KR101838394B1 - 뇌실하 영역의 돌연변이 유전자를 이용한 교모세포종 조직 기원의 예측 방법 및 동물 모델 - Google Patents
뇌실하 영역의 돌연변이 유전자를 이용한 교모세포종 조직 기원의 예측 방법 및 동물 모델 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 뇌실하 영역(subventricular zone, SVZ)에서 암 유전자 돌연변이 발현 수준을 측정하여 교모세포종(gliblastoma; GBM)의 조직 기원을 예측하는 방법을 제공하고, 더 나아가 상기 교모세포종 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. 또한, 암 유전자 돌연변이를 주입하여 교모세포종이 유도된 동물 모델을 제공한다. 상기 뇌실하 영역(Subventricular Zone; SVZ)의 특정 암 유전자 돌연변이의 발현 수준을 측정하여 IDH-정상 교모세포종의 조직 기원을 예측함을 통해 상기 교모세포종에 대한 적절한 치료 전략 수립을 가능하게 할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 뇌실하 영역의 특정 돌연변이 유전자를 포함하는 동물 모델을 통하여 교모세포종 환자의 발생 원인, 치료 및 예방 방법에 대한 연구를 수행하여 교모세포종을 극복할 수 있는 연구 기반을 제시할 수 있다.
Description
본 발명은 뇌실하 영역(Subventricular zone, SVZ)에서 암 유전자 돌연변이를 확인하여 교모세포종(Gliblastoma; GBM)조직 기원을 예측하는 방법과, 더 나아가 교모세포종을 진단하는 방법 및 교모세포종이 유도된 동물 모델에 관한 것이다.
신경교종(glioma)은 원발성 뇌종양(primary brain tumor)의 60% 를 차지하는 종양으로서, 발생빈도가 높고 치료가 어려워, 현재까지도 방사선 치료 외엔 특별한 치료법이 없는 악성 종양에 해당한다. 그 중 가장 악성으로 분류되고 있는 교모세포종(glioblastoma, GBM)의 경우, 다른 암과 비교하였을 때 방사선 및 항암제 치료에 대한 저항성이 매우 높아 일단 진단되면 생존기간이 1년에 불과하므로, 각 환자의 발생 기원과 과정에 대한 적절한 진단 및 이해가 중요하다.
또한, 상기 뇌종양의 경우, 뇌혈관 장벽(Brain Blood Barrier)이 존재하기 때문에 치료를 위한 약물 전달이 목적하는 뇌 부위로 전달되기 어려울 뿐만 아니라, 상대적으로 뇌신경 생물학에 대한 이해가 부족하여 치료제 개발이 활발하지 못한 것이 현실이다. 더욱이, 교모세포종은 다른 뇌종양과 비교해볼 때 공격적 변이(aggressive variant)를 나타내어, 이를 빠른 시일 내에 치료하지 않으면 몇 주 이내에 치명적인 결과를 초래할 수 있다.
따라서, 교모세포종의 치료에는 외과적 처치 이외에 방사선 치료 및 화학 약물 치료가 함께 수행되고 있으나, 상기 치료는 내성 변이의 발생, 종양줄기세포에 의한 재발 등의 원인으로 인하여 완벽한 치료법이 없다. 따라서, 발생 기원에 대한 초기 진단과 이해 및 그에 기반한 새로운 치료법을 개발하여야 할 필요성이 요구되고 있는 실정이다.
본 발명의 일 목적은 뇌실하 영역(subventricular zone; SVZ)에서 암 유전자(oncogene) 돌연변이 발현 수준과 교모세포종 조직간의 유전자 돌연변이의 발현 수준을 비교하여 교모세포종 조직 기원을 예측하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 뇌실하 영역(subventricular zone; SVZ)에서 암 유전자(oncogene) 돌연변이 발현 수준을 측정하여 교모세포종을 진단하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 암 유전자(oncogene) 돌연변이를 포함하는 교모세포종화 동물 모델 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명자들은 IDH-정상(IDH-wild type) 교모세포종(gliblastoma; GBM)이 뇌실하 영역(Subventricular Zone; SVZ)에서 유래되어, 상기 IDH-정상 교모세포종 세포의 암 유전자 돌연변이가 뇌실하 영역과 공유됨을 확인하고, 상기 돌연변이의 발현 수준을 측정함으로써, IDH-정상 교모세포종의 조직 기원을 예측할 수 있었을 뿐만 아니라, 나아가 교모세포종을 진단할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명에 있어서 상기 “교모세포종(gliblastoma; GBM)” 이란, 뇌 척수 조직이나 이를 싸고 있는 막 영역으로부터 발생되는 원발성 종양으로, 정상적으로 뇌조직에 풍부하게 존재하고 있는 신경교세포(Neuroglia cell)에서 시작된 종양이다.
본 발명의 일 구현 예에서, (a) 목적하는 개체로부터 시료를 분리하는 단계; (b) 상기 시료로부터 암 유전자 돌연변이의 발현 수준을 측정하는 단계; (c) 목적하는 개체의 교모세포종 조직으로부터 암 유전자 돌연변이 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (d) 상기 (b) 단계에서 얻어진 시료의 암 유전자 돌연변이 발현 수준과, 상기 (c) 단계에서 얻어진 교모세포종 조직의 유전자 돌연변이 발현 수준을 비교하는 단계를 포함하는, 교모세포종의 조직 기원을 예측하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체 예에서 상기 교모세포종의 조직 기원을 예측하는 방법은 IDH-정상 교모세포종의 조직 기원을 예측하는 방법일 수 있다. 바람직하게는 상기 IDH-정상 교모세포종은 뇌실하 영역의 돌연변이 유전자로부터 기원된 IDH-정상 교모세포종 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
단, 본 발명에 있어서 상기 "암 유전자(oncogene)"란, 세포에 암을 유발시키는 능력을 가진 유전자를 일컫는 말을 의미한다. 상기 암 유전자는 정상적인 세포에도 존재하며 세포의 증식, 분열의 제어와 분화 및 발생 등의 기능에 중요한 작용을 하는 것으로 알려져 있으며 발암물질 또는 방사선 작용에 의하여 돌연변이를 일으켜 암 유전자로서 활성화되면 보통 때와는 다른 단백질을 생성하고 그것이 계기가 되어 암화 과정으로 진전되는 것으로 여겨지고 있다(The World of the Cell, Becker, W.M., et al., 7th ed. San Francisco, CA; 2009.).
바람직하게는 상기 암 유전자는 TERT(Telomerase reverse transcriptase) C228T, TERT C250T, EGFR(Epidermal growth factor receptor), PTEN(Phosphatase and tensin homolog), Rb1(Retinoblastoma 1), PDGFRA(Platelet-derived growth factor receptor alpha) 및 TP53(Tumor protein p53)으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
여기서, 상기 "TERT C228T 및 TERT C250T"란, 멜라노마-프론(melanoma-prone) 패밀리에서 TERT(telomerase reverse transcriptase) 유전자의 프로모터 부위에 발생한 돌연변이로, 특히 TERT 유전자의 프로모터의 체세포 돌연변이가 높은 빈도로 관찰되는 부분인 C228T 및 C250T를 의미한다(Science 339(6122): 959-9).
본 발명에서 있어서 상기 개체로부터 얻어진 “시료” 란, 본 발명에 따른 상기 유전자의 돌연변이의 존재 또는 차이가 존재하는 조직, 세포, 혈액, 혈청 또는 혈장과 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 발명에서 상기 목적하는 개체로부터 얻어진 생물학적 시료에서 유전자를 분리하는 과정은 공지의 과정을 통하여 수행될 수 있다. 본 발명의 목적상 상기 시료는 뇌실하 영역(subventricular zone)으로부터 분리된 것일 수 있으며, 상기 교모세포종 조직은 뇌실하 영역 이외의 뇌 척수조직 또는 상기 뇌척수조직을 싸고있는 막 영역으로부터 분리된 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 교모세포종 조직은 뇌실하 영역의 교모세포종이 발생되지 않은 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
여기서, 상기 “뇌실하 영역(subventricular zone)”이란, 측뇌실(lateral ventricle)의 측벽(lateral wall)에 뇌실막층과 거의 맞닿은 곳에 위치하는 영역으로, 증식하는 세포들은 뇌실하 영역에 많이 모여 있을 뿐만 아니라, 다양한 성숙단계에 있는 다양한 종류의 신경계열 세포들로 구성되어 있다는 특징이 있다.
또한, 본 발명에 있어서 “유전자 돌연변이 발현 수준 측정" 이란, 본 발명에 따른 교모세포종의 조직 기원을 예측하는 방법 및/또는 교모세포종 진단을 위한 정보를 제공하기 위하여 상기 시료에 포함되어 있는 표적 유전자의 돌연변이 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정일 수 있다.
본 발명의 일 구체 예에서, 상기 유전자 돌연변이 발현 수준을 측정하는 방법은 TERT C228T, TERT C250T, EGFR, PTEN, PDGFRA 및 TP53으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 1종 이상의 유전자 복제수 변이(copy number variation; CNV)를 정상 대조군과 비교하는 것일 수 있다. 바람직하게는 EGFR 유전자의 복제수 변이가 정상 대조군에 비하여 증가하거나, PTEN 또는 TP53 유전자 중 어느 하나 이상의 복제수 변이가 정상 대조군에 비하여 감소하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 더욱 바람직하게는, 상기 복제수 변이 분석은 상기 유전자에 특이적인 프라이머(primer)를 이용하는 분석일 수 있다.
또한, 상기 복제수 변이 분석에 사용되는 프라이머는, 바람직하게는 상기 TERT 돌연변이 유전자에 특이적인 프라이머는 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머일 수 있고, 상기 EGFR 돌연변이 유전자에 특이적인 프라이머는 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머일 수 있으며, 상기 PTEN 돌연변이 유전자에 특이적인 프라이머는 서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머일 수 있고, 상기 TP53 돌연변이 유전자에 특이적인 프라이머는 서열번호 7의 정방향 프라이머 및 서열번호 8의 역방향 프라이머일 수 있고, 상기 PDGFRA 돌연변이 유전자에 특이적인 프라이머는 서열번호 9의 정방향 프라이머 및 서열번호 10의 역방향 프라이머일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
단, 본 발명에 있어서 상기 “복제수 변이(copy number variation; CNV)” 란, 유전체에서의 구조적 변이의 한 형태로, 1Kb 이상의 DNA 절편의 증폭(amplification) 또는 결실(deletion)을 가리킨다.
본 발명의 다른 구체 예에서, 목적하는 개체로부터 분리된 시료 및/또는 교모세포종 조직으로부터 분리된 시료로부터 TERT C228T, TERT C250T, EGFR, PTEN, Rb1, PDGFRA 및 TP53으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 1종 이상의 유전자 돌연변이 발현 수준을 측정하는 단계는 DNA-서열(DNA-sequencing) 분석, 마이크로 어레이 칩, RNA-서열(RNA-sequencing)분석, N-카운터(nCounter)분석, FISH(fluorescence in situ hybridization) 분석으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나에 의해 수행될 수 있다.
본 발명에서 상기 (d) 단계 시, 상기 시료에서 돌연변이가 발생한 유전자의 종류와 교모세포종에서 돌연변이가 발생한 유전자의 종류를 대비할 수 있다. 바람직하게는 시료로부터 TERT C228T, TERT C250T, EGFR, PTEN, Rb1, PDGFRA 및 TP53 중 돌연변이가 발생된 유전자의 종류와, 교모세포종으로부터 TERT C228T, TERT C250T, EGFR, PTEN, Rb1, PDGFRA 및 TP53 중 돌연변이가 발생된 유전자를 대비할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 (d) 단계에 후속적으로, 상기 (b) 단계에서 얻어진 시료의 유전자 돌연변이와, 상기 (c) 단계에서 얻어진 교모세포종 조직의 유전자 돌연변이 중 어느 하나 이상이 일치하는 경우 교모세포종이 목적하는 개체의 시료가 분리된 영역에서 유래한 것으로 판단하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기와 같이 돌연변이 유전자 중 어느 하나 이상이 일치하는 경우는 일반적인 뇌조직에서 발생하는 경우에 해당하지 않기 때문에, 교모세포종 유발 돌연변이를 가진 조직 기원이 뇌하실하 영역으로부터 유래된 것으로 예측할 수 있다.
본 발명의 다른 구현 예에서, (a) 목적하는 개체로부터 분리된 시료를 분리하는 단계; 및 (b) 상기 시료로부터 암 유전자 돌연변이의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 교모세포종 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. 바람직하게는 상기 (b) 단계에 후속적으로 (a) 단계에서 측정된 시료의 돌연변이 유전자의 발현 수준을 측정하여 정상 대조군과 비교하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서는, 본 발명의 목적상 본 발명에 따른 교모세포종의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법은 IDH-정상 교모세포종의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법일 수 있다. 바람직하게는 상기 IDH-정상 교모세포종은 뇌실하 영역의 돌연변이 유전자로부터 기원된 IDH-정상 교모세포종 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 바람직하게는 상기 암 유전자는 TERT(Telomerase reverse transcriptase) C228T, TERT C250T, EGFR(Epidermal growth factor receptor), PTEN(Phosphatase and tensin homolog), Rb1(Retinoblastoma 1), PDGFRA(Platelet-derived growth factor receptor alpha) 및 TP53(Tumor protein p53)으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
단, 본 발명에 있어서, 상기 "TERT C228T 및 TERT C250T"란, 멜라노마-프론(melanoma-prone) 패밀리에서 TERT(telomerase reverse transcriptase) 유전자의 프로모터 부위에 발생한 돌연변이로, 특히 TERT 유전자의 프로모터의 체세포 돌연변이가 높은 빈도로 관찰되는 부분인 C228T 및 C250T를 의미한다(Science 339(6122): 959-9).
본 발명에서 있어서 상기 개체로부터 얻어진 “생물학적 시료” 란, 본 발명에 따른 상기 유전자의 돌연변이의 존재 또는 차이가 존재하는 조직, 세포, 혈액, 혈청 또는 혈장과 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 발명에서 상기 목적하는 개체로부터 얻어진 생물학적 시료에서 유전자를 분리하는 과정은 공지의 과정을 통하여 수행될 수 있다. 본 발명의 목적상 상기 생물학적 시료는 뇌실하 영역(subventricular zone)으로부터 분리된 것일 수 있다.
여기서, 상기 “뇌실하 영역(subventricular zone)”이란, 측뇌실(lateral ventricle)의 측벽(lateral wall)에 뇌실막층과 거의 맞닿은 곳에 위치하는 영역으로, 증식하는 세포들은 뇌실하 영역에 많이 모여 있을 뿐만 아니라, 다양한 성숙단계에 있는 다양한 종류의 신경 계열 세포들로 구성되어 있다는 특징이 있다.
또한, 본 발명에 있어서 “유전자 돌연변이 발현 수준 측정" 이란, 본 발명에 따른 교모세포종 진단을 위한 정보를 제공하기 위하여 상기 시료에 포함되어 있는 표적 유전자의 돌연변이 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정일 수 있다.
본 발명의 일 구체 예에서, 상기 암 유전자 돌연변이 발현 수준을 측정하는 방법은 TERT C228T, TERT C250T, EGFR, PTEN, PDGFRA 및 TP53으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 1종 이상의 유전자 복제수 변이(copy number variation; CNV)를 정상 대조군과 비교하는 것일 수 있다. 바람직하게는 EGFR 및 PDGFRA 유전자의 복제수 변이가 정상 대조군에 비하여 증가하거나, PTEN 또는 TP53 유전자 중 어느 하나 이상의 복제수 변이가 정상 대조군에 비하여 감소하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는, 상기 복제수 변이 분석은 상기 유전자에 특이적인 프라이머(primer)를 이용하는 분석일 수 있다.
또한, 상기 복제수 변이 분석에 사용되는 프라이머는, 바람직하게는 상기 TERT 돌연변이 유전자에 특이적인 프라이머는 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머일 수 있고, 상기 EGFR 돌연변이 유전자에 특이적인 프라이머는 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머일 수 있으며, 상기 PTEN 돌연변이 유전자에 특이적인 프라이머는 서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머일 수 있고, 상기 TP53 돌연변이 유전자에 특이적인 프라이머는 서열번호 7의 정방향 프라이머 및 서열번호 8의 역방향 프라이머일 수 있고, 상기 PDGFRA 돌연변이 유전자에 특이적인 프라이머는 서열번호 9의 정방향 프라이머 및 서열번호 10의 역방향 프라이머일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
단, 본 발명에 있어서 상기 “복제수 변이(copy number variation; CNV)” 란, 유전체에서의 구조적 변이의 한 형태로, 1Kb 이상의 DNA 절편의 증폭(amplification) 또는 결실(deletion)을 가리킨다.
본 발명의 다른 구체 예에서, 목적하는 개체로부터 분리된 시료로부터 TERT C228T, TERT C250T, EGFR, PTEN, Rb1, PDGFRA 및 TP53으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 1종 이상의 유전자 돌연변이 발현 수준을 측정하는 단계는 DNA-서열(DNA-sequencing) 분석, 마이크로 어레이 칩, RNA-서열(RNA-sequencing)분석, N-카운터(nCounter)분석, FISH(fluorescence in situ hybridization) 분석으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 상기 "마이크로 어레이"란, 기판상에 올리고뉴클레오티드 그룹이 높은 밀도로 고정화되어 있는 것으로서, 상기 올리고뉴클레오티드 그룹은 각각 일정한 영역에 고정화되어 있는 마이크로어레이를 의미한다. 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 기판은 유리, 막(membrane), 슬라이드, 필터, 칩, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함한다. 본 발명의 유전자와 결합할 수 있는 DNA 앱타머는 상기 기판상에 배열되고 고정화될 수 있다. 상기와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV 등과 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시된다. 예를 들어, DNA 올리고뉴클레오타이드는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 유리 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV 등에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 DNA 올리고뉴클레오타이드는 링커를 통해 기판에 결합될 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 “프라이머(primer)”란, 짧은 자유 3말단 수산화기(Free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(Template)와 염기쌍(Base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 상기 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 바람직하게는, 발명에서 마이크로 RNA 폴리뉴클레오타이드의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 생성물의 생성 여부를 통해 질병의 발병 여부를 예측할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에서, 인간을 제외한 대상체의 뇌실하 영역에 돌연변이 유전자를 주입하는 단계를 포함하는 교모세포종화 동물 모델의 제조방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 돌연변이 유전자는 TERT(Telomerase reverse transcriptase) C228T, TERT C250T, EGFR(Epidermal growth factor receptor), PTEN(Phosphatase and tensin homolog), Rb1(Retinoblastoma 1), PDGFRA(Platelet-derived growth factor receptor alpha) 및 TP53(Tumor protein p53)으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 1종 이상의 유전자 돌연변이일 수 있다.
본 발명의 일 구체 예에서, 상기 돌연변이 유전자를 포함시키는 단계는 상기 돌연변이 유전자를 뇌실하 영역에 직접 주입하는 방법일 수 있다. 구체적으로, 상기 돌연변이 유전자를 뇌실하 영역에 직접 주입하는 방법은 모세관 주사기 등을 이용하여 뇌실하 영역에 주입한 뒤, 전기청공법을 이용하여 세포 내 삽입을 유도하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구체 예에서, 본 발명에 따른 교모세포종화 동물 모델은 교모세포종화 동물 모델의 제조방법일 수 있다. 본 발명에 따른 동물 모델은 교모세포종의 표적화된 치료 및/또는 예방용 후보물질 스크리닝 방법 또는 발생 과정에 대한 연구를 수행하는데 효과적으로 이용될 수 있다는 장점이 있다.
본 발명에 있어서 상기 "인간을 제외한 대상체"란, 교모세포종이 유발될 수 있는 인간을 제외한 동물을 의미한다. 바람직하게는, 마우스, 랫드, 토끼, 개 및 기니피그로부터 선택되는 적어도 1종 이상의 동물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현 예에서, 인간을 제외한 대상체의 뇌실하 영역에 돌연변이 유전자가 포함된 교모세포종화 동물 모델을 제공한다. 바람직하게는, 상기 돌연변이 유전자는 TERT(Telomerase reverse transcriptase) C228T, TERT C250T, EGFR(Epidermal growth factor receptor), PTEN(Phosphatase and tensin homolog), Rb1(Retinoblastoma 1), PDGFRA(Platelet-derived growth factor receptor alpha) 및 TP53(Tumor protein p53)으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 1종 이상의 유전자 돌연변이일 수 있다.
본 발명의 일 구체 예에서, 본 발명에 따른 교모세포종화 동물 모델은 교모세포종화 동물 모델일 수 있다. 본 발명에 따른 동물 모델은 교모세포종의 표적화된 치료 및/또는 예방용 후보물질 스크리닝 방법 또는 발생 과정에 대한 연구를 수행하는데 효과적으로 이용될 수 있다는 장점이 있다.
본 발명에 있어서 상기 "인간을 제외한 대상체"란, 교모세포종이 유발될 수 있는 인간을 제외한 동물을 의미하며, 바람직하게는, 마우스, 랫드, 토끼, 개 및 기니피그로부터 선택되는 적어도 1종 이상의 동물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 뇌실하 영역(Subventricular Zone; SVZ)의 암 유전자 돌연변이의 발현 수준을 측정하는 것을 통해 IDH-정상 교모세포종의 조직 기원을 예측하여 상기 교모세포종에대한 적절한 치료 전략 수립을 가능하게 할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 뇌실하 영역의 암 유전자 돌연변이를 포함하는 동물 모델을 통하여 교모세포종 환자의 발생 원인, 치료 및 예방 방법에대한 연구를 수행하여 교모세포종을 극복할 수 있는 연구 기반을 제시할 수 있다.
도 1의 (a) 내지 (c)는 본 발명의 일 실시예에 따른 genomic DNA의 돌연변이 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 TERT 유전자의 돌연변이에 대한 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자 복제수 변이(copy number variation; CNV)에 대한 결과를 나타낸 것이다.
도 4의 (a) 내지 (c)는 본 발명의 일 실시예에 따른 동물 모델의 종양 발달 과정에 대한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 TERT 유전자의 돌연변이에 대한 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자 복제수 변이(copy number variation; CNV)에 대한 결과를 나타낸 것이다.
도 4의 (a) 내지 (c)는 본 발명의 일 실시예에 따른 동물 모델의 종양 발달 과정에 대한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
[
실시예
]
[
실시예
1]
교모세포종 환자 분석 시료 준비
세브란스 병원의 악성 교모세포종 환자(표 1)에 대한 치료적 수술 과정에서 적출된 종양, 뇌실하 영역(subventricular zone) 및 정상 대조군에 해당하는 정상 뇌 실질 또는 혈액을 냉동 보관한 뒤, 상기 냉동 보관된 샘플로부터 Qiamp mini DNA 키트(Qiagen, USA) 를 사용하여 제조사에서 제공하는 프로토콜에 의해 genomic DNA를 추출하였다.
| NO. | 성별 | 나이 | 샘플 위치 | 병리 | 종양 위치 | IDH1 돌연변이 |
EGFR | 아형 (microarray) |
|
| 실 험 군 |
26 | F | 70 | 뇌실 | 종양 없음 | ||||
| 종양 | 교모세포종 | 측두엽 | - | 3+ | proneuronal | ||||
| 27 | M | 61 | 뇌실 | 저급 교모세포종 | |||||
| 종양 | 교모세포종 | 측두엽 | - | 2+ | - | ||||
| 37 | M | 53 | 뇌실 | 종양 없음 | |||||
| 종양 | 교모세포종 | 측두엽 | - | 3+ | classic | ||||
| 52 | M | 44 | 뇌실 | 종양 없음 | |||||
| 종양 | 교모세포종 | 측두엽 | - | 3+ | neural | ||||
| 187 | M | 67 | 뇌실 | 종양 없음 | |||||
| 종양 | 교모세포종 | 측두엽 | - | 3+ | proneuronal | ||||
| 158 | M | 55 | 뇌실 | 종양 없음 | |||||
| 종양 | 교모세포종 | 측두엽 | - | 2+ | - | ||||
| 245 | M | 73 | 뇌실 | 종양 없음 | |||||
| 종양 | 교모세포종 | 측두엽 | - | 1+ | proneuronal | ||||
| 253 | F | 65 | 뇌실 | 종양 없음 | |||||
| 종양 | 교모세포종 | 측두엽 | - | 0+ | |||||
| 260 | M | 46 | 뇌실 | 종양 없음 | |||||
| 종양 | 교모세포종 | 측두엽 | - | 3+ | - | ||||
| 276 | M | 60 | 뇌실 | 종양 없음 | |||||
| 종양 | 교모세포종 | 후두부 | - | - | mesenchymal | ||||
| 342 | F | 75 | 뇌실 | 저급 교모세포종 | |||||
| 종양 | 교모세포종 | 정면 신경절 | - | - | - | ||||
| 346 | M | 75 | 뇌실 | 저급 교모세포종 | |||||
| 종양 | 교모세포종 | 측두엽 | - | - | - | ||||
| 양성 대조군(뇌실하 영역으로 전이) |
146 | M | 65 | 뇌실 | 교모세포종 | ||||
| 종양 | 교모세포종 | proneuronal | |||||||
| 179 | M | 42 | 뇌실 | 교모세포종 | |||||
| 종양 | 교모세포종 | ||||||||
| 음성 대조군 |
160 | M | 50 | 뇌실 | 종양 없음 | ||||
| 종양 | 교모세포종 | + | neural | ||||||
| 246 | F | 34 | 뇌실 | 종양 없음 | |||||
| 종양 | 뇌수막종 | ||||||||
| 251 | M | 39 | 뇌실 | 종양 없음 | |||||
| 종양 | 악성 뇌교종 | ||||||||
| 344 | M | 60 | 뇌실 | 종양 없음 | |||||
| 종양 | 폐암으로부터 전이 |
[
실시예
2]
뇌실하
영역의 유전자 서열 삽입 및 결실 확인
2-1.
엑솜
-서열(
Exome
-
sequencing
) 분석
상기 실시예 1의 방법에 의해 얻은 IDH-정상 교모세포종(IDH-wild type GBM W/GBM-free SVZ), IDH-돌연변이 교모세포종(IDH-mutant GBM), 뇌수막종(Meningioma) 및 뇌실하 영역으로의 침습(invasion)이 일어난 교모세포종(GBM invasion to subventricle)의 genomic DNA에서 뇌실하 영역의 유전자 돌연변이를 확인하기 위하여, 전체 엑솜 염기서열 분석을 진행 하였다.
엑솜-서열 분석 방법은 genomic DNA 라이브러리를 생성하고, Illumina HiSeq 2000 instrument을 통해 Agilent library preparation protocols (Agilent Human All Exon 50 Mb kit)에 따라서 paired-end read를 서열 분석 하였다. 상기 평균 read 깊이(depth)는 300x로 하여, 두개의 fastq 파일을 병합한 후 Broad Institute의 “Best Practices” 진행방식에 따라 분석을 위한 bam 파일을 생성하였다.
2-2. 체세포 돌연변이(
somatic
mutation
) 분석
상기 실시예 2-1에 의해 정렬된 서열의 체세포 돌연변이인 삽입 및 결실(Insertion 및 Deletion; 이하 'Indel'이라 함.) 콜링(Calling) 파이프라인은 GATK를 사용하였고, 상기 정렬 결과 얻은 bam 파일로부터 돌연변이 콜링(Calling)은 Strelka tool (https :// sites . google .com/ site / strelkasomaticvariantcaller /)을 이용하여 분석하였다.
상기 과정을 통해 콜링된 read 중 최소 20개의 read를 갖고, 종양은 대립형질(allele) 빈도가 최소 3%에 해당하는 경우 또는 변이체 read가 15 이상인 경우만 선별하였다. 또한, 정상의 경우 대립형질(allele) 빈도가 최대 3%에 해당하는 경우만을 선별하였다.
상기 돌연변이는 미스센스(Missense), 넌센스(Nonsense), UTR, 스플라이싱(splicing) 지역 및 침묵 돌연변이의 돌연변이에 해당하는 경우를 포함하도록 분석하였다.
또한, 상기 결과로부터 얻은 돌연변이에 대한 정보를 Broad Institute 의 Oncotator(http://www.broadinstitute.org/oncotator/)를 통하여 명칭을 붙인 뒤, 상기 종양 조직 및 뇌실하조직의 체세포 돌연변이 사이에서 일치하는 돌연변이의 비율과 분포를 정리하여, 그 결과를 도 1의 (a) 내지 (c)나타내었다.
도 1의 (a)에서 보는 바와 같이, 대조군에 해당하는 뇌수막종(meningioma) 및 IDH-돌연변이 교모세포종의 경우에는 체세포 돌연변이 비율의 공유가 현저히 적은 반면, 뇌실하 영역에 교모세포종이 없는 IDH-정상 교모세포종(실험군)의 경우에는 종양과 뇌실하 영역의 체세포 돌연변이 비율이 26,27,52,187 및 245번 환자에서 높은 수준으로 일치하는 것을 확인할 수 있었다. 단, 뇌실하 영역으로 종양의 침습이 일어난 경우(GBM invasion to subventricle)에는 하나의 종양 클론에서 유래된 것에 해당하므로, 대부분의 체세포 돌연변이가 공유되는 것을 알 수 있었다. 상기와 같이 뇌실하 영역으로 교모세포종이 침습하지 않은 IDH-정상 교모세포종의 경우, 뇌실하 영역과 IDH-정상 교모세포종의 종양이 동일한 체세포 돌연변이를 갖고 있다는 결과로부터 IDH-정상 교모세포종의 종양이 뇌실하 영역으로부터 기인한 것임을 알 수 있다.
또한, 도 1의 (b)는 종양의 돌연변이 및 뇌실하 영역의 돌연변이 빈도 및 유전자를 그래프로, 뇌실하 영역의 교모세포종이 없는 IDH-정상 교모세포종(실험군)의 경우에는 PTEN 미스센스 돌연변이, TP53 넌센스 돌연변이, EGFR 미스센스 돌연변이, Rb1의 K202 프레임 시프트(frame shift) 돌연변이 및 TP53 스플라이스 사이트와 같은 체세포 돌연변이 유전자 비율이 종양에 가까울 수록 증가하였다. 반면에, 대조군에 해당하는 뇌수막종 및 IDH-돌연변이 교모세포종의 경우에는 종양 유발 돌연변이가 종양조직에만 존재하였다. 상기한 바와 같이 IDH-정상 교모세포종의 종양 유발 돌연변이가 뇌실하 영역 및 종양 간에 공유된 결과로부터, IDH-정상 교모세포종의 종양 유발 돌연변이를 가진 조상 세포가 뇌실하 영역으로부터 기원한 것을 알 수 있다.
또한, 도 1의 (c)에서 보는 바와 같이, 뇌실하 영역의 교모세포종이 없는 IDH-정상 교모세포종(실험군)의 경우에는 공유되어 있는 돌연변이 유전자의 비율이 뇌실하 영역에서 종양으로 가면서 증가하는 반면, 대조군에 해당하는 뇌수막종 및 IDH-돌연변이 교모세포종의 경우에는 공유된 돌연변이 유전자 비율이 종양보다 뇌실하영역에서 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 상기한 결과를 통하여, IDH-정상 교모세포종은 뇌실하영역에서부터 그 종양이 유래되어 발전되는 것을 알 수 있다.
[
실시예
3]
TERT
유전자 돌연변이 확인
교모세포종 환자에서 흔히 발견되는 TERT의 C228T 및 C250T 유전자 돌연변이를 확인하기 위하여 아래의 과정을 서열분석을 수행하였다.
상기 실시예 1에서 얻은 genomic DNA를 이용하여, 서열번호 1 및 2에 해당하는 프라이머를 이용하여 high-fidelity PrimeSTAR GXL DNA polymerase (Takara, Japan)에 의한 유전자 증폭(PCR)을 제조사의 프로토콜에 따라 수행하였다. 상기 증폭된 유전자는 MEGAquick spin total fragment DNA purification kit (Intron, Korea)를 이용하여 상기 프라이머에 의해 증폭된 DNA를 정제하여 TERT 유전자 돌연변이 여부를 분석하여, 도 2의 (a) 및 (b)에 나타내었다.
도 2의 (a) 및 (b)에서 보는 바와 같이, TERT 유전자의 C228T 및 C250T 종양간의 유전자 돌연변이가 IDH-정상 교모세포종과 뇌실하 영역에서 공유되어 있음을 확인하였고, 그 돌연변이 비율이 뇌실하 영역에서 종양으로 갈수록 증가되는 것을 확인하였다.
상기 결과를 통하여, 종양에서 발견되는 TERT 유전자 돌연변이가 뇌실하 영역으로부터 기원하는 것을 알 수 있다.
[
실시예
4]
유전자
복제수
변이(
copy
number
variation
;
CNV
) 확인
상기 실시예 2에서 발견된 EGFR, PTEN 및 TP53 유전자의 유전자 복제수 변이 가 IDH-정상 교모세포종 및 뇌실하 영역에서 공유되고 있는지 확인을 위하여 실시간 중합효소 연쇄반응(real time PCR)을 수행하였다. 구체적인 방법은 하기와 같다.
상기 EGFR, PTEN, PDGFRA 및 TP53 유전자에 상보적인 프라이머(서열번호 3 내지 10)와 nano-drop을 이용하여 정량화된 상기 실시예 1에서 얻은 genomic DNA를 각각 혼합한 뒤, SYBR Green Real-Time PCR Master Mixes (Thermo Scientific, USA)을 이용하여 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time PCR)을 수행하였다. 구체적인 반응 조건은 95℃에서 10분간 변성시킨 후, 95℃에서 20초, 59℃에서 30초씩 40 사이클을 반응시켜 얻은 정량적인 결과를, 도 3에 나타내었다.
도 3에서 보는 바와 같이, EGFR의 경우 26,52, 276 및 245 환자에서, 정상 조직에서 추출한 genomic DNA에 비하여 IDH-정상 교모세포종 및 뇌실하 영역의 돌연변이인 EGFR의 증폭(amplification)에 의해 증가된 것을 확인할 수 있었고, 245번 환자에서 IDH-정상 교모세포종 및 뇌실하 영역의 PDGFRA의 증폭 돌연변이가 증가된 것 역시 확인할 수 있었다. 또한, 26, 27, 158, 187, 253 및 245 환자에서, 정상 조직에서 추출한 genomic DNA에 비하여 IDH-정상 교모세포종 및 뇌실하 영역의 돌연변이인 TP53의 결실(deletion)에 의해 감소된 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과를 통하여, TP53, PDGFRA 및 EGFR의 유전자 복제수 변이 역시 IDH-정상 교모종세포와 뇌실하 영역 간에 공유되고 있음을 알 수 있다.
[
실시예
5]
뇌실하
영역의 돌연변이 벡터가 삽입된 동물 모델 제작
5-1. 돌연변이 유전자 벡터 제작
뇌실하 영역의 TPEN 및 TP53 돌연변이 유전자 주입을 위하여, pU6-(BbsI)_CBh-Cas9-T2A-BFP 플라스미드(a gift from Ralf Kuehn, Addgene plasmid # 64323)에 Bbsl 부분의 제한효소로 절단한 후, 녹 아웃(Knock-out) 시키려는 유전자에 상보적 서열에 해당하는 단일 가이드 RNA(single guide RNA; sgRNA) 서열을 결합(ligase)하는 과정을 통하여 돌연변이를 발생시킬 수 있는 단일 가이드 RNA(sgRNA)가 삽입되어 있는 재조합 벡터를 제작하였다. 상기 재조합 벡터의 T2A-BFP 부분을 HindIII와 EcoRI 제한효소로 절단한 후 P2A-Cre 서열을 삽입하여 Cre 재조합효소(recombinase)가 발현되도록 하는 재조합 벡터를 제작하였다.
PTEN 단일 가이드 RNA 서열은 서열번호 11번, TP53 단일 가이드 RNA 서열은 서열번호 12번 및 대조군에 해당하는 LacZ를 표적하는 단일 가이드 RNA 서열은 서열번호 13번으로 표시되는 RNA를 사용하였다.
5-2. 돌연변이 유전자 벡터의 삽입
뇌실하 영역의 돌연변이 동물의 제작을 위해 사용된 동물 모델은 EGFR의 활성 돌연변이 모델을 위하여 Cre 재조합 효소가 발현되는 세포에서만 EGFR 변이체(variant) ⅲ를 발현시키는 쥐인 Cre-의존적 EGFR 변이체(variant) ⅲ 발현 쥐(Cre-dependent EGFR variant iii expressing mouse)를 사용하였다. 또한, Cre 재조합 효소가 발현되는 세포에서만 형광단백질인 tdTomato가 발현되는 Cre-의존적 tdTomato 쥐(Cre-dependent tdTomato mouse)를 사용하였다. 상기 각각의 쥐에 대하여 상기 실시예 5-1에서 제작된 돌연변이 유전자 벡터 삽입 수술 과정은 하기와 같다.
상기 쥐를 저온에 노출시켜 발 자극이 없음을 확인한 뒤, 모세관 주사기를 통하여 뇌실하 영역에 증류수와 함께 녹인 상기 실시예 5-1의 각각의 유전자를 주입하였다. 그 뒤, 전기천공법(electroporation) 을 통하여 유전자가 세포에 삽입될 수 있도록 하였다. 상기 과정은 실험 동물이 마취에서 회복 되기 전인 5분 내에 완료될 수 있도록 하였다. 상기 수술이 끝난 뒤 37℃ 보온 수술포에서 상기 각각의 벡터가 삽입된 쥐를 완전히 회복시킨 뒤, 케이지로 복귀시키는 과정을 통하여 뇌실하 영역의 돌연변이 동물 모델을 제작하였다.
5-3. 돌연변이 유전자 벡터의 삽입 후 교모세포종 발생 관찰
상기 실시예 5-2에 의해 제작된 동물 모델의 교모세포종 발생을 관찰하기 위하여 형광현미경으로 상기 동물 모델의 세포 이동을 관찰하였다.
도 4의 (a)에서 보는 바와 같이, tdTomato 리포터를 발현 중인 세포들이 수술 후 22일(POD22)부터 35일(POD35)까지 뇌실하 영역으로부터 뇌 피질로의 이동이 증가하는 것을 관찰할 수 있었다.
또한, 도 4의 (b)에서 보는 바와 같이, 상기 벡터를 삽입한지 10주가 지난 시점에서 상기 동물 모델은 뇌종양이 발생되는 것을 확인할 수 있었다. 형광 현미경 관찰 결과 tdTomato 리포터의 발색이 뇌종양이 발생된 위치와 일치하는 것을 통하여, 상기 뇌종양이 뇌실하 영역에 삽입된 돌연변이 유전자에 의해 발생되었음을 알 수 있었다.
상기 결과를 이상에서 본 발명에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고, 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능하다는 것은 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게는 자명할 것이다.
<110> YEONSEI
KAIST
<120> PREDICTION METHOD FOR USING TISSUE ORIGIN OF GLIBLASTOMA
DETECTING GENITIC MUTATION AND ANIMAL MODEL FOR GLIBLASTOMA
<130> DPB162516
<160> 13
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
agcacctcgc ggtagtgg 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
gtcctgcccc ttcacctt 18
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
cgtctcttgc cggaatgt 18
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 4
ggattaaaga aataacctcc taccc 25
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 5
cagacttgac aggtttgttc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 6
tccagtcact acccctgagc 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 7
ttatggcggg aggtagactg 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 8
aaagcattgg tcagggaaaa 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 9
cctacccacc tcccaggata 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 10
cgcctctgat gcacactaaa 20
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 11
ggttggtcaa gatcttcaca ga 22
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 12
ggtgtaatag ctcctgcatg g 21
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 13
cgtctcttgc cggaatgt 18
Claims (26)
- (a) 시험관(in vitro)에서, 목적하는 개체의 뇌실하 영역(subventricular zone) 조직으로부터 TERT(Telomerase reverse transcriptase) C228T; TERT C250T; EGFR(Epidermal growth factor receptor) 및 PDGFRA(Platelet-derived growth factor receptor alpha)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상;으로 구성된 암 유전자 돌연변이의 발현 수준을 측정하는 단계;
(b) 시험관(in vitro)에서, 목적하는 개체의 IDH1 정상 교모세포종 조직으로부터 TERT C228T; TERT C250T; EGFR 및 PDGFRA으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상;으로 구성된 암 유전자 돌연변이의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(c) 상기 (a) 단계의 뇌실하 영역 조직과 상기 (b) 단계의 IDH1 정상 교모세포종 조직이 TERT C228T 및 TERT C250T 돌연변이를 공유하고, 상기 (a) 단계의 뇌실하 영역 조직과 상기 (b) 단계의 IDH1 정상 교모세포종 조직 모두에서 EGFR 및 PDGFRA 중 1종 이상의 유전자의 복제수 변이가 정상 대조군에 비하여 증가한 경우, 상기 IDH1 정상 교모세포종 조직은 뇌실하 영역에서 발생된 것으로 예측하는, IDH1 정상 교모세포종의 조직 기원을 예측하는 방법. - 제 1항에 있어서,
상기 (a) 단계의 뇌실하 영역 조직과 상기 (b) 단계의 IDH1 정상 교모세포종 조직으로부터 Rb1(Retinoblastoma 1) 돌연변이의 발현 수준을 측정하는 단계를 더 포함하는, IDH1 정상 교모세포종의 조직 기원을 예측하는 방법. - 제 2항에 있어서,
상기 (a) 단계의 뇌실하 영역 조직과 상기 (b) 단계의 IDH1 정상 교모세포종 조직 모두에서 Rb1(Retinoblastoma 1) 돌연변이가 발현되는 경우, 상기 IDH1 정상 교모세포종 조직은 뇌실하 영역에서 발생된 것으로 예측하는, IDH1 정상 교모세포종의 조직 기원을 예측하는 방법. - 제 1항에 있어서,
상기 교모세포종 조직은 뇌실하 영역 이외의 뇌척수 조직 또는 상기 뇌척수 조직을 싸고 있는 막 영역으로부터 분리된 것인, IDH1 정상 교모세포종의 조직 기원을 예측하는 방법. - 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제 1항에 있어서,
상기 (a) 단계 및 (b) 단계에서 암 유전자 돌연변이 발현 수준은 DNA 서열(DNA-sequencing) 분석, RT-PCR, 마이크로어레이 칩, RNA 서열(RNA-sequencing) 분석, N-카운터 (nCounter) 분석, FISH (fluorescence in situ hybridization) 분석으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 방법에 의해 측정되는, IDH1 정상 교모세포종의 조직 기원을 예측하는 방법. - 제 1항에 있어서,
상기 EGFR 및 PDGFRA의 유전자 복제수 변이(copy number variation; CNV)의 분석은 상기 EGFR 및 PDGFRA에 특이적인 프라이머를 이용하여 수행되는 것인, IDH1 정상 교모세포종의 조직 기원을 예측하는 방법. - 제 9항에 있어서,
상기 EGFR 돌연변이 유전자에 특이적인 프라이머는 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머로 이루어지고, 상기 PDGFRA 돌연변이 유전자에 특이적인 프라이머는 서열번호 9의 정방향 프라이머 및 서열번호 10의 역방향 프라이머로 이루어지는, IDH1 정상 교모세포종의 조직 기원을 예측하는 방법. - (a) 시험관(in vitro)에서, 목적하는 개체의 뇌실하 영역(subventricular zone) 조직으로부터 TERT(Telomerase reverse transcriptase) C228T; TERT C250T; EGFR(Epidermal growth factor receptor) 및 PDGFRA(Platelet-derived growth factor receptor alpha)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상;으로 구성된 암 유전자 돌연변이의 발현 수준을 측정하는 단계;
(b) 시험관(in vitro)에서, 목적하는 개체의 교모세포종 조직으로부터 TERT C228T; TERT C250T; EGFR 및 PDGFRA으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상;으로 구성된 암 유전자 돌연변이의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(c) 상기 (a) 단계의 뇌실하 영역 조직과 상기 (b) 단계의 교모세포종 조직이 TERT C228T 및 TERT C250T 돌연변이를 공유하고, 상기 (a) 단계의 뇌실하 영역 조직과 상기 (b) 단계의 교모세포종 조직 모두에서 EGFR 및 PDGFRA 중 1종 이상의 유전자의 복제수 변이가 정상 대조군에 비하여 증가한 경우, 상기 교모세포종 조직은 뇌실하 영역에서 발생된 IDH1 교모세포종인 것으로 예측하는, 교모세포종 진단을 위한 정보를 제공하는 방법. - 제 11항에 있어서,
상기 (a) 단계의 뇌실하 영역 조직과 상기 (b) 단계의 교모세포종 조직으로부터 Rb1(Retinoblastoma 1) 돌연변이의 발현 수준을 측정하는 단계를 더 포함하는, 교모세포종 진단을 위한 정보를 제공하는 방법. - 제 12항에 있어서,
상기 (a) 단계의 뇌실하 영역 조직과 상기 (b) 단계의 교모세포종 조직 모두에서 Rb1(Retinoblastoma 1) 돌연변이가 발현되는 경우, 상기 교모세포종은 뇌실하 영역에서 발생된 IDH1 교모세포종인 것으로 예측하는, 교모세포종 진단을 위한 정보를 제공하는 방법. - 삭제
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- 제 11항에 있어서,
상기 (a) 단계 및 (b) 단계에서 암 유전자 돌연변이 발현 수준은 DNA 서열(DNA-sequencing) 분석, RT-PCR, 마이크로어레이 칩, RNA 서열(RNA-sequencing) 분석, N-카운터 (nCounter) 분석, FISH (fluorescence in situ hybridization) 분석으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 방법에 의해 측정되는, 교모세포종 진단을 위한 정보를 제공하는 방법. - 제 11항에 있어서,
상기 EGFR 및 PDGFRA의 유전자 복제수 변이(copy number variation; CNV)의 분석은 상기 EGFR 및 PDGFRA에 특이적인 프라이머를 이용하여 수행되는 것인, 교모세포종 진단을 위한 정보를 제공하는 방법. - 제 21항에 있어서,
상기 EGFR 돌연변이 유전자에 특이적인 프라이머는 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머로 이루어지고, 상기 PDGFRA 돌연변이 유전자에 특이적인 프라이머는 서열번호 9의 정방향 프라이머 및 서열번호 10의 역방향 프라이머로 이루어지는, 교모세포종 진단을 위한 정보를 제공하는 방법. - 삭제
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