CN107238703A - 一种可检测6种养殖鱼类细菌性疾病的抗体芯片 - Google Patents

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Abstract

本发明具体公开了一种可检测6种养殖鱼类细菌性疾病的抗体芯片，包括把6种鱼类细菌性疾病的抗体以及6种鱼类细菌性疾病的混合抗体以微阵列的形式，微阵列布局为8行×6列，均匀固定在固相载体表面，制备获得抗体芯片。本发明具有样本用量低，检测快速，高通量，灵敏度高等优点，适合在普通实验室和养殖户中规模化推广，具有广阔的应用前景。

Description

一种可检测6种养殖鱼类细菌性疾病的抗体芯片
技术领域
本发明涉及养殖鱼类细菌性疾病检测技术领域，尤其涉及一种可检测6种养殖鱼类细菌性疾病的抗体芯片。
背景技术
近年来，我国的水产养殖业取得突飞猛进的发展，不管是淡水养殖还是海水的鱼类养殖。我国的鱼类养殖已成为水产养殖业最主要的组成部分，无论在养殖品种还是养殖数量上都取得了较大的飞跃。随着经济的快速发展，环境污染也越来越严重。随着养殖规模的不断扩大和集约化养殖方式的逐渐推广，养殖水体富营养化现象愈来愈严重，致使养殖水体环境恶化，养殖鱼类自身抵抗力降低,各种疾病不时暴发，造成巨大的经济损失，也严重阻碍了鱼类养殖业的发展，病害已成为制约鱼类养殖业发展的主要因素。
养殖鱼类的主要病害包括病毒病、细菌病、寄生虫病以及由营养因素和环境因素引起的其它一些疾病。细菌病是养殖鱼类最为常见而且是危害最大的一类疾病，其流行广，发病率高，常导致养殖和野生鱼类的大量死亡，给水产业造成了严重的经济损失，因此一直是本行业研究关注的重点。
传统细菌检测主要依据细胞的形态特征、培养特征、染色反应和生理生化特性等细菌学性状进行的，或采用组织学检测病原体对宿主器官的影响，但传统病原检测方法耗时、工作量大、特异性和灵敏度低，常不能满足日常快速检测的需要。随着微生物学、生物化学和分子生物学技术的飞速发展，对病原微生物的鉴定已不再局限于对它的形态结构和生理特性等一般检验上，而是从分子生物学水平上研究生物大分子，特别是核酸结构及其组成部分，疾病诊断技术已进入到基因组诊断的分子生物学水平；如聚合酶链式反应(PCR)技术，该技术与传统诊断方法相比，具有灵敏度高、特异性强、反应快、操作简便、省时等优点，但常规在使用上存在着如引物的非特异性扩增、假阳性、假阴性、不能获得定量结果等问题。
基因芯片技术具有传统的检测方法所不可比拟的优点，因此，如果可以将基因芯片技术应用到养殖鱼类细菌性疾病检测中，将大大提高其检测效率。
发明内容
针对现有技术的上述不足，本发明提供一种可检测6种养殖鱼类细菌性疾病的抗体芯片，以解决上述的技术问题：
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种可检测6种养殖鱼类细菌性疾病的抗体芯片，包括把6种鱼类细菌性疾病的抗体以及6种鱼类细菌性疾病的混合抗体以微阵列的形式，微阵列布局为8行×6列，微阵列布局如图1所示，均匀固定在固相载体表面，制备获得抗体芯片。
附图说明
图1是本发明的结构示意图。
其中：哈维弧菌-1、嗜水气单胞菌-2、柱状屈挠杆菌-3、迟缓爱德华氏菌-4、海分支杆菌-5、荧光假单胞菌-6、阳性对照-7、阴性对照-8。
具体实施方式
结合以下实施例对本发明作进一步描述。
一种可检测6种养殖鱼类细菌性疾病的抗体芯片，包括把6种鱼类细菌性疾病的抗体以及6种鱼类细菌性疾病的混合抗体以微阵列的形式，微阵列布局为8行×6列，微阵列布局如图1所示，均匀固定在固相载体表面，制备获得抗体芯片。
优选地，所述细菌性病菌的病原菌包括哈维弧菌、嗜水气单胞菌、柱状屈挠杆菌、迟缓爱德华氏菌、海分支杆菌和荧光假单胞菌。
优选地，所述固相载体包括玻璃片、硅片、硝酸纤维素膜、PVDF膜和云母片。
作为优选的实施例，以下将详细介绍以上所述的抗体芯片的制备方法，包括以下步骤：
S1、固相载体的预处理；
S2、哈维弧菌、嗜水气单胞菌、柱状屈挠杆菌、迟缓爱德华氏菌、海分支杆菌和荧光假单胞菌抗血清进行纯化，使用辣根过氧化物酶标试剂盒对抗体进行标记；标记后的抗体进行混合；
S3、使用pH7.0～8.0的20～30％的PBS缓冲液稀释纯化后的血清进行稀释，稀释浓度为0.1-3mg/mL，4℃保存备用；
S4、室温下，使用微阵列芯片点样仪进行点样，设置阳性对照和阴性对照点，点样完成后，25～28℃固定3～5h，4℃保存备用。
作为另一个优选的实施例，接下来将详细介绍以上所述的抗体芯片的检测方法，包括以下步骤：
(1)、将已点样的载体从4℃取出，置于室温平衡20min，PBS洗涤3次，每次3～5min；室温晾干；
(2)使用PBS配置1％的脱脂奶粉或者BSA，将上述的固相载体置于其中封闭，室温，振荡110rpm，1h；
(3)PBS-T洗涤3次，每次5～10min；室温甩干；
(4)室温晾干后，向载体上的点分别滴加一系列浓度梯度的病原菌悬液和病原菌混合液，37℃，反应1～2h；
(5)PBS-T洗涤3次，每次5～10min；室温甩干；
(6)向载体上的点分别滴加标记的抗体，37℃孵育1～2h；
(7)PBS-T洗涤3次，每次5-10min，加TMB避光发色20min，使用1mol/L硫酸终止反应，去离子水漂洗5次，室温甩干；
(8)扫描仪扫描，记录实验结果。
1、本发明创造性地将多种常见鱼类病原菌的检测综合在一起，如果鱼类发病有多种症状，既可以实现一次检测确定多种疾病，减少检测的时间成本、人力成本和经济成本。
2、本发明的抗体芯片可以同时检测哈维弧菌、嗜水气单胞菌、柱状屈挠杆菌、迟缓爱德华氏菌、海分支杆菌和荧光假单胞菌这六种常见的病原菌，解决多数养殖场的疾病检测。
3、本发明具有样本用量低，检测快速，高通量，灵敏度高等优点，适合在普通实验室和养殖户中规模化推广，具有广阔的应用前景。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (5)

1.一种可检测6种养殖鱼类细菌性疾病的抗体芯片，其特征在于，包括把6种鱼类细菌性疾病的抗体以及6种鱼类细菌性疾病的混合抗体以微阵列的形式，微阵列布局为8行×6列，均匀固定在固相载体表面，制备获得抗体芯片。
2.根据权利要求1所述的可检测6种养殖鱼类细菌性疾病的抗体芯片，其特征在于，所述细菌性病菌的病原菌包括哈维弧菌、嗜水气单胞菌、柱状屈挠杆菌、迟缓爱德华氏菌、海分支杆菌和荧光假单胞菌。
3.根据权利要求2所述的可检测6种养殖鱼类细菌性疾病的抗体芯片，其特征在于，所述固相载体包括玻璃片、硅片、硝酸纤维素膜、PVDF膜和云母片。
4.一种权利要求1所述的抗体芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、固相载体的预处理；
S2、哈维弧菌、嗜水气单胞菌、柱状屈挠杆菌、迟缓爱德华氏菌、海分支杆菌和荧光假单胞菌抗血清进行纯化，使用辣根过氧化物酶标试剂盒对抗体进行标记；标记后的抗体进行混合；
S3、使用pH7.0～8.0的20～30％的PBS缓冲液稀释纯化后的血清进行稀释，稀释浓度为0.1～3mg/mL，4℃保存备用；
S4、室温下，使用微阵列芯片点样仪进行点样，设置阳性对照和阴性对照点，点样完成后，25～28℃固定3～5h，4℃保存备用。
5.一种权利要求1所述的抗体芯片的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)、将已点样的载体从4℃取出，置于室温平衡20min，PBS洗涤3次，每次3～5min；室温晾干；
(2)使用PBS配置1％的脱脂奶粉或者BSA，将上述的固相载体置于其中封闭，室温，振荡110rpm，1h；
(3)PBS-T洗涤3次，每次5～10min；室温甩干；
(4)室温晾干后，向载体上的点分别滴加一系列浓度梯度的病原菌悬液和病原菌混合液，37℃，反应1～2h；
(5)PBS-T洗涤3次，每次5～10min；室温甩干；
(6)向载体上的点分别滴加标记的抗体，37℃孵育1-2h；
(7)PBS-T洗涤3次，每次5～10min，加TMB避光发色20min，使用1mol/L硫酸终止反应，去离子水漂洗5次，室温甩干；
(8)扫描仪扫描，记录实验结果。
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