CN103439493A - 适配子渗滤式生物芯片及制备方法 - Google Patents
适配子渗滤式生物芯片及制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103439493A CN103439493A CN201310346599XA CN201310346599A CN103439493A CN 103439493 A CN103439493 A CN 103439493A CN 201310346599X A CN201310346599X A CN 201310346599XA CN 201310346599 A CN201310346599 A CN 201310346599A CN 103439493 A CN103439493 A CN 103439493A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- aptamer
- biochip
- preparation
- nitrocellulose filter
- dna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Abstract
本发明涉及一种适配子渗滤式生物芯片及制备方法。本发明在芯片外壳上设置窗口,在窗口下的芯片外壳内从上至下设置硝酸纤维素膜、反渗层、吸水层、防漏层;硝酸纤维素膜的表面固定有针对靶物质的适配子分子,适配子分子是RNA或者DNA或者是经过修饰的RNA或DNA。本发明克服了现有技术存在的检测范围受到限制、灵敏度不高、特异性不强、易变质、工艺复杂、反应时间长等缺陷。本发明通过SELEX筛选,从体外大量的单链寡核苷酸文库中筛选出与目标分子有特异性结合的DNA分子,再经过大量扩增得到适配子,且渗滤式生物芯片让待检测的样本快速通过硝酸纤维膜的微孔,其目标分子可迅速和膜上的适配子结合,大大缩短反应时间,而且敏感性和特异性更高。
Description
技术领域
本发明属于临床检测以及科学研究检测技术领域,特别涉及一种适配子渗滤式生物芯片及制备方法。
背景技术
适配子是上个世纪九十年代发展起来的一种新技术,是一种人工合成的单链DNA或者RNA,可以和特定的物质相结合。通常,适配子是通过多次的SELEX筛选技术筛选出,适合和各种分子进行特异性结合,例如小分子,蛋白质,核酸,甚至细胞,组织和微生物等,在生物研究和体外诊断以及治疗上有广阔的应用前景。相比抗体而言,适配子具有非常多的优点,例如适配子可以完全人工合成,成本低,另外适配子的筛选过程也比单克隆抗体制备快。核酸适配子的稳定性非常好,可以在常温条件下运输和保存很长时间,即使变性后也容易复性。适配子结合目标分子特异性非常高,可以提高检测结果的准确性。
上个世纪九十年代另一个突破性的发明是生物芯片。生物芯片是把生物分子固定在固相载体上,利用分子之间相互作用的原理,同时检测成千上万种生物分子,例如核酸,蛋白,糖,多肽等等。生物芯片的固相载体一般是玻璃片、硅片、凝胶、尼龙膜等。固定在载体上的分子可以是DNA,蛋白质,多肽,抗原等。待检测的物质和生物芯片上的分子结合后,再通过标记,转变成为信号由生物芯片识别仪进行分析,就可以得到大量数据。生物芯片作为生命科学研究和临床检测的有力工具,可以一次性得到大量的数据,而且准确性比以往的检测方法更高,操作更加简单,自动化程度更高。
在本发明之前,传统生物芯片包括基因芯片和蛋白芯片,也存在着明显的缺陷。基因芯片是将DNA探针固定在固相载体上,从而检测样品中的DNA含量。这种设计有几个缺点:1.被检测物质只能是核酸,限制了待检测物质的范围。2.由于探针一般为20个碱基左右,所以不能很好地和待检测的物质结合,因而灵敏度不高。3.特异性不强:DNA杂交的时候可能存在碱基错配的现象,因此基因芯片对于序列相近的DNA特异性不强。蛋白芯片是将抗原或抗体固定在载体上,这类芯片业也存在着问题:1.保存条件严格:由于固定在载体上的是蛋白质,因此容易变质。2.敏感性和特异性也容易受到抗原或者抗体纯度的影响。3.制备抗原或者抗体的工艺复杂,使得蛋白芯片应用受到限制。另外,传统的生物芯片需要待检测物质充分和载体上的探针结合,因而往往需要较长时间进行反应,难以满足临床上对样本大量检测的需要。
由于以上原因,使得传统生物芯片很难有进一步的发展。因此,为解决上述传统生物芯片的问题,新型生物芯片的研究显得十分迫切。
发明内容
本发明的目的就是克服上述缺陷,研制适配子渗滤式生物芯片。
本发明的技术方案如下:
适配子渗滤式生物芯片,包括芯片外壳,其主要技术特征在于在芯片外壳上设置窗口,在窗口下的芯片外壳内从上至下设置硝酸纤维素膜、反渗层、吸水层、防漏层;硝酸纤维素膜的表面固定有针对靶物质的适配子分子,适配子分子是RNA或者DNA或者是经过修饰的RNA或DNA。
本发明的另一技术方案是:
适配子渗滤式生物芯片的制备方法,其主要技术特征在于将适配子分子固定于硝酸纤维素膜上;适配子通过疏水性作用与硝酸纤维素膜进行物理性吸附,或者是标记生物素,透过分子间的疏水作用力、氢键以及静电作用力固定于硝酸纤维素膜,得适配子渗滤式生物芯片。
上述所称适配子分子是通过SELEX(Systematic Evolution of Ligands byExponential enrichment,是一种用来制造与目标分子具有高度亲和力之核酸分子的演化筛选技术)筛选出的特异性分子,经过扩增制备后,固定于硝酸纤维素膜上。
所述的适配子生物芯片在使用时,先将待检测物质加在硝酸纤维素膜上,再加入显色试剂和其他相应试剂,待反应后再将芯片放入配套的生物芯片识别仪中读取反应结果和数据,并进行分析从而得到检测结果。
所述的适配子检测的目标可以是核酸,蛋白,脂类,多糖,重金属离子,病毒,细胞混合物,有机小分子。
所述的适配子生物芯片,显色试剂在适配子渗滤式生物芯片检测反应中用于被检测物之后,用来显示免疫反应是否进行。显色试剂可以是标记的多抗,单抗,也可以是适配子。标记的方法可以是胶体金,酶,或者是荧光物质。
适配子生物芯片的检测方法,待检样本与生物芯片及配套试剂反应后,生物芯片上的生物信息被识别仪识别、读取,然后进行检测,其检测步骤包括仪器校正、套圈、生物芯片系数校正。
本发明的有益效果是:
适配子是通过SELEX筛选,从体外大量的单链寡核苷酸文库中筛选出与目标分子有特异性结合的DNA分子,再经过大量扩增得到适配子。适配子与目标分子具有高亲和力,甚至高于抗体。适配子制备不需要动物,制备过程简单,自动化程度高,价格低廉,稳定性好,没有毒性或者毒性很低。适配子在应用上有着抗体所没有的优势:1.亲和力和特异性高:通常适配子能够区分甲基或者羟基基团,这是一般抗体不能做到的。2.目标分子范围广泛:理论上说任何一种分子都能够筛选出相应的适配子。而抗体对一些小分子则无能为力。3.体外筛选方法成熟:目前基于SELEX的方法不断完善,筛选出适配子的周期越来越短。4.制备的适配子纯度高,批间差小,易于大规模生产。5.方便修饰:由于适配子基于核酸,其修饰方法已经非常成熟,并且修饰后不会破坏活性。
与传统生物芯片不同,渗滤式生物芯片可以让待检测的样本快速通过硝酸纤维膜的微孔,样品中的目标分子可以迅速和膜上的适配子结合。传统式的生物芯片由于只能靠长时间的温育使得适配子和目标分子充分结合。因此渗滤式的生物芯片可以大大缩短反应时间,而且敏感性和特异性更高。
由于识别仪软件的自动套圈,图像合成,系数校正和仪器校正等步骤,可以实现芯片反应结果的准确分析,比传统生物芯片方法更具有准确性。
附图说明
图1——本发明实施例所述的适配子生物芯片的结构示意图。
图中所标标号与部件名称对应关系如下:
芯片外壳1、硝酸纤维素膜2、反渗层3、吸水层4、防漏层5。
具体实施方式
以下以具体实施例来说明本发明的技术方案,但本发明的保护范围不限于此:
实施例1:
适配子渗滤式生物芯片,如图1所示,芯片外壳1窗口下且芯片外壳1内由上至下依次分别为硝酸纤维素膜(膜上固定有適配子分子)2、反渗层3、吸水层4、防漏层5。相互之间依次自然压缩而成,无需任何胶黏剂。芯片外壳1上有一个窗口,窗口下方由有背衬的硝酸纤维素膜2紧密连接,防止加入窗口的液滴由缝隙处渗漏出;硝酸纤维素膜2下方紧密结合反渗层3,阻止液体从芯片内腔反渗回硝酸纤维素膜2表面;反渗层3下面结合吸水层4,可以吸收多余液体;吸水层4下面结合防漏层5,防止液体漏出芯片,污染环境。
将待检测物质加在膜上,再加入显色试剂和其他相应试剂,待反应后再将芯片放入配套的生物芯片识别仪中读取反应结果和数据,并进行分析从而得到检测结果。
分析程序如下:
(1)自动套圈:
软件划定拍摄的生物芯片盒边界,确定生物芯片的有效区域。利用生物芯片上的物理信息对有效区域进行网格划分,确定每个网格内有且只有一个生物芯片点。在每个网格内进行搜索,确定生物芯片点的实际边界,并进行大范围内的动态差额算法搜索,构造广泛边界点集合,对此集合进行筛选,确定生物芯片点。对已经确定的生物芯片点位置进行校正,含点间距、阵间距、平行性。推算其余为确定的生物芯片点位置。得到自动套圈结果。在自动套圈失败情况下,软件可以转为手工套圈进行校正。
(2)图像合成:
软件对生物芯片连续拍摄1~10次,将上述图像合成,获取平均值。
(3)芯片系数校正:
如见自动读取生物芯片的芯片系数,并将芯片系数与生物芯片出厂时刻录在光盘上的芯片系数进行校正,校正的范围在允许的范围内。
(4)仪器自动校正:
对生物芯片上的信息经过上述(1)、(2)、(3)步骤,将上述步骤的结果与刻录在光盘上的标准生物芯片的灰度数值、芯片系数进行对比,校正到标准生物芯片的灰度数值、芯片系数。
所述芯片的硝酸纤维素膜2上点有三种适配子分别为:
幽门螺旋杆菌尿素酶适配子、幽门螺旋杆菌细胞毒素相关蛋白适配子、幽门螺旋杆菌空泡毒素蛋白适配子。
所述芯片的制备方法为:
采用SELEX技术,用纯化的尿素酶,细胞毒素相关蛋白,空泡毒素蛋白作为目标物质筛选DNA适配子,再通过体外扩增技术制备纯化的DNA适配子。
利用生物素-亲和素标记适配子:
取DNA0.5μg加入50μl TE(pH8.0)缓冲液中,再加入5μg生物素-补骨脂素,溶解后,置365nm紫外光下直接照射20min,距离5cm,加等体积TE,移入用TE平衡的Sephadex G-50柱(高1.0cm),离心法过柱,收集液体即为Bio-DNA探针。
TE:10mM Tris-HCl(pH8.0),1mM EDTA(pH8.0):1M Tris-HCl(pH8.0)1ml,0.5M EDTA(pH8.0)0.2ml,加ddH2O至100ml。121℃高压湿热灭菌20min,4℃保存备用。
(1)1M Tris Cl(Tris(三羟甲基)氨基甲烷):800ml H2O中溶解121gTris碱,用浓盐酸调pH值至8.0,混匀后加水到1L;
(2)0.5M EDTA(乙二胺四乙酸):700ml H2O中溶解186.1g Na22EDTA.·2H2O,用10M NaOH调pH8.0(需约50ml),补H2O到1L。
Bio-DNA探针通过生物芯片喷墨点样机喷点在硝酸纤维素膜2上,再将硝酸纤维素膜2和反渗层3、吸水层4、防漏层5材料按照次序组装在生物芯片外壳中,即得到适配子渗滤式生物芯片。
用所述的生物芯片可以用来检测幽门螺旋杆菌的抗原尿素酶,细胞毒素相关蛋白和空泡毒素蛋白分子。将病人的标本加入芯片的反应窗口,待液体渗入芯片后,再加入显色试剂和其他相应试剂。显色后放入生物芯片识别仪读取反应的信号,分析后即可得知抗原浓度,并判断病人是否感染幽门螺旋杆菌。
实施例2:
适配子渗滤式生物芯片的结构同实施例1所示。
所述的生物芯片的硝酸纤维素膜2是有滤纸被衬,膜上点有可以捕获结核分枝杆菌抗原的三种适配子分别为:
脂阿拉伯甘露糖(LAM)适配子、结核分枝杆菌CFP-10蛋白适配子、结核分枝杆菌ESAT-6蛋白适配子。
将三种适配子通过生物芯片喷墨点样机喷点在硝酸纤维素膜上,再将反渗层,吸水层,防漏层,和芯片外壳组装即可得到用于检测结核分枝杆菌抗原的适配子渗滤式生物芯片。检测时将被检测样本(如痰液或者血清)滴加在生物芯片的反应窗口内,待样品渗滤完全后,滴加相应的洗涤液和显色试剂,再用生物芯片识别仪读取芯片反应结果并进行分析。
Claims (7)
1.适配子渗滤式生物芯片,包括芯片外壳,其特征在于在芯片外壳上设置窗口,在窗口下的芯片外壳内从上至下依次设置硝酸纤维素膜、反渗层、吸水层、防漏层;硝酸纤维素膜的表面固定有针对靶物质的适配子分子,适配子分子是RNA或者DNA或者是经过修饰的RNA或DNA。
2.根据权利要求书1所述的适配子渗滤式生物芯片,其特征在于硝酸纤维素膜包括有背衬的硝酸纤维素膜或无任何背衬的硝酸纤维素膜。
3.根据权利要求书1所述的适配子渗滤式生物芯片,其特征在于反渗层为滤纸或无纺布。
4.根据权利要求1所述的适配子渗滤式生物芯片的制备方法,其特征在于将适配子分子固定于硝酸纤维素膜上;适配子通过疏水性作用与硝酸纤维素膜进行物理性吸附,或者是标记生物素,透过分子间的疏水作用力、氢键以及静电作用力固定于硝酸纤维素膜,得适配子渗滤式生物芯片。
5.根据权利要求书4所述的适配子渗滤式生物芯片的制备方法,其特征在于所述标记生物素的制备方法:取DNA0.5μg加入50μl TE缓冲液中,再加入5μg生物素-补骨脂素,溶解后,置365nm紫外光下直接照射20min,距离5cm,加等体积TE,移入用TE平衡的Sephadex G-50柱,离心法过柱,收集液体即为Bio-DNA探针。
6.根据权利要求书4所述的适配子渗滤式生物芯片的制备方法,其特征在于需搭配显色试剂,显色试剂是标记的物质,即多抗或单抗或适配子。
7.根据权利要求书6所述的适配子渗滤式生物芯片的制备方法,其特征在于标记的物质是胶体金、酶、或者是荧光物质。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201310346599XA CN103439493A (zh) | 2013-08-08 | 2013-08-08 | 适配子渗滤式生物芯片及制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201310346599XA CN103439493A (zh) | 2013-08-08 | 2013-08-08 | 适配子渗滤式生物芯片及制备方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN103439493A true CN103439493A (zh) | 2013-12-11 |
Family
ID=49693198
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201310346599XA Pending CN103439493A (zh) | 2013-08-08 | 2013-08-08 | 适配子渗滤式生物芯片及制备方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN103439493A (zh) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104198704A (zh) * | 2014-09-02 | 2014-12-10 | 张明 | 一种百日咳诊断试剂盒及制备方法 |
CN105092854A (zh) * | 2014-05-07 | 2015-11-25 | 湖州数问生物技术有限公司 | 体外诊断装置和试剂盒 |
CN105968157A (zh) * | 2016-04-29 | 2016-09-28 | 武汉大学 | 一种具有光激活性能的适配子探针及检测癌症部位的方法 |
Citations (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1570649A (zh) * | 2004-04-29 | 2005-01-26 | 南京大渊生物技术工程有限责任公司 | 生物芯片的检测方法 |
WO2005059553A1 (fr) * | 2003-12-19 | 2005-06-30 | Chengdu Kuachang Medical Industrial Limited | Essai biologique par puce a adn et equipement correspondant |
CN101526535A (zh) * | 2009-04-14 | 2009-09-09 | 河南省豫康生物工程技术有限公司 | 多种肿瘤标志物联合检测液相芯片及其制备方法 |
CN101691610A (zh) * | 2009-08-06 | 2010-04-07 | 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 | 适配子型生物芯片及其制备方法和应用 |
US20100136652A1 (en) * | 2005-11-23 | 2010-06-03 | Christopher Bieniarz | Molecular Conjugate |
CN101782571A (zh) * | 2008-12-25 | 2010-07-21 | 国家纳米技术与工程研究院 | 一种检测抗体亚型的方法 |
CN102866147A (zh) * | 2012-09-05 | 2013-01-09 | 重庆医科大学 | 一种基于适体的微流控化学发光芯片及其制备方法 |
CN202710549U (zh) * | 2012-07-26 | 2013-01-30 | 南京大渊生物技术工程有限责任公司 | 生物芯片 |
CN102943308A (zh) * | 2012-05-21 | 2013-02-27 | 新疆医科大学第一附属医院 | 细粒棘球绦虫发育阶段表达分泌蛋白的基因芯片 |
-
2013
- 2013-08-08 CN CN201310346599XA patent/CN103439493A/zh active Pending
Patent Citations (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2005059553A1 (fr) * | 2003-12-19 | 2005-06-30 | Chengdu Kuachang Medical Industrial Limited | Essai biologique par puce a adn et equipement correspondant |
CN1570649A (zh) * | 2004-04-29 | 2005-01-26 | 南京大渊生物技术工程有限责任公司 | 生物芯片的检测方法 |
US20100136652A1 (en) * | 2005-11-23 | 2010-06-03 | Christopher Bieniarz | Molecular Conjugate |
CN101782571A (zh) * | 2008-12-25 | 2010-07-21 | 国家纳米技术与工程研究院 | 一种检测抗体亚型的方法 |
CN101526535A (zh) * | 2009-04-14 | 2009-09-09 | 河南省豫康生物工程技术有限公司 | 多种肿瘤标志物联合检测液相芯片及其制备方法 |
CN101691610A (zh) * | 2009-08-06 | 2010-04-07 | 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 | 适配子型生物芯片及其制备方法和应用 |
CN102943308A (zh) * | 2012-05-21 | 2013-02-27 | 新疆医科大学第一附属医院 | 细粒棘球绦虫发育阶段表达分泌蛋白的基因芯片 |
CN202710549U (zh) * | 2012-07-26 | 2013-01-30 | 南京大渊生物技术工程有限责任公司 | 生物芯片 |
CN102866147A (zh) * | 2012-09-05 | 2013-01-09 | 重庆医科大学 | 一种基于适体的微流控化学发光芯片及其制备方法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
蔡文琴等: "《实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术》", 31 December 1994, article "生物素-补骨脂素(Biotin-psoralen)标记法" * |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105092854A (zh) * | 2014-05-07 | 2015-11-25 | 湖州数问生物技术有限公司 | 体外诊断装置和试剂盒 |
CN104198704A (zh) * | 2014-09-02 | 2014-12-10 | 张明 | 一种百日咳诊断试剂盒及制备方法 |
CN104198704B (zh) * | 2014-09-02 | 2015-11-11 | 张明 | 一种百日咳诊断试剂盒及制备方法 |
CN105968157A (zh) * | 2016-04-29 | 2016-09-28 | 武汉大学 | 一种具有光激活性能的适配子探针及检测癌症部位的方法 |
CN105968157B (zh) * | 2016-04-29 | 2019-04-09 | 武汉大学 | 一种具有光激活性能的适配子探针及检测癌症部位的方法 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Hussein et al. | Point-of-care diagnostics of COVID-19: From current work to future perspectives | |
Sakurai et al. | Updated values for molecular diagnosis for highly pathogenic avian influenza virus | |
CN104812915A (zh) | 基于pcr用于平行检测生物材料的测定 | |
US20090317796A1 (en) | Indirect immunofluorescence assay typing kit for coxsackievirus A group and method for typing coxsackievirus A group | |
CN103439493A (zh) | 适配子渗滤式生物芯片及制备方法 | |
Zandi et al. | Biosensor as an alternative diagnostic method for rabies virus detection: A literature review | |
CN109704954B (zh) | 3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸的衍生物、均相酶免疫检测试剂及其制备方法 | |
CN102735836A (zh) | 一种可视化快速联检植物病原的方法和抗体芯片 | |
WO2011032278A1 (en) | A method and apparatus for lateral flow determination of analyte concentration | |
CN112813070B (zh) | 结合河豚毒素的高亲和性核酸适配体及其获得方法和用途 | |
CN113125753B (zh) | 一种用于检测尘螨组分特异性抗体的试剂盒 | |
CN105131106A (zh) | 5-羟基吲哚乙酸免疫原、抗体和检测试剂及制备方法 | |
CN111122847A (zh) | 一种基于适配体的现场快速检测黄曲霉毒素b1的方法 | |
CN104374921A (zh) | 一种用于莱姆病鞭毛抗原免疫血清学诊断的蛋白质芯片及其制备方法和应用 | |
CN103235114A (zh) | 一种检测脂蛋白残粒胆固醇浓度的试剂盒及方法 | |
Estrada et al. | Multiplex detection of pathogen biomarkers in human blood, serum, and saliva using silicon photonic microring resonators | |
Gilboa et al. | Single‐Molecule Enzymology for Diagnostics: Profiling Alkaline Phosphatase Activity in Clinical Samples | |
CN104109674B (zh) | 一种糖化血红蛋白的核酸适体及其制备方法 | |
CN105044338A (zh) | 一种基于气压计检测凝血酶的方法 | |
CN105467113A (zh) | 一种基于荧光素和萤光素酶生物发光反应的免疫分析方法 | |
CN114910460A (zh) | 一种基于适配体的蛋白质芯片及其制备与应用 | |
Chen et al. | Aptamer‐based thrombin assay on microfluidic platform | |
Nieto-Callejas et al. | Diagnosis of COVID-19 and innovative alternative methods based on optic fiber immunosensor | |
CN111394521B (zh) | 对猪瘟野毒及其疫苗进行鉴别诊断的基因芯片以及检测方法 | |
CN104109675B (zh) | 一种糖化血红蛋白的核酸适体及其制备方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20131211 |
|
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |