の診断や、治療薬開発の対象
遺伝子等としても有用である。

【００２６】なお、この発明(4)の新規遺伝子TIGAに
は、それがコードするタンパク質の発現に対する制御領
域（プロモーター／エンハンサー、サプレッサー等）も
含まれる。これらの発現制御領域は、タンパク質Tigaの
機能や、あるいは遺伝子TIGAの発現制御因子の探索に有
用である。

【００２７】この発明(4)の遺伝子TIGAは、例えば、配
列番号１−４０の奇数配列番号の塩基配列またはその一
部配列からなるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオ
チドをプローブとしてヒトゲノムDNAライブラリーをス
クリーニングすることによって単離するすることができ
る。

【００２８】発明(5)は、前記発明(4)の遺伝子TIGAのゲ
ノムDNA、mRNA、cDNAまたはこれらの相補配列から精製
されたポリヌクレオチドである。このようなポリヌクレ
オチドは、発明(6)のオリゴヌクレオチドの調製や、タ
ンパク質Tigaの遺伝子工学的生産のための材料として有
用である。

【００２９】これらのポリヌクレオチドは、ヒト細胞か
ら単離したゲノムDNAやmRNAから公知の方法により精製
することによってDNA断片やRNA断片として得ることがで
きる。また、cDNAはヒト細胞から抽出したポリ(A)＋RNA
を鋳型として合成することができる。ヒト細胞として
は、人体から手術などによって摘出されたものでも培養
細胞でも良い。cDNAは、公知の方法（Mol. Cell Biol.
2, 161-170, 1982; Gene25, 263-269, 1983； Gene, 15
0, 243-250, 1994）を用いて合成することができる。あ
るいは、オリゴヌクレオチドをプライマ−として、ヒト
細胞から単離したmRNAを鋳型とするRT-PCR法を用いて、
目的cDNAを合成することもできる。このようにして調製
されるcDNAはそれぞれ、具体的には配列番号１−４０の
奇数配列番号の塩基配列を有している。なお、一般にヒ
ト遺伝子は個体差による多型が頻繁に認められる。従っ
て前記奇数配列番号の塩基配列において、１または複数
個（10以下）のヌクレオチドの付加、欠失および／また
は他のヌクレオチドによる置換がなされているポリヌク
レオチドもこの発明のポリヌクレオチド（cDNA）の範囲
に含まれる。また、同様に、これらの変更によって生じ
る、１または複数個のアミノ酸の付加、欠失および／ま
たは他のアミノ酸による置換がなされているタンパク質
も、タンパク質Tigaの活性を有する限り、後記発明(10)
のタンパク質の範囲に含まれる。

【００３０】発明(6)は、前記発明(4)の遺伝子TIGAまた
は前記発明(5)のポリヌクレオチドにハイブリダイズす
る、10塩基対以上の塩基配列からなるオリゴヌクレオチ
ドである。これらのオリゴヌクレオチド（DNA断片また
はRNA断片、若しくはそれらのアンチセンス鎖）は、例
えば、遺伝子TIGAやその変異を検出するためのプロー
ブ、あるいはポリヌクレオチドを合成するためのPCRプ
ライマーとして有用である。また、一般の悪性腫瘍診断
用のマイクロアレイ等のためのDNA断片やRNA断片として
使用することもできる。このようなオリゴヌクレオチド
は、常法により合成して調製することもでき、あるいは
場合によっては発明(5)のポリヌクレオチドを適当な制
限酵素で切断することによってもできる。

【００３１】発明(7)は、前記発明(5)のポリヌクレオチ
ドを保有する組換えベクターである。ベクターはクロー
ニングベクターまたは発現ベクターであり、インサート
としてのポリヌクレオチドの種類や、その使用目的等に
応じて適宜のものを使用する。例えば、cDNAまたはその
ORF領域をインサートとしてタンパク質Tigaを生産する
場合には、in vitro転写用の発現ベクターや、大腸菌、
枯草菌等の原核細胞や、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞
等の真核細胞のそれぞれに適した発現ベクターを使用す
ることができる。また、遺伝子TIGAのゲノムDNAをイン
サートとする場合には、BAC（Bacterial Artificial Ch
romosome）ベクターやコスミドベクター等を使用するこ
ともでき、こられらの組換えベクターは、例えば蛍光in
situハイブリダイゼーション（FISH）による染色体異
常を診断するためのプローブとして有用である。さらに
は、遺伝子TIGA由来のポリヌクレオチドをウイルスベク
ター等に組換え、これを遺伝子治療に用いることもでき
る。

【００３２】発明(8)は、前記発明(7)の組換えベクター
による形質転換体細胞である。これらの細胞は、例え
ば、タンパク質Tigaを製造する場合には、大腸菌、枯草
菌等の原核細胞や、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の
真核細胞等を使用することができる。また、遺伝子TIGA
由来のポリヌクレオチドを組み換えたウイルスベクター
によって形質転換した細胞は、遺伝子治療に用いること
もできる。これらの形質転換体細胞は、電気穿孔法、リ
ン酸カルシウム法、リポソーム法、DEAEデキストラン法
など公知の方法によって組換えベクターを細胞に導入す
ることによって調製することができる。

【００３３】発明(9)は、前記発明(3)のTIGA発現産物で
ある。また、発明(10)は前記発明(4)の新規遺伝子TIGA
の発現産物であって、各々、配列表の偶数配列番号のア
ミノ酸配列を有することを特徴とするタンパク質Tigaで
ある。このタンパク質は、抗体作製のための免疫原とし
て、あるいは悪性黒色腫やその他の悪性腫瘍の治療薬を
開発するための標的分子等として有用である。このタン
パク質は、ヒト細胞から単離する方法、偶数配列番号の
アミノ酸配列に基づき化学合成によってペプチドを調製
する方法等によって得ることができるが、好ましくは、
発明(8)の形質転換細胞から単離・精製する方法によっ
て大量に生産せることができる（発明(11)）。すなわ
ち、形質転換体細胞を培養し、その培養物から、例え
ば、尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波
処理、酵素消化、塩析や溶媒沈殿法、透析、遠心分離、
限外濾過、ゲル濾過、SDS-PAGE、等電点電気泳動、イオ
ン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィ
ー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマト
グラフィー等によって単離、精製することによってタン
パク質Tigaを大量に得ることができる。なお、発明(11)
のタンパク質には、他の任意の蛋白質との融合蛋白質も
含まれる。例えば、グルタチン−Ｓ−トランスフェラ−
ゼ（GST）や緑色蛍光蛋白質（GFP）との融合蛋白質など
が例示できる。

【００３４】さらに、細胞で発現したタンパク質は、翻
訳された後、細胞内で各種修飾を受ける場合がある。し
たがって、修飾されたタンパク質も発明(11)のタンパク
質の範囲に含まれる。このような翻訳後修飾としては、
Ｎ末端メチオニンの脱離、Ｎ末端アセチル化、糖鎖付
加、細胞内プロテア−ゼによる限定分解、ミリストイル
化、イソプレニル化、リン酸化などである。

【００３５】発明(12)は、それぞれ偶数配列番号の連続
５アミノ酸残基以上のアミノ酸配列からなるオリゴペプ
チドである。このオリゴペプチドは、例えば抗体作製の
ための抗原として使用することができ、例えば、配列番
号１−４０の偶数配列番号のアミノ酸配列に基づき、公
知のペプチド合成法等により作成することができる。

【００３６】発明(13)は、発明(9)または(10)のタンパ
ク質Tigaを認識するポリクローナル抗体またはモノクロ
ーナル抗体である。この抗体は、細胞でのタンパク質ま
たはその変異体タンパク質の発現を調べることによって
悪性黒色腫やその他の悪性腫瘍の診断を行うための材料
等として有用である。この抗体には、タンパク質Tigaの
エピトープに結合することができる全体分子、およびFa
b、F(ab')2、Fv断片等が全て含まれる。このような抗体
は、例えばポリクローナル抗体の場合には、前記のタン
パク質Tigaやそのペプチドを抗原として用いて動物を免
役した後、血清から得ることが出きる。あるいは、上記
の真核細胞用発現ベクターを注射や遺伝子銃によって、
動物の筋肉や皮膚に導入した後、血清を採取することに
よって作製することができる。動物としては、マウス、
ラット、ウサギ、ヤギ、ニワトリなどが用いられる。免
疫した動物の脾臓から採取したＢ細胞をミエロ−マと融
合させてハイブリド−マを作製すれば、モノクロ−ナル
抗体を産生することができる。

【００３７】発明(14)は、前記発明(5)のポリヌクレオ
チドの少なくとも１種、または前記発明(6)のオリゴヌ
クレオチドの少なくとも１種と、担体とからなる組成物
である。このような組成物は、例えばDNAチップやDNAマ
イクロアレイであり、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌ
クレオチドを担体（基盤）上に直接合成したものであっ
てもよく、あるいはポリヌクレオチドやオリゴヌクレオ
チドが結合するような素材でコーティングした基盤上に
オリゴヌクレオチドをスポットしたものであってもよ
い。そして、標識化した被験サンプルDNAと基盤上のポ
リヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドとのハイブリ
ダイゼーションの有無を指標として、被験サンプル細胞
における細胞増殖抑制遺伝子の発現の有無を検出するこ
とができる。そして、このような組成物を備えたキット
（発明15）は、遺伝子検索や癌診断のための有効な手段
となりうる。

【００３８】以下、実施例を示してこの出願の発明につ
いてさらに詳細かつ具体的に説明するが、この出願の発
明は以下の例によって限定されるものではない。

【００３９】

【実施例】1：材料および方法 1.1：TIG-1(正常ヒト胎児由来2 倍体繊維芽細胞)の培養 1.1.1：材料 DMEM 培地：DMEM(大日本製薬)10 L用1本分(134.8 g)、
炭酸水素ナトリウム37 g(終濃度0.37 %)と結晶ペニシリ
ンGカリウム萬有製薬、100万単位/バイアル)、硫酸スト
レプトマイシン[明治製菓、1 g(力価)/バイアル]各1バ
イアルをMilliQ水10 Lに溶解した。フィルター滅菌(孔
径0.22 μm；IWAKI)後、500 または1000 mlずつmedium
ビンへ分注し、4℃で保管した。 DMEM＋10% FCS培地：FCSを終濃度が10%となるように上
記培地に添加し、使用した。 DMEM＋0.5% FCS培地：FCSを終濃度が0.5%となるように
上記培地に添加し、使用した。 1.1.2：培養方法 TIG-1(JCRB0501、20 PDL)はヒューマンサイエンス研究
資源バンクより購入したものを用いた。コンフルエント
〜セミコンフルエントとなったところで培地を除き、PB
S(-)で洗浄後、0.05 %トリプシン/0.02 % EDTA/PBS(-)
で細胞を剥がした。これに培地(DMEM/10 % FCS)を加
え、細胞を懸濁し、滅菌チューブに移して遠心(室温、1
000 rpm、5 min)した。上清を除き、再度PBS(-)に懸濁
し遠心(室温、1000 rpm、5 min)した。上清除去後、培
地(DMEM/10 % FCS)によく懸濁して、直径60または100 m
m dishにまいた。Split ratioは1：4または1：8で、パ
ッセージは5〜7日に一度行った。70〜80 %コンフルエン
トとなったところで対数増殖期(以後、Logとする)由来
のtotal RNAの調整を、以降におけるRNA調整のステップ
通りに行った。血清飢餓の実験には、PDL約40までの細
胞を用いた。 1.2：TIG-1の血清飢餓培養 50〜60 %コンフルエントとなったところで培地(DMEM/10
% FCS)を除き、PBS(-)で2回洗浄後、これに培地(DMEM/
0.5 % FCS)を加え、細胞を培養した。静止期(以後、G0
とする)由来のtotal RNAの調製は、培地交換後、約96時
間経過したものについて以降におけるRNA調整のステッ
プの通りに行った。 1.3：Total RNAの調整(CsTFA法) 1.3.1：材料 5.5 M GTC溶液：以下の組成、 Guanidinethiocyanate 64.9 g Sodium citrate ・2H2O 0.74 g Sodium lauryl sarcosinate 0.5 g からなるGTC溶液を滅菌MilliQ水で100 mlとし、室温保
存した。使用直前に2- mercaptoethanol(以後、2-MEと
する)を1/71(終濃度0.2 M)加えて使用した。 CsTFA(D=1.51)溶液：以下の組成、 CsTFA (D=2.01；Pharmacia) 100 ml 0.5M EDTA(pH 7.0) 39.5 ml(終濃度 100 mM) 滅菌MilliQ 水 58.15 ml からなるCsTFA(D=1.51)溶液を4 ℃で保存し、使用し
た。 4 M GTC溶液：以下の組成、 5.5 M GTC 溶液 4 ml 滅菌MilliQ 水 1.5 ml 2- ME 56μl からなるGTC溶液を室温保存し、使用した。 TE：10 mM Tris・HCl(pH 8.0)/1 mM EDTA(pH 8.0)をフ
ィルター(孔径 0.22 μm;MILLIPORE)滅菌後、更にオー
トクレーブ滅菌し、- 20 ℃で保存した。 1.3.2：Total RNAの調整方法 Total RNAはLog、G0状態のTIG-1細胞について、それぞ
れ培養皿(直径100 mm)100および200枚分の細胞を用いて
調整した。各状態の細胞について、培地を除去し、PBS
(-)で2回洗浄して死細胞や残査血清を除いた後、培養皿
に直接0.8〜1 mlの5.5 M GTCを加えることで細胞を溶か
し、ラバーポリスマンでビーカーにそれぞれ回収した。
30 ml注射筒に18 G注射針を付け、溶液を2個の乾熱滅菌
済ビーカーの一方から他方へ移す要領で、溶液の粘性が
減るまで数回注射針を通過させてDNAを細断した。遠心
により細胞破片を除き、上清22〜23 mlをオートクレー
ブ済みのポリアロマーチューブ(BECKMAN；40 ml容)に入
れたCsTFA溶液15 ml上にそっと重層した。超遠心(17
℃、25000 rpm、24時間)後、上清を静かに除き、沈澱を
600 μlの4 M GTC溶液にピペッティングにより溶解し
た。これをエッペンドルフチューブに移し、遠心(4
℃、15000 rpm、30 sec)して不溶物を沈澱させた。上清
600 μlあたり15 μlの1 M酢酸、450 μlのエタノール
を加えvortexし、-20℃で3時間以上氷冷した。遠心(4
℃、15000 rpm、10 min)して上清を除き、沈澱を330 μ
lのTEに溶かした。遠心(4 ℃、15000 rpm、30 sec)して
不溶物を沈澱させ、上清330 μlあたり33 μlの2 M NaC
l、990 μlの100 %エタノールを加え、vortexした。-20
℃で3時間以上氷冷した後、遠心(4 ℃、15000 rpm、10
min)し、沈澱を直前に調整した70 %エタノールで洗浄
した。上清を完全に除き、得られたRNA沈澱をTEに溶解
した。これは-80 ℃に保存した。 1.4：Total RNAの調整(AGPC法) 1.4.1：材料 Solution D：以下の組成、 Guanidinethiocyanate 50 g 0.75 M Sodium citrate (pH 7.0) 1.52 ml 10 % Sodium lauryl sarcosinate 5.28 ml からなる溶液を滅菌MilliQ水で100 mlとし、室温保存し
た。使用直前に2-MEを1/142(終濃度0.1 M)加えて使用し
た。水飽和フェノール：65 ℃で溶解させたフェノール1
00 gに、100 mlの滅菌MilliQ水と0.1 gの8-ヒドロキシ
キノリンを加え、スターラーで5分撹拌した。静置後、
水層を除去した。この操作を2〜3回繰り返すことで、水
飽和状態とした。これは4 ℃で遮光保存した。 1.4.2：Total RNAの調整方法 以降に述べるノーザン解析でRNAをブロットしたメンブ
レンを作製する際のtotal RNAをAGPC法により調整し
た。Log、G0状態のTIG-1細胞について、1×10⁶細胞あた
り1.6 mlのSolution Dを加え、ピペッティング、vortex
により細胞を溶かした。ソニケーションによりDNAを細
断後、遠心(4 ℃、15000 rpm、30 sec)して不溶物を沈
澱させた。上清を500 μlずつ3本のエッペンドルフチュ
ーブに移した。500 μlあたり50 μlの2 M NaOAc(pH 4.
0)、500 μlの水飽和フェノール、300μlのクロロホル
ムを加え、10 秒間vortexした。氷上に15分放置した
後、遠心(4℃、15000 rpm、10 min)した。水層のみ採取
し、等量のイソプロパノール約500μlを添加、vortex
後、室温で10分静置した。遠心(4 ℃、15000 rpm、15 m
in)によりRNAが沈澱するので上清を静かに捨て、Soluti
on Dを100 μl加え、沈澱を完全に溶解させた。これに1
00 μlのイソプロパノールを加え、vortex後、-20℃で3
0分静置した。遠心(4 ℃、15000 rpm、10 min)後、上清
を捨て、150 μlの70 %エタノールで洗浄した。遠心(4
℃、15000 rpm、3 min)等によりエタノールを完全に除
去後、30 μlのTEを加え、沈澱を溶解させた。沈澱が溶
けにくい場合は、更に適当量のTEを加え、沈澱を完全に
溶解させた。 1.5：Poly(A)+RNAの調整 1.5.1：オリゴ(dT)セルロースカラムの調整 0.2 gのオリゴ(dT)セルロース(Type3；Collaborative R
esearch)に20 mlの滅菌MilliQ水を加え、室温で10分静
置した。上清をデカンテーションにより除き、新たに10
mlの滅菌MilliQ水を加えた。この懸濁液をオートクレ
ーブ済みのエコノカラム(直径0.6 cm；Bio-Rad)に注ぎ
込み、セルロースカラムの高さが約1cmになるようにし
た。滅菌水が流れ落ちた後、約8 mlのTE/NaCl（TEと1 M
NaClを1:1の割合で混合し、-20 ℃で保存したもの）を
加え、平衡化した。 1.5.2：Poly(A)+RNAの調整 超遠心(CsTFA)法により得られたLog、G0由来のtotal RN
Aに等容のTE、および2倍量の1 M NaClを加え、総容量を
約1 mlとした。1.5.1で平衡化したカラムに全RNA溶液を
加え、溶出してきた液を再度カラムに注いだ。溶出液を
もう一度カラムに通した後、8 mlのTE/NaClで洗浄し
た。0.5 mlずつ6回に分けてTEをカラムに加え、poly(A)
+RNAを溶出した。溶出液はすぐに氷上に置いた。各分画
について2μlずつ、パラフィルム上で20 μlのEtBr溶液
(1 μg/ml)と混合し、UVライト下で写真撮影した。RNA
を含む分画250 μlあたり50 μlの2 M NaCl、750 μlの
エタノール、1 μlのGlycogenを加え、vortexした。-80
℃のエタノール中で20分以上氷冷した後、遠心(4 ℃、
15000 rpm、15 min)し、上清を静かに除いた。直前に調
整した70 %エタノールで洗浄し、遠心(4 ℃、15000 rp
m、5 min)した後、上清をできるだけ除いた。30 μlの5
mM Tris・HCl(pH 7.5)に溶解し、一部をすぐにcDNAラ
イブラリー作製に用いた。残りは-80 ℃で保存した。最
終的にLogおよびG0について、それぞれ約49および55μg
のpoly(A)+RNAを得た。 1.6：cDNAライブラリーの作製 1.6.1：材料 リンカープライマー：5'-(GA)10 ACGCGTCGACTCGAGCGGCC
GCGGACCG (T)18-3' アダプター：Bam HI (Bgl II)- Sma I d(GATCCCCGGG) ベクターDNA：pAP3neoをNot Iで切断後、BAP 処理し、
その後Bgl IIで切断したもの。 Not I補充液：278 mM NaCl/8 mM MgCl₂/1.8 mM DTT/0.0
18 % BSA/0.018 % Triton X-100 10×STE：1 M NaCl/0.1 M Tris・HCl(pH 8.0)/10 mM ED
TA(pH 8.0) 1.6.2：First strandの合成 LogおよびG0由来のPoly(A)+RNA 7.5 μl(4.5 μg)をエ
ッペンドルフチューブにとり、65 ℃で5分加熱した後、
氷上で急冷し、変性させた。ここに2.5 μlの10×First
Strand Buffer(ZAP cDNA Synthesis Kit「Stratagen
e」内のもの)、2.5 μlの0.1 M DTT、1.5 μlのFirst S
trand Methyl Nucleotide Mixture(10 mMdATP、dGTP、d
TTP/5 mM 5-methyl-dCTP；ZAP cDNA Synthesis Kit「St
ratagene」内のもの)、1 μlのリンカープライマー(1.6
μg/μl)、0.5 μlのRNase Inhibitor(40 U/μl；東洋
紡績)、8.5 μlの滅菌MilliQ水を順に加えていった。室
温に10分放置し、プライマーをアニーリングさせた。2
μlの逆転写酵素(約20 U/μl；生化学工業)を加え、ピ
ペッティングにより混合し37 ℃で40分、反応させた。S
uperscript II RT(200 U/μl；GIBCO BRL)を2 μl加
え、48℃で40分、さらに反応させた。遠心(4 ℃、15000
rpm、5 sec)後、氷上に置いた。 1.6.3：Second strandの合成 氷上に置いた反応液に、20 μlの10×Second Strand Bu
ffer(ZAP cDNA Synthesis Kit 「Stratagene」内のも
の)、7.5 μlの0.1 M DTT、3 μlのSecond Strand Nucl
eotide Mixture(10 mM dATP、dGTP、dTTP/25 mM dCTP；
ZAP cDNA Synthesis Kit「Stratagene」内のもの)、13
2.5 μlの滅菌MilliQ水(予め氷冷しておいたもの)を順
に加えていった。氷上に5分置いた後、1.5 μlのRNaseH
(1.5 U/μl；東洋紡績)、6 μlのE.coli DNA polymeras
e I(9 U/μl；東洋紡績)を加え(総容量約200 μl)、16
℃で150分反応させた。200 μlのフェノール/クロロホ
ルムを加え、vortex後、遠心(室温、15000 rpm、7 min)
して上清を新しいエッペンドルフチューブに移した。50
μlの滅菌MilliQ水で再抽出した後、クロロホルム処理
を行った。50 μlの滅菌MilliQ水で再抽出した後、上清
をミリポアフィルター(UFCP3TK50；MILLIPORE)の上室に
のせ、溶液が全て下室に流れ落ちるまで遠心(4℃、1000
0 rpm、20 min)した。下室のTEを除き、新たに上室に10
0 μlのTEを加え、遠心(4℃、10000 rpm、15 min)して
フィルターを洗浄した。この操作をもう一度行った後、
30 μlの1/10 TEをフィルターの上室に加え、ピペッテ
ィングとvortexによりフィルターに付着したcDNAを溶か
し出した。フィルターを逆さにして遠心(4℃、5000 rp
m、10 sec)することでcDNA溶液を回収した。 1.6.4：2本鎖cDNAの末端平滑化 上述のcDNA溶液30 μl(in 1/10 TE)に、10 μlの10×Se
cond Strand Buffer(ZAP cDNA Synthesis Kit 「Strata
gene」内のもの)、5 μlのblunting dNTP Mixture(KIT
内のもの)、51.5 μlの滅菌MilliQ水を順に加えた。こ
こに3.5 μlのPfu DNA polymerase (2.5 U/μl)を加え
(総容量100 μl)、軽くvortexした後、37℃で30分、反
応させた。フェノール/クロロホルム処理を行い、100
μlの滅菌MilliQ水で再抽出を行った。この後、クロロ
ホルム処理を行い、100 μlの滅菌MilliQ水で再抽出を
行った。上清をミリポアフィルターにのせ、1.6.3の場
合と同様にしてフリーのdNTPを除いた。最終的に20 μl
のTEに2本鎖cDNAを回収した。 1.6.5：アダプターのライゲーション、Not Iによる切断 前記の1.6.4で末端を平滑化した2本鎖cDNA 20 μlのう
ち、4 μlをとり、2 μlの10×ligation buffer、2 μl
の10 mM rATP、1 μlのBam HI (Bgl II)-Sma Id(GATCCC
CGGG)アダプター(0.35 μg/μl)、10 μlの滅菌MilliQ
水を加えた。氷上に5分置いた後、1.5 μlのT4 DNA lig
ase(4 U/μl；東洋紡績)を加え、ピペッティングにより
混合した。8℃で24時間反応させた。70℃で30分加熱し
た後、遠心(4℃、10000 rpm、10 sec)して氷上に置い
た。ここに27 μlのNot I補充液、3μlのNot I(10 U/μ
l；NEB)を加え、ピペッティングにより混合した。37℃
で90分保温し、Not Iで切断した。反応液に5 μlの10×
STE、5 μlのtRNA(2 μg/μl)を加え(総容量 60 μl)、
10 μlずつスピンカラム(CHROMA SPIN-400；Clontech)
に加えた(この時、カラムの内壁をつたわらせないよう
に注意した)。遠心(BECKMAN J6-HC；4℃、2100 rpm［70
0 g］、5 min)後、等量のフェノール/クロロホルムを加
え、vortexした。これを遠心(室温、15000 rpm、2 min)
後、上清を新しい0.6 mlチューブに回収した。これに等
量のクロロホルムを加え、vortexした後、遠心(室温、1
5000 rpm、2 min)により上清を回収した。これに4 μl
の5 M NaCl、100 μlのエタノールを加え、vortex後、-
80℃に2〜3時間静置した。 1.6.6:ベクターへのライゲーション 遠心(4℃、15000 rpm、15 min)後、上清を注意深く除
き、直前に調整した100μlの70 %エタノールを加えて再
度遠心(4℃、15000 rpm、7 min)した。上清を注意深く
除き、cDNAの沈殿に3 μlの10×ligation buffer、3 μ
lの10 mM ATP、22μlの滅菌MilliQ水、1 μlのベクター
(pAP3neo/Not I/Bgl II、1 μg/μl)を直接加えた。氷
上に5分置いた後、1 μlのT4 DNA ligase(4 U/μl；東
洋紡績)を加え、ピペッティングにより混合した。12℃
で40時間、反応させた。70℃で30分加熱した後、遠心(4
℃、10000 rpm、10 sec)し、70 μlのTEを加えた。フェ
ノール/クロロホルム処理を行い、50 μlのTEで再抽出
を行った。上清をミリポアフィルター(UFCP3TK50)の上
室にのせ、溶液が全て下室に流れ落ちるまで遠心(4℃、
10000 rpm、20 min)した。下室のTEを除き、新たに上室
に100 μlのTEを加え、遠心(4℃、10000 rpm、15 min)
してフィルターを洗浄した。この操作をもう一度行った
後、30 μlのTEをフィルターの上室に加え、ピペッティ
ングとvortexによりフィルターに付着したDNAを溶かし
出した。フィルターを逆さにして遠心(4℃、5000 rpm、
10 sec)することでDNA溶液を回収した。これは、-20℃
で保存しておいた。 1.6.7：大腸菌への導入 前記1.6.6で調整したライゲーション液のうち約15(5×
3)μlを、エレクトロポレーション用濃縮大腸菌DH12S(G
IBCO BRL)150(50×3)μlに導入した。エレクトロポレー
ションはLog、G0のそれぞれについて、各5 μlずつ3回
に分けて行った。2 mlのSOC培地(2 ml×3本、計6 ml)
中、37℃で1時間、激しく振とう培養した。これを全
て、アンピシリンを含む500 mlのLB培地(3 Lの三角フラ
スコ内)に移し、よく混合し、10 μl、100 μlをとって
それぞれアンピシリンを含むLBプレートにまいた。37℃
で終夜培養し、titerを測定した。残りの培養液は37℃
で激しく振とう培養した。約6時間後、200 mlの培養液
を新しい3 Lの三角フラスコに移し、5 mlのヘルパーフ
ァージ(R408)を加え37℃で終夜培養した。残りの300 ml
の培養液については、そのまま終夜培養を行った。ヘル
パーファージを加えた200 mlの培養液については、1本
鎖DNA(ssDNA)の調整を引き続き行った(後述)。300mlの
終夜培養液については、約275 mlからプラスミド抽出キ
ット(QIAGEN Maxi)を用い、総プラスミドを調整した。
残りの約25 mlについては、DMSOを7 %となるように添加
し、液体窒素中で保存した。 1.6.8：Titerの測定、インサート分布の検査 Titer check用プレート上のコロニーをカウントし、各
ライブラリーのtiterを算出した。また、Log、G0の各プ
レート上の任意の約20クローンについて、制限酵素処理
(Eco RI/Kpn I)により、インサートサイズの分布を調べ
た。 1.7：一本鎖 DNA(ssDNA)の調整 1.7.1：材料 2×YT培地：以下の組成、 Bacto tryptone 16 g Bacto yeast extract 10 g NaCl 5 g からなる培地をH₂Oで1 Lとし、オートクレーブ滅菌し
た。 10×DNase buffer：0.1 M Tris・HCl(pH 7.5)/0.1 M Mg
Cl₂ 1.7.2：方法 200 mlの培養液を新しい3 Lの三角フラスコに移し、5 m
lのヘルパーファージ(R408)を加え37℃で終夜培養後、
培養液を滅菌ガラスチューブに移し、遠心(4℃、10000
rpm、5 min)して大腸菌を沈殿させた。上清を注意深く
新しい滅菌ガラスチューブに移し、再度遠心(4℃、1000
0 rpm、10 min)した。上清を滅菌フィルター(孔径0.22
μm；MILLIPORE)に通し、大腸菌を完全に除いた。25 ml
の上清あたり2.5 mlの10×DNase buffer、1 μlの DNas
e I(20 U/μlに希釈したもの；ニッポンジーン)を加
え、37℃で30分反応させた。1/4容量の20 % PEG(MW=600
0)/2.5 M NaClを加えてvortexし、滅菌ガラスチューブ
に移した。室温に20分置いた後、遠心(4℃、10000 rp
m、10 min)し上清を除いた。再度遠心(4℃、10000 rp
m、5min)し、イエローチップを用いて上清を除いた。さ
らにもう一度遠心(4℃、10000 rpm、1 min)し、先の細
いチップを用いて上清を完全に除いた。得られたファー
ジの沈殿を、総容量で400 μlのTEに溶解し、25 μlのp
roteinase K(2 μg/μl in 20 % glycerol)、4 μlの10
% SDSを加えて42℃で1時間、反応させた。フェノール
処理、フェノール/クロロホルム処理(5〜6回)、クロロ
ホルム処理の後、エタノール沈殿を行った。70 %エタノ
ールで洗浄後、得られたssDNAを20〜30μlのTEに溶解し
た。-20 ℃で保存した。 1.8：サブトラクションライブラリーの作製 1.8.1：材料 PHOTOPROBE Biotin：0.5 mgのPHOTOPROBE Biotin(Vecto
r Laboratories)に、0.5mlの滅菌MilliQ水(-20℃保存し
ておいたもの)を暗所で加え、溶解させた。-20℃で遮光
保存した。 2×HB：以下の組成、 脱イオンホルムアミド 400 μl 1 M HEPES(pH 7.5) 50 μl 0.5 M EDTA(pH 8.0) 2 μl 10 % SDS 10 μl 滅菌MilliQ 水 38 μl からなる2×HB溶液を使用直前に調整した。 SB：以下の組成、 1 M HEPES(pH 7.5) 50 μl 0.5 M EDTA(pH 8.0) 4 μl 2 M NaCl 250 μl 滅菌MilliQ 水 696 μl からなるSB溶液を使用直前に調整した。 5'-APプライマー：5'-GGAAGTGTTACTTCTGCTCT-3' 1.8.2：Poly(A)+RNA のビオチン化 Log由来のpoly(A)+RNA 10 μgをエッペンドルフチュー
ブにとり、滅菌MilliQ水を加えて容量を20 μlとした。
ここに10 μlのPHOTOPROBE Biotin(1 μg/μl)を暗所で
加え、ピペッティングにより混合した。エッペンドルフ
チューブの蓋を開けて氷上に置き、約10 cmの高さから
水銀ランプ(アイセルフバラスト、BHRF160WH；岩崎電
気)で20分照射してビオチン化を行った。70 μlの0.1 M
Tris・HCl(pH 9.5)/1 mM EDTAを加え、100 μlの水飽
和ブタノールを加えてvortexした。遠心(4℃、15000 rp
m、5 min)後、上層(ブタノール層)を除いた。この操作
をあと2回繰り返した。水層に100 μlのクロロホルムを
加えてvortexし、遠心(4℃、15000 rpm、5 min)後、水
層を新しいエッペンドルフチューブに移した。クロロホ
ルム抽出をもう一度行った後、水層に1/10倍量の3 M Na
OAc(pH 5.2)、3倍量の100%エタノール、1 μlのglycoge
nを加えてvortexし、-80℃で30分以上置いた。遠心(4
℃、15000 rpm、15 min)して上清を除き、RNAの沈殿が
薄くオレンジ色をしていることを確認した。直前に調整
した70 %エタノールで洗浄した後、沈殿を20μlの滅菌M
illiQ水に溶かした。ここに再度10 μlのPHOTOPROBE Bi
otin(1 μg/μl)を暗所で加え、上記の操作を繰り返し
た。cDNAとのハイブリダイゼーションまで、エタノール
沈殿の状態で-80℃に置いた。 1.8.3：cDNAとPAB-RNA(ビオチン化RNA)のハイブリダイ
ゼーション 前記1.8.2で調整したPAB-RNA 5 μg分を遠心(4℃、1500
0 rpm、15 min)により回収し、70 %エタノールで洗浄
後、上清を除き8 μlの滅菌MilliQ水に溶かした。ここ
に、12.5 μlの2×HB、2.5 μlの2 M NaCl、1 μlのpol
y(A)(1 μg/μl；Pharmacia)、および1 μlのssDNA(0.5
μg/μl；G0由来のcDNAライブラリー)を加え、総容量を
25 μlとした。65℃で10分加熱した後、速やかに42℃の
ヒートブロックに移した。2〜3晩(42時間以上)、ハイブ
リダイゼーションを行った。 1.8.4：ssDNAの回収、再ハイブリダイゼーション サンプルをエッペンドルフチューブに移し、400 μlのS
Bを加えてピペッティングで混合した。5 μlのStreptav
idin(2 μg/μl；GIBCO BRL)を加え、ピペッティングで
混合後、室温に5分置いた。フェノール/クロロホルム処
理を行い、上清を新しいエッペンドルフチューブに移し
た。残りのフェノール/クロロホルム溶液に100 μlのTE
を加えて再抽出した。更に、上清に5 μlのStreptavidi
n(2μg/μl)を加え、ピペッティングで混合後、室温に5
分置き、フェノール/クロロホルム処理を2回行い、クロ
ロホルム処理を1回行った。水層をミリポアフィルター
(UFCP3TK50；MILLIPORE)の上室にのせ、溶液が全て下室
に流れ落ちるまで遠心(4℃、10000 rpm)した。下室のTE
を除き、新たに上室に300 μlのTEを加え、溶液が全て
下室に流れ落ちるまで遠心(4℃、10000 rpm)してフィル
ターを洗浄した。この操作をもう一度行った後、30 μl
の1/10 TEをフィルターの上室に加え、しつこくピペッ
ティングとvortexを行いフィルターに付着したssDNAを
溶かし出した。フィルターを逆さにして遠心(4℃、5000
rpm、10 sec)することでssDNA溶液を回収した。これを
真空乾燥し、滅菌MilliQ水で調整して9 μlとした。前
記1.8.2で調整したPAB-RNA 3 μg分を遠心して回収し、
70 %エタノールで洗浄後、上清を除き、上記のssDNA溶
液9 μlを加えた。ここに12.5 μlの2×HB、2.5 μlの2
M NaCl、1 μlのpoly(A)(1 μg/μl)を加え、前記1.8.
3の場合と同様にしてハイブリダイゼーションを行っ
た。 1.8.5：ssDNAの回収、2本鎖DNAの合成、大腸菌への導入 上記の様にしてPAB-RNAと2回ハイブリダイゼーションを
行ったcDNAについて、1.8.4の方法に従いssDNAを回収し
た。30 μl(in 1/10 TE)のssDNA溶液のうち15μlを以降
の2本鎖DNA合成に使用し、残りは-20℃に保存した。SsD
NA 15 μlに、14 μlの滅菌MilliQ水、1 μlの5'-APプ
ライマー(0.2 μg/μl、リン酸化済みのもの)を加え、6
5℃で10分加熱した。室温に5分置いてプライマーをssDN
Aにアニーリングさせた後、5 μlの10×buffer(Bca BES
T Dideoxy Sequencing Kit[宝酒造]内のもの)、10 μl
の1 mM dNTP mixture、0.5 μlのSSB(3 μg/μl)、2 μ
lのBca BEST DNA polymerase (2U/μl；宝酒造)、3 μl
の滅菌MilliQ水を加えた。65℃で1時間反応することに
より2本鎖DNAを合成した。反応液に50 μlの滅菌MilliQ
水を加え、フェノール/クロロホルム処理を行った。残
りのフェノール/クロロホルム溶液に100 μlのTEを加え
て再抽出した。抽出した上清のクロロホルム処理を行っ
た。残りのクロロホルム溶液に100 μlのTEを加えて再
抽出した後、上清をミリポアフィルター(UFCP3TK50；MI
LLIPORE)にのせ、溶液が全て下室に流れ落ちるまで遠心
(4℃、10000 rpm)した。下室のTEを除き、上室に300 μ
lのTEを加えて溶液が全て下室に流れ落ちるまで遠心(4
℃、10000 rpm)してフィルターを洗浄した。この操作を
もう一度行った後、25 μlのTEをフィルターの上室に加
え、しつこくピペッティングとvortexを行いフィルター
に付着した2本鎖 DNAを溶かし出した。フィルターを逆
さにして遠心(4℃、5000 rpm、10 sec)することで2本鎖
DNAを回収した。この25 μl(6.25 μl×4)をエレクトロ
ポレーション用濃縮大腸菌(50 μl×4)に導入した。こ
れに各々1.5 mlのSOC培地を加え、37℃で1時間激しく振
とうし後、4本を1本にまとめた。このうちの300 μlにL
B 2 mlを加え、230 μlずつ10枚のLB/Ampプレートにま
いた。また、この培養液のうち1、10、100 μl をアン
ピシリンを含むLBプレートにまいた。37℃で終夜培養
し、titerを測定した。残りはアンピシリンを含むLB培
地500 mlに加え、37℃で6時間、振とう培養した。この5
00 mlのうち30 mlからプラスミドを抽出した(G0-Log ds
DNA subtracted library)。残りの470 mlについては、3
mlのヘルパーファージ(R408)を加え、約6時間、37℃で
振とう培養した後、前述の方法と同様にしてssDNAを回
収した(G0-Log ssDNA subtracted library)。 1.9： サブトラクション（差分化）cDNAライブラリー
のインサートチェックとサザンフィルターの作成及びイ
ンサートの回収とサザンハイブリダイゼーション 1.9.1：材料 10×TAE：以下の組成、 Tris 48.4 g 氷酢酸 11.4 ml 0.5 M EDTA (pH 8.0) 20 ml をMilliQ水で1 Lにfill upし、室温に保存した。 0.8 % アガロースゲル（12×14 cm）：1 gのアガロース
につき125 ml の1×TAEを加えて加熱溶解させた。12×1
4 cm大のゲルメーカーに注ぎ込み1枚のゲルに4段の、we
ll数が20個のコーム（+マーカーレ−ン3個）を使用して
作成した（1枚につき80個のサンプルをapplyできる）。 加水分解液：35 % HCl 11.1 mlを滅菌MilliQ水で500 ml
にfill upしたもの。室温に保存した。変性溶液：以下
の組成、 NaOH 20 g NaCl 87.7 g を滅菌MilliQ水を加えて1 Lにfill upし、室温に保存し
た。 20×SSC：以下の組成、 NaCl 175.4 g クエン酸ナトリウム 2水和物 88.2 g を滅菌MilliQ水で1 Lとし、オートクレーブ滅菌し、室
温に保存した。 50×Denhardt's：以下の組成、 Ficoll (Type 400；Pharmacia) 5 g Polyvinylpyrrolidone (MW=360,000；SIGMA) 5 g Bovine serum albumin (Fraction V；SIGMA) 5 g を滅菌MilliQ水で500 mlとし、フィルター(孔径0.22 μ
m；MILLIPORE)滅菌し、-20℃で保存した。 プレハイ・ハイブリダイゼーション液：5×Denhardt's/
5×SSC/0.1 % SDSを使用直前に調整し、ここに変性させ
たサケ精子 DNA(5 mg/ml)を1/50加えた(最終濃度0.1 mg
/ml)。 1.9.2：インサートチェックとサザンフィルターの作成 重差分化cDNAライブラリーよりコロニーを80個あるいは
160個を1セットとしてピックアップし、2 mlのLB/ampの
入ったプラスミド抽出機器（PI-100L AUTOMATIC PLASMI
D ISOLATION SYSTEM ; KURABO）専用チューブに植菌し
て37℃で終夜振とう培養した。プラスミド抽出機器によ
り抽出された各プラスミドに100 μlのTEを加え室温で3
0分撹拌した。それぞれのプラスミド 5 μlを制限酵素
処理（SmaＩ/NotＩ）し、0.8 %のアガロースゲル2枚で
インサートのチェックを行った。インサートのあったプ
ラスミドのみを0.6 mlのチューブに回収した。インサー
トチェックで使用したゲルは続いてサザントランスファ
ーを行った。ゲルを適当な容器に入れ、加水分解液を加
え、室温で振とうし、色素の色が変わるのを確認した
後、さらに10分振とうした。加水分解液を捨てた後、変
性溶液を加え、室温で色素の色が元に戻るのを確認でき
たら、さらに5分振とうした後、溶液を捨て、もう一度
変性溶液を加えて、10〜15分振とうした。20×SSCを用
いたキャピラリートランスファーによりゲル中のDNAを
ナイロンメンブレン(Biodyne B、孔径0.45 μm；PALL)
にブロットした(一晩)。メンブレンを80℃で2時間bake
することにより、DNAをメンブレンに固定した。ハイブ
リダイゼーションまでハイブリダイゼーション用バッグ
に密閉して室温で保存した。このフィルターはノーザン
ハイブリダイゼーションと同時に行い、重複クローンの
検出のために使用した。また、この操作は後々、次の重
差分化への移行または重差分完了の目安となる。 1.9.3：インサートの切り出しと抽出 以下のような手順でQIAquick Gel Extraction Kitを用
いてインサートの回収を行った。1.9.2で収したプラス
ミドから20 μlを制限酵素処理（SmaＩ/NotＩ）し、0.8
%アガロースゲル（SeaKem GTG agarose ; BioProduct
s）で電気泳動後、目的のバンドを切り出し、重量を測
定した後-80℃に20〜30分置いた。重量の3倍量のSolBuf
fer QG（QIAquick Gel Extraction Kit内のもの）を加
え、65℃、10分してゲルを完全に溶解させた（オレンジ
色あるいは紫色に変色した場合は10μlの3 M酢酸ナトリ
ウム（pH 5.0）を加え黄色になるのを確認する）。2 ml
のコレクションチューブに入ったQIAquick spin column
（QIAquick Gel ExtractionKit内のもの; QIAGEN）に溶
液を注ぎ室温に10分置いた。5000 rpm、1 min、4℃で遠
心後、コレクションチューブの溶液を除いた。QIAquick
spin columnにWashBuffer PE(QIAquick Gel Extractio
n Kit内のもの; QIAGEN)を650 μl加えて室温に10分置
いた。13000 rpm、1 min、4℃で遠心後、コレクション
チューブの溶液を除いた。再度13000 rpm、1 min、4℃
で遠心して、QIAquick spin column中の溶液を完全に除
いた。ランプ下で10分程乾燥させた後、30 μlの10 mM
Tris・HCl（pH 8.5）を加え、室温に10分置いた。QIAqu
ick spin columnを新しい1.5 mlのエッペンドルフチュ
ーブに移し、13000 rpm、1 min、4℃で遠心してインサ
ートを回収した。これら回収したインサートはサザンお
よびノーザンハイブリダイゼーション用のプローブとし
て使用した（後述）。 1.9.4：サザンプレハイブリ・ハイブリダイゼーション サザンハイブリダイゼーションは、後述のノーザンハイ
ブリダイゼーションに使用する各プローブから一部をと
り、それらをミックスしたものをプローブに使用するの
でノーザンハイブリダイゼーションと同時に行った。1.
9.2で作製したハイブリバッグに入ったメンブレンに、
直前に調整したプレハイブリダイゼーション液を10 ml
加えた。泡ができるだけ入らないようにシーリングし、
55℃の湯浴中に2時間以上おいてプレハイブリダイゼー
ションを行った。ノーザン用にラベルしたそれぞれのプ
ローブ（後述）から1/3から1/2量とってミックスしたも
のをミックスプローブとして使用した。プローブを95℃
で5分加熱後、5分急冷し、変性させた。これを3 mlのハ
イブリダイゼーション液と混合し、プレハイブリダイゼ
ーション溶液を除いた後のメンブレンに加えた。泡がで
きるだけ入らないようシーリングし、55℃の湯浴中で24
時間以上、ハイブリダイゼーションを行った。 1.9.5：洗浄、オートラジオグラフィー メンブレンをハイブリバッグから注意深く取り出し、2
×SSC/0.1 % SDSの入ったガラストレイ(乾熱滅菌したも
の)に移した。65℃で20〜30分を2回ゆっくり振とうして
ハイブリダイゼーション液をできるだけ除いた後、0.1
×SSC/0.1 % SDS中、65℃で20〜30分2〜3回洗浄した。
メンブレンをサランラップに包み、増感紙2枚を用いて-
80℃で30〜60分程度X線フィルムに感光させた。 1.10 ノーザンハイブリダイゼーション 1.10.1：材料 10×MOPS buffer：6.56 gのNaOAcと4.2 gのMOPSを約800
mlの滅菌MilliQ水に溶かし、NaOHでpHを7.0に調整し
た。20 mlの0.5 M EDTA(pH 8.0)を加え、滅菌MilliQ水
で容量を1 Lとした。フィルター滅菌(孔径0.22 μm；IW
AKI)後、4℃で遮光保存した。 MOPS/ホルムアルデヒドゲル：以下の組成、 10×MOPS buffer 13 ml 滅菌MilliQ水 110.5 ml の溶液にアガロース（1.3 g）を溶かし、50〜60℃に冷
めたら、ホルマリン(35 %ホルムアルデヒド溶液)を7.8
ml加えた。 20×SSC：以下の組成、 NaCl 175.4 g クエン酸ナトリウム 2水和物 88.2 g を滅菌MilliQ水で1 Lとし、オートクレーブ滅菌した。 ホルムアルデヒドゲル泳動用色素：以下の組成、 Glycerol 2.5 ml 0.5M EDTA(pH 8.0) 10 μl BPB 12.5 mg XC 12.5 mg 滅菌MilliQ水 2.5 ml をオートクレーブ滅菌後、エッペンドルフチューブに分
注し、-20℃で保存した。 脱イオンホルムアミド：30〜40 mlの100 %ホルムアミド
(ナカライテスク、分子生物学特級)に0.5 g程度のイオ
ン交換レジン(AG 501-X8；Bio-Rad)を加え、軽く撹拌し
た。-20℃で保存し、使用前に緑色のレジンが残ってい
れば使用可能とし、すべてオレンジ色ならば新たにレジ
ンを加えた。 50×Denhardt's：以下の組成、 Ficoll(Type400；Pharmacia) 5 g Polyvinylpyrrolidone(MW=360,000；SIGMA) 5 g Bovine serum albumin(Fraction V；SIGMA) 5 g を滅菌MilliQ水で500 mlとし、フィルター(孔径0.22 μ
m；MILLIPORE)滅菌し、-20℃で保存した。 ハイブリダイゼーション液：50 %ホルムアミド/5×Denh
ardt's/5×SSC/0.1 % SDSを使用直前に調整し、ここに
変性させたサケ精子 DNA(5 mg/ml)を1/50 加えた(最終
濃度0.1 mg/ml)。 1.10.2：RNAのブロッティング Log、G0状態のTIG-1細胞から超遠心(CsTFAの代わりにCs
Clを使用)、またはAGPC法により得たtotal RNA 1 μl(3
μg/μlに調整)に1 μlの10×MOPS、2 μlのホルムア
ルデヒド溶液、5 μlの脱イオンホルムアミドを加え、
総容量を9 μlとした。65℃で5分加熱した後、氷上に5
分置いて急冷した。1 μlの泳動用色素を加え、全量をM
OPS/ホルムアルデヒドゲルにアプライした。滅菌した1
×MOPS bufferを用いて100 Vで電気泳動した。BPBが2/3
程度流れた時点で泳動を止め、滅菌MilliQ水で15分ずつ
3回洗うことによりゲルからホルムアルデヒドを除い
た。20×SSCに30〜60分浸した後、20×SSCを用いたキャ
ピラリートランスファーによりゲル中のRNAをナイロン
メンブレン(Biodyne A、孔径0.2 μm；PALL)にブロット
した(一晩)。メンブレンを80℃で2時間ベイクすること
により、RNAをメンブレンに固定した。ハイブリダイゼ
ーションまでハイブリダイゼーション用バッグに密閉し
て室温で保存した。 1.10.3：Sephadex G-50カラムの作製 プローブをラベルした後、残存する[α-³²P]dCTPを効率
良く除くため、以下のようにしてカラムを自作した。0.
6 mlのチューブの底に21Gの注射針で軽く穴を開け、1.5
mlのエッペンドルフチューブ上に置いた。TEで膨潤さ
せオートクレーブ滅菌したSephadex G-50(Pharmacia)を
500 μlとり、上述の0.6 mlチューブ内に入れた。遠心
(室温、3000 rpm、3 min)して1.5 mlチューブ内に落ち
たTEを除き、再度遠心(室温、3000 rpm、3 min)してTE
を除いた。0.6 mlチューブ内にSephadex G-50をもう250
μl加え、上記の操作を繰り返してTEを除いた。プロー
ブ1個について、このカラムを2個作製した。 1.10.4：プローブのラベリング サブトラクションライブラリー中、インサートが0.4 kb
以上であるクローンについて、Sma IとNot Iで切断し、
インサートを含むDNA断片を精製した（前述）。Random
Primer DNA Labeling Kit Ver.2(宝酒造)を用い、以下
の様にしてプローブのラベリングを行った。精製したDN
A断片25〜50 ng程度に1 μlのRandom Primerを加え、2.
5 μlとした。95℃で5分加熱後、急冷し、DNAを変性さ
せた。ここに1.25 μlの10×buffer、1.25 μlのdNTP m
ixture、2 μlの[α-³²P] dCTP(3000 Ci/mmol；Amersha
m)、0.5 μlのExo-free klenow(2 U/μl)を加え、滅菌M
illiQ水で総容量を12.5 μlとした。37℃で30分反応し
た後、65℃で10分加熱してKlenowを変性させた。反応液
にTEを38 μl加えて約50 μlとし、このうちから1μlを
とり、[α-³²P]dCTPの取り込み率の測定に使用した。残
りの反応液を1.10.3で作製したカラムに加え、遠心(室
温、3000 rpm、5 min)した。溶出液を新しいカラムに加
え、遠心(室温、3000 rpm、5 min)後、溶出液のうち1
μlを取り込み率の測定に使用した。カラム処理の前後
で反応液の放射能活性を測定することで、[α-³²P]dCTP
の取り込み効率を測定した。残りの反応液はハイブリダ
イゼーションに用いるまで-20℃で保存した。 1.10.5：プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼ
ーション 1.10.2で作製したハイブリバッグに入ったメンブレン
に、直前に調整したハイブリダイゼーション液を加え
た。このとき、6×1.5 cm程度の短冊型メンブレンの場
合には、1枚あたり2 ml加えた。泡ができるだけ入らな
いようにシーリングし、42℃の湯浴中に2時間以上おい
てプレハイブリダイゼーションを行った。1.10.4で調整
したプローブを95℃で5分加熱後、急冷し、変性させ
た。これを0.2 mlのハイブリダイゼーション液と混合
し、プレハイブリダイゼーション後のメンブレンに加え
た(0.2m/枚)。泡ができるだけ入らないようシーリング
し、42℃の湯浴中で24時間以上、ハイブリダイゼーショ
ンを行った。 1.10.6：洗浄、オートラジオグラフィー メンブレンをハイブリバッグから注意深く取り出し、2
×SSC/0.1 % SDSの入ったガラストレイ(乾熱滅菌したも
の)に移した。50℃で10分を2回ゆっくり振とうしてハイ
ブリダイゼーション液をできるだけ除いた後、0.1×SSC
/0.1 % SDS中、50℃で10〜20分2〜3回洗浄した。メンブ
レンをサランラップに包み、増感紙2枚を用いて-80℃で
数時間から一晩、X線フィルムに感光させた。 1.11：一次差分化・・・段階的サブトラクション（重差
分）化（1回目） 1.11.1：材料 マスキングオリゴ：5'-CCCGGGGATCTAGACGTCGAATTCCC-3' 1.11.2：解析クローンからのRNAの合成とビオチン化 作製したサブトラクションライブラリー中、ノーザン解
析を行った約30クローンのプラスミドを混合し、フェノ
ール/クロロホルム処理、クロロホルム処理、エタノー
ル沈殿により精製した。このうち20 μgをとり、10 μl
の10×NEB buffer 4、10 μlの10×BSA(NEB)、5 μlのN
ot I(10U/μl；NEB)および滅菌MilliQ水を加えて総容量
を100 μlとした。37℃で終夜反応させ、Not Iで切断し
た。このうち1 μlを電気泳動して切断を確認した後、
フェノール/クロロホルム処理、クロロホルム処理を行
った。上清をミリポアフィルター(UFCP3TK50)の上室に
のせ、溶液が全て下に流れ落ちるまで遠心(4℃、10000
rpm)した。下室のTEを除き、新たに上室に300 μlのTE
を加え、溶液が全て下に流れ落ちるまで遠心(4℃、1000
0 rpm)してフィルターを洗浄した。この操作をもう一度
行い、フィルターを洗浄した。30 μlのTEをフィルター
の上室に加え、しつこくピペッティングとvortexを行い
フィルターに付着したNot I切断プラスミドを溶かし出
した。ここに、10 μlの10×TRL buffer(T7 RNA polyme
raseに付属のもの)、10 μlの10 mM rATP、10 μlの10
mM rCTP、10 μlの10 mM rGTP、10 μlの10 mM rUTP、1
μlのRNase inhibitor(40 U/μl；東洋紡績)、3 μlの
T7 RNA polymerase(160 U/μl；東洋紡績)を加え、滅菌
MilliQ水で総容量を100 μlとし、37℃で90分反応させ
た。1 μlのDNase I(70 U/μl；宝酒造)を加え、37℃で
15分保温して鋳型DNAを分解した。等量のフェノール/ク
ロロホルムを加え処理した後、更に等量のクロロホルム
で処理を行った。上清を回収後、これに総容量が330 μ
lとなるようにTEを加え、13 μlの5 M NaClと1 μlのgl
ycogen、990 μlの100 %エタノールを加え、-80℃に30
分静置した。これを遠心(4℃、15000 rpm、15 min)後、
沈殿に70 %エタノールを加え洗浄し、更に遠心4℃、150
00 rpm、5 min)によりエタノールを完全に除去後、50
μlのTEに溶解した。20 μgの鋳型DNAから約100 μgのR
NAが合成された。このうちの5 μgとLog由来のpoly(A)+
RNA 5 μgを、前述の方法に従って、ビオチン化した。 1.11.3：ハイブリダイゼーション、サブトラクション Log由来のpoly(A)+RNAとサブトラクションで解析済みの
クローン由来のRNA各5μgをビオチン化したものに滅菌M
illiQ水を加え、総容量を10 μlとした。このうちの6
μl(理論的には、各々のRNAが3 μg含まれていることに
なる)に1.2 μlのマスキングオリゴ(100 pmol/μl)を加
え、滅菌MilliQ水で総容量を12 μlとした。65℃で10分
加熱した後、室温に30分置き、ビオチン化RNAにマスキ
ングオリゴをアニーリングさせた。ここに20 μlの2×H
B(通常のサブトラクション時に用いるもの)、4 μlの2
M NaCl、2 μlのpoly(A)、1 μlのssDNA(0.1 μg/μl;G
0-Log ssDNA subtracted library)を加えた。65 ℃で変
性せず、そのまま42℃のヒートブロックに移し、48時間
ハイブリダイゼーションを行った。以下、通常のサブト
ラクション時と同様にしてssDNAを回収し、2本鎖DNAと
した。これから、G0-Log 1次差分化ds-、ss-cDNAライブ
ラリーを前述と同様の方法により作製した。 1.12：二次差分化・・・段階的サブトラクション（重差
分）化（2回目） 2回目の重差分化を行うにあたっては、1次重差分化ssDN
AライブラリーからRNA化1次重差分化cDNAライブラリー
解析クローンを引くか、または、最初のサブトラクショ
ンssDNAライブラリーからRNA化サブトラクションcDNAラ
イブラリー解析クローンとRNA化1次重差分化cDNAライブ
ラリー解析クローンを差し引く方法があるが、先に述べ
た方法で行ったところ、作成したcDNAライブラリー中の
コロニーが非常に多かったため、あまりうまく差分化さ
れていないと判断し、後に述べた方法で行った。なお、
念のため、Log由来poly(A)+RNAも差し引いた。 1.12.1：1次重差分化cDNAライブラリー解析クローンか
らのRNAの合成とビオチン化 作製したサブトラクションライブラリー中、ノーザン解
析を行った216クローンのプラスミドを混合し、フェノ
ール/クロロホルム処理、クロロホルム処理、エタノー
ル沈殿により精製した。このうち20 μgをとり、10 μl
の10×NEB buffer 4、10 μlの10×BSA (NEB)、5 μlの
Not I(10 U/μl；NEB)および滅菌MilliQ水を加えて総容
量を100 μlとした。37℃で終夜反応させ、Not Iで切断
した。このうち1 μlを電気泳動して切断を確認した
後、フェノール/クロロホルム処理、クロロホルム処理
を行った。上清をミリポアフィルター(UFCP3TK50)の上
室にのせ、溶液が全て下に流れ落ちるまで遠心(4℃、10
000 rpm)した。下室のTEを除き、新たに上室に300 μl
のTEを加え、溶液が全て下に流れ落ちるまで遠心(4℃、
10000 rpm)してフィルターを洗浄した。この操作をもう
一度行い、フィルターを洗浄した。30 μlのTEをフィル
ターの上室に加え、しつこくピペッティングとvortexを
行いフィルターに付着したNot I切断プラスミドを溶か
し出した。ここに、10 μlの10×TRL buffer(T7 RNA po
lymeraseに付属のもの)、10 μlの10 mM rATP、10 μl
の10 mM rCTP、10 μlの10 mM rGTP、10 μlの10 mM rU
TP、1 μlのRNase inhibitor(40 U/μl；東洋紡績)、3
μlのT7 RNA polymerase(160 U/μl；東洋紡績)を加
え、滅菌MilliQ水で総容量を100 μlとし、37℃で90分
反応させた。1 μlのDNase I(70 U/μl；宝酒造)を加
え、37℃で15分保温して鋳型DNAを分解した。等量のフ
ェノール/クロロホルムを加え処理した後、更に等量の
クロロホルムで処理を行った。上清を回収後、これに総
容量が330 μlとなるようにTEを加え、13 μlの5 M NaC
lと1 μlのglycogen、990 μlの100 %エタノールを加
え、-80℃に30分静置した。これを遠心(4℃、15000 rp
m、15 min)後、沈殿に70%エタノールを加え洗浄し、更
に遠心(4℃、15000 rpm、5 min)によりエタノールを完
全に除去後、50 μlのTEに溶解した。20 μgの鋳型DNA
から約100 μgのRNAが合成された。このうちの5 μgと
すでにRNA化済みの1次重差分解析クローン 5μg、最初
のサブトラクションcDNAライブラリー解析クローン5 μ
gおよびLog由来のpoly(A)+RNA 5 μgを、前述の方法に
従って、ビオチン化した。 1.12.2：ハイブリダイゼーション、サブトラクション 前述の通りビオチン化した各RNA 5 μg相当量を含んだ
混合液10 μlから6 μl(理論的には、各々のRNAが3 μg
含まれていることになる)をとり、そこに1.2 μlのマス
キングオリゴ(100 pmol/μl)を加え、滅菌MilliQ水で総
容量を12 μlとした。65℃で10分加熱した後、室温に30
分置き、ビオチン化RNAにマスキングオリゴをアニーリ
ングさせた。ここに20 μlの2×HB(通常のサブトラクシ
ョン時に用いるもの)、4 μlの2 M NaCl、2 μlのpoly
(A)、1 μlのssDNA(0.1 μg/μl;G0-Log ssDNA subtrac
ted library)を加えた。65℃で変性せず、そのまま42℃
のヒートブロックに移し、48時間ハイブリダイゼーショ
ンを行った。以下、通常のサブトラクション時と同様に
してssDNAを回収し、2本鎖DNAとした。これから、G0-Lo
g 2次重差分化ds-、ss-cDNAライブラリーを前述と同様
の方法により作製した。 １.13：三次差分化・・・段階的サブトラクション（重
差分）化（3回目） 3回目の重差分化cDNAライブラリーは、2次重差分化ssDN
AライブラリーからRNA化したサブトラクションcDNAライ
ブラリー解析クローン、1次重差分化cDNAライブラリー
解析クローン、2次重差分化cDNAライブラリー解析クロ
ーンを差し引いて作成した。 1.13.1：2次重差分化cDNAライブラリー解析クローンか
らのRNAの合成とビオチン化 作製したサブトラクションライブラリー中、ノーザン解
析を行った146クローンのプラスミドを混合し、1次重差
分化cDNAライブラリー解析クローンと同様の手順に従っ
てRNAの合成を行った。続いて、RNA化した2次重差分化c
DNAライブラリー解析クローンおよびRNA化済みのサブト
ラクションcDNAライブラリー解析クローン、1次重差分
化cDNAライブラリー解析クローンおよび2次重差分化cDN
Aライブラリー解析クローン各5 μgを前述と同様の方法
によりビオチン化を行った。 1.13.2：ハイブリダイゼーション、サブトラクション 前述の通りビオチン化した各RNA 5 μg相当量を含んだ
混合液10 μlから6 μl(理論的には、各々のRNAが3 μg
含まれていることになる)をとり、そこに1.2 μlのマス
キングオリゴ(100 pmol/μl)を加え、滅菌MilliQ水で総
容量を12 μlとした。65℃で10分加熱した後、室温に30
分置き、ビオチン化RNAにマスキングオリゴをアニーリ
ングさせた。ここに20 μlの2×HB(通常のサブトラクシ
ョン時に用いるもの)、4 μlの2 M NaCl、2 μlのpoly
(A)〔1 μg/μl〕、1 μlのssDNA(0.1 μg/μl; G0-Log
二次重差分化ssDNAライブラリー)を加えた。65℃で変性
させず、そのまま42℃のヒートブロックに移し、48時間
ハイブリダイゼーションを行った。以下、通常のサブト
ラクション時と同様にしてssDNAを回収し、2本鎖DNAと
した。これから、G0-Log2次重差分化ds-、ss-cDNAライ
ブラリーを前述と同様の方法により作製した。 2. 結果と考察 2.1：一次重差分化(重差分の1回目) 重差分化法は、ライブラリー中に含まれる各クローンの
ノーザン解析を効率的に行うことを目的とした方法であ
る。つまり、ノーザン解析を行ったクローン(プラスミ
ド)の混合物を鋳型としてインサート由来のRNAを合成、
1本鎖DNAとハイブリし、それらを有するssDNAを除去し
たライブラリーを作製する。この原理に従い、先に作成
したサブトラクションライブラリーで解析を行った約30
クローン(プラスミド)を混合し、それらに含まれるイン
サート由来のRNAを合成し、ハイブリダイゼーションに
使用した。また、このサブトラクションライブラリーで
は、G0期特異的な遺伝子が十分に濃縮されていなかった
ことから、ssDNAの約30倍量に相当するpoly(A)+RNA (Lo
g)も同時に加え、1次重差分化cDNAライブラリーの作製
を行った。その結果、作製した同ライブラリーの複雑度
は、約1×10⁵となった。つまり、1次重差分化cDNA ライ
ブラリーは前ライブラリー（サブトラクションライブラ
リー）の約10倍程度の濃縮がかかったライブラリーであ
ると考えられた。

【００４０】最初のサブトラクションライブラリーの場
合と同様に、まず任意の約30クローンからプラスミドを
ピックアップし、続いてインサートを回収し、それらを
プローブとしてノーザン解析を行った。その結果、これ
らの中にはgrowth arrest(G0)特異的に発現量が上昇し
ているものが含まれていた。この結果より、1次重差分
化cDNAライブラリー中の解析クローン数を増やし、最終
的に400クローンからプラスミド、更にインサートを回
収し、ノーザン解析を行った。その結果、400クローン
中、0.4 kb以上のインサートを含むものが218個であっ
た(インサートの挿入率；54.5 %)。これらについて、静
止期で発現が上昇しているものをノーザンスクリーニン
グしたところ、そのようなクローンを20個単離すること
ができた。これらのクローンについて、その再現性の確
認も兼ね、更にTime course northern (Serum starve)
を行った。その結果を図７に示す。前述の約30クローン
のうちの15個については再現性が確認された。 2.2：二次重差分化 1次重差分化cDNAライブラリーの解析もある程度解析ク
ローン数が増えてくるとノーザンスクリーニングを繰り
返しても(1)重複するクローンが増えてくる、(2)あまり
差のあるものがとれなくなってくる、(3)あるいはその
両方が原因で効率が落ちてくる時期が来る。1次重差分
化cDNAライブラリーの解析では(2)が原因と考えられる
状態になってきた。従って、このまま1次重差分化cDNA
ライブラリーの解析を続けるより次の重差分化に移行し
た方が効率がよいと考え、1次重差分化cDNAライブラリ
ーの作成手順と同様にして、2次重差分化を行った（1.
材料と方法の項参照）。実際には、1つの重差分化ライ
ブラリーについて150〜200個の解析を行えば次の重差分
化に移行した方が遙かに効率的である。あまり１つのラ
イブラリーにこだわって数をこなすのは逆に非効率的
で、それでは重差分をしている意味がなくなる。

【００４１】2次重差分化cDNAライブラリーでは、はじ
めに任意の160個のコロニーをピックアップし、インサ
ートのチェックを行った。その結果、約50 %の確率でイ
ンサートが挿入されていた。1次重差分化cDNAライブラ
リーより約5 %程低い値になっているが、これは、重差
分を繰り返すほどよけいなものが引かれて取り除かれる
ので理にかなった結果だと考えられる。最終的に解析し
たクローンは約150クローンでそのうちノーザンスクリ
ーニングで静止期に発現上昇がみられたものが約30個あ
り1次重差分と同様にこれらのクローンについて、その
再現性の確認も兼ね、Time course northern (Serum st
arve)を行った。その結果、これら約30個のクローンの
うち12クローンについて再現性が確認された。

【００４２】次に単離された各クローンの塩基配列を決
定し、それらとデータベース間でホモロジーサーチを行
った。その結果、これらのクローンの中には、(i)規遺
伝子であると考えられるものが1種、(ii)制遺伝子、或
いはそのcandidateである可能性が示唆されているもの
が2種類、が含まれていた。 2.3：三次重差分化法 2次重差分化cDNAライブラリーの解析では解析クローン
数が増えてくるに従って、重複するクローンが増えてき
た。従って、このまま続けていくよりも次の差分化に移
行した方が効率がよいと考え、3次重差分化cDNAライブ
ラリーの作成に取りかかった。3次重差分化では2次重差
分化ssDNAライブラリーからこれまで解析してきた各差
分化cDNAライブラリー解析クローン（RNA化済み）を差
し引いて作成した（１.材料と方法の項参照）。

【００４３】3次重差分化cDNAライブラリーでは、2次重
差分化cDNAライブラリーと同様に、はじめに任意の160
個のコロニーをピックアップし、インサートのチェック
を行った。その結果、約45 %の確率でインサートが挿入
されていた。2次重差分化cDNAライブラリーより約5 %程
低い値になっているが、これも、2次重差分化時と同様
に、よけいなものが差し引かれて取り除かれた結果だと
考えられる。また、これらのインサートを回収して、30
個のクローンについてノーザンスクリーニングを行った
ところ目的とするクローンの候補が7個とれてきた。こ
の結果からも、この3次重差分化cDNAライブラリーは、
目的とするcDNAが濃縮されており、ライブラリーの作成
は成功したと考えられる。従って、このライブラリーか
ら次々と解析を進めていくことにした。最終的に解析し
たクローンは約240 クローンでそのうちノーザンスクリ
ーニングで静止期に発現上昇がみられたものが約45個あ
り1、2次重差分と同様にこれらのクローンについて、そ
の再現性の確認も兼ね、Time course northern (Serum
starved)を行った。その結果、これら約45個のクローン
のうち14クローンについて再現性が確認された。

【００４４】次に単離された各クローンの塩基配列を決
定し、それらとデータベース間でホモロジーサーチを行
った。その結果、これらのクローンの中には、新規遺伝
子と考えられるものが2種類、機能など未解析のものが5
種類が含まれていた。様々な方法で遺伝子解析プロジェ
クトが行われてきているため、検索を行うと種々のプロ
ジェクトcDNAライブラリーでクローニングされたものが
検索されてくるが、その殆どは機能など未解析のものが
多かった。従って、これら未解析の遺伝子は、新規の遺
伝子と考えることもできる。癌抑制遺伝子、或いはその
candidateである可能性が示唆されているものは今回と
れてこなかった。しかし、これら新規或いは機能未解析
のものの中には新規の癌抑制遺伝子、或いはそのcandid
ate遺伝子が存在する可能性は十分にあり、非常に興味
深い遺伝子であるといえる。こうして最終的にクローニ
ングした20種類の遺伝子をTIGA3-TIGA22と名づけた。そ
のノーザンブロット解析の結果をまとめて図７に示す。

【００４５】

【参照文献】Kobori, M., Ikeda, Y., Nara, H., Kato,
M., Kumegawa, M., Nojima, H. &Kawashima, H. Large
scale isolation of osteoclast-specific genes by a
nimproved method involving the preparation of a su
btracted cDNA library. Genes Cells,Genes Cells 3,
459-475 (1998). 2. Kobori, M. & Nojima, H. A simple treatment of D
NA in a ligation mixtureprior to electroporation i
mproves transformation frequency. Nucleic Acids Re
s. 21,2782 (1993). 3. Sive, H. L. & St John, T. A simple subtractive
hybridization technique employing photoactivatable
biotin and phenol extraction. Nucleic AcidsRes. 1
6,10937 (1988).

【００４６】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Japan Science and Technology Corporation <120> Gene cloning method and human gene <130> NP01324 <140> <141> <160> 40 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1741 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (384)..(1046) <400> 1 cccgggccag ggctcaacta ccccctggag acctttgtgg agagtctcag taacaagggc 60 atctcagaca tcatcaaggt gctggtgctt cgagaaggcc aaagtgcacc cctgctgagt 120 gcccacgtca acatgcctgg gagcgagggg ctggcggccg cctgagacct gagctgctgt 180 gaaagcccct gcacaatcag ccagggagaa ctgggcgggt ttagtggccc caggcccact 240 cctcatgcag cagtgtgctg gggcgacagc tcgtctcccc tctcttaagc acccgcttcc 300 tcaccacccc cactgttggg cctatagtag caggttagtg agtacctagg gcggctcaac 360 tcctcccaca gcaccaaccc agc atg gtc cca ctg aag tcc tac tac gcc ctc 413 Met Val Pro Leu Lys Ser Tyr Tyr Ala Leu 1 5 10 ccc tcc cca gcc ttt tcc aga aac cat act ggg ctc aga tca gag ctc 461 Pro Ser Pro Ala Phe Ser Arg Asn His Thr Gly Leu Arg Ser Glu Leu 15 20 25 cga agc ggt caa agt gag ctg agc agg aca ggc cca gcc ttt ctc cac 509 Arg Ser Gly Gln Ser Glu Leu Ser Arg Thr Gly Pro Ala Phe Leu His 30 35 40 tgc cac gtc cct cat gca cat cac tca tct cct gct gca ggc caa ggc 557 Cys His Val Pro His Ala His His Ser Ser Pro Ala Ala Gly Gln Gly 45 50 55 caa aat tgg gct agt cct ggc cag gga aat cag aag ctc ttc ttg ggt 605 Gln Asn Trp Ala Ser Pro Gly Gln Gly Asn Gln Lys Leu Phe Leu Gly 60 65 70 gag att gag cct cct gtt gct ccc tgg agt tcc gga ggc tgg gct gca 653 Glu Ile Glu Pro Pro Val Ala Pro Trp Ser Ser Gly Gly Trp Ala Ala 75 80 85 90 gcc cac tca gct tgc ggg caa aat acg tgc tct cct ctc tcc ttg tca 701 Ala His Ser Ala Cys Gly Gln Asn Thr Cys Ser Pro Leu Ser Leu Ser 95 100 105 gct gag caa acc cag gga ata gcc ctc ctc tcc cca gga aac ttc tct 749 Ala Glu Gln Thr Gln Gly Ile Ala Leu Leu Ser Pro Gly Asn Phe Ser 110 115 120 gaa atc tta gac tta gcc agt ctt agg cct acg atg cca cac aaa ggt 797 Glu Ile Leu Asp Leu Ala Ser Leu Arg Pro Thr Met Pro His Lys Gly 125 130 135 tgt tca ggg aga agg ggg tgc agg agg cag agg gtg ccc cgc agg gag 845 Cys Ser Gly Arg Arg Gly Cys Arg Arg Gln Arg Val Pro Arg Arg Glu 140 145 150 ctg gtg gct cca gcc cca cta gag ctc cta aag atc aca cag cag ctg 893 Leu Val Ala Pro Ala Pro Leu Glu Leu Leu Lys Ile Thr Gln Gln Leu 155 160 165 170 ctc ctg aca ggg atg ctc atg ccc aga aag caa gcc cag gag agg aag 941 Leu Leu Thr Gly Met Leu Met Pro Arg Lys Gln Ala Gln Glu Arg Lys 175 180 185 gca gag tgt gac aga gca gag cca ggg cca ggc gca cca gga gag gcg 989 Ala Glu Cys Asp Arg Ala Glu Pro Gly Pro Gly Ala Pro Gly Glu Ala 190 195 200 ttt ctg ggg ctc cag aga agt gcc acg gga ggc aga agt cca gaa ctg 1037 Phe Leu Gly Leu Gln Arg Ser Ala Thr Gly Gly Arg Ser Pro Glu Leu 205 210 215 ccc ata tag atgcccttct acatcctgga gcccaaatca gtcatgtggg 1086 Pro Ile 220 tgggaagttc ccagggcagt ggtcacatcg tgaaaattag caggaaaggc ggggcctttc 1146 ttgtcatagc tatttctgag gatgaaatgg gagacatatg cccagcacct gatgtaagtt 1206 tatataatgt aatattatgt acctaccact aagaaataca tgaaccgtgc catgaggaca 1266 gtaagtgttc ataaagcaac atgaagcaag aaacagtgca gggtgcccag tgcacacact 1326 agagagaaat tgtgaacatt aaggacaagg agaattggtg tctttctaaa acatacttat 1386 ttaaaacaca tacccactta ctaatgtgga attacacagt ttgtaacaag aaaacagtct 1446 ctcccattct ctagtactgc tcccctaccc agcatcactt ccagttcatt cagctatttt 1506 taaaatgtgc ttatatgact cttgcttgat atatcaatct tagacattac ctgttgactc 1566 cctgttgtca tacatgaggc tttagctctc ttttgtcagc aaccctcccc catccctagt 1626 tattaggtta aaaaatactc agattactat ttctattact atgtgaaagt taactgcgga 1686 gccaagagtt ggactataat taaattacct tccttgtaaa aaaaaaaaaa aaaaa 1741 <210> 2 <211> 220 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Val Pro Leu Lys Ser Tyr Tyr Ala Leu Pro Ser Pro Ala Phe Ser 1 5 10 15 Arg Asn His Thr Gly Leu Arg Ser Glu Leu Arg Ser Gly Gln Ser Glu 20 25 30 Leu Ser Arg Thr Gly Pro Ala Phe Leu His Cys His Val Pro His Ala 35 40 45 His His Ser Ser Pro Ala Ala Gly Gln Gly Gln Asn Trp Ala Ser Pro 50 55 60 Gly Gln Gly Asn Gln Lys Leu Phe Leu Gly Glu Ile Glu Pro Pro Val 65 70 75 80 Ala Pro Trp Ser Ser Gly Gly Trp Ala Ala Ala His Ser Ala Cys Gly 85 90 95 Gln Asn Thr Cys Ser Pro Leu Ser Leu Ser Ala Glu Gln Thr Gln Gly 100 105 110 Ile Ala Leu Leu Ser Pro Gly Asn Phe Ser Glu Ile Leu Asp Leu Ala 115 120 125 Ser Leu Arg Pro Thr Met Pro His Lys Gly Cys Ser Gly Arg Arg Gly 130 135 140 Cys Arg Arg Gln Arg Val Pro Arg Arg Glu Leu Val Ala Pro Ala Pro 145 150 155 160 Leu Glu Leu Leu Lys Ile Thr Gln Gln Leu Leu Leu Thr Gly Met Leu 165 170 175 Met Pro Arg Lys Gln Ala Gln Glu Arg Lys Ala Glu Cys Asp Arg Ala 180 185 190 Glu Pro Gly Pro Gly Ala Pro Gly Glu Ala Phe Leu Gly Leu Gln Arg 195 200 205 Ser Ala Thr Gly Gly Arg Ser Pro Glu Leu Pro Ile 210 215 220 <210> 3 <211> 714 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (62)..(697) <400> 3 tttttttaaa aaatatwcac actcaamttg gtgrtttmtm tatymtttma gcccywgstg 60 g atg aga tac agt gga cta gcg cgc ggc kgc ccc awa cta rgn cgg aag 109 Met Arg Tyr Ser Gly Leu Ala Arg Gly Xaa Pro Xaa Leu Xaa Arg Lys 1 5 10 15 gyt ctt awg tar sty ata tgs tcg gcy ctt agg cga ggc gct tcc tat 157 Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Ile Xaa Ser Xaa Leu Arg Arg Gly Ala Ser Tyr 20 25 30 ggt gat ctt ggr aaa act ytt gct act gry aga gkg ata tgy tct tat 205 Gly Asp Leu Xaa Lys Thr Xaa Ala Thr Xaa Arg Xaa Ile Cys Ser Tyr 35 40 45 cta agc cct agc cga ata gga cya mtg ksm cca aam aac cyc cmg tcy 253 Leu Ser Pro Ser Arg Ile Gly Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Asn Xaa Xaa Xaa 50 55 60 ctc ttg gaa gta aag gta ttc aga gat act tat acc agt mtt agg ctt 301 Leu Leu Glu Val Lys Val Phe Arg Asp Thr Tyr Thr Ser Xaa Arg Leu 65 70 75 80 ctg mma mmt ttt caa att tgt ctc cac tgc cmm gam tgc cct aaa tat 349 Leu Xaa Xaa Phe Gln Ile Cys Leu His Cys Xaa Xaa Cys Pro Lys Tyr 85 90 95 att cct twc atg cgc tgg trg aga gac tgg gcg ttg tgt tcc tcc aka 397 Ile Pro Xaa Met Arg Trp Xaa Arg Asp Trp Ala Leu Cys Ser Ser Xaa 100 105 110 ccg cas cay gca ktc wct cac ycc cag cgs kct tct ctc ctg cgm tca 445 Pro Xaa His Ala Xaa Xaa His Xaa Gln Xaa Xaa Ser Leu Leu Xaa Ser 115 120 125 cgs atc ccc atc cca tgc aag ctr tgr sct mga gsg cgt cay kgs tct 493 Xaa Ile Pro Ile Pro Cys Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg His Xaa Ser 130 135 140 atc sgt ctc act mcc gcg asg agg tsg cta aaa gts aga ctt ags art 541 Ile Xaa Leu Thr Xaa Ala Xaa Arg Xaa Leu Lys Xaa Arg Leu Xaa Xaa 145 150 155 160 cty cnt cts yty aca cst kyg cct smg tct gtg cac acc ccc cca agc 589 Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Pro Xaa Ser Val His Thr Pro Pro Ser 165 170 175 ycc mct caa gsg cat cca rkk agc tsr gcc cat stg csc cgt ggg ggk 637 Xaa Xaa Gln Xaa His Pro Xaa Ser Xaa Ala His Xaa Xaa Arg Gly Xaa 180 185 190 tta tat cct ccc yyg tcc rts aac crg gtk tcy cas akg kgc ttc cac 685 Leu Tyr Pro Pro Xaa Ser Xaa Asn Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe His 195 200 205 atg tgc aac tag awttgkgtrm akgssgc 714 Met Cys Asn 210 <210> 4 <211> 211 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Arg Tyr Ser Gly Leu Ala Arg Gly Xaa Pro Xaa Leu Xaa Arg Lys 1 5 10 15 Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Ile Xaa Ser Xaa Leu Arg Arg Gly Ala Ser Tyr 20 25 30 Gly Asp Leu Xaa Lys Thr Xaa Ala Thr Xaa Arg Xaa Ile Cys Ser Tyr 35 40 45 Leu Ser Pro Ser Arg Ile Gly Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Asn Xaa Xaa Xaa 50 55 60 Leu Leu Glu Val Lys Val Phe Arg Asp Thr Tyr Thr Ser Xaa Arg Leu 65 70 75 80 Leu Xaa Xaa Phe Gln Ile Cys Leu His Cys Xaa Xaa Cys Pro Lys Tyr 85 90 95 Ile Pro Xaa Met Arg Trp Xaa Arg Asp Trp Ala Leu Cys Ser Ser Xaa 100 105 110 Pro Xaa His Ala Xaa Xaa His Xaa Gln Xaa Xaa Ser Leu Leu Xaa Ser 115 120 125 Xaa Ile Pro Ile Pro Cys Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg His Xaa Ser 130 135 140 Ile Xaa Leu Thr Xaa Ala Xaa Arg Xaa Leu Lys Xaa Arg Leu Xaa Xaa 145 150 155 160 Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Pro Xaa Ser Val His Thr Pro Pro Ser 165 170 175 Xaa Xaa Gln Xaa His Pro Xaa Ser Xaa Ala His Xaa Xaa Arg Gly Xaa 180 185 190 Leu Tyr Pro Pro Xaa Ser Xaa Asn Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe His 195 200 205 Met Cys Asn 210 <210> 5 <211> 659 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (42)..(470) <400> 5 tgacatgtgt atgcgtatgc atacacacca cacacacaca c atg cac aag tca tgt 56 Met His Lys Ser Cys 1 5 gcg aac agc cct cca aag cct atg cca cag aca gct ctt gcc cca gcc 104 Ala Asn Ser Pro Pro Lys Pro Met Pro Gln Thr Ala Leu Ala Pro Ala 10 15 20 aga atc agc cat agc agc tcg ccg tct gcc ctg tcc atc tgt ccg tcc 152 Arg Ile Ser His Ser Ser Ser Pro Ser Ala Leu Ser Ile Cys Pro Ser 25 30 35 gtt ccc tgg aga aga cac aag ggt atc cat gct ctg tgg cca ggt gcc 200 Val Pro Trp Arg Arg His Lys Gly Ile His Ala Leu Trp Pro Gly Ala 40 45 50 tgc cac cct ctg gaa ctc aca aaa gct ggc ttt tat tcc ttt ccc atc 248 Cys His Pro Leu Glu Leu Thr Lys Ala Gly Phe Tyr Ser Phe Pro Ile 55 60 65 cta tgg gga cag gag cct tca gga ctg ctg gcc tgg cct ggc cca ccc 296 Leu Trp Gly Gln Glu Pro Ser Gly Leu Leu Ala Trp Pro Gly Pro Pro 70 75 80 85 tgc tcc tcc agg tgc tgg gca gtc act ctg cta aga gtc cct ccc tgc 344 Cys Ser Ser Arg Cys Trp Ala Val Thr Leu Leu Arg Val Pro Pro Cys 90 95 100 cac gcc ctg gca gga cac agg cac ttt tcc aat ggg caa gcc cag tgg 392 His Ala Leu Ala Gly His Arg His Phe Ser Asn Gly Gln Ala Gln Trp 105 110 115 agg cag gat ggg aga gcc ccc tgg gtg ctg ctg ggg cct tgg ggc agg 440 Arg Gln Asp Gly Arg Ala Pro Trp Val Leu Leu Gly Pro Trp Gly Arg 120 125 130 agt gaa gca gag gtg atg ggg ctg ggc tga gccagggagg aaggacccag 490 Ser Glu Ala Glu Val Met Gly Leu Gly 135 140 ctgcacctag gagacacctt tgttcttcag gcctgtgggg gaagttccgg gtgcctttat 550 tttttattct tttctaagga aaaaaatgat aaaaatctca aagctgattt ttcttgttat 610 agaaaaacta atataaaagc attatcccta aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 659 <210> 6 <211> 142 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met His Lys Ser Cys Ala Asn Ser Pro Pro Lys Pro Met Pro Gln Thr 1 5 10 15 Ala Leu Ala Pro Ala Arg Ile Ser His Ser Ser Ser Pro Ser Ala Leu 20 25 30 Ser Ile Cys Pro Ser Val Pro Trp Arg Arg His Lys Gly Ile His Ala 35 40 45 Leu Trp Pro Gly Ala Cys His Pro Leu Glu Leu Thr Lys Ala Gly Phe 50 55 60 Tyr Ser Phe Pro Ile Leu Trp Gly Gln Glu Pro Ser Gly Leu Leu Ala 65 70 75 80 Trp Pro Gly Pro Pro Cys Ser Ser Arg Cys Trp Ala Val Thr Leu Leu 85 90 95 Arg Val Pro Pro Cys His Ala Leu Ala Gly His Arg His Phe Ser Asn 100 105 110 Gly Gln Ala Gln Trp Arg Gln Asp Gly Arg Ala Pro Trp Val Leu Leu 115 120 125 Gly Pro Trp Gly Arg Ser Glu Ala Glu Val Met Gly Leu Gly 130 135 140 <210> 7 <211> 981 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (539)..(964) <400> 7 cctgcggtgc gccgcgaccg tttttttttt tttttttttc cgggtggaac aaatctttta 60 ttttctgaag acaagtgatt tgaagtccag actgaatggc atttaagaat taggaatcct 120 gcgtgccatc ctggagtgaa ttaaactaaa ttagagtcca gaatatgcag cttctttaag 180 aaaaaattct cctctgaaat attttctttc ccactgcatt aagtagtgtt cctcatgaga 240 catctgaaaa cattgattgt taaaatgtgg tcctgggacc agcagcaatg acatcacctg 300 gggccccact tcagactcct ggactctgga tctctggagg gtggaggcat ctaggtgatt 360 ctgaagaacc actggcttaa aagtctcctt ggtcagtgct ttccactaat cagtaaatat 420 atagagctag cagagctgga gctctgttta tcacttctct ttttagaatg aagtctctgt 480 ttgacagtgg gaaagcctgc tagaatgatc ctgagttgct tgtgaagtca tacaagca 538 atg bgn gns nga gag aga gag aga gag agc gag aga gag gac ttc cct 586 Met Xaa Xaa Xaa Glu Arg Glu Arg Glu Ser Glu Arg Glu Asp Phe Pro 1 5 10 15 ggc tgc agt ccc aga ttg gat atc gtg tst gcc gtc ggn agn rck cgc 634 Gly Cys Ser Pro Arg Leu Asp Ile Val Xaa Ala Val Xaa Xaa Xaa Arg 20 25 30 cag act cgg ctt acg ttg gga cgc gtt cat ttg cgc cgt cca ggg cgt 682 Gln Thr Arg Leu Thr Leu Gly Arg Val His Leu Arg Arg Pro Gly Arg 35 40 45 cgt ggg ggc tgc ctt ggg ggt gng gct gct ggg gtc tta tct atg agg 730 Arg Gly Gly Cys Leu Gly Gly Xaa Ala Ala Gly Val Leu Ser Met Arg 50 55 60 ccc ttt cgg agt gag gtg tgs ggg gcc ggg gcg tgg agg aat tcg acg 778 Pro Phe Arg Ser Glu Val Xaa Gly Ala Gly Ala Trp Arg Asn Ser Thr 65 70 75 80 ata aag ctt cag cgg gga cgg ccg gcg ttc gcg ggg ggg gcc ggg tac 826 Ile Lys Leu Gln Arg Gly Arg Pro Ala Phe Ala Gly Gly Ala Gly Tyr 85 90 95 cca agc ttt ttg cct cat ttg gtg aag ggt ggg tgg ggg tgt tcc gcg 874 Pro Ser Phe Leu Pro His Leu Val Lys Gly Gly Trp Gly Cys Ser Ala 100 105 110 aaa acc ttg gtc att gcc gtt ttc ctg tgg gga atg ggg gtc cgg ccc 922 Lys Thr Leu Val Ile Ala Val Phe Leu Trp Gly Met Gly Val Arg Pro 115 120 125 ggc atg gca nnn aan att ctg ggc ttt tgc gnn tgt gtg tag 964 Gly Met Ala Xaa Xaa Ile Leu Gly Phe Cys Xaa Cys Val 130 135 140 gggctngggn gcntntc 981 <210> 8 <211> 141 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Xaa Xaa Xaa Glu Arg Glu Arg Glu Ser Glu Arg Glu Asp Phe Pro 1 5 10 15 Gly Cys Ser Pro Arg Leu Asp Ile Val Xaa Ala Val Xaa Xaa Xaa Arg 20 25 30 Gln Thr Arg Leu Thr Leu Gly Arg Val His Leu Arg Arg Pro Gly Arg 35 40 45 Arg Gly Gly Cys Leu Gly Gly Xaa Ala Ala Gly Val Leu Ser Met Arg 50 55 60 Pro Phe Arg Ser Glu Val Xaa Gly Ala Gly Ala Trp Arg Asn Ser Thr 65 70 75 80 Ile Lys Leu Gln Arg Gly Arg Pro Ala Phe Ala Gly Gly Ala Gly Tyr 85 90 95 Pro Ser Phe Leu Pro His Leu Val Lys Gly Gly Trp Gly Cys Ser Ala 100 105 110 Lys Thr Leu Val Ile Ala Val Phe Leu Trp Gly Met Gly Val Arg Pro 115 120 125 Gly Met Ala Xaa Xaa Ile Leu Gly Phe Cys Xaa Cys Val 130 135 140 <210> 9 <211> 1702 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (195)..(416) <400> 1 agctaaattc attgggtttg atctcaagtc aaacttagaa atactgtcat ctcagccaca 60 aatttcacac taaagtagat agaaaccact actaaatcac tactttgtct taaaatgaaa 120 gtataataga ctgtaaggtt ataattgctt ttttaagtta aactttgttt tacatttaca 180 gaaaatttgc aaaa atg gag tcc cca cac acc ctt cat cca att tcc cct 230 Met Glu Ser Pro His Thr Leu His Pro Ile Ser Pro 1 5 10 acc att aat atc tta caa tac cat ggt ata tct gtc aca ata aag aaa 278 Thr Ile Asn Ile Leu Gln Tyr His Gly Ile Ser Val Thr Ile Lys Lys 15 20 25 tcg gta ttg gca cta tta cct aaa ttc cac act ttg ttc aga ttc gct 326 Ser Val Leu Ala Leu Leu Pro Lys Phe His Thr Leu Phe Arg Phe Ala 30 35 40 agt ttt cca tta atg tcc ttt ttc tgc tgg aga tcc cag cca gga tac 374 Ser Phe Pro Leu Met Ser Phe Phe Cys Trp Arg Ser Gln Pro Gly Tyr 45 50 55 60 cac att aca ttt aat cat tat gca tca ttt tct ctg gca taa 416 His Ile Thr Phe Asn His Tyr Ala Ser Phe Ser Leu Ala 65 70 tagtttctca gacttttctt gtttttgagt agtgattagg taatttgtaa aatgctaacc 476 agcgatctca gctcaccata acttccgcct ctcgggctca agagattctc ccacctcaac 536 ctcccgagta gccgggacta caggcgttca ccaccacacc aggctaattt ttgtattttt 596 agtagaaacg gggtttcgcc atgttagcca ggctggtctc caactcctaa cctcaagtga 656 tccgcccgcc tcggcctccc aaagtgctgg gatcacagac gtgagccacc gcgttcggcc 716 cctttttcta atattgtcta aaataagtat cctaaacagg aaataccaaa aaaatccccc 776 tcgctttcgt gacctacacc ggtaagcgtc aggatctttc gctatgcgag aaccttttgg 836 ctctcgtatg tgcgcatgcg tctggatccg gagccaggtg acccgctcag acgtggacca 896 tgtgcggggg aggggggaaa ggagccgcga agggggtggt agaccgaaca ggtggagccg 956 cggcggggct aggcggggcg gggagtgaaa acagcatagg ctccgcccct cgcggcgctt 1016 cccccggaat agcgtcatca tttctataag acagcgtgtg ccgaaggcct cggcctttca 1076 cattcgggaa gcgtcgggat taggtgaaag tacgtattgt ctttcgtaag ttaaaatgat 1136 aattgggccg aaacttactg ccttacctaa aaggcagcgc agtcaggata ttggtaggtc 1196 gggggcggct ttggaaaccc ttaagtttac aagcatgcgc ggacttgagt gctcattagg 1256 tcgccgggcg tccacgtgca gccctggacc ctgaaccccg gcgtgcgtgg gccgtgggcc 1316 tcggggaaag gttccgtgca ctcggggact ccggtgaagc ctgttcagcc gtctgtgtca 1376 tgtggccatc ttgagtctac tctgtcgctc ttgtgcccta gcaccccgag aaccgtcagt 1436 ttgagccaga tggaagctga gctgaacaca ttacgatgga tgatggaaac ataagactat 1496 caagaaatcc aagtggtaat gggcgaagtt tattcagcat ccggcaatgg acttatcgta 1556 gttggggaaa cgggtgttcc gaataatatc ctggaagtta tcaggacacc tattttaaat 1616 ataggcctga attttgtaaa gtaatattta aggtggtccg tgataattaa ataaaatgct 1676 taattcataa aaraaaaaaa aaaaaa 1702 <210> 10 <211> 73 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Met Glu Ser Pro His Thr Leu His Pro Ile Ser Pro Thr Ile Asn Ile 1 5 10 15 Leu Gln Tyr His Gly Ile Ser Val Thr Ile Lys Lys Ser Val Leu Ala 20 25 30 Leu Leu Pro Lys Phe His Thr Leu Phe Arg Phe Ala Ser Phe Pro Leu 35 40 45 Met Ser Phe Phe Cys Trp Arg Ser Gln Pro Gly Tyr His Ile Thr Phe 50 55 60 Asn His Tyr Ala Ser Phe Ser Leu Ala 65 70 <210> 11 <211> 840 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (396)..(620) <400> 11 cgccagaggg gttgagccac gggagtagaa acggggttgg cgagcgtagg tgagtaacat 60 ggataakata cgcaggaccc gcmctgtgta gtgacgggtg aatattaaat acgtcagcgg 120 tcgcgtatgt gagattaacc agcagagatc agcgctgtct cgcacgcgmg kwacagawcg 180 catgaccggt atctcgctcg cacgtgcgat gcacacgtac atagaataga gatacagtct 240 gtagtgtatg tattagtgat catagacaca acgacactag taatgctatg tagagacaag 300 acatatgact ttgattcttg tggaaattta gtgcatgctt aattgcttta atatctagta 360 actcattatt acagtckagt ccatatgrra tcgag atg ctc acm aca wct aga 413 Met Leu Xaa Thr Xaa Arg 1 5 tca gac taw rca ttc tat ttt att gct ktc akg ctc tac atg agg gga 461 Ser Asp Xaa Xaa Phe Tyr Phe Ile Ala Xaa Xaa Leu Tyr Met Arg Gly 10 15 20 ggt gta ggc atg tgt ata ttt gta amt gca agt aat ata cmt cta caa 509 Gly Val Gly Met Cys Ile Phe Val Xaa Ala Ser Asn Ile Xaa Leu Gln 25 30 35 atg tgg taw kcg ctg ryt agt cgt atc cgg ctg acc tcg cgc gat agt 557 Met Trp Xaa Xaa Leu Xaa Ser Arg Ile Arg Leu Thr Ser Arg Asp Ser 40 45 50 cgg gtg atg acg agc wga tca acc tct cga cac gat gcw cga ctc cgc 605 Arg Val Met Thr Ser Xaa Ser Thr Ser Arg His Asp Xaa Arg Leu Arg 55 60 65 70 gga gac tgt gtc tag cgagcttgtc tktcakccga ttgmygggwg caaayaakcc 660 Gly Asp Cys Val 75 cgttaggcas atsagcggtw attcgckgst gwsgggcgca cattaaccca akcacgtaac 720 gatacgacrt wcatmmtggc ytaamtatcc tgcatcatat cgcwktgtac tcagmcmtca 780 ccatatgccg tgctcaaaka ccscacasct rccttmagwg ggmatmccsy wtcakgmgct 840 <210> 12 <211> 74 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Met Leu Xaa Thr Xaa Arg Ser Asp Xaa Xaa Phe Tyr Phe Ile Ala Xaa 1 5 10 15 Xaa Leu Tyr Met Arg Gly Gly Val Gly Met Cys Ile Phe Val Xaa Ala 20 25 30 Ser Asn Ile Xaa Leu Gln Met Trp Xaa Xaa Leu Xaa Ser Arg Ile Arg 35 40 45 Leu Thr Ser Arg Asp Ser Arg Val Met Thr Ser Xaa Ser Thr Ser Arg 50 55 60 His Asp Xaa Arg Leu Arg Gly Asp Cys Val 65 70 <210> 13 <211> 2552 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (94)..(1038) <400> 13 cagcacctga agtccaaggc actgcgggag cgctggctgc tggaggggac gccgtcctcg 60 gcctcagagg gggatgagga cctgaggagg cag atg cag gac gac gag cag aag 114 Met Gln Asp Asp Glu Gln Lys 1 5 aca cgg ctg ctg gag gac tcg gtg tcc agg ttg gag aag gaa att gag 162 Thr Arg Leu Leu Glu Asp Ser Val Ser Arg Leu Glu Lys Glu Ile Glu 10 15 20 gtg ctg gag cgt gga gac tcc gcc cca gcc act gcc aag gag aac gcg 210 Val Leu Glu Arg Gly Asp Ser Ala Pro Ala Thr Ala Lys Glu Asn Ala 25 30 35 gcg gcc ccg agc cca gtc cgg gcc cca gcc ccg agt cca gcc aag gag 258 Ala Ala Pro Ser Pro Val Arg Ala Pro Ala Pro Ser Pro Ala Lys Glu 40 45 50 55 gag cgc aag aca gag gtg gtg atg aat tca cag cag acg ccg gtg ggc 306 Glu Arg Lys Thr Glu Val Val Met Asn Ser Gln Gln Thr Pro Val Gly 60 65 70 acg ccc aaa gac aag cga gtc tcc aac acg ccc ctg agg acg gtt gac 354 Thr Pro Lys Asp Lys Arg Val Ser Asn Thr Pro Leu Arg Thr Val Asp 75 80 85 ggc tcc ccc atg atg aag gca gcc atg tac tcg gtt gag atc act gtg 402 Gly Ser Pro Met Met Lys Ala Ala Met Tyr Ser Val Glu Ile Thr Val 90 95 100 gag aag gac aag gtg aca ggg gag acc agg gtg ctg tcc agc acc acg 450 Glu Lys Asp Lys Val Thr Gly Glu Thr Arg Val Leu Ser Ser Thr Thr 105 110 115 ctg ctc cct cgg cag ccg ctc cct ctg ggc atc aaa gtc tac gag gac 498 Leu Leu Pro Arg Gln Pro Leu Pro Leu Gly Ile Lys Val Tyr Glu Asp 120 125 130 135 gag acc aaa gtg gtc cat gct gtg gac ggc acc gcc gag aac ggg atc 546 Glu Thr Lys Val Val His Ala Val Asp Gly Thr Ala Glu Asn Gly Ile 140 145 150 cac ccc ctg agc tcc tcc gag gtg gac gaa ctc atc cac aaa gcg gac 594 His Pro Leu Ser Ser Ser Glu Val Asp Glu Leu Ile His Lys Ala Asp 155 160 165 gag gtc acg ctg agc gag gca ggg tcc acg gcc ggg gcg gca gag acc 642 Glu Val Thr Leu Ser Glu Ala Gly Ser Thr Ala Gly Ala Ala Glu Thr 170 175 180 cgg ggg gct gtg gag ggg gca gcc cgg acc acg ccc tcc cgg cgg gag 690 Arg Gly Ala Val Glu Gly Ala Ala Arg Thr Thr Pro Ser Arg Arg Glu 185 190 195 atc acc ggt gtg cag gca cag cca ggc gag gcc acg tcc ggc ccg ccg 738 Ile Thr Gly Val Gln Ala Gln Pro Gly Glu Ala Thr Ser Gly Pro Pro 200 205 210 215 ggg atc cag ccc ggc cag gag ccc ccg gtc aca atg atc ttc atg ggt 786 Gly Ile Gln Pro Gly Gln Glu Pro Pro Val Thr Met Ile Phe Met Gly 220 225 230 tac cag aac gtg gag gat gag gcc gag acc aag aag gtg ctg ggc ctt 834 Tyr Gln Asn Val Glu Asp Glu Ala Glu Thr Lys Lys Val Leu Gly Leu 235 240 245 caa gat acc atc acg gcg gag ctg gtg gtc atc gaa gac gcg gct gag 882 Gln Asp Thr Ile Thr Ala Glu Leu Val Val Ile Glu Asp Ala Ala Glu 250 255 260 ccc aag gag cct gca cca ccc aac ggc agt gct gcc gag cct ccc acg 930 Pro Lys Glu Pro Ala Pro Pro Asn Gly Ser Ala Ala Glu Pro Pro Thr 265 270 275 gag gcc gcc tcc agg gaa gag aat cag gcg ggg ccc gag gcc acc acc 978 Glu Ala Ala Ser Arg Glu Glu Asn Gln Ala Gly Pro Glu Ala Thr Thr 280 285 290 295 agc gac ccc cag gac ctc gac atg aag aag cac cgt tgt aaa tgc tgc 1026 Ser Asp Pro Gln Asp Leu Asp Met Lys Lys His Arg Cys Lys Cys Cys 300 305 310 tcc atc atg tga gccggccccc gagaccccgg cccccacccc acaccacaga 1078 Ser Ile Met 315 cacccaccag cccggcccct cccggcgcct gcccaccctc cacccacagc ctcacgggtc 1138 caggacttgg cgtgttgtta catgttcctt ccgagttttc tttcgctgga aagagggaca 1198 ggggccccca cccgtcacca cgccccaaca ctccccccga accagagccg tgcacttgtg 1258 cctggtagga gagagacagg acagacccgc ttttcccgag acaaggaccc cccatgtcac 1318 ggcagcttca cagacgcggc tcgcgcccac cggggtcctg gcgggtggga cccgcagcct 1378 ccacgcggcc caggccagcc tgccaccctc tgggcctcct acctgtgcct ttctctgagg 1438 ggacaccccg ccagagaggg ccccgggagc cgggggtggg tactgaggcc tgctcaggcc 1498 ctggaagtga ggctctatgg ggttccctgg ccaaggcgct ggccccccaa tctcaggcag 1558 ttggggtgag gccgtgcctc tttgggggct aaaggtcttg ggtggaggac aggcccctct 1618 gctgtgcccc tatgccctgt gtgggcccaa ccagtggaca atggagtctg ggggaggggg 1678 aaccccgggg acatgccccc acccgggagg ggccggtaac ccctgggcta tcttctagac 1738 ggggcgaacc aggggtcatt gacctgcccc ctgcacaggg cagggaccga gtgagccact 1798 ccttgtcccg agctcccgcc cccactgggc cctccttcct cctggtgcta atttggggac 1858 cccaggggcc gcccccggcc tcttctccat cctgcttgga ccagggtcct gggtcttccc 1918 aaccataccc cgagatcagg ccccacctgc cagctctact gggcttggag cacgtccggg 1978 cagtggaggg agggacacag cctgggacag gaagcctctt gggttggagc aggagaccct 2038 catttgccac ccagaccaat gtgagcctgc ccccagcccc ctctcattgg aagtggcaag 2098 gggcttccct cctgggggca gctacactcg tccccagagg cacattcgtg cacattctca 2158 cagacaccgt ctcacacgtt ggctttggac aaccaggccc caacttggtc cctgccctag 2218 ggacctccag cctggtgccc agtgctcagg ccacctcctg gtccagtcac cacctgcagc 2278 ctcggcaggg caggtacagg ggccacctcg gatgggagcc tgggtccctg cctccgctct 2338 gcccctgggt ggctgggagg agaggccctc tcgggggtga cctgggcgtc agccgtggaa 2398 ccccctcctc ctccctggag tctgcctgag tccctcgagc cgcgagcctt cgctgaagtg 2458 cccttgctat aaccccctct gcttctggtg tgtgacgagg cccccgatgt tcttgatttt 2518 cccagagaag caaataaaca gcgtgaacag cccc 2552 <210> 14 <211> 314 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Met Gln Asp Asp Glu Gln Lys Thr Arg Leu Leu Glu Asp Ser Val Ser 1 5 10 15 Arg Leu Glu Lys Glu Ile Glu Val Leu Glu Arg Gly Asp Ser Ala Pro 20 25 30 Ala Thr Ala Lys Glu Asn Ala Ala Ala Pro Ser Pro Val Arg Ala Pro 35 40 45 Ala Pro Ser Pro Ala Lys Glu Glu Arg Lys Thr Glu Val Val Met Asn 50 55 60 Ser Gln Gln Thr Pro Val Gly Thr Pro Lys Asp Lys Arg Val Ser Asn 65 70 75 80 Thr Pro Leu Arg Thr Val Asp Gly Ser Pro Met Met Lys Ala Ala Met 85 90 95 Tyr Ser Val Glu Ile Thr Val Glu Lys Asp Lys Val Thr Gly Glu Thr 100 105 110 Arg Val Leu Ser Ser Thr Thr Leu Leu Pro Arg Gln Pro Leu Pro Leu 115 120 125 Gly Ile Lys Val Tyr Glu Asp Glu Thr Lys Val Val His Ala Val Asp 130 135 140 Gly Thr Ala Glu Asn Gly Ile His Pro Leu Ser Ser Ser Glu Val Asp 145 150 155 160 Glu Leu Ile His Lys Ala Asp Glu Val Thr Leu Ser Glu Ala Gly Ser 165 170 175 Thr Ala Gly Ala Ala Glu Thr Arg Gly Ala Val Glu Gly Ala Ala Arg 180 185 190 Thr Thr Pro Ser Arg Arg Glu Ile Thr Gly Val Gln Ala Gln Pro Gly 195 200 205 Glu Ala Thr Ser Gly Pro Pro Gly Ile Gln Pro Gly Gln Glu Pro Pro 210 215 220 Val Thr Met Ile Phe Met Gly Tyr Gln Asn Val Glu Asp Glu Ala Glu 225 230 235 240 Thr Lys Lys Val Leu Gly Leu Gln Asp Thr Ile Thr Ala Glu Leu Val 245 250 255 Val Ile Glu Asp Ala Ala Glu Pro Lys Glu Pro Ala Pro Pro Asn Gly 260 265 270 Ser Ala Ala Glu Pro Pro Thr Glu Ala Ala Ser Arg Glu Glu Asn Gln 275 280 285 Ala Gly Pro Glu Ala Thr Thr Ser Asp Pro Gln Asp Leu Asp Met Lys 290 295 300 Lys His Arg Cys Lys Cys Cys Ser Ile Met 305 310 <210> 15 <211> 4692 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> 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Thr Arg Leu Asn Pro Lys Val 55 60 65 caa gac ttc ggc tgg cct gag ctg cat gct cca ccc ctg gac aag ctg 597 Gln Asp Phe Gly Trp Pro Glu Leu His Ala Pro Pro Leu Asp Lys Leu 70 75 80 tgc tcc atc tgc aaa gcc atg gag aca tgg ctc agt gct gac cca cag 645 Cys Ser Ile Cys Lys Ala Met Glu Thr Trp Leu Ser Ala Asp Pro Gln 85 90 95 100 cac gtg gtc gta cta tac tgc aag gga aac aag ggc aag ctt ggg gtc 693 His Val Val Val Leu Tyr Cys Lys Gly Asn Lys Gly Lys Leu Gly Val 105 110 115 atc gtt tct gcc tac atg cac tac agc aag atc tct gca ggg gcg gac 741 Ile Val Ser Ala Tyr Met His Tyr Ser Lys Ile Ser Ala Gly Ala Asp 120 125 130 cag gca ctg gcc act ctt acc atg cgg aaa ttc tgc gag gac aag gtg 789 Gln Ala Leu Ala Thr Leu Thr Met Arg Lys Phe Cys Glu Asp Lys Val 135 140 145 gcc aca gaa ctg cag ccc tcc cag cgt cga tat atc agc tac ttc agt 837 Ala Thr Glu Leu Gln Pro Ser Gln Arg Arg Tyr Ile Ser Tyr Phe Ser 150 155 160 ggg ctg cta tct ggc tcc atc aga atg aac agc agc cct ctc ttc ctg 885 Gly Leu Leu Ser Gly Ser Ile Arg Met Asn Ser Ser Pro Leu Phe Leu 165 170 175 180 cac tat gtg ctc atc ccc atg ctg cca gcc ttt gaa cct ggc aca ggc 933 His Tyr Val Leu Ile Pro Met Leu Pro Ala Phe Glu Pro Gly Thr Gly 185 190 195 ttc cag ccc ttc ctt aaa atc tac cag tcc atg cag ctt gtc tac aca 981 Phe Gln Pro Phe Leu Lys Ile Tyr Gln Ser Met Gln Leu Val Tyr Thr 200 205 210 tct gga gtc tat cac att gca ggc cct ggt ccc cag cag ctt tgc atc 1029 Ser Gly Val Tyr His Ile Ala Gly Pro Gly Pro Gln Gln Leu Cys Ile 215 220 225 agc ctg gag cca gcc ctc ctc ctc aaa ggc gat gtc atg gta aca tgt 1077 Ser Leu Glu Pro Ala Leu Leu Leu Lys Gly Asp Val Met Val Thr Cys 230 235 240 tat cac aag ggt ggc cgg ggc aca gac cgg acc ctc gtg ttc cga gtc 1125 Tyr His Lys Gly Gly Arg Gly Thr Asp Arg Thr Leu Val Phe Arg Val 245 250 255 260 cag ttc cac acc tgc acc atc cac gga cca cag ctc act ttc ccc aag 1173 Gln Phe His Thr Cys Thr Ile His Gly Pro Gln Leu Thr Phe Pro Lys 265 270 275 gac cag ctt gac gag gcc tgg act gat gag agg ttc ccc ttc caa gcc 1221 Asp Gln Leu Asp Glu Ala Trp Thr Asp Glu Arg Phe Pro Phe Gln Ala 280 285 290 tcc gtg gag ttt gtc ttc tcc tcc agc ccc gag aag atc aaa ggc agc 1269 Ser Val Glu Phe Val Phe Ser Ser Ser Pro Glu Lys Ile Lys Gly Ser 295 300 305 act cca cgg aac gac ccc tcg gtc tct gtc gac tac aac acc act gag 1317 Thr Pro Arg Asn Asp Pro Ser Val Ser Val Asp Tyr Asn Thr Thr Glu 310 315 320 cca gcc gtg cgc tgg gac tcc tat gag aac ttc aac cag cac cac gag 1365 Pro Ala Val Arg Trp Asp Ser Tyr Glu Asn Phe Asn Gln His His Glu 325 330 335 340 gac agt gtg gat ggc tcc ttg acc cac acc cgg ggt ccc ctg gat ggc 1413 Asp Ser Val Asp Gly Ser Leu Thr His Thr Arg Gly Pro Leu Asp Gly 345 350 355 agt cct tat gcc cag gtg cag cgg cct ccc cgg cag acc ccc ccg gca 1461 Ser Pro Tyr Ala Gln Val Gln Arg Pro Pro Arg Gln Thr Pro Pro Ala 360 365 370 ccc tct cca gag cct cca cca ccc ccc atg ctc tct gtc agc agc gac 1509 Pro Ser Pro Glu Pro Pro Pro Pro Pro Met Leu Ser Val Ser Ser Asp 375 380 385 tca ggc cat tcc tcc acg ctg acc aca gag ccg gct gct gag tcc cct 1557 Ser Gly His Ser Ser Thr Leu Thr Thr Glu Pro Ala Ala Glu Ser Pro 390 395 400 ggc cgg ccg ccc cct aca gct gct gaa cgg cag gag ctg gat cgc ctc 1605 Gly Arg Pro Pro Pro Thr Ala Ala Glu Arg Gln Glu Leu Asp Arg Leu 405 410 415 420 cta gga ggc tgc gga gtg gcc agt ggg ggc cgg gga gct ggg cgc gag 1653 Leu Gly Gly Cys Gly Val Ala Ser Gly Gly Arg Gly Ala Gly Arg Glu 425 430 435 acg gcc atc cta gat gac gaa gag cag ccc act gtg ggc gga ggc ccc 1701 Thr Ala Ile Leu Asp Asp Glu Glu Gln Pro Thr Val Gly Gly Gly Pro 440 445 450 cac ctc gga gtg tat cca ggc cat agg cct ggc ctc agc cgc cac tgc 1749 His Leu Gly Val Tyr Pro Gly His Arg Pro Gly Leu Ser Arg His Cys 455 460 465 tcc tgc cgc cag ggc tac cgg gag ccc tgc ggg gtt ccc aat ggg ggc 1797 Ser Cys Arg Gln Gly Tyr Arg Glu Pro Cys Gly Val Pro Asn Gly Gly 470 475 480 tac tac cgg cca gag gga acc ctg gag agg agg cga ctg gcc tac ggg 1845 Tyr Tyr Arg Pro Glu Gly Thr Leu Glu Arg Arg Arg Leu Ala Tyr Gly 485 490 495 500 ggc tat gag gga tcc ccc cag ggc tac gcc gag gcc tcg atg gag aag 1893 Gly Tyr Glu Gly Ser Pro Gln Gly Tyr Ala Glu Ala Ser Met Glu Lys 505 510 515 agg cgc ctc tgc cga tcg ctg tca gag ggg cta tac ccc tac cca cct 1941 Arg Arg Leu Cys Arg Ser Leu Ser Glu Gly Leu Tyr Pro Tyr Pro Pro 520 525 530 gag atg ggg aaa cca gcc act ggg gac ttt ggc tac cgc gcc cca ggc 1989 Glu Met Gly Lys Pro Ala Thr Gly Asp Phe Gly Tyr Arg Ala Pro Gly 535 540 545 tac cgg gag gtg gtc atc ctg gag gac cct ggg ctg cct gcc cta tac 2037 Tyr Arg Glu Val Val Ile Leu Glu Asp Pro Gly Leu Pro Ala Leu Tyr 550 555 560 cca tgc cca gcc tgc gag gag aag ctg gcg ctg cct aca gca gcc ttg 2085 Pro Cys Pro Ala Cys Glu Glu Lys Leu Ala Leu Pro Thr Ala Ala Leu 565 570 575 580 tat gga ctg cgg ctg gag agg gag gct gga gaa ggg tgg gca agt gag 2133 Tyr Gly Leu Arg Leu Glu Arg Glu Ala Gly Glu Gly Trp Ala Ser Glu 585 590 595 gct ggc aag cct ctc ctg cac cca gtg cgg cct ggg cac ccg ctg cct 2181 Ala Gly Lys Pro Leu Leu His Pro Val Arg Pro Gly His Pro Leu Pro 600 605 610 ctg ctc ttg cct gcc tgt ggg cat cac cat gcc ccg atg cct gac tac 2229 Leu Leu Leu Pro Ala Cys Gly His His His Ala Pro Met Pro Asp Tyr 615 620 625 agc tgc ctg aag cca ccc aag gca ggc gag gaa ggg cac gag ggc tgc 2277 Ser Cys Leu Lys Pro Pro Lys Ala Gly Glu Glu Gly His Glu Gly Cys 630 635 640 tcc tac acc atg tgc ccc gaa ggc agg tat ggg cat cca ggg tac cct 2325 Ser Tyr Thr Met Cys Pro Glu Gly Arg Tyr Gly His Pro Gly Tyr Pro 645 650 655 660 gcc ctg gtg aca tac agc tat gga gga gca gtt ccc agt tac tgc cca 2373 Ala Leu Val Thr Tyr Ser Tyr Gly Gly Ala Val Pro Ser Tyr Cys Pro 665 670 675 gca tat ggc cgt gtg cct cat agc tgt ggc tct cca gga gag ggc aga 2421 Ala Tyr Gly Arg Val Pro His Ser Cys Gly Ser Pro Gly Glu Gly Arg 680 685 690 ggg tat ccc agc cct ggt gcc cac tcc cca cgg gct ggc tcc att tcc 2469 Gly Tyr Pro Ser Pro Gly Ala His Ser Pro Arg Ala Gly Ser Ile Ser 695 700 705 ccg ggc agc ccg ccc tat cca caa tct agg aag ctg agc tac gag atc 2517 Pro Gly Ser Pro Pro Tyr Pro Gln Ser Arg Lys Leu Ser Tyr Glu Ile 710 715 720 cct acg gag gag gga ggg gac agg tac cca ttg cct ggg cac ctg gcc 2565 Pro Thr Glu Glu Gly Gly Asp Arg Tyr Pro Leu Pro Gly His Leu Ala 725 730 735 740 tca gca gga cct ttg gca tct gca gag tcg ctg gag ccg gtg tcc tgg 2613 Ser Ala Gly Pro Leu Ala Ser Ala Glu Ser Leu Glu Pro Val Ser Trp 745 750 755 agg gag ggc ccc agt ggg cac agc aca ctg cct cgg tct ccc cga gat 2661 Arg Glu Gly Pro Ser Gly His Ser Thr Leu Pro Arg Ser Pro Arg Asp 760 765 770 gcc cca tgc agt gct tcg tca gag ttg tct ggt ccc tcc acg ccc ctg 2709 Ala Pro Cys Ser Ala Ser Ser Glu Leu Ser Gly Pro Ser Thr Pro Leu 775 780 785 cac acc agc agt cca gtc cag ggc aag gaa agc acc cgg cga cag gac 2757 His Thr Ser Ser Pro Val Gln Gly Lys Glu Ser Thr Arg Arg Gln Asp 790 795 800 acc agg tcc ccc acc tca gcg ccc act cag aga ctg agt cct ggc gag 2805 Thr Arg Ser Pro Thr Ser Ala Pro Thr Gln Arg Leu Ser Pro Gly Glu 805 810 815 820 gcc ttg ccc cct gtt tcc cag gca ggc acc gga aag gcc cct gag ctg 2853 Ala Leu Pro Pro Val Ser Gln Ala Gly Thr Gly Lys Ala Pro Glu Leu 825 830 835 ccg tcg gga agt ggg cct gag cct ctg gcc cct agc cca gtc tct ccg 2901 Pro Ser Gly Ser Gly Pro Glu Pro Leu Ala Pro Ser Pro Val Ser Pro 840 845 850 acc ttc cct ccc agc tcg ccc agt gac tgg cct cag gaa agg agt cca 2949 Thr Phe Pro Pro Ser Ser Pro Ser Asp Trp Pro Gln Glu Arg Ser Pro 855 860 865 ggg ggc cac tca gat ggc gcc agt cct cgg agc cct gtg ccc acc aca 2997 Gly Gly His Ser Asp Gly Ala Ser Pro Arg Ser Pro Val Pro Thr Thr 870 875 880 ctt cct ggc ctc cgc cac gcc ccc tgg caa ggc cct cga ggc ccc ccc 3045 Leu Pro Gly Leu Arg His Ala Pro Trp Gln Gly Pro Arg Gly Pro Pro 885 890 895 900 gac agc cca gat ggg tct ccc ctc act cct gtg cct tcc cag atg ccc 3093 Asp Ser Pro Asp Gly Ser Pro Leu Thr Pro Val Pro Ser Gln Met Pro 905 910 915 tgg ctt gtg gcc agc cca gag ccg cct cag agc tca cct aca cct gct 3141 Trp Leu Val Ala Ser Pro Glu Pro Pro Gln Ser Ser Pro Thr Pro Ala 920 925 930 ttc ccc ctg gct gcc tcc tat gac acc aat ggc ctt agc cag ccc cca 3189 Phe Pro Leu Ala Ala Ser Tyr Asp Thr Asn Gly Leu Ser Gln Pro Pro 935 940 945 ctt cct gag aaa cgc cac ctg ccc ggg ccg ggg caa cag cca gga ccc 3237 Leu Pro Glu Lys Arg His Leu Pro Gly Pro Gly Gln Gln Pro Gly Pro 950 955 960 tgg ggc cca gag cag gca tca tcg cca gcc aga ggc atc agt cac cat 3285 Trp Gly Pro Glu Gln Ala Ser Ser Pro Ala Arg Gly Ile Ser His His 965 970 975 980 gtc acc ttc gca cct ctg ctc tca gat aat gtc ccc caa acc cca gag 3333 Val Thr Phe Ala Pro Leu Leu Ser Asp Asn Val Pro Gln Thr Pro Glu 985 990 995 cct cct aca caa gag agc caa agc aat gtc aag ttt gtc cag gat aca 3381 Pro Pro Thr Gln Glu Ser Gln Ser Asn Val Lys Phe Val Gln Asp Thr 1000 1005 1010 tcc aag ttc tgg tac aag cca cac ctg tcc cgt gac caa gcc att gcc 3429 Ser Lys Phe Trp Tyr Lys Pro His Leu Ser Arg Asp Gln Ala Ile Ala 1015 1020 1025 ctg ctg aag gac aag gac cct ggg gcc ttc ctg atc agg gac agt cat 3477 Leu Leu Lys Asp Lys Asp Pro Gly Ala Phe Leu Ile Arg Asp Ser His 1030 1035 1040 tca ttc caa gga gct tat ggg ctg gcc ctc aag gtg gcc aca ccg cca 3525 Ser Phe Gln Gly Ala Tyr Gly Leu Ala Leu Lys Val Ala Thr Pro Pro 1045 1050 1055 1060 ccc agt gcc cag ccc tgg aaa ggg gac ccc gtg gaa cag ctg gtc cgc 3573 Pro Ser Ala Gln Pro Trp Lys Gly Asp Pro Val Glu Gln Leu Val Arg 1065 1070 1075 cat ttc ctc atc gag act ggg ccc aaa ggg gtg aag atc aag ggc tgc 3621 His Phe Leu Ile Glu Thr Gly Pro Lys Gly Val Lys Ile Lys Gly Cys 1080 1085 1090 ccc agt gag ccc tac ttt ggc agc ctg tcc gcc ttg gtc tcc cag cac 3669 Pro Ser Glu Pro Tyr Phe Gly Ser Leu Ser Ala Leu Val Ser Gln His 1095 1100 1105 tcc atc tcc ccc atc tcc ctg ccc tgc tgc ctg cgc att ctc agc aaa 3717 Ser Ile Ser Pro Ile Ser Leu Pro Cys Cys Leu Arg Ile Leu Ser Lys 1110 1115 1120 gat cct ctg gaa gag acc cca gag gct cca gtg ccc acc aac atg agc 3765 Asp Pro Leu Glu Glu Thr Pro Glu Ala Pro Val Pro Thr Asn Met Ser 1125 1130 1135 1140 aca gcg gca gac ctc ctg cgt cag ggt gct gcc tgc agc gtg ctc tac 3813 Thr Ala Ala Asp Leu Leu Arg Gln Gly Ala Ala Cys Ser Val Leu Tyr 1145 1150 1155 ttg acc tca gtg gag aca gag tca ctg acg ggc ccc caa gct gtg gcc 3861 Leu Thr Ser Val Glu Thr Glu Ser Leu Thr Gly Pro Gln Ala Val Ala 1160 1165 1170 cgg gcc agc tct gca gct ctg agc tgt agc ccc cgc ccg aca cca gct 3909 Arg Ala Ser Ser Ala Ala Leu Ser Cys Ser Pro Arg Pro Thr Pro Ala 1175 1180 1185 gtt gtc cac ttc aag gtg tca gcc cag ggc att aca ctg acg gac aac 3957 Val Val His Phe Lys Val Ser Ala Gln Gly Ile Thr Leu Thr Asp Asn 1190 1195 1200 caa agg aag ctc ttc ttt cgc cgc cat tat cca gtg aac agc atc acc 4005 Gln Arg Lys Leu Phe Phe Arg Arg His Tyr Pro Val Asn Ser Ile Thr 1205 1210 1215 1220 ttc tcc agc act gac cct caa gac cgg aga tgg acc aac cca gac ggg 4053 Phe Ser Ser Thr Asp Pro Gln Asp Arg Arg Trp Thr Asn Pro Asp Gly 1225 1230 1235 acc acc tcc aag atc ttt ggt ttc gtg gcc aag aag ccg gga agc ccc 4101 Thr Thr Ser Lys Ile Phe Gly Phe Val Ala Lys Lys Pro Gly Ser Pro 1240 1245 1250 tgg gag aat gtg tgt cac ctc ttt gca gag ctt gac cca gat cag cct 4149 Trp Glu Asn Val Cys His Leu Phe Ala Glu Leu Asp Pro Asp Gln Pro 1255 1260 1265 gct ggc gcc att gtc acc ttc atc acc aaa gtt cta ctg ggc cag aga 4197 Ala Gly Ala Ile Val Thr Phe Ile Thr Lys Val Leu Leu Gly Gln Arg 1270 1275 1280 aaa tga aggaaggcca caagctcaga gcccacatca acactgcccc cctcccagca 4253 Lys 1285 ccccacagcc ctcacatccc ctggcctgga cccaggagac ccaggagaaa gcaccctccc 4313 ttaggaatga ggagtgggca tcaggcctgg gacactgctc tccttccccg cccccagcct 4373 gctaagttaa gtggacaggc ccacaagatg accttgcatg tgagcagatg gcagagatgg 4433 gtgtgtgagg ggtgaggagg catcagcagt tgagccccga aggagatcag gcagccccac 4493 ctgcaggaga acgtcagccc tccaggggat cagcccctgc cagttccacc cagctgcagg 4553 tgccagcacg gcagggatgg gagaggggtg gggagcgagt cactgcctcc tctgagcaga 4613 gattcagagt aggatcacat gaatagggga aaaaagagag tctatttttg tctaataata 4673 aagaatttct ataaacttt 4692 <210> 16 <211> 1285 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Met Glu Arg Arg Trp Asp Leu Asp Leu Thr Tyr Val Thr Glu Arg Ile 1 5 10 15 Leu Ala Ala Ala Phe Pro Ala Arg Pro Asp Glu Gln Arg His Arg Gly 20 25 30 His Leu Arg Glu Leu Ala His 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Gly Thr Asp Arg Thr Leu 245 250 255 Val Phe Arg Val Gln Phe His Thr Cys Thr Ile His Gly Pro Gln Leu 260 265 270 Thr Phe Pro Lys Asp Gln Leu Asp Glu Ala Trp Thr Asp Glu Arg Phe 275 280 285 Pro Phe Gln Ala Ser Val Glu Phe Val Phe Ser Ser Ser Pro Glu Lys 290 295 300 Ile Lys Gly Ser Thr Pro Arg Asn Asp Pro Ser Val Ser Val Asp Tyr 305 310 315 320 Asn Thr Thr Glu Pro Ala Val Arg Trp Asp Ser Tyr Glu Asn Phe Asn 325 330 335 Gln His His Glu Asp Ser Val Asp Gly Ser Leu Thr His Thr Arg Gly 340 345 350 Pro Leu Asp Gly Ser Pro Tyr Ala Gln Val Gln Arg Pro Pro Arg Gln 355 360 365 Thr Pro Pro Ala Pro Ser Pro Glu Pro Pro Pro Pro Pro Met Leu Ser 370 375 380 Val Ser Ser Asp Ser Gly His Ser Ser Thr Leu Thr Thr Glu Pro Ala 385 390 395 400 Ala Glu Ser Pro Gly Arg Pro Pro Pro Thr Ala Ala Glu Arg Gln Glu 405 410 415 Leu Asp Arg Leu Leu Gly Gly Cys Gly Val Ala Ser Gly Gly Arg Gly 420 425 430 Ala Gly Arg Glu Thr Ala Ile Leu Asp Asp Glu Glu Gln Pro Thr Val 435 440 445 Gly Gly Gly Pro His Leu Gly Val Tyr Pro Gly His Arg Pro Gly Leu 450 455 460 Ser Arg His Cys Ser Cys Arg Gln Gly Tyr Arg Glu Pro Cys Gly Val 465 470 475 480 Pro Asn Gly Gly Tyr Tyr Arg Pro Glu Gly Thr Leu Glu Arg Arg Arg 485 490 495 Leu Ala Tyr Gly Gly Tyr Glu Gly Ser Pro Gln Gly Tyr Ala Glu Ala 500 505 510 Ser Met Glu Lys Arg Arg Leu Cys Arg Ser Leu Ser Glu Gly Leu Tyr 515 520 525 Pro Tyr Pro Pro Glu Met Gly Lys Pro Ala Thr Gly Asp Phe Gly Tyr 530 535 540 Arg Ala Pro Gly Tyr Arg Glu Val Val Ile Leu Glu Asp Pro Gly Leu 545 550 555 560 Pro Ala Leu Tyr Pro Cys Pro Ala Cys Glu Glu Lys Leu Ala Leu Pro 565 570 575 Thr Ala Ala Leu Tyr Gly Leu Arg Leu Glu Arg Glu Ala Gly Glu Gly 580 585 590 Trp Ala Ser Glu Ala Gly Lys Pro Leu Leu His Pro Val Arg Pro Gly 595 600 605 His Pro Leu Pro Leu Leu Leu Pro Ala Cys Gly His His His Ala Pro 610 615 620 Met Pro Asp Tyr Ser Cys Leu Lys Pro Pro Lys Ala Gly Glu Glu Gly 625 630 635 640 His Glu Gly Cys Ser Tyr Thr Met Cys Pro Glu Gly Arg Tyr Gly His 645 650 655 Pro Gly Tyr Pro Ala Leu Val Thr Tyr Ser Tyr 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Gly Val Gly Val Ile Thr 15 20 25 30 acc aaa cgt gtc ggt gct gga gtt gca ggg aga gac tcc cat tct gat 687 Thr Lys Arg Val Gly Ala Gly Val Ala Gly Arg Asp Ser His Ser Asp 35 40 45 ttc tcc ttc tcc agc tac cct aat tac ctt tct tct cta cct ttg ttc 735 Phe Ser Phe Ser Ser Tyr Pro Asn Tyr Leu Ser Ser Leu Pro Leu Phe 50 55 60 ttt ttt agg aat ttg aca aga aat ata acc cta cct ggc att gta tcg 783 Phe Phe Arg Asn Leu Thr Arg Asn Ile Thr Leu Pro Gly Ile Val Ser 65 70 75 tgg gcc gaa att ttg gca gct acg tca cac acg aga caa agc act tca 831 Trp Ala Glu Ile Leu Ala Ala Thr Ser His Thr Arg Gln Ser Thr Ser 80 85 90 tct att ttt act tgg gtc aag ttg caa tcc tcc tct tca agt cag gct 879 Ser Ile Phe Thr Trp Val Lys Leu Gln Ser Ser Ser Ser Ser Gln Ala 95 100 105 110 agg tgg cca tgg tga aggtgtcagt ggcggcggca gcgatggcaa gcaggcggcg 934 Arg Trp Pro Trp 115 ttgctgggac tgttttgcac tggagccagc atcaggatgt cctctccaat ggctgtgcta 994 ctgcatggac tgtatactcg atttcatgtg tatgtcgcag taaacaaaac caaacctctt 1054 tctgtttagt tgcctggggg aagaaggctg ctttatgttt atttttcaag actttaaaaa 1114 tattttttgg ttgtattgca ctaggaaatc tctcccacct ctcccttttc tctttctttc 1174 cctatacaaa ataaaaggcc caccatagag actaggcggc cgaaagacta ggagggctga 1234 ggaaaagaaa taggtctctg gaggtggaac taaaactgtg cagctgcctc ttcctggcgg 1294 tggatgctgc tttgggaggg ccagggaggc tgcaggggga cagtgttggg attgtcaagg 1354 aaaaaggggt aggaaggaag gtggagggat tgatctagta ccagggagaa tattccactg 1414 aactgtgatt ctatggcttg gggcggaggg tggggtgggg atgccttctt taggggccct 1474 gagatgtgtt tgtctgtggt gtgtgggagt ggggagcaga tttgtcttgc tgtctttgtc 1534 agaatttcta agtaagggct gtgtctttgt ggattacctt cttttgttct tcctgccaga 1594 gatcatgaca ggaggatgct ggggtaggat tagcttgaat cttttttttc tttacatttt 1654 tctcctgtct gctccctgct tagccctcag tttcctcatt cctctggagt tctcttagag 1714 cagcccctgt tgttagttgg ctggcaaggg aatttctggt gactgtagtt ccttagttag 1774 gtcttagcaa tcaaaccaaa ttgatgtctc ccttgactct tctgtgtata tgtgtgaata 1834 tgtgtgtata tgtgtgtgta tgtgtgtgtg gggtttgggg tagaagggag ggagggggca 1894 ggacagtgtg gaatctctag ggtgtatggg taggtagggg gcacagttag ttctaagtgg 1954 gcttttatgc taaaagcctc tggggatatc tgttttgaaa ataaagatag gtgtcccctc 2014 cttgctgtca tctagcccag acactctgct tgctctctgg ctgtctgctc cctgggaagg 2074 ctttaggagg accacccagg acaggatgac catgctgcca tctgctctgg agctgggtct 2134 cagtgcagag ggacagtgac tgtggatggt tgcagtctct ggtgggaggt gaggatagaa 2194 gtgataaaga gctaagagga gcttctggga gccttggagg aggtcagtct tgcagtggtg 2254 aagccaggac ataggagatg gagcagggct gtgagaggag gagattctga ggaggatgca 2314 ggggaaatct tgtctgttaa tgaaatagga gtggggtggg gtttggggtg gggtggtcat 2374 tgccgtttga gctgctgatt ttcatgagtc gccttcaaaa ctctcgtgta gggttgacaa 2434 tgtggggggg tgggggatcc agcttattct tttattttca agtccattct tggggctggt 2494 ggggaggcag gagaattacc ctccctaagc ccttagtgtg tgccgagctt gctttgtgat 2554 gthggnaggg gaggggagac ctgggtggtg actgagttcc ctttatcaaa cccttcaatg 2614 ggcacaaaat tgagtgcttg attttaggtt ttattttttt atgaatgtcc aaatctgtgt 2674 ttccccctgc cctcccagac tgtgtggcca gttgaaagtg tctggtttgt gttcatctct 2734 ccctcatttc tggaagcagg gcctgagacc ctgccacatc tcctatgctc tgcatccacg 2794 cctcttttgg acattaaagg ttgattgahg cacctctgca aaaaaaaaaa aaaaaaa 2851 <210> 18 <211> 114 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Met Arg Gly Arg Val Ser Trp Pro Ala Leu Lys Pro Glu Leu Leu Arg 1 5 10 15 Phe Gly Glu Leu Arg Leu Arg Asp Gly Val Gly Val Ile Thr Thr Lys 20 25 30 Arg Val Gly Ala Gly Val Ala Gly Arg Asp Ser His Ser Asp Phe Ser 35 40 45 Phe Ser Ser Tyr Pro Asn Tyr Leu Ser Ser Leu Pro Leu Phe Phe Phe 50 55 60 Arg Asn Leu Thr Arg Asn Ile Thr Leu Pro Gly Ile Val Ser Trp Ala 65 70 75 80 Glu Ile Leu Ala Ala Thr Ser His Thr Arg Gln Ser Thr Ser Ser Ile 85 90 95 Phe Thr Trp Val Lys Leu Gln Ser Ser Ser Ser Ser Gln Ala Arg Trp 100 105 110 Pro Trp <210> 19 <211> 1337 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (28)..(1179) <400> 19 ctggcgtccc ctttccggcc ggtcccc atg gag gcg ctg ggg aag ctg aag cag 54 Met Glu Ala Leu Gly Lys Leu Lys Gln 1 5 ttc gat gcc tac ccc aag act ttg gag gac ttc cgg gtc aag acc tgc 102 Phe Asp Ala Tyr Pro Lys Thr Leu Glu Asp Phe Arg Val Lys Thr Cys 10 15 20 25 ggg ggc gcc acc gtg acc att gtc agt ggc ctt ctc atg ctg cta ctg 150 Gly Gly Ala Thr Val Thr Ile Val Ser Gly Leu Leu Met Leu Leu Leu 30 35 40 ttc ctg tcc gag ctg cag tat tac ctc acc acg gag gtg cat cct gag 198 Phe Leu Ser Glu Leu Gln Tyr Tyr Leu Thr Thr Glu Val His Pro Glu 45 50 55 ctc tac gtg gac aag tcg cgg gga gat aaa ctg aag atc aac atc gat 246 Leu Tyr Val Asp Lys Ser Arg Gly Asp Lys Leu Lys Ile Asn Ile Asp 60 65 70 gta ctt ttt ccg cac atg cct tgt gcc tat ctg agt att gat gcc atg 294 Val Leu Phe Pro His Met Pro Cys Ala Tyr Leu Ser Ile Asp Ala Met 75 80 85 gat gtg gcc gga gaa cag cag ctg gat gtg gaa cac aac ctg ttc aag 342 Asp Val Ala Gly Glu Gln Gln Leu Asp Val Glu His Asn Leu Phe Lys 90 95 100 105 caa cga cta gat aaa gat ggc atc ccc gtg agc tca gag gct gag cgg 390 Gln Arg Leu Asp Lys Asp Gly Ile Pro Val Ser Ser Glu Ala Glu Arg 110 115 120 cat gag ctt ggg aaa gtc gag gtg acg gtg ttt gac cct gac tcc ctg 438 His Glu Leu Gly Lys Val Glu Val Thr Val Phe Asp Pro Asp Ser Leu 125 130 135 gac cct gat cgc tgt gag agc tgc tat ggt gct gag gca gaa gat atc 486 Asp Pro Asp Arg Cys Glu Ser Cys Tyr Gly Ala Glu Ala Glu Asp Ile 140 145 150 aag tgc tgt aac acc tgt gaa gat gtg cgg gag gca tat cgc cgt aga 534 Lys Cys Cys Asn Thr Cys Glu Asp Val Arg Glu Ala Tyr Arg Arg Arg 155 160 165 ggc tgg gcc ttc aag aac cca gat act att gag cag tgc cgg cga gag 582 Gly Trp Ala Phe Lys Asn Pro Asp Thr Ile Glu Gln Cys Arg Arg Glu 170 175 180 185 ggc ttc agc cag aag atg cag gag cag aag aat gaa ggc tgc cag gtg 630 Gly Phe Ser Gln Lys Met Gln Glu Gln Lys Asn Glu Gly Cys Gln Val 190 195 200 tat ggc ttc ttg gaa gtc aat aag gtg gcc gga aac ttc cac ttt gcc 678 Tyr Gly Phe Leu Glu Val Asn Lys Val Ala Gly Asn Phe His Phe Ala 205 210 215 cct ggg aag agc ttc cag cag tcc cat gtg cac gtc cat gac ttg cag 726 Pro Gly Lys Ser Phe Gln Gln Ser His Val His Val His Asp Leu Gln 220 225 230 agc ttt ggc ctt gac aac atc aac atg acc cac tac atc cag cac ctg 774 Ser Phe Gly Leu Asp Asn Ile Asn Met Thr His Tyr Ile Gln His Leu 235 240 245 tca ttt ggg gag gac tat cca ggc att gtg aac ccc ctg gac cac acc 822 Ser Phe Gly Glu Asp Tyr Pro Gly Ile Val Asn Pro Leu Asp His Thr 250 255 260 265 aat gtc act gcg ccc caa gcc tcc atg atg ttc cag tac ttt gtg aag 870 Asn Val Thr Ala Pro Gln Ala Ser Met Met Phe Gln Tyr Phe Val Lys 270 275 280 gtg gtg ccc act gtg tac atg aag gtg gac gga gag gta ctg agg aca 918 Val Val Pro Thr Val Tyr Met Lys Val Asp Gly Glu Val Leu Arg Thr 285 290 295 aat cag ttc tct gtg acc aga cat gag aag gtt gcc aat ggg ctg ttg 966 Asn Gln Phe Ser Val Thr Arg His Glu Lys Val Ala Asn Gly Leu Leu 300 305 310 ggc gac caa ggc ctt ccc gga gtc ttc gtc ctc tat gag ctc tcg ccc 1014 Gly Asp Gln Gly Leu Pro Gly Val Phe Val Leu Tyr Glu Leu Ser Pro 315 320 325 atg atg gtg aag ctg acg gag aag cac agg tcc ttc acc cac ttc ctg 1062 Met Met Val Lys Leu Thr Glu Lys His Arg Ser Phe Thr His Phe Leu 330 335 340 345 aca ggt gtg tgc gcc atc att ggg ggc atg ttc aca gtg gct gga ctc 1110 Thr Gly Val Cys Ala Ile Ile Gly Gly Met Phe Thr Val Ala Gly Leu 350 355 360 atc gat tcg ctc atc tac cac tca gca cga gcc atc cag aag aaa att 1158 Ile Asp Ser Leu Ile Tyr His Ser Ala Arg Ala Ile Gln Lys Lys Ile 365 370 375 gat cta ggg aag aca acg tag tcaccctcgg tgcttcctct gtctcctctt 1209 Asp Leu Gly Lys Thr Thr 380 tctccctggc ctgtggttgt cccccagcct ctgccaccct ccacctcctc ggtcagcccc 1269 agccccaggt tgataaatct attgattgat tgtgatagta aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1329 aaaaaaaa 1337 <210> 20 <211> 383 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Met Glu Ala Leu Gly Lys Leu Lys Gln Phe Asp Ala Tyr Pro Lys Thr 1 5 10 15 Leu Glu Asp Phe Arg Val Lys Thr Cys Gly Gly Ala Thr Val Thr Ile 20 25 30 Val Ser Gly Leu Leu Met Leu Leu Leu Phe Leu Ser Glu Leu Gln Tyr 35 40 45 Tyr Leu Thr Thr Glu Val His Pro Glu Leu Tyr Val Asp Lys Ser Arg 50 55 60 Gly Asp Lys Leu Lys Ile Asn Ile Asp Val Leu Phe Pro His Met Pro 65 70 75 80 Cys Ala Tyr Leu Ser Ile Asp Ala Met Asp Val Ala Gly Glu Gln Gln 85 90 95 Leu Asp Val Glu His Asn Leu Phe Lys Gln Arg Leu Asp Lys Asp Gly 100 105 110 Ile Pro Val Ser Ser Glu Ala Glu Arg His Glu Leu Gly Lys Val Glu 115 120 125 Val Thr Val Phe Asp Pro Asp Ser Leu Asp Pro Asp Arg Cys Glu Ser 130 135 140 Cys Tyr Gly Ala Glu Ala Glu Asp Ile Lys Cys Cys Asn Thr Cys Glu 145 150 155 160 Asp Val Arg Glu Ala Tyr Arg Arg Arg Gly Trp Ala Phe Lys Asn Pro 165 170 175 Asp Thr Ile Glu Gln Cys Arg Arg Glu Gly Phe Ser Gln Lys Met Gln 180 185 190 Glu Gln Lys Asn Glu Gly Cys Gln Val Tyr Gly Phe Leu Glu Val Asn 195 200 205 Lys Val Ala Gly Asn Phe His Phe Ala Pro Gly Lys Ser Phe Gln Gln 210 215 220 Ser His Val His Val His Asp Leu Gln Ser Phe Gly Leu Asp Asn Ile 225 230 235 240 Asn Met Thr His Tyr Ile Gln His Leu Ser Phe Gly Glu Asp Tyr Pro 245 250 255 Gly Ile Val Asn Pro Leu Asp His Thr Asn Val Thr Ala Pro Gln Ala 260 265 270 Ser Met Met Phe Gln Tyr Phe Val Lys Val Val Pro Thr Val Tyr Met 275 280 285 Lys Val Asp Gly Glu Val Leu Arg Thr Asn Gln Phe Ser Val Thr Arg 290 295 300 His Glu Lys Val Ala Asn Gly Leu Leu Gly Asp Gln Gly Leu Pro Gly 305 310 315 320 Val Phe Val Leu Tyr Glu Leu Ser Pro Met Met Val Lys Leu Thr Glu 325 330 335 Lys His Arg Ser Phe Thr His Phe Leu Thr Gly Val Cys Ala Ile Ile 340 345 350 Gly Gly Met Phe Thr Val Ala Gly Leu Ile Asp Ser Leu Ile Tyr His 355 360 365 Ser Ala Arg Ala Ile Gln Lys Lys Ile Asp Leu Gly Lys Thr Thr 370 375 380 <210> 11 <211> 2196 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (269)..(850) <400> 11 ctcgatgtag aggggttggt agcagacagg tggttacatt agaatagtca cacaaactgt 60 tcagtgttgc aggaaccttt tcttgggggt gggggagttt cccttttcta aaaatgcaat 120 gcactaaaac tattttaaga atgtagttaa ttctgcttat tcataaagtg ggcatcttct 180 gtgttttagg tgtaatatcg aagtcctggc ttttctcgtt ttctcacttg ctctcttgtt 240 ctctgttttt ttaaaccaat tttacttt atg aat ata ttc atg aca ttt gta 292 Met Asn Ile Phe Met Thr Phe Val 1 5 ata aat gtc ttg aga aag aat ttg ttt cat ggc ttc atg gtc atc act 340 Ile Asn Val Leu Arg Lys Asn Leu Phe His Gly Phe Met Val Ile Thr 10 15 20 caa gct ccc gta agg ata tta ccg tct cag gaa agg atc agg act cca 388 Gln Ala Pro Val Arg Ile Leu Pro Ser Gln Glu Arg Ile Arg Thr Pro 25 30 35 40 tgt cac agt cct gcc atc tta ctt tcc tct tgt cga gtt ctg agt gga 436 Cys His Ser Pro Ala Ile Leu Leu Ser Ser Cys Arg Val Leu Ser Gly 45 50 55 aat aac tgc att atg gct gct tta acc tca gtc atc aaa aga aac ttg 484 Asn Asn Cys Ile Met Ala Ala Leu Thr Ser Val Ile Lys Arg Asn Leu 60 65 70 ctg ttt ttt agg ctt gat ctt ttt cct ttg tgg tta att ttc ctg tat 532 Leu Phe Phe Arg Leu Asp Leu Phe Pro Leu Trp Leu Ile Phe Leu Tyr 75 80 85 att gtg aaa atg ggg gat ttt ccc tct gct ccc acc cac cta aac aca 580 Ile Val Lys Met Gly Asp Phe Pro Ser Ala Pro Thr His Leu Asn Thr 90 95 100 gca gcc att tgt acc tgt ttg ctt ccc atc cca ctt ggc acc cac tct 628 Ala Ala Ile Cys Thr Cys Leu Leu Pro Ile Pro Leu Gly Thr His Ser 105 110 115 120 gac ctc ttg tca gtt tcc tgt tcc tgg ttc cat ctt ttt gaa aaa ggc 676 Asp Leu Leu Ser Val Ser Cys Ser Trp Phe His Leu Phe Glu Lys Gly 125 130 135 cct cct ttg agc tac aaa cat ctg gta aga caa gta cat cca ctc atg 724 Pro Pro Leu Ser Tyr Lys His Leu Val Arg Gln Val His Pro Leu Met 140 145 150 aat gca gac aca gca gct ggt ggt ttt gtg tat acc tgt aaa gac aag 772 Asn Ala Asp Thr Ala Ala Gly Gly Phe Val Tyr Thr Cys Lys Asp Lys 155 160 165 ctg aga agc tta ctt ttt ggg gaa gta aaa gaa gat gga aat gga tgt 820 Leu Arg Ser Leu Leu Phe Gly Glu Val Lys Glu Asp Gly Asn Gly Cys 170 175 180 ttc att tgt atg agt ttg gag cag tgc tga aggccaaagc cgcctactgg 870 Phe Ile Cys Met Ser Leu Glu Gln Cys 185 190 tttgtagtta acctagagaa ggttgaaaaa ttaatcctac ctttaaaggg atttgaggta 930 ggctggattc catcgccaca ggactttagt tagaattaaa ttcctgcttg taatttatat 990 ccatgtttag gcttttcata agatgaaaca tgccacagtg aacacactcg tgtacatatc 1050 aagagaagaa ggaaaggcac aggtggagaa cagtaaaagg tgggcagatg tctttgaaga 1110 aatgctcaat gtctgatgct aagtgggaga aggcagagaa caaaggatgt ggcataatgg 1170 tcttaacatt atccaaagac ttgaagctcc atgtctgtaa gtcaaatgtt acacaaaaaa 1230 aaatgcaaat ggtgtttcat tggaattacc aagtgcttag aacttgctgg ctttcccata 1290 ggtggtaaag gggtctgagc tcacaccgag ttgtgcttgg cttgcttgtg cagctccagg 1350 cacccggtgg gcactctggt ggtgtttgtg gtgaactgaa ttgaatccat tgttgggctt 1410 aagttactga aattggaaca ccctttgtcc ttctcggcgg gggcttcctg gtctgtgctt 1470 tacttggctt ttttccttcc cgtcttagcc tcaccccctt gtcaaccaga ttgagttgct 1530 atagcttgat gcagggaccc agtgaagttt ctccgttaaa gattgggagt cgtcgaaatg 1590 tttagattct tttaggaaag gaattatttt cccccctttt acagggtagt aacttctcca 1650 cagaagtgcc aatatggcaa aattacacaa gaaaacagta ttgcaatgac accattacat 1710 aaggaacatt gaactgttag aggagtgctc ttccaaacaa aacaaaaatg tctctaggtt 1770 tagtcagagc tttcacaagt aataaccttt ctgtattaaa atcagagtaa ccctttctgt 1830 attgagtgca gtgtttttta ctcttttctc atgcacatgt tacgttggag aaaatgttta 1890 caaaaatggt tttgttacac taatgcgcac cacatattta tggtttattt taagtgactt 1950 tttatgggtt atttaggttt tcgtcttagt tgtagcacac ttaccctaat tttgccaatt 2010 attaatttgc taaatagtaa tacaaatgac aaactgcatt aaatttacta attataaaag 2070 ctgcaaagca gactggtggc aagtacacag cccttttttt tgcagtgcta acttgtctac 2130 tgtgtattat gaaaattact gttgtccccc cacccttttt tccttaaata aagtaaaaat 2190 gacacc 2196 <210> 22 <211> 193 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Met Asn Ile Phe Met Thr Phe Val Ile Asn Val Leu Arg Lys Asn Leu 1 5 10 15 Phe His Gly Phe Met Val Ile Thr Gln Ala Pro Val Arg Ile Leu Pro 20 25 30 Ser Gln Glu Arg Ile Arg Thr Pro Cys His Ser Pro Ala Ile Leu Leu 35 40 45 Ser Ser Cys Arg Val Leu Ser Gly Asn Asn Cys Ile Met Ala Ala Leu 50 55 60 Thr Ser Val Ile Lys Arg Asn Leu Leu Phe Phe Arg Leu Asp Leu Phe 65 70 75 80 Pro Leu Trp Leu Ile Phe Leu Tyr Ile Val Lys Met Gly Asp Phe Pro 85 90 95 Ser Ala Pro Thr His Leu Asn Thr Ala Ala Ile Cys Thr Cys Leu Leu 100 105 110 Pro Ile Pro Leu Gly Thr His Ser Asp Leu Leu Ser Val Ser Cys Ser 115 120 125 Trp Phe His Leu Phe Glu Lys Gly Pro Pro Leu Ser Tyr Lys His Leu 130 135 140 Val Arg Gln Val His Pro Leu Met Asn Ala Asp Thr Ala Ala Gly Gly 145 150 155 160 Phe Val Tyr Thr Cys Lys Asp Lys Leu Arg Ser Leu Leu Phe Gly Glu 165 170 175 Val Lys Glu Asp Gly Asn Gly Cys Phe Ile Cys Met Ser Leu Glu Gln 180 185 190 Cys <210> 23 <211> 6272 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (154)..(5721) <400> 23 gttagctcaa ataatgtgct tttaaattct caggctgatg acagagttgt aataaataaa 60 ccagaatctg caggttttag agatgttggc tctgaagaaa tccaggatgc agaaaatagt 120 gctaaaactc ttaaggaaat tcggacactt ttg atg gag gca gaa aat atg gca 174 Met Glu Ala Glu Asn Met Ala 1 5 ctg aaa cga tgc aat ttt cct gct ccc ctt gcc cgt ttc aga gat att 222 Leu Lys Arg Cys Asn Phe Pro Ala Pro Leu Ala Arg Phe Arg Asp Ile 10 15 20 agt gat att tca ttt ata caa tct aag aag gtg gtt tgc ttc aaa gaa 270 Ser Asp Ile Ser Phe Ile Gln Ser Lys Lys Val Val Cys Phe Lys Glu 25 30 35 ccc tct tcc acg ggt gta tct aat ggt gat ttg ctt cac aga cag cca 318 Pro Ser Ser Thr Gly Val Ser Asn Gly Asp Leu Leu His Arg Gln Pro 40 45 50 55 ttc aca gag gaa agc cca agc agc agg tgc ata cag aag gat att ggc 366 Phe Thr Glu Glu Ser Pro Ser Ser Arg Cys Ile Gln Lys Asp Ile Gly 60 65 70 aca cag acg aat ttg aaa tgc cgg aga ggc att gaa aat tgg gag ttt 414 Thr Gln Thr Asn Leu Lys Cys Arg Arg Gly Ile Glu Asn Trp Glu Phe 75 80 85 att agt tca act aca gtt aga agt cct cta cag gaa gca gag agc aaa 462 Ile Ser Ser Thr Thr Val Arg Ser Pro Leu Gln Glu Ala Glu Ser Lys 90 95 100 gtc agt atg gca tta gaa gaa act ctt agg caa tat caa gca gcc aaa 510 Val Ser Met Ala Leu Glu Glu Thr Leu Arg Gln Tyr Gln Ala Ala Lys 105 110 115 tct gta atg agg tct gaa cct gaa ggg tgt agt gga acc att ggg aat 558 Ser Val Met Arg Ser Glu Pro Glu Gly Cys Ser Gly Thr Ile Gly Asn 120 125 130 135 aaa att att atc cct atg atg act gtc ata aaa agt gat tca agt agt 606 Lys Ile Ile Ile Pro Met Met Thr Val Ile Lys Ser Asp Ser Ser Ser 140 145 150 gat gcc agt gat gga aat ggt tcc tgc tcg tgg gac agt aat tta cca 654 Asp Ala Ser Asp Gly Asn Gly Ser Cys Ser Trp Asp Ser Asn Leu Pro 155 160 165 gag tct ttg gaa tca gtt tct gat gtt ctt cta aac ttc ttt cca tat 702 Glu Ser Leu Glu Ser Val Ser Asp Val Leu Leu Asn Phe Phe Pro Tyr 170 175 180 gtt tca ccc aag aca agt ata aca gat agc agg gag gaa gag ggt gtg 750 Val Ser Pro Lys Thr Ser Ile Thr Asp Ser Arg Glu Glu Glu Gly Val 185 190 195 tca gag agt gag gat ggt ggt ggt agc agt gta gat tca ctg gct gca 798 Ser Glu Ser Glu Asp Gly Gly Gly Ser Ser Val Asp Ser Leu Ala Ala 200 205 210 215 cat gtg aaa aac ctt ctg caa tgt gaa tcc tca ctg aat cat gct aaa 846 His Val Lys Asn Leu Leu Gln Cys Glu Ser Ser Leu Asn His Ala Lys 220 225 230 gaa ata ctc aga aat gca gag gaa gag gaa agc cgg gta cga gca cat 894 Glu Ile Leu Arg Asn Ala Glu Glu Glu Glu Ser Arg Val Arg Ala His 235 240 245 gcc tgg aat atg aag ttc aat tta gca cat gat tgt gga tac tcc att 942 Ala Trp Asn Met Lys Phe Asn Leu Ala His Asp Cys Gly Tyr Ser Ile 250 255 260 tca gaa tta aat gaa gat gac agg agg aaa gta gaa gag atc aag gca 990 Ser Glu Leu Asn Glu Asp Asp Arg Arg Lys Val Glu Glu Ile Lys Ala 265 270 275 gag tta ttt ggt cat gga aga aca act gac ttg tcc aag ggt tta cag 1038 Glu Leu Phe Gly His Gly Arg Thr Thr Asp Leu Ser Lys Gly Leu Gln 280 285 290 295 agt cca cgg gga atg gga tgc aag cca gaa gct gta tgt agt cac att 1086 Ser Pro Arg Gly Met Gly Cys Lys Pro Glu Ala Val Cys Ser His Ile 300 305 310 att att gag agc cat gaa aag gga tgt ttc cgg act cta act tct gaa 1134 Ile Ile Glu Ser His Glu Lys Gly Cys Phe Arg Thr Leu Thr Ser Glu 315 320 325 cat cca caa cta gat aga cac cct tgt gct ttc aga tct gct gga ccc 1182 His Pro Gln Leu Asp Arg His Pro Cys Ala Phe Arg Ser Ala Gly Pro 330 335 340 tca gaa atg acc aga gga cgg cag aac cca tca tca tgc aga gcc aag 1230 Ser Glu Met Thr Arg Gly Arg Gln Asn Pro Ser Ser Cys Arg Ala Lys 345 350 355 cat gtc aac ctt tct gca tcc tta gac cag aac aac tcc cat ttc aaa 1278 His Val Asn Leu Ser Ala Ser Leu Asp Gln Asn Asn Ser His Phe Lys 360 365 370 375 gtt tgg aat tcc ttg cag tta aaa agt cat tcc cca ttt cag aac ttt 1326 Val Trp Asn Ser Leu Gln Leu Lys Ser His Ser Pro Phe Gln Asn Phe 380 385 390 ata cct gat gaa ttc aaa atc agc aaa ggt ctt cga atg cca ttc gat 1374 Ile Pro Asp Glu Phe Lys Ile Ser Lys Gly Leu Arg Met Pro Phe Asp 395 400 405 gaa aag 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505 510 515 act att tta gca gaa ggt aga agg caa agc caa aaa tta cct gtt gat 1758 Thr Ile Leu Ala Glu Gly Arg Arg Gln Ser Gln Lys Leu Pro Val Asp 520 525 530 535 ttt gag cgt tct ttt caa gaa gaa aaa ccc tta gaa aga tca gat ttt 1806 Phe Glu Arg Ser Phe Gln Glu Glu Lys Pro Leu Glu Arg Ser Asp Phe 540 545 550 aca ggc agt cat tct gag ccc agt acc agg gca aat tgt agc aat ttc 1854 Thr Gly Ser His Ser Glu Pro Ser Thr Arg Ala Asn Cys Ser Asn Phe 555 560 565 aag gaa att cag att tct gat aac cat acc ctt att agc atg ggc aga 1902 Lys Glu Ile Gln Ile Ser Asp Asn His Thr Leu Ile Ser Met Gly Arg 570 575 580 cca agt tcc acc cta gga gta aac aga tcg agt tcc aga cta gga gta 1950 Pro Ser Ser Thr Leu Gly Val Asn Arg Ser Ser Ser Arg Leu Gly Val 585 590 595 aaa gag aag aat gta act ata act cca gat ctt cct tct tgc att ttt 1998 Lys Glu Lys Asn Val Thr Ile Thr Pro Asp Leu Pro Ser Cys Ile Phe 600 605 610 615 ctt gaa caa cga gag ctc ttt gaa caa agc aaa gcc cca cgt gca gat 2046 Leu Glu Gln Arg Glu Leu Phe Glu Gln Ser Lys Ala Pro Arg Ala Asp 620 625 630 gac cat gtg agg aaa cac cat tct ccc tct cct caa cat cag gat tat 2094 Asp His Val Arg Lys His His Ser Pro Ser Pro Gln His Gln Asp Tyr 635 640 645 gta gct cca gac ctt cct tct tgc att ttt ctt gaa caa cga gaa ctc 2142 Val Ala Pro Asp Leu Pro Ser Cys Ile Phe Leu Glu Gln Arg Glu Leu 650 655 660 ttt gaa cag tgc aaa gcc cca tat gta gat cat caa atg aga gaa aac 2190 Phe Glu Gln Cys Lys Ala Pro Tyr Val Asp His Gln Met Arg Glu Asn 665 670 675 cat tct ccc ctt cct caa ggt cag gat tct ata gct tca gac ctt ccg 2238 His Ser Pro Leu Pro Gln Gly Gln Asp Ser Ile Ala Ser Asp Leu Pro 680 685 690 695 tct ccc att tct ctt gaa caa tgc caa agc aaa gcg cca ggt gta gat 2286 Ser Pro Ile Ser Leu Glu Gln Cys Gln Ser Lys Ala Pro Gly Val Asp 700 705 710 gac caa atg aat aaa cac cat ttt ccc ctt cct caa ggt cag gat tgt 2334 Asp Gln Met Asn Lys His His Phe Pro Leu Pro Gln Gly Gln Asp Cys 715 720 725 gta gtg gaa aag aat aat caa cat aag cct aaa tca cac att tct aat 2382 Val Val Glu Lys Asn Asn Gln His Lys Pro Lys Ser His Ile Ser Asn 730 735 740 ata aat gtt gaa gcc aag ttc aat act gtg gtc tcc cag tca gcc cca 2430 Ile Asn Val Glu Ala Lys Phe Asn Thr Val Val Ser Gln Ser Ala Pro 745 750 755 aat cac tgt aca tta gca gca tct gca tct act cct cct tca aat aga 2478 Asn His Cys Thr Leu Ala Ala Ser Ala Ser Thr Pro Pro Ser Asn Arg 760 765 770 775 aaa gca ctt tct tgt gtt cat ata act ctt tgt ccc aag act tct tcc 2526 Lys Ala Leu Ser Cys Val His Ile Thr Leu Cys Pro Lys Thr Ser Ser 780 785 790 aag ttg gat agt gga act tta gat gaa aga ttc cat tca ttg gat gct 2574 Lys Leu Asp Ser Gly Thr Leu Asp Glu Arg Phe His Ser Leu Asp Ala 795 800 805 gct tct aaa gcg agg atg aat agt gag ttt aac ttt gac tta cat act 2622 Ala Ser Lys Ala Arg Met Asn Ser Glu Phe Asn Phe Asp Leu His Thr 810 815 820 gta tct tcg aga tca ctg gaa cca acc tcc aaa tta ttg acc agt aaa 2670 Val Ser Ser Arg Ser Leu Glu Pro Thr Ser Lys Leu Leu Thr Ser Lys 825 830 835 cct gta gca cag gat caa gaa tct tta ggt ttt cta gga cct aaa tct 2718 Pro Val Ala Gln Asp Gln Glu Ser Leu Gly Phe Leu Gly Pro Lys Ser 840 845 850 855 tca ctg gat ttc caa gtc gta cag cct tct ctt cca gac agt aac act 2766 Ser Leu Asp Phe Gln Val Val Gln Pro Ser Leu Pro Asp Ser Asn Thr 860 865 870 att act cag gac ttg aaa acc ata cct tct cag aat agc cag ata gta 2814 Ile Thr Gln Asp Leu Lys Thr Ile Pro Ser Gln Asn Ser Gln Ile Val 875 880 885 acc tcc agg caa ata caa gtg aac att tca gat ttc gaa gga cat tcc 2862 Thr Ser Arg Gln Ile Gln Val Asn Ile Ser Asp Phe Glu Gly His Ser 890 895 900 aat cca gag ggg acc cca gta ttt gca gat cga tta cca gag aag atg 2910 Asn Pro Glu Gly Thr Pro Val Phe Ala Asp Arg Leu Pro Glu Lys Met 905 910 915 aag acc cca ctt tct gct ttc tct gaa aaa ttg tca tct gat gca gtc 2958 Lys Thr Pro Leu Ser Ala Phe Ser Glu Lys Leu Ser Ser Asp Ala Val 920 925 930 935 act cag ata aca aca gaa agt cca gaa aag acc cta ttt tca tct gag 3006 Thr Gln Ile Thr Thr Glu Ser Pro Glu Lys Thr Leu Phe Ser Ser Glu 940 945 950 att ttt att aat gct gaa gat cgt gga cat gaa att ata gag cct ggt 3054 Ile Phe Ile Asn Ala Glu Asp Arg Gly His Glu Ile Ile Glu Pro Gly 955 960 965 aac cag aag cta cgc aaa gct cct gtc aag ttt gcc tca tca tct tca 3102 Asn Gln Lys Leu Arg Lys Ala Pro Val Lys Phe Ala Ser Ser Ser Ser 970 975 980 gtc caa cag gtt act ttt tct cgc ggc aca gat ggc cag cct tta tta 3150 Val Gln Gln Val Thr Phe Ser Arg Gly Thr Asp Gly Gln Pro Leu Leu 985 990 995 ttg cca tat aag cct tct ggt agt acc aag atg tat tat gtt cca caa 3198 Leu Pro Tyr Lys Pro Ser Gly Ser Thr Lys Met Tyr Tyr Val Pro Gln 1000 1005 1010 1015 tta aga caa att cct cca tct ccg gat tcc aaa tca gat acc acc gtt 3246 Leu Arg Gln Ile Pro Pro Ser Pro Asp Ser Lys Ser Asp Thr Thr Val 1020 1025 1030 gaa agc tcc cat tca gga tcc aat gat gcc att gct cca gac ttc cca 3294 Glu Ser Ser His Ser Gly Ser Asn Asp Ala Ile Ala Pro Asp Phe Pro 1035 1040 1045 gct cag gtg cta ggc aca aga gat gat gac ctc tca gcc act gtt aac 3342 Ala Gln Val Leu Gly Thr Arg Asp Asp Asp Leu Ser Ala Thr Val Asn 1050 1055 1060 att aaa cat aaa gaa gga atc tac agt aag agg gta gtg act aag gca 3390 Ile Lys His Lys Glu Gly Ile Tyr Ser Lys Arg Val Val Thr Lys Ala 1065 1070 1075 tcc ttg cca gtg gga gaa aaa ccc ttg cag aat gaa aat gca gat gcc 3438 Ser Leu Pro Val Gly Glu Lys Pro Leu Gln Asn Glu Asn Ala Asp Ala 1080 1085 1090 1095 tca gtt caa gtg cta atc act ggg gat gag aac ctc tca gac aaa aaa 3486 Ser Val Gln Val Leu Ile Thr Gly Asp Glu Asn Leu Ser Asp Lys Lys 1100 1105 1110 cag caa gag att cac agt aca agg gca gtg act gag gct gcc cag gct 3534 Gln Gln Glu Ile His Ser Thr Arg Ala Val Thr Glu Ala Ala Gln Ala 1115 1120 1125 aaa gaa aaa gaa tct ttg cag aaa gat act gca gat tcc agt gct gct 3582 Lys Glu Lys Glu Ser Leu Gln Lys Asp Thr Ala Asp Ser Ser Ala Ala 1130 1135 1140 gct gct gca gag cac tca gct caa gta gga gac cca gaa atg aag aac 3630 Ala Ala Ala Glu His Ser Ala Gln Val Gly Asp Pro Glu Met Lys Asn 1145 1150 1155 ttg cca gac act aaa gcc att aca cag aaa gag gag atc cat agg aag 3678 Leu Pro Asp Thr Lys Ala Ile Thr Gln Lys Glu Glu Ile His Arg Lys 1160 1165 1170 1175 aag aca gtt ccc gag gaa gcc tgg cca aac aat aaa gaa tcc cta cag 3726 Lys Thr Val Pro Glu Glu Ala Trp Pro Asn Asn Lys Glu Ser Leu Gln 1180 1185 1190 atc aat att gaa gag tcc gaa tgt cat tca gaa ttt gaa aat act acc 3774 Ile Asn Ile Glu Glu Ser Glu Cys His Ser Glu Phe Glu Asn Thr Thr 1195 1200 1205 cgt tct gtc ttc agg tca gca aag ttt tac att cat cat ccc gta cac 3822 Arg Ser Val Phe Arg Ser Ala Lys Phe Tyr Ile His His Pro Val His 1210 1215 1220 cta cca agt gat caa gat att tgc cat gaa tct ttg gga aag agt gtt 3870 Leu Pro Ser Asp Gln Asp Ile Cys His Glu Ser Leu Gly Lys Ser Val 1225 1230 1235 ttc atg aga cat tct tgg aaa gat ttc ttt cag cat cat cca gac aaa 3918 Phe Met Arg His Ser Trp Lys Asp Phe Phe Gln His His Pro Asp Lys 1240 1245 1250 1255 cat aga gaa cac atg tgt ctt cct ctt cct tat caa aac atg gac aag 3966 His Arg Glu His Met Cys Leu Pro Leu Pro Tyr Gln Asn Met Asp Lys 1260 1265 1270 act aag aca gat tat acc aga ata aag agc ctc agc atc aat gtg aat 4014 Thr Lys Thr Asp Tyr Thr Arg Ile Lys Ser Leu Ser Ile Asn Val Asn 1275 1280 1285 ttg gga aac aaa gaa gtg atg gat act act aaa agt caa gtt aga gat 4062 Leu Gly Asn Lys Glu Val Met Asp Thr Thr Lys Ser Gln Val Arg Asp 1290 1295 1300 tat cca aaa cat aat gga caa att agt gat cca caa agg gat cag aag 4110 Tyr Pro Lys His Asn Gly Gln Ile Ser Asp Pro Gln Arg Asp Gln Lys 1305 1310 1315 gtc acc cca gag caa aca act cag cac act gtg agt ttg aat gaa ctg 4158 Val Thr Pro Glu Gln Thr Thr Gln His Thr Val Ser Leu Asn Glu Leu 1320 1325 1330 1335 tgg aac aag tat cgg gag cga cag agg caa cag aga cag cct gag ttg 4206 Trp Asn Lys Tyr Arg Glu Arg Gln Arg Gln Gln Arg Gln Pro Glu Leu 1340 1345 1350 ggt gac agg aaa gaa ctg tcc ttg gtg gac cga ctt gat cgg ttg gct 4254 Gly Asp Arg Lys Glu Leu Ser Leu Val Asp Arg Leu Asp Arg Leu Ala 1355 1360 1365 aaa att ctt cag aat cca atc aca cat tct ctc cag gtc tca gaa agt 4302 Lys Ile Leu Gln Asn Pro Ile Thr His Ser Leu Gln Val Ser Glu Ser 1370 1375 1380 aca cat gat gat agc aga ggg gaa cga agt gtg aag gaa tgg agt ggt 4350 Thr His Asp Asp Ser Arg Gly Glu Arg Ser Val Lys Glu Trp Ser Gly 1385 1390 1395 aga caa cag cag aga aat aag ctt cag aaa aag aag cgg ttt aaa agc 4398 Arg Gln Gln Gln Arg Asn Lys Leu Gln Lys Lys Lys Arg Phe Lys Ser 1400 1405 1410 1415 cta gag aaa agc cat aaa aat aca ggc gag ctt aaa aaa agc aag gtg 4446 Leu Glu Lys Ser His Lys Asn Thr Gly Glu Leu Lys Lys Ser Lys Val 1420 1425 1430 ctt tct cat cat cga gct ggg agg tct aat caa att aaa att gaa cag 4494 Leu Ser His His Arg Ala Gly Arg Ser Asn Gln Ile Lys Ile Glu Gln 1435 1440 1445 att aaa ttt gat aaa tat att ctg agt aaa cag cca ggt ttt aat tat 4542 Ile Lys Phe Asp Lys Tyr Ile Leu Ser Lys Gln Pro Gly Phe Asn Tyr 1450 1455 1460 ata agc aac act tct tcg gat tgt cgg ccc tca gag gag agt gag ctg 4590 Ile Ser Asn Thr Ser Ser Asp Cys Arg Pro Ser Glu Glu Ser Glu Leu 1465 1470 1475 ctc aca gat act acc acc aac atc ctt tcc ggc acc act tct act gtc 4638 Leu Thr Asp Thr Thr Thr Asn Ile Leu Ser Gly Thr Thr Ser Thr Val 1480 1485 1490 1495 gaa tca gat ata ttg acc caa aca gat aga gag gtg gct ctg cac gaa 4686 Glu Ser Asp Ile Leu Thr Gln Thr Asp Arg Glu Val Ala Leu His Glu 1500 1505 1510 agg agt agc tct gtt tcc act att gac act gcc cgg ctg att caa gct 4734 Arg Ser Ser Ser Val Ser Thr Ile Asp Thr Ala Arg Leu Ile Gln Ala 1515 1520 1525 ttt ggc cat gaa aga gta tgc ttg tca ccc aga cga att aaa tta tat 4782 Phe Gly His Glu Arg Val Cys Leu Ser Pro Arg Arg Ile Lys Leu Tyr 1530 1535 1540 agc agc atc acc aac caa cag agg aga tac ctt gag aag cgg agc aaa 4830 Ser Ser Ile Thr Asn Gln Gln Arg Arg Tyr Leu Glu Lys Arg Ser Lys 1545 1550 1555 cac agc aag aaa gtg ctg aat aca ggt cat ccc cta gtg act tct gag 4878 His Ser Lys Lys Val Leu Asn Thr Gly His Pro Leu Val Thr Ser Glu 1560 1565 1570 1575 cac acc aga agg aga cac atc cag gta gca aac cat gtg att tct tct 4926 His Thr Arg Arg Arg His Ile Gln Val Ala Asn His Val Ile Ser Ser 1580 1585 1590 gac tct att tcc tct tct gcc agt agt ttc ctg agc tca aac tct act 4974 Asp Ser Ile Ser Ser Ser Ala Ser Ser Phe Leu Ser Ser Asn Ser Thr 1595 1600 1605 ttt tgc aac aag cag aat gta cac atg tta aac aag ggc ata caa gca 5022 Phe Cys Asn Lys Gln Asn Val His Met Leu Asn Lys Gly Ile Gln Ala 1610 1615 1620 ggt aac ttg gag att gtg aac ggt gcc aaa aaa cac act cga gat gtt 5070 Gly Asn Leu Glu Ile Val Asn Gly Ala Lys Lys His Thr Arg Asp Val 1625 1630 1635 ggg ata act ttc cca act cca agt tcc agc gag gct aaa ttg gaa gag 5118 Gly Ile Thr Phe Pro Thr Pro Ser Ser Ser Glu Ala Lys Leu Glu Glu 1640 1645 1650 1655 aac agt gat gtg act tct tgg tca gaa gaa aaa cgt gaa gag aaa atg 5166 Asn Ser Asp Val Thr Ser Trp Ser Glu Glu Lys Arg Glu Glu Lys Met 1660 1665 1670 ctc ttt acc ggt tat cct gag gac aga aag tta aaa aag aac aag aag 5214 Leu Phe Thr Gly Tyr Pro Glu Asp Arg Lys Leu Lys Lys Asn Lys Lys 1675 1680 1685 aat tcc cat gaa gga gtt tcc tgg ttt gtt cct gtg gaa aat gtg gag 5262 Asn Ser His Glu Gly Val Ser Trp Phe Val Pro Val Glu Asn Val Glu 1690 1695 1700 tct aga tca aag aag gaa aac gtg cct aac act tgt ggc cct ggc atc 5310 Ser Arg Ser Lys Lys Glu Asn Val Pro Asn Thr Cys Gly Pro Gly Ile 1705 1710 1715 tcc tgg ttt gaa cca ata acc aag acc aga ccc tgg agg gag cca ctg 5358 Ser Trp Phe Glu Pro Ile Thr Lys Thr Arg Pro Trp Arg Glu Pro Leu 1720 1725 1730 1735 cgg gag cag aac tgt cag ggg cag cac ctg gac ggt cgg ggc tac ctg 5406 Arg Glu Gln Asn Cys Gln Gly Gln His Leu Asp Gly Arg Gly Tyr Leu 1740 1745 1750 gca ggc cca ggc aga gag gct ggc aga gac cta ctg aag cca ttt gtg 5454 Ala Gly Pro Gly Arg Glu Ala Gly Arg Asp Leu Leu Lys Pro Phe Val 1755 1760 1765 aga gca acc ctt cag gaa tcg ctt cag ttt cac aga cct gac ttc atc 5502 Arg Ala Thr Leu Gln Glu Ser Leu Gln Phe His Arg Pro Asp Phe Ile 1770 1775 1780 tcc cgc tct ggg gag cgg ata aag cgc ctg aag tta ata gtc cag gag 5550 Ser Arg Ser Gly Glu Arg Ile Lys Arg Leu Lys Leu Ile Val Gln Glu 1785 1790 1795 agg aag ctg cag agc atg tta cag acc gag cgg gat gca cta ttc aac 5598 Arg Lys Leu Gln Ser Met Leu Gln Thr Glu Arg Asp Ala Leu Phe Asn 1800 1805 1810 1815 att gac agg gaa cgg cag ggc cac cag aat cgc atg tgc ccg ctg ccc 5646 Ile Asp Arg Glu Arg Gln Gly His Gln Asn Arg Met Cys Pro Leu Pro 1820 1825 1830 aag aga gtc ttc ctg gct atc cag aag aac aag cct atc agc aag aag 5694 Lys Arg Val Phe Leu Ala Ile Gln Lys Asn Lys Pro Ile Ser Lys Lys 1835 1840 1845 gaa atg att cag agg tcc aaa cgg taa gaccaagaaa acaagagtac 5741 Glu Met Ile Gln Arg Ser Lys Arg 1850 1855 gtatacaagt gtaaaccagg ccaccaagtg gtcgggagct ctggcttgca cccagaataa 5801 atgtattata ctcaagttta aacattatga gaaagttgtg agagtcattt ctcacttatg 5861 gcactgaaaa aaaaaaaagc acatcatggt atgaatgact catatgcaaa agatgaaaaa 5921 cttctcacta atttgcatgt cttaggctcc tctttattag aaacctaaat gtaaataaag 5981 aatattttag gccaggtacg gtggctcatg cctgtaatcc cagcacttag ggaggccgag 6041 gtgtgcagat cacatgaggt taggagttcg agaccagcct ggccaacatg gtgaaactcc 6101 atctctactc aaaatacaaa aattagctgg gtgtggaggc acacgcctgt aatcccagct 6161 actcagtagg ctgagccggg aggatctctt gaacctggga ggcagaggtt gcagtgagct 6221 tagatggtgc cactgtactc cagtctgggc gacagaacga gactccatct c 6272 <210> 24 <211> 1855 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Met Glu Ala Glu Asn Met Ala Leu Lys Arg Cys Asn Phe Pro Ala Pro 1 5 10 15 Leu Ala Arg Phe Arg Asp Ile Ser Asp Ile Ser Phe Ile Gln Ser Lys 20 25 30 Lys Val Val Cys Phe Lys Glu Pro Ser Ser Thr Gly Val Ser Asn Gly 35 40 45 Asp Leu Leu His Arg Gln Pro Phe Thr Glu Glu Ser Pro Ser Ser Arg 50 55 60 Cys Ile Gln Lys Asp Ile Gly Thr Gln Thr Asn Leu Lys Cys Arg Arg 65 70 75 80 Gly Ile Glu Asn Trp Glu Phe Ile Ser Ser Thr Thr Val Arg Ser Pro 85 90 95 Leu Gln Glu Ala Glu Ser Lys Val Ser Met Ala Leu Glu Glu Thr Leu 100 105 110 Arg Gln Tyr Gln Ala Ala Lys Ser Val Met Arg Ser Glu Pro Glu Gly 115 120 125 Cys Ser Gly Thr Ile Gly Asn Lys Ile Ile Ile Pro Met Met Thr Val 130 135 140 Ile Lys Ser Asp Ser Ser Ser Asp Ala Ser Asp Gly Asn Gly Ser Cys 145 150 155 160 Ser Trp Asp Ser Asn Leu Pro Glu Ser Leu Glu Ser Val Ser Asp Val 165 170 175 Leu Leu Asn Phe Phe Pro Tyr Val Ser Pro Lys Thr Ser Ile Thr Asp 180 185 190 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Leu Pro Ser Cys Ile Phe Leu Glu Gln Arg Glu Leu Phe Glu Gln 610 615 620 Ser Lys Ala Pro Arg Ala Asp Asp His Val Arg Lys His His Ser Pro 625 630 635 640 Ser Pro Gln His Gln Asp Tyr Val Ala Pro Asp Leu Pro Ser Cys Ile 645 650 655 Phe Leu Glu Gln Arg Glu Leu Phe Glu Gln Cys Lys Ala Pro Tyr Val 660 665 670 Asp His Gln Met Arg Glu Asn His Ser Pro Leu Pro Gln Gly Gln Asp 675 680 685 Ser Ile Ala Ser Asp Leu Pro Ser Pro Ile Ser Leu Glu Gln Cys Gln 690 695 700 Ser Lys Ala Pro Gly Val Asp Asp Gln Met Asn Lys His His Phe Pro 705 710 715 720 Leu Pro Gln Gly Gln Asp Cys Val Val Glu Lys Asn Asn Gln His Lys 725 730 735 Pro Lys Ser His Ile Ser Asn Ile Asn Val Glu Ala Lys Phe Asn Thr 740 745 750 Val Val Ser Gln Ser Ala Pro Asn His Cys Thr Leu Ala Ala Ser Ala 755 760 765 Ser Thr Pro Pro Ser Asn Arg Lys Ala Leu Ser Cys Val His Ile Thr 770 775 780 Leu Cys Pro Lys Thr Ser Ser Lys Leu Asp Ser Gly Thr Leu Asp Glu 785 790 795 800 Arg Phe His Ser Leu Asp Ala Ala Ser Lys Ala Arg Met Asn Ser Glu 805 810 815 Phe 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tttatatctg acagtaaagt 660 ttgctgcaag tgtatgagtt caaacacatc ccttgttttc tgtccctagg ggaaaagtca 720 tgtagtttta gcttggctcc agtgttaata ttatattcag tagcagcctt agaagagtgg 780 tctaagactt gaacctggag caattttata gcacagaatc ctacgaagat aggactgtga 840 acatttgttt tctttttcgt gtgtgtcaaa ctaactggtt tttgctttac caataaaatg 900 tcctcggcag agtaaatttt aaacgtgaaa attatagatc ttgatattga atccatcagt 960 gattcaagag atacacctat ttgcctaaaa caacctaag atg tat tgg tta tgg 1014 Met Tyr Trp Leu Trp 1 5 aat cat gtg ttg gat agg ttc tta aga cct gtt tcc tca aat ctt gac 1062 Asn His Val Leu Asp Arg Phe Leu Arg Pro Val Ser Ser Asn Leu Asp 10 15 20 aca gtt ttc aag ggt ggc tta ttg act tgc acg gtt ggg cag ata atc 1110 Thr Val Phe Lys Gly Gly Leu Leu Thr Cys Thr Val Gly Gln Ile Ile 25 30 35 cag att tac cta aga ttg ggt aaa aaa gtc atc tgt gac ttt gct ggc 1158 Gln Ile Tyr Leu Arg Leu Gly Lys Lys Val Ile Cys Asp Phe Ala Gly 40 45 50 agg gca ttt gct aag tgg agt aca gga tct aaa agg gtt ttc tta gaa 1206 Arg Ala Phe Ala Lys Trp Ser Thr Gly Ser Lys Arg Val Phe Leu Glu 55 60 65 agg gca ata ttg tcc aat gaa gta agc aga agg act ctg ggt tag 1251 Arg Ala Ile Leu Ser Asn Glu Val Ser Arg Arg Thr Leu Gly 70 75 80 aagcatctgc acaaaaactg gtgagaccta ctctccactg ctctgcagct ggatggctga 1311 tggcaggctg agcagtgggg aagcaggttt taacaacagg gagtccttcc aggtcactgt 1371 atattgagaa gaaacataaa actattgtct gttacattcc gaggtcagcc ttcttcttaa 1431 cgttttataa tatgcaaatg ccagcttctg gaaagcaagt atcatcatgt accaaatgct 1491 ttatacacca tcacattcat gaatttttta gcatggtcag aacttgtgta aatatgtctc 1551 ttagatgatt ttggggagat gtgatttatt tttcatattt tcaaaatgca tttcatttca 1611 aataaagtta tctattgaga caaccgaaaa aaaaaaaaaa aaaa 1655 <210> 26 <211> 83 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Met Tyr Trp Leu Trp Asn His Val Leu Asp Arg Phe Leu Arg Pro Val 1 5 10 15 Ser Ser Asn Leu Asp Thr Val Phe Lys Gly Gly Leu Leu Thr Cys Thr 20 25 30 Val Gly Gln Ile Ile Gln Ile Tyr Leu Arg Leu Gly Lys Lys Val Ile 35 40 45 Cys Asp Phe Ala Gly Arg Ala Phe Ala Lys Trp Ser Thr Gly Ser Lys 50 55 60 Arg 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Gln Ser Ser Asp Leu Arg Ser Trp Thr Phe Gly Gln 170 175 180 tct gcc caa gcc atg gcc tcc cgc cac cgc ccc cgc ccc agc agt gtc 811 Ser Ala Gln Ala Met Ala Ser Arg His Arg Pro Arg Pro Ser Ser Val 185 190 195 ctc aga aca ctc tac tcg cac ctc ccg gtg atc cat gaa ctc tga 856 Leu Arg Thr Leu Tyr Ser His Leu Pro Val Ile His Glu Leu 200 205 210 cccctcccca gtaaaggctt ctgtagagag catgctgggt ctgcatctcc tctcgtctcc 916 tccatggtgg tcactgcccc tggcaggtct ctgaaaggga aatgcttttc tgcagaggcc 976 cctgcttggg cagttcacag tgagaccgac cccctctgaa tatgataaca gcctgtttca 1036 catgaggaga tgttaccaat cccgttcgct ctgacccttg ctggctgatc accttgagca 1096 acttacttaa catctgtgtt cctcagtttc tcatgggtaa tatagggata attactggca 1156 cctgcctccc aggccattct gacgtgtaac cgcatatagg agcccactgg ctgagtagct 1216 accatcatcg ctggtgggga aactggtggt aggggtgtga gggtagtggg ggtgtcagcc 1276 ccccaggtgt ttcagaacaa ggcctcgggc actcccaagt ctgcctcttg gctcccaccc 1336 tcaaagccca tgttctgtga ggcccaagag aacacatgga gtcttagcaa atgcactaat 1396 gtattccggg ggactgtcac 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gttacagatt agtcttaaag 2700 aattgcatta acttaaaaaa aatcaaacct tggcaagagc taaaataatt tggagatatc 2760 tttgcccttg acttgtagac gacatctaag aggatgaaga aaggagagtc taagtgagac 2820 tctggcctac ttcctaacaa tgtcttggaa gtgggatgat ggtaaaggag aaaggccaca 2880 gtccaatccc tctgccttca gatagggaac tcaaatcctg aaattactgt tttctttctg 2940 gccttttctc ctggttagag gaggaagcgg aaagtagttt tgagtaatac tttgttcata 3000 ttacccccct tttgttttgt ttctggcccc tctaccaata gggcagtagc ctcctgccct 3060 ggatgggtat aaggtgggct tggtccaaca ggtgcccaga gggtacatac tcctttctgg 3120 ggagagaatg ctccctacca tatagttgac agtggttagg aactctccct ttccctacct 3180 accttccttt taatagcaga attcctattt ttcccttgat tatgtgtatt gatcaccctg 3240 caatcctatt atg tat ctg agt gtg tgt gtg tgt gta tgt gtg tgt tat 3289 Met Tyr Leu Ser Val Cys Val Cys Val Cys Val Cys Tyr 1 5 10 ggg gga agg ggg ggg ttc ttt aaa att tct gtg gtt tgt ggc ttt ttc 3337 Gly Gly Arg Gly Gly Phe Phe Lys Ile Ser Val Val Cys Gly Phe Phe 15 20 25 ttc cat aca tta gtt ccc acc atc gca tgc cca ggg acc act gcc tgg 3385 Phe His Thr Leu Val Pro Thr Ile Ala Cys Pro Gly Thr Thr Ala Trp 30 35 40 45 cat tat cgc atg ctg gga tca tcg ggg gag ggt agt gaa gct cac cac 3433 His Tyr Arg Met Leu Gly Ser Ser Gly Glu Gly Ser Glu Ala His His 50 55 60 tgt cct ttg ttt tgg aga ttt tta ttt ttg cat aat att ttg cat cct 3481 Cys Pro Leu Phe Trp Arg Phe Leu Phe Leu His Asn Ile Leu His Pro 65 70 75 ata cag ata gct gat taa ctgtattccc ctttccccta tggctgctgg 3529 Ile Gln Ile Ala Asp 80 tgtaaataaa ctgcatctcc ccattggtaa acagtaataa aattttaaaa aatgaaaaaa 3589 aaaaaaaaaa aaaa 3603 <210> 30 <211> 82 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Met Tyr Leu Ser Val Cys Val Cys Val Cys Val Cys Tyr Gly Gly Arg 1 5 10 15 Gly Gly Phe Phe Lys Ile Ser Val Val Cys Gly Phe Phe Phe His Thr 20 25 30 Leu Val Pro Thr Ile Ala Cys Pro Gly Thr Thr Ala Trp His Tyr Arg 35 40 45 Met Leu Gly Ser Ser Gly Glu Gly Ser Glu Ala His His Cys Pro Leu 50 55 60 Phe Trp Arg Phe Leu Phe Leu His Asn Ile Leu His Pro Ile Gln Ile 65 70 75 80 Ala Asp <210> 31 <211> 548 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (419)..(505) <400> 31 tgggcttccc tccagtggac ggcttgtccc cactagtcct gggcatcatg gcagtbgccc 60 tgggtgcccc agggctcatg ctgctagggg gcggcttggt tctgctgctg caccacaaga 120 agtactcaga gtaccagtcc ataaattaag gcccgctctc tggagggaag gacattactg 180 aacctgtctt gctgtgcctc gaaactctgg aggttggagc atcaagttcc agccggcccc 240 ttcactcccc catcttgctt ttctgtggaa cctcagaggc cagcctcgac ttcctggaga 300 cccccaggtg gggcttcctt catactttgt tgggggactt tggaggcggg caggggacag 360 ggctattgat aaggtcccct tggtgttgcc ttcttgcatc tccacacatt tcccttgg 418 atg gga ctt gca ggc cta aat gag agg cat tct gac tgg ttg gct gcc 466 Met Gly Leu Ala Gly Leu Asn Glu Arg His Ser Asp Trp Leu Ala Ala 1 5 10 15 ctg gaa ggc aag aaa ata gat tta ttt ttt ttc aca ggg aaaaaaaaaa 515 Leu Glu Gly Lys Lys Ile Asp Leu Phe Phe Phe Thr Gly 20 25 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 548 <210> 32 <211> 29 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Met Gly Leu Ala Gly Leu Asn Glu Arg His Ser Asp Trp Leu Ala Ala 1 5 10 15 Leu Glu Gly Lys Lys Ile Asp Leu Phe Phe Phe Thr Gly 20 25 <210> 33 <211> 2382 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (593)..(937) <400> 33 gtagatgtgc gccagatcta tgacaaattc cccgagaaaa agggaggatt gaaggagctc 60 tatgagaagg ggccccctaa tgccttcttc cttgtcaagt tctgggtgag tccccctggc 120 cttctctgct ccaagccccc ttccccaccc cagaggtgca acatccaggc ccactgcatt 180 gacctctgac cctgctgcat cctcatggct tgtgggcaga gtgccagaga tggatccttg 240 ggcaggactc tgatgtggtg tggcgggaat acttctggtc tctgccagca cctaacaccc 300 cccaccccca tgcccaggcc gacctcaaca gcaccatcca ggagggcccg ggagccttct 360 atggggtcag ctctcagtac agctctgctg atagcatgac catcagcgtc tccaccaagg 420 tgtgctcctt tggcaaacag gtggtagaga aggtggaggt gagtgggggc tctgggtggc 480 ttggtggggc tgggagcagg caggccgagt gacgccttct ccatattctc tgcagactga 540 gtatgccagg ctggagaacg ggcgctttgt gtaccgtatc caccgctcgc cc atg tgc 598 Met Cys 1 gag tac atg atc aac ttc atc cac aag ctg aag cac ctg ccc gag aag 646 Glu Tyr Met Ile Asn Phe Ile His Lys Leu Lys His Leu Pro Glu Lys 5 10 15 tac atg atg aac agc gtg ctg gag aac ttc acc atc ctg cag gta tgg 694 Tyr Met Met Asn Ser Val Leu Glu Asn Phe Thr Ile Leu Gln Val Trp 20 25 30 ggg cag cag ggg tcg tgg gga gtc cca cag gcc agg gcc tcc aag ttg 742 Gly Gln Gln Gly Ser Trp Gly Val Pro Gln Ala Arg Ala Ser Lys Leu 35 40 45 50 ggt agc cag aca cat cgc ttg gct gag agg cat aga tcc gga aag gag 790 Gly Ser Gln Thr His Arg Leu Ala Glu Arg His Arg Ser Gly Lys Glu 55 60 65 aat ggt ctg ttc agc ccc ctg ccc cgt ggc cct ttt ctc cct gac ctc 838 Asn Gly Leu Phe Ser Pro Leu Pro Arg Gly Pro Phe Leu Pro Asp Leu 70 75 80 ctg aat ctc tta cct gct cac ccc cca ggt ggt cac gag ccg gga ctc 886 Leu Asn Leu Leu Pro Ala His Pro Pro Gly Gly His Glu Pro Gly Leu 85 90 95 cca gga gac cct gct tgt cat tgc ttt tgt ctt cga agt ctc cac cag 934 Pro Gly Asp Pro Ala Cys His Cys Phe Cys Leu Arg Ser Leu His Gln 100 105 110 tga gcacggggcc cagcaccatg tctacaagct cgtcaaagac tagggtgccc 987 115 tctgcgcctc cttaaggatg cagggtgagc atctcctctc cacacctgcc tggcacccct 1047 gggggggtcc aggattgagg attcatctac ctgccaggcc tcaggcccag gacccaggag 1107 gcctccccac ctaccccagc acacacactc cctgccactg ttctgcgctt taattgtggg 1167 agaagagagg agaggagggc tcagcggtgg ggcagcctgt ccggggcgct gacccaccat 1227 caccctgctc tgcccagcct cgcgtgacct cagagaggtg gggatagggg acaccttcag 1287 cctccagcat gtgtggccac tgtaccccca cccacccttg ggggagcatg atgggcaggt 1347 gagggcagga tggagaccaa gggagtcagt gagcagaggc cctgggagtg tccggtcggg 1407 gttggactga ggacagaggg gcccacactt ccttgcccct ttgtgtccca ggcctggtgc 1467 ccagactcct tgcatggctt gtgtggtcct cagactccgc acagcgagcg taggtctctg 1527 ggtttcagat gaagtgccca ggctccagga agttgaggga cccacaggag aggtgggcag 1587 agctggagtt ctcatccagg gctgcttgtc cccagagccc aggtttatac tacctccctg 1647 gggcgggggc tggccgcagg taggggagag gctctgcagt gtggagtgga gcctcatcga 1707 ggggcgctgg gttaggggag cacctgtttc agactgggca tgaagaaggg agcacagcag 1767 ctactagacc ccattagcac ctcattagcc cacaagccag ccaggggccc caggaagatg 1827 gggcaccccc agcaccctcc agattgagag caaggtagag gaaggagtcc cagcctctgg 1887 gcagaccaga ggcccagagg gagagagtag cagaaggctt ttgatttttc tcttgcctga 1947 ggcttgaatc tgacaaaacc ccttggtggg cactgctccc ttaggttctt cccacctcaa 2007 tctacctgcc tagagtagca gctccagacc agttctggga ctgaaggtta accttcacct 2067 gctgtccttc ttacacccag gccccagagc cagctgggcc tgtcagcagc aactgtggta 2127 ttatgagttc atatgaagta ctgtgcccct tcccttcctc atcccgaccc tgcccgagct 2187 tcctgaaggt cctcactgtt tgcatatcgc tcaggccacc tccaaacccc acctaggttt 2247 tataatgtat attatatatt tttttgtgta tttttaaaat ccagctgtga tgggttatat 2307 cataaatgca gcttggggtt ggagcagggg ccctcaaagg cccagctcct gctcaaaaaa 2367 aaaaaaaaaa aaaaa 2382 <210> 34 <211> 114 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Met Cys Glu Tyr Met Ile Asn Phe Ile His Lys Leu Lys His Leu Pro 1 5 10 15 Glu Lys Tyr Met Met Asn Ser Val Leu Glu Asn Phe Thr Ile Leu Gln 20 25 30 Val Trp Gly Gln Gln Gly Ser Trp Gly Val Pro Gln Ala Arg Ala Ser 35 40 45 Lys Leu Gly Ser Gln Thr His Arg Leu Ala Glu Arg His Arg Ser Gly 50 55 60 Lys Glu Asn Gly Leu Phe Ser Pro Leu Pro Arg Gly Pro Phe Leu Pro 65 70 75 80 Asp Leu Leu Asn Leu Leu Pro Ala His Pro Pro Gly Gly His Glu Pro 85 90 95 Gly Leu Pro Gly Asp Pro Ala Cys His Cys Phe Cys Leu Arg Ser Leu 100 105 110 His Gln <210> 35 <211> 551 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (432)..(551) <400> 35 actyaatggc yytgtcttca ggatttcatt gaaaatcccc cagtctctyc ayatywgaka 60 cwyyctgtck matccayyac tstatcacca ttaacatgyt ggcagataaa yygaacatga 120 ctccagaata agctgaaagg tcggawtstw aatywrawta aaaatscaaa acwggatgcc 180 aagahygatt cyaaattagg wcaygkggyy wtksrywaca atgcagwctc acccyatcag 240 caagtgawts araagaccaw magcctwtcc tttagcaacg ccatcaatgw ctggcacatc 300 taactattag akaatgaaac ttaatcagaa tagcmkgtca sattgcttcc taactgkrca 360 actcaatgwk tcttggctct cymsyswmsa mccataaaga wrwgcatgaa taacttawct 420 atcaaakrww g atg gaa tta atr caa act aat tat ata car ggt gac tyw 470 Met Glu Leu Xaa Gln Thr Asn Tyr Ile Gln Gly Asp Xaa 1 5 10 ctt ttw rtg tam cww cat att acg try tac tgy ykt ckc ttt gkc cya 518 Leu Xaa Xaa Xaa Xaa His Ile Thr Xaa Tyr Cys Xaa Xaa Phe Xaa Xaa 15 20 25 ccc wtg gyw caw yta rga ttg gtg ggt ttc tgg 551 Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Val Gly Phe Trp 30 35 40 <210> 36 <211> 40 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Met Glu Leu Xaa Gln Thr Asn Tyr Ile Gln Gly Asp Xaa Leu Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa His Ile Thr Xaa Tyr Cys Xaa Xaa Phe Xaa Xaa Pro Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Leu Val Gly Phe Trp 35 40 <210> 37 <211> 2450 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (184)..(1353) <400> 37 gtacacattc caaaaagaga ttgatacact tgcaatgaag ggttcttgct tgagggagcc 60 aggagtcggg tttgtcttgc caatggaagt tggagtggag ccactcccga ctgtgtgcct 120 gtcagatgtg ccaccccgcc acaactggcc aatggggtga cggaaggcct ggactatggc 180 ttc atg aag gaa gta aca ttc cac tgt cat gag ggc tac atc ttg cac 228 Met Lys Glu Val Thr Phe His Cys His Glu Gly Tyr Ile Leu His 1 5 10 15 ggt gct cca aaa ctc acc tgt cag tca gat ggc aac tgg gat gca gag 276 Gly Ala Pro Lys Leu Thr Cys Gln Ser Asp Gly Asn Trp Asp Ala Glu 20 25 30 att cct ctc tgt aaa cca gtc aac tgt gga cct cct gaa gat ctt gcc 324 Ile Pro Leu Cys Lys Pro Val Asn Cys Gly Pro Pro Glu Asp Leu Ala 35 40 45 cat ggt ttc cct aat ggt ttt tcc ttt att cat ggg ggc cat ata cag 372 His Gly Phe Pro Asn Gly Phe Ser Phe Ile His Gly Gly His Ile Gln 50 55 60 tat cag tgc ttt cct ggt tat aag ctc cat gga aat tca tca aga agg 420 Tyr Gln Cys Phe Pro Gly Tyr Lys Leu His Gly Asn Ser Ser Arg Arg 65 70 75 tgc ctc tcc aat ggc tcc tgg agt ggc agc tca cct tcc tgc ctg cct 468 Cys Leu Ser Asn Gly Ser Trp Ser Gly Ser Ser Pro Ser Cys Leu Pro 80 85 90 95 tgc aga tgt tcc aca cca gta att gaa tat gga act gtc aat ggg aca 516 Cys Arg Cys Ser Thr Pro Val Ile Glu Tyr Gly Thr Val Asn Gly Thr 100 105 110 gat ttt gac tgt gga aag gca gcc cgg att cag tgc ttc aaa ggc ttc 564 Asp Phe Asp Cys Gly Lys Ala Ala Arg Ile Gln Cys Phe Lys Gly Phe 115 120 125 aag ctc cta gga ctt tct gaa atc acc tgt gaa gcc gat ggc cag tgg 612 Lys Leu Leu Gly Leu Ser Glu Ile Thr Cys Glu Ala Asp Gly Gln Trp 130 135 140 agc tct ggg ttc cac cac ttt gaa cac act tct tgt ggt tct ctt cca 660 Ser Ser Gly Phe His His Phe Glu His Thr Ser Cys Gly Ser Leu Pro 145 150 155 atg ata cca aat gcg ttc atc agt gag acc agc tct tgg aag gaa aat 708 Met Ile Pro Asn Ala Phe Ile Ser Glu Thr Ser Ser Trp Lys Glu Asn 160 165 170 175 gtg ata act tac agc tgc agg tct gga tat gtc ata caa ggc agt tca 756 Val Ile Thr Tyr Ser Cys Arg Ser Gly Tyr Val Ile Gln Gly Ser Ser 180 185 190 gat ctg att tgt aca gag aaa ggg gta tgg agc cag cct tat cca gtc 804 Asp Leu Ile Cys Thr Glu Lys Gly Val Trp Ser Gln Pro Tyr Pro Val 195 200 205 tgt gag ccc ttg tcc tgt ggg tcc cca ccg tct gtc gcc aat gca gtg 852 Cys Glu Pro Leu Ser Cys Gly Ser Pro Pro Ser Val Ala Asn Ala Val 210 215 220 gca act gga gag gca cac acc tat gaa agt gaa gtg aaa ctc aga tgt 900 Ala Thr Gly Glu Ala His Thr Tyr Glu Ser Glu Val Lys Leu Arg Cys 225 230 235 ctg gaa ggt tat acg atg gat aca gat acc aga tca atc acc tgt cag 948 Leu Glu Gly Tyr Thr Met Asp Thr Asp Thr Arg Ser Ile Thr Cys Gln 240 245 250 255 aaa gat ggt cgc tgg ttc cct gag aga atc tcc tgc agt cct aaa aaa 996 Lys Asp Gly Arg Trp Phe Pro Glu Arg Ile Ser Cys Ser Pro Lys Lys 260 265 270 tgt cct ctc ccg gaa aac ata aca cat ata ctt gta cat ggg gac gat 1044 Cys Pro Leu Pro Glu Asn Ile Thr His Ile Leu Val His Gly Asp Asp 275 280 285 ttc agt gtg aat agg caa gtt tct gtg tca tgt gca gaa ggg tat acc 1092 Phe Ser Val Asn Arg Gln Val Ser Val Ser Cys Ala Glu Gly Tyr Thr 290 295 300 ttt gag gga gtt aac ata tca gta tgt cag ctt gat gga acc tgg gag 1140 Phe Glu Gly Val Asn Ile Ser Val Cys Gln Leu Asp Gly Thr Trp Glu 305 310 315 cca cca ttc tcc gat gaa tct tgc agt cca gtt tct tgt ggg aaa cct 1188 Pro Pro Phe Ser Asp Glu Ser Cys Ser Pro Val Ser Cys Gly Lys Pro 320 325 330 335 gaa agt cca gaa cat gga ttt gtg gtt ggc agt aaa tac acc ttt gaa 1236 Glu Ser Pro Glu His Gly Phe Val Val Gly Ser Lys Tyr Thr Phe Glu 340 345 350 agc aca att att tat cag tgt gag cct ggc tat gaa cta ggg gaa cag 1284 Ser Thr Ile Ile Tyr Gln Cys Glu Pro Gly Tyr Glu Leu Gly Glu Gln 355 360 365 gga acg tgt ctg cca gga gaa cag aca gtg gag tgg agg ggt ggc aat 1332 Gly Thr Cys Leu Pro Gly Glu Gln Thr Val Glu Trp Arg Gly Gly Asn 370 375 380 atg caa aga gac cag gtg tga aactccactt gaatttctca atgggaaagc 1383 Met Gln Arg Asp Gln Val 385 390 tgacattgaa aacaggacga ctggacccaa cgtggtatat tcctgcaaca gaggctacag 1443 tcttgaaggg ccatctgagg cacactgcac agaaaatgga acctggagcc acccagtccc 1503 tctctgcaaa ccaaatccat gccctgttcc ttttgtgatt cccgagaatg ctctgctgtc 1563 tgaaaaggag ttttatgttg atcagaatgt gtccatcaaa tgtagggaag gttttctgct 1623 gcagggccac ggcatcatta cctgcaaccc cgacgagacg tggacacaga caagcgccaa 1683 atgtgaaaaa atctcatgtg gtccaccagc tcacgtagaa aatgcaattg ctcgaggcgt 1743 acattatcaa tatggagaca tgatcaccta ctcatgttac agtggataca tgttggaggg 1803 tttcctgagg agtgtttgtt tagaaaatgg aacatggaca tcacctccta tttgcagagc 1863 tgtctgtcga tttccatgtc agaatggggg catctgccaa cgcccaaatg cttgttcctg 1923 tccagagggc tggatggggc gcctctgtga agaaccaatc tgcattcttc cctgtctgaa 1983 cggaggtcgc tgtgtggccc cttaccagtg tgactgcccg cctggctgga cggggtctcg 2043 ctgtcataca gctgtttgcc agtctccctg cttaaatggt ggaaaatgtg taagaccaaa 2103 ccgatgtcac tgtctttctt cttggacggg acataactgt tccaggaaaa ggaggactgg 2163 gttttaacca ctgcacgacc atctggctct cccaaaagca ggatcatctc tcctcggtag 2223 tgcctgggca tcctggaact tatgcaaaga aagtccaaca tggtgctggg tcttgtttag 2283 taaacttgtt acttggggtt acttttttta ttttgtgata tattttgtta ttccttgtga 2343 catactttct tacatgtttc catttttaaa tatgcctgta ttttctatat aaaaattata 2403 ttaaatagat gctgctacaa aatgtaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 2450 <210> 38 <211> 389 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Met Lys Glu Val Thr Phe His Cys His Glu Gly Tyr Ile Leu His Gly 1 5 10 15 Ala Pro Lys Leu Thr Cys Gln Ser Asp Gly Asn Trp Asp Ala Glu Ile 20 25 30 Pro Leu Cys Lys Pro Val Asn Cys Gly Pro Pro Glu Asp Leu Ala His 35 40 45 Gly Phe Pro Asn Gly Phe Ser Phe Ile His Gly Gly His Ile Gln Tyr 50 55 60 Gln Cys Phe Pro Gly Tyr Lys Leu His Gly Asn Ser Ser Arg Arg Cys 65 70 75 80 Leu Ser Asn Gly Ser Trp Ser Gly Ser Ser Pro Ser Cys Leu Pro Cys 85 90 95 Arg Cys Ser Thr Pro Val Ile Glu Tyr Gly Thr Val Asn Gly Thr Asp 100 105 110 Phe Asp Cys Gly Lys Ala Ala Arg Ile Gln Cys Phe Lys Gly Phe Lys 115 120 125 Leu Leu Gly Leu Ser Glu Ile Thr Cys Glu Ala Asp Gly Gln Trp Ser 130 135 140 Ser Gly Phe His His Phe Glu His Thr Ser Cys Gly Ser Leu Pro Met 145 150 155 160 Ile Pro Asn Ala Phe Ile Ser Glu Thr Ser Ser Trp Lys Glu Asn Val 165 170 175 Ile Thr Tyr Ser Cys Arg Ser Gly Tyr Val Ile Gln Gly Ser Ser Asp 180 185 190 Leu Ile Cys Thr Glu Lys Gly Val Trp Ser Gln Pro Tyr Pro Val Cys 195 200 205 Glu Pro Leu Ser Cys Gly Ser Pro Pro Ser Val Ala Asn Ala Val Ala 210 215 220 Thr Gly Glu Ala His Thr Tyr Glu Ser Glu Val Lys Leu Arg Cys Leu 225 230 235 240 Glu Gly Tyr Thr Met Asp Thr Asp Thr Arg Ser Ile Thr Cys Gln Lys 245 250 255 Asp Gly Arg Trp Phe Pro Glu Arg Ile Ser Cys Ser Pro Lys Lys Cys 260 265 270 Pro Leu Pro Glu Asn Ile Thr His Ile Leu Val His Gly Asp Asp Phe 275 280 285 Ser Val Asn Arg Gln Val Ser Val Ser Cys Ala Glu Gly Tyr Thr Phe 290 295 300 Glu Gly Val Asn Ile Ser Val Cys Gln Leu Asp Gly Thr Trp Glu Pro 305 310 315 320 Pro Phe Ser Asp Glu Ser Cys Ser Pro Val Ser Cys Gly Lys Pro Glu 325 330 335 Ser Pro Glu His Gly Phe Val Val Gly Ser Lys Tyr Thr Phe Glu Ser 340 345 350 Thr Ile Ile Tyr Gln Cys Glu Pro Gly Tyr Glu Leu Gly Glu Gln Gly 355 360 365 Thr Cys Leu Pro Gly Glu Gln Thr Val Glu Trp Arg Gly Gly Asn Met 370 375 380 Gln Arg Asp Gln Val 385 <210> 39 <211> 1854 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (59)..(427) <400> 39 agatagagga ggtaagaaag gaggagtaga gtactgtccc aattgccgag gtactgga 58 atg caa ata aga att cat cag ata gga cct gga aag gtt cag caa att 106 Met Gln Ile Arg Ile His Gln Ile Gly Pro Gly Lys Val Gln Gln Ile 1 5 10 15 cag tct gtg tgc gtg gag tgc cag ggc cat ggg gag cag atc agt cct 154 Gln Ser Val Cys Val Glu Cys Gln Gly His Gly Glu Gln Ile Ser Pro 20 25 30 aaa gat aga tgt gaa agc tgc aat gga agg aag ata ctt cga gag aag 202 Lys Asp Arg Cys Glu Ser Cys Asn Gly Arg Lys Ile Leu Arg Glu Lys 35 40 45 aag att cta gaa ttt cat att gac aaa ggc atg aaa tat ggc cag aag 250 Lys Ile Leu Glu Phe His Ile Asp Lys Gly Met Lys Tyr Gly Gln Lys 50 55 60 ata aca ttc cat ggt gaa gga tac caa gaa cca gga ctg gag gga gaa 298 Ile Thr Phe His Gly Glu Gly Tyr Gln Glu Pro Gly Leu Glu Gly Glu 65 70 75 80 gat att atc att gtg tta gat cag aag gac gat gct gtt ttt act cga 346 Asp Ile Ile Ile Val Leu Asp Gln Lys Asp Asp Ala Val Phe Thr Arg 85 90 95 caa gga gaa gac ctt ttc atg tgt atg gac ata cag ctg gtt gaa gca 394 Gln Gly Glu Asp Leu Phe Met Cys Met Asp Ile Gln Leu Val Glu Ala 100 105 110 ttc cag aag cca ata tct act ctt gac aac tga accatagtca tcacctctca 447 Phe Gln Lys Pro Ile Ser Thr Leu Asp Asn 115 120 tccaggtcag attgtcaagc atggagatat caagtgtgta ataaatgaag gaatgccaat 507 ttatcctagg ccatatgaaa agggtcgcct aatcattgaa ttcaaggtaa acttgcctga 567 gaatgacttt ctctctcctg ataaactgtc tttgctggaa aaactcctac ccaagaggaa 627 ggaagtggaa gaaactgatg agatggatca agtagaactg gtggactttg atccaaatca 687 ggaaagatgg caccattaca atggagaagc atatgaggat gatgaacatc atcccagagg 747 tggtgttcgg tgtcagacct cttaatgggc cagtgaataa cacccactgg tggcatttta 807 tgtgcagtag taaatgagtg aaggactgtg atcataacat gctcactact tgctcttgtt 867 tttgtttaat attcaactat agtagtgttt taaaaagtta aatgaagaat aaatgcaaat 927 gtaaaagctc tgactttgcc ctgtatgtat gatgacttcg gtgtgcaaga tgaagtttaa 987 tacctgtaaa gactacttta caaagaagtt cccctagcat ttataggcca aaccttgtaa 1047 ttgacttcag ctatgtatgt ggacaagctt agactgaaat gctaggtata tgtattggct 1107 tcagtgtatg acccttcatt gttaagctat gaaagtaaaa ctctgtattt aactggcaat 1167 gaggaaaaaa aaattttgta gagaagtgtt ggtctgtata gttctttata ttaagtggga 1227 ttcattgtaa tgcctctgca tttattctgt tgcctcagct gttacttgaa gatggcgtaa 1287 tatataattt atcctgtggt atcagtgata aaaatgatac ctttctgtag gaggggttta 1347 tcataatatg ctgcttcttg aaggcttgca cttccagaat tgtgtttcct tctgctgtgc 1407 cattcatata tatatacata tatatatata atcttgacca gtcctggtca tttgctcccc 1467 tccttgtctg tggaccatga taagcccaag tagtgacttc agagctgggt aacagaaatt 1527 aaagtgaaaa gacctttacg tggagaattt gcatgcgtaa tataggaagg tgttctttag 1587 gtatgttaca ggattacttt aaaccatttg actttcgctc caaagttatg ttggtagtat 1647 agcaaattat gatgaatagc tataattgta tgtttaasag tctcatatgt tcacatgctt 1707 aagtctgggt atcagaattt aagcaattct tgaratgtat tgtctcctta atatactaat 1767 tgcgaagcat cagagrsggg gggggggggc gggccgcggc cgccctttag ttgngggtaa 1827 gtttagtcgg tacgcgcgat ttattta 1854 <210> 40 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Met Gln Ile Arg Ile His Gln Ile Gly Pro Gly Lys Val Gln Gln Ile 1 5 10 15 Gln Ser Val Cys Val Glu Cys Gln Gly His Gly Glu Gln Ile Ser Pro 20 25 30 Lys Asp Arg Cys Glu Ser Cys Asn Gly Arg Lys Ile Leu Arg Glu Lys 35 40 45 Lys Ile Leu Glu Phe His Ile Asp Lys Gly Met Lys Tyr Gly Gln Lys 50 55 60 Ile Thr Phe His Gly Glu Gly Tyr Gln Glu Pro Gly Leu Glu Gly Glu 65 70 75 80 Asp Ile Ile Ile Val Leu Asp Gln Lys Asp Asp Ala Val Phe Thr Arg 85 90 95 Gln Gly Glu Asp Leu Phe Met Cys Met Asp Ile Gln Leu Val Glu Ala 100 105 110 Phe Gln Lys Pro Ile Ser Thr Leu Asp Asn 115 120

【図面の簡単な説明】

【図１】静止期特異的に転写誘導される遺伝子群の転写
産物（mRNA：cDNA）が濃縮されたサブトラクティッドcD
NAライブラリーの作製の手順である。

【図２】段階的サブトラクションにおけるプラスミド解
析の手順である。

【図３】３種類のTIGA遺伝子のノーザン解析の結果であ
る。

【図４】段階的サブトラクションの結果をプロットして
得られると思われる曲線の予想図である。

【図５】高次サブトラクションcDNAライブラリー作成の
概略図である。

【図６】実施例例において得られた段階的サブトラクシ
ョン曲線である。

【図７】実施例でクローニングした20種のTIGA遺伝子の
ノーザン解析の結果である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 5/10 5/00 Ａ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 CA09 CA12 DA06 HA17 4B065 AA26X AA93Y AB01 BA03 CA24 CA44 4H045 AA10 AA11 AA20 BA10 CA40 EA20 FA74

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 異なる生理現象を示す細胞ＸおよびＹに
   おいてそれぞれに発現する遺伝子のライブラリーから共
   通に発現する遺伝子を削除する操作を３回以上繰り返
   し、細胞Ｘで特異的に発現する20〜500個の遺伝子を特
   定することを特徴とする多段階差次的クローニング方
   法。
2. 【請求項２】 細胞Ｘが細胞周期静止期のヒト細胞であ
   り、細胞Ｙが細胞周期増殖期のヒト細胞である請求項１
   の多段階差次的クローニング方法。
3. 【請求項３】 請求項２の方法によってクローニングさ
   れた遺伝子であって、細胞周期静止期のヒト細胞で特異
   的に発現している細胞増殖制御遺伝子。
4. 【請求項４】 cDNAが、配列番号１−４０の奇数配列番
   号のいずれかの塩基配列を有する細胞増殖制御遺伝子ま
   たはそれらの集合。
5. 【請求項５】 請求項４の細胞増殖制御遺伝子のゲノム
   DNA、mRNA、cDNAまたはそれらの相補配列から精製され
   たポリヌクレオチド。
6. 【請求項６】 請求項４の細胞増殖制御遺伝子または請
   求項５のポリヌクレオチドにハイブリダイズする、10塩
   基対以上の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
7. 【請求項７】 請求項５のポリヌクレオチドを保有する
   組換えベクター。
8. 【請求項８】 請求項７の組換えベクターによる形質転
   換体細胞。
9. 【請求項９】 請求項３の細胞増殖制御遺伝子の発現産
   物であるヒト細胞増殖抑制タンパク質。
10. 【請求項１０】 請求項４の細胞増殖制御遺伝子の発現
    産物であって、配列番号１−４０の偶数配列番号のいず
    れかのアミノ酸配列を有するヒト細胞増殖抑制タンパク
    質またはそれらの集合。
11. 【請求項１１】 請求項８の形質転換体細胞によって産
    生される請求項１０のヒト細胞増殖抑制タンパク質。
12. 【請求項１２】 配列表の偶数配列番号のいずれかのア
    ミノ酸配列における連続５アミノ酸残基以上のアミノ配
    列からなるペプチド。
13. 【請求項１３】 請求項９または請求項１０のヒト細胞
    増殖抑制タンパク質を認識する抗体。
14. 【請求項１４】 請求項５のポリヌクレオチドの少なく
    とも１、または請求項６のオリゴヌクレオチドの少なく
    とも１と、担体とからなる組成物。
15. 【請求項１５】 請求項１４の組成物を備えた検索・診
    断キット。