CN102735836A - 一种可视化快速联检植物病原的方法和抗体芯片 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种可视化快速联检植物病原的方法和抗体芯片，将植物病原捕获抗体点布在基膜上得到抗体芯片；将检测样品与抗体芯片杂交孵育，洗涤后再加入相应的植物病原检测抗体，继续反应，洗涤后显色。本发明具有与ELISA等方法同等的灵敏度、特异性、重复性，还有传统方法不具备的一次实验同时检测多种病原能力。

Description

一种可视化快速联检植物病原的方法和抗体芯片

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体为植物病原的检测方法和试剂，尤其是可视化快速联检植物病原的方法和抗体芯片。

背景技术

植物病害分为侵染性和非侵染性两类，其中侵染性病害又主要可分为真菌性、细菌性、病毒性和线虫性等。植物病害种类繁多、传播途径广，可破坏或干扰植物正常的生理机能，且目前缺少有效防治措施，使得许多重要的病毒病、细菌病一旦流行，便很难控制，是导致蔬菜、花卉产量和品质下降最重要的原因之一。

目前对植物病害的检测方法主要有生物学检测、电子显微镜观察、血清学检测和分子生物学方法等(Direct-PCR、免疫-PCR、RT-PCR等)。生物学检测又称指示植物检测法，该方法是将某种病毒接种特定的指示植物，根据指示植物表现出的局部或系统症状，初步判定病毒的种类和归属。电子显微镜技术可直接观察到病害的形态结构、存在与否等信息，是最直接、最准确的病原检测手段。血清学检测，主要是利用抗原抗体可特异性结合的原理，利用病原的特异性抗体来检测鉴定病原。分子生物学检测方法主要有核酸分子杂交技术、dsRNA电泳技术、PCR技术等，这些方法均可快速、灵敏、特异性的检测病原。

但以上这些比较通用的植物病害检测方法，都或多或少存在着缺陷：生物学检测一般需在温室中进行，全检测过程耗时较长；电子显微镜观察一般需负染色或制作超薄切片，且检测鉴定过程需在电子显微镜下进行；ELISA等血清学方法其检测时间较长，且每个反应孔只可单独检测一种病原，在需筛选大量样品或单个样品的多个病原项目时，工作量往往相当庞大，具有耗时、费力的缺点；分子生物学方法需要标记探针分子(核酸分子杂交技术)，或提取核酸后进一步将mRNA反转录成cDNA(RC-PCR)，检测过程中目标核酸损失较大，检测结果因为核酸杂交或扩增过程易受植物成分的抑制而出现假阴性结果。

蛋白质芯片是近些年发展起来的一项新技术，又称蛋白质阵列或蛋白质微阵列，最早由德国科学家Angelika Lueking于1995年开始研究，主要利用抗原与抗体、受体与配体间可特异性结合的原理，将探针分子固定在载体表面，用于分析被检样品液中目的分子信息的技术。蛋白质芯片诞生初期主要被用于蛋白质组学研究，随后被逐渐推广至生物医学相关领域，而将蛋白质芯片(抗体芯片)用于植物病原的检测，国内外目前仍未见相关报道。蛋白质芯片用于植物病原的快速检测，具有节约时间、节省抗体、灵敏度高、重复性好等众多优点，检测结果既可用肉眼直接判定，也可通过分析灰度后作定量检测，推广应用前景广阔。

发明内容

本发明旨在提供一种可视化快速联检植物病原的方法。

本发明还提供了可视化快速联检植物病原的抗体芯片。。

一种可视化快速联检植物病原的方法，包括以下步骤：

(1)将检测样品与抗体芯片杂交孵育1～5hr；所述的抗体芯片包括固定在基膜上的植物病原捕获抗体；

(2)洗涤后再加入相应的植物病原检测抗体杂交孵育，继续反应1～5hr；

(3)洗涤后显色。

所用的植物病原捕获抗体分别为番茄细菌性溃疡病菌(Corynebacterium michiganense pv.Michiganense，Cmm)、黄瓜花叶病毒(CuCumber mosaic virus，CMV)、凤果花叶病毒(Pepinomosaic virus，PepMV)、番茄不孕病毒(Tomato aspermy virus，TAV)、番茄黑环病毒(Tomato black ring virus，TBRV)、番茄花叶病毒(Tomato mosaic virus，ToMV)、番茄环斑病毒(Tomato ring spot virus，ToRSV)、烟草环斑病毒(Tobacco ringspot virus，TRSV)、烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus，TRV)和番茄斑萎病毒(Tomato spotted wildvirus，TSWV)捕获抗体中的至少一种。

以IgG为质控对照。

用pH＝7.2～7.4、吐温-20质量含量0.01％～0.1％的磷酸盐缓冲液洗涤。

用pH＝7.2～7.4、吐温-20质量含量0.01％～0.1％、BSA质量含量0.1％～0.5％的磷酸盐缓冲液稀释检测抗体。

检测抗体的标记物为碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶或生物素等。

碱性磷酸酶的显色底物为5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐和四唑硝基蓝；辣根过氧化物酶的显色底物为二氨基联苯胺；标记物为生物素时先加入亲和素-纳米金，再用银染色。

一种可视化快速联检植物病原的抗体芯片，包括基膜及点布在基膜上的植物病原捕获抗体。所述的植物病原捕获抗体分别为番茄细菌性溃疡病菌、黄瓜花叶病毒、番茄不孕病毒、番茄黑环病毒、番茄花叶病毒、番茄环斑病毒、烟草环斑病毒、烟草脆裂病毒和番茄斑萎病毒捕获抗体等茄科植物病原捕获抗体中的至少一种。

所述的基膜为硝酸纤维素膜、聚偏氟乙烯膜、玻璃基片、硝酸纤维素涂层的玻璃基片或聚偏氟乙烯涂层的玻璃基片。

将捕获抗体用浓度为0.001～0.5mol/L、pH值7.0～10.0的碳酸盐缓冲液稀释后点在基膜上并固定，得到上述抗体芯片；稀释后的捕获抗体浓度为捕获抗体浓度为10～120mg/L，优选为20～100mg/L。

相对现行的植物病害检测方法，本发明的抗体芯片和方法能快速同时检测茄科植物多种检疫性病害，这种抗体芯片和方法所具有的优势在于：(1)既具有与传统方法同等的单病原检测能力，还有传统方法不具备的一次实验同时检测多种病原能力，可在一次实验中同时检测至少10种植物病原；(2)利用标记酶及相应的显色底物(如碱性磷酸酶及相应的BCIP/NBT显色底物等)标记检测抗体，显示杂交信号，结果既可用肉眼直接判定，也可以普通平板扫描仪直接获取，进一步进行灰度分析后，从而实现对病原的半定量检测；(3)利用本发明检测植物病害，检测结果稳定，不易受植物成分的影响而出现假阴性结果；(4)每次实验可检测的样品量更大，可有效提高阳性检出率；(5)利用抗体芯片检测植物病原，检测及获取信号过程只需摇床和平板扫描仪即可，降低了对贵重仪器的依赖度，操作简便，可在绝大部分实验室推广；(6)利用抗体芯片实现多病原的同时检测，可节约时间、节省抗体，且具有与ELISA等方法同等的灵敏度、特异性、重复性，检测结果可长期保存，推广前景广阔。

附图说明

图1为实施例1捕获抗体点样制备的抗体芯片的阵列排布图。

图2为实施例3分别单独检测10种病原的阳性结果。

图3为实施例4同时检测多种病原的阳性结果，A为同时检测除TBRV外的9种病原；B为同时检测10种病原。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细、完整地说明：

实施例1抗体芯片的制备

1、材料与试剂

点样缓冲液：碳酸盐缓冲液，浓度为0.5mol/L，pH 9.6(配制方法：Na₂CO₃ 1.59g，NaHCO₃ 2.93g，NaN₃ 0.2g，ddH₂O 1000mL)；

捕获抗体：抗-番茄细菌性溃疡病菌(德国LOEWE公司，货号07063)，抗-黄瓜花叶病毒(苏格兰NEOGEN公司，货号1016)，抗-凤果花叶病毒(美国Agdia公司，货号SRA 13000)，抗-番茄不孕病毒(苏格兰NEOGEN公司，货号1187)，抗-番茄黑环病毒(苏格兰NEOGEN公司，货号1068)，抗-番茄花叶病毒(美国Agdia公司，货号SRA 35400)，抗-番茄环斑病毒(苏格兰NEOGEN公司，货号1233)，抗-烟草环斑病毒(苏格兰NEOGEN公司，货号1069)，抗-烟草脆裂病毒(苏格兰NEOGEN公司，货号1161)，抗-番茄斑萎病毒(苏格兰NEOGEN公司，货号1071)；

阳性质控：碱性磷酸酶标记的抗山羊IgG(碧云天生物技术研究所，货号A0266)；

硝酸纤维素膜：美国Millipore公司。

2、芯片制备

1)抗体稀释：以点样缓冲液分别将捕获抗体5倍稀释，则各抗体工作浓度为20mg/L～80mg/L；同时以10倍稀释碱性磷酸酶标记的IgG作为阳性质控；

2)基片预处理：点样前，需以ddH₂O浸泡硝酸纤维素膜基片20min，室温中晾干恒定；

3)点样：按芯片设计示意图，如图1所示，分别将针对10种病原的捕获抗体：抗-番茄细菌性溃疡病菌、抗-黄瓜花叶病毒、抗-凤果花叶病毒、抗-番茄不孕病毒、抗-番茄黑环病毒、抗-番茄花叶病毒、抗-番茄环斑病毒、抗-烟草环斑病毒、抗-烟草脆裂病毒和抗-番茄斑萎病毒依次点在编号1～10的位置；在P和N的位置分别点阳性质控、阴性质控(点样缓冲液)。

将上述试剂按阵列排布点样于基片表面，每点0.2uL，点间距0.2cm。点样完毕后，将芯片置于湿盒中37℃固定后，4℃保存，从而制得具同时检测茄科植物10种主要检疫性病害能力的抗体芯片。

实施例2试剂盒的组装

可同时检测茄科植物主要检疫性病害的抗体芯片检测试剂盒，主要组成如下：

(1)实施例1所制备的抗体芯片10张；

(2)检测抗体原液：实施例1所述的10种病原相应的检测抗体原液(与相应的捕获抗体为同一公司产品)各1管；检测抗体的标记酶为碱性磷酸酶；

(3)抗体稀释缓冲液：抗体稀释液为含0.2％BSA和0.05％吐温-20的磷酸盐缓冲液(pH＝7.2～7.4)，1瓶；

(4)洗涤液：含0.05％吐温-20的磷酸盐缓冲液(pH＝7.2～7.4)，1瓶；

(5)显色底物：5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐、四唑硝基蓝(BCIP/NBT)和1×碱性磷酸酶反应缓冲液，1套(购自天根生化试剂有限公司)；

实施例3利用抗体芯片检测单病原

将10种病原的阳性对照液，分别以无菌PBS稀释，配制抗体芯片的测试样品液。以抗体芯片检测：

1)样品杂交：将配好的测试样品，分别与制备好的抗体芯片于室温下，振荡(30r/min)孵育杂交2.5h；

2)洗涤：以PBST(0.01mol/L PBS+0.05％Tween 20)振荡(80r/min)洗涤三次，每次1min；

3)检测抗体孵育：以含0.2％BSA的PBST稀释200倍稀释检测抗体，配制同时含10种病原的特异性检测抗体混合液，加于芯片表面继续振荡反应1.5h；

4)显色：芯片经洗涤后，将20×的5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐、20×四唑硝基蓝(BCIP、NBT)和1×碱性磷酸酶反应缓冲液按1∶1∶20的比例配制显色体系，加于芯片表面室温平缓摇动反应20min，反应完毕后，将芯片浸入水中终止反应，并将芯片晾干保存结果。

单独检测上述10种病原的结果如图2所示。1～10分别为单独检测Cmm、CMV、pepMV、TAV、TBRV、ToMV、ToRSV、TRSV、TRV和TSWV的阳性结果。结果显示，抗体芯片具有良好的单病原检测能力。

实施例4利用抗体芯片同时检测多个病原项目

取10种病原的阳性对照液，以无菌PBS稀释后，随机混合模拟同时感染多种病原的植物样品液。以ELISA法，对各模拟感染的植物样品进行上述10个病原项目的筛选。同时以抗体芯片检测：

1)样品杂交：将配好的测试样品，分别与制备好的抗体芯片于室温下，振荡(30r/min)孵育杂交2.5h；

2)洗涤：以PBST(0.01mol/L PBS+0.05％Tween 20)振荡(80r/min)洗涤三次，每次1min；

3)检测抗体孵育：以含0.2％BSA的PBST稀释200倍稀释检测抗体，配制同时含10种病原的特异性检测抗体混合液，加于芯片表面继续振荡反应1.5h；

4)显色：芯片经洗涤后，将20×的5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐、20×四唑硝基蓝(BCIP、NBT)和1×碱性磷酸酶反应缓冲液按1∶1∶20的比例配制显色体系，加于芯片表面室温平缓摇动反应20min，反应完毕后，将芯片浸入水中终止反应，并将芯片晾干保存结果。

检测结果如图3所示，A为同时检测除TBRV外的9种病原；B为同时检测10种病原。说明本发明的抗体片具有同时检测上述10种病原的能力。以抗体芯片对12份模拟感染的样品累计共筛选出52项感染，这与ELISA法的检测结果基本一致。

实施例5抗体芯片检测实际种子样品的应用

收集24份种子样品，随机抽取12份，分别加入1-4种上述10种病原的阳性对照液，因加入的阳性对照液均由带病的植物叶片研磨配制而成，故此处认为24份样品中至少有12份为同时感染两种病原以上的植物样品。以ELISA法对24份样品分别进行10个病原项目的检测，并同时以抗体芯片检测，检测步骤同实施例3。检测结果显示，抗体芯片不仅具有与ELISA等同的单病原检测能力，而且还具有传统方法所不具有的一次实验同时检测多个病原项目的能力。

实施例2～5中，检测抗体的标记物可选用辣根过氧化物酶或生物素，并用相应的显色底物及染料，结果相同。

实施例1中的硝酸纤维素膜可用聚偏氟乙烯膜、玻璃基片、硝酸纤维素涂层的玻璃基片或聚偏氟乙烯涂层的玻璃基片代替，效果相同。

Claims (8)

1.一种可视化快速联检植物病原的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将检测样品与抗体芯片杂交孵育1～5hr；所述的抗体芯片包括固定在基膜上的植物病原捕获抗体；

(2)洗涤后再加入相应的植物病原检测抗体杂交孵育，继续反应1～5hr；

(3)洗涤后显色；

所述的植物病原捕获抗体为番茄细菌性溃疡病菌、黄瓜花叶病毒、凤果花叶病毒、番茄不孕病毒、番茄黑环病毒、番茄花叶病毒、番茄环斑病毒、烟草环斑病毒、烟草脆裂病毒和番茄斑萎病毒捕获抗体中的至少一种。

2.权利要求1所述可视化快速联检植物病原的方法，其特征在于，所述检测抗体的标记物为碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶或生物素。

3.权利要求1或2所述可视化快速联检植物病原的方法，其特征在于，检测抗体的标记物为碱性磷酸酶时，显色底物为5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐和四唑硝基蓝；标记物为辣根过氧化物酶时，显色底物为二氨基联苯胺；标记物为生物素时先加入亲和素-纳米金，再用银染色。

4.权利要求1所述可视化快速联检植物病原的方法，其特征在于，以IgG为质控对照。

5.权利要求1所述可视化快速联检植物病原的方法，其特征在于，用pH＝7.2～7.4、吐温-20质量含量0.01％～0.1％的磷酸盐缓冲液洗涤。

6.权利要求1所述可视化快速联检植物病原的方法，其特征在于，用pH＝7.2～7.4、吐温-20质量含量0.01％～0.1％、BSA质量含量0.1％～0.5％的磷酸盐缓冲液稀释检测抗体。

7.一种可视化快速联检植物病原的方法的抗体芯片，其特征在于，包括基膜及点布在基膜上的茄科植物病原捕获抗体，所述的茄科植物病原捕获抗体分别为番茄细菌性溃疡病菌、黄瓜花叶病毒、凤果花叶病毒、番茄不孕病毒、番茄黑环病毒、番茄花叶病毒、番茄环斑病毒、烟草环斑病毒、烟草脆裂病毒和番茄斑萎病毒捕获抗体中的至少一种。

8.权利要求7所述可视化快速联检植物病原的方法的抗体芯片，其特征在于，所述的基膜为硝酸纤维素膜、聚偏氟乙烯膜、玻璃基片、硝酸纤维素涂层的玻璃基片或聚偏氟乙烯涂层的玻璃基片。

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