CN110616279A - 一种同步定量检测3种重要虾类病原的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种同步定量检测3种重要虾类病原的试剂盒，所述试剂盒包括同步检测3种病原(WSSV、EHP和SHIV)的引物。本发明基于定量PCR检测方法，不仅检测灵敏度比普通检测方法大幅提升，还可以实现同步评估3种病原的感染率与感染程度，适用于对对虾中3种病原隐性感染的早期监测，尤其适用于对取样量和带毒量双低的虾苗样品的批量检测。

Description

一种同步定量检测3种重要虾类病原的试剂盒

技术领域

本发明属于虾类病原检测领域，特别涉及一种同步定量检测3种重要虾类病原的试剂盒。

背景技术

引进品种凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)因为生长速度快、适应性强，其种苗培育和养殖产业在我国得到持续发展，成为我国重要水产养殖经济品种。然而，随着混养与集约化等多种模式的开发和国内外虾类产品与苗种流通的增加，我国凡纳滨对虾病原种类呈现增多趋势，如白斑综合征病毒(WSSV)、虾肝肠胞虫(EHP)和虾虹彩病毒(SHIV)等。其中，WSSV等多种病毒所致疾病被农业农村部列入需要重点防控的动物疫病名录；EHP和SHIV尽管为近年新发病原，但是造成的经济损失却非常严重，已经成为虾类养殖业的重要威胁。鉴于对虾病原种类的多样性、危害严重性以及许多养殖病害的暴发源于病原对种苗的微量感染等，近年来生物安保育苗技术在大型对虾育苗场逐步推广，通过对苗场生物性危害因素和关键控制点的监测、识别与防控，确保苗种的无毒化培育。近几年在上海、海南和福建等省市几家大型凡纳滨对虾育苗场对常见病原的检测结果表明，EHP、WSSV和SHIV为育苗场内主要生物性危害因素，因此，这3种病原为凡纳滨对虾育苗场内构建生物安保体系的重点监测对象。

常规的病原检测技术如组织病理、免疫组化等具有周期长、取样量大、不能一次确诊等缺点，而大型苗场的样品还具有批次多、检测量大且取样量和携带病原量均低的特征，因此，快速、灵敏和组织样品需要量极小的聚合酶链式反应(PCR)技术适用于对苗种病原的检测，尤其是灵敏度高的多重或同步定量PCR检测技术，既能满足监测中对灵敏度和风险程度准确评估的要求，又能适应对检测的快速、通量化需要，可以为苗场生物安保技术体系的构建和对虾健康养殖提供良好技术支撑。目前，还未见一种针对这三种病原可以做到同步定量检测的试剂盒。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种同步定量检测3种重要虾类病原的试剂盒，该试剂盒基于定量PCR检测方法，不仅检测灵敏度比普通检测方法大幅提升，还可以实现同步评估3种病原的感染率与感染程度，适用于对对虾中3种病原隐性感染的早期监测，尤其适用于对取样量和带毒量双低的虾苗样品的批量检测。

本发明提供了一种同步定量检测3种重要虾类病原的试剂盒，所述试剂盒包括如下引物：

EHP上游：5'-GCAGAGTGTTGTTAAGGGTTTAAGT-3'；

EHP下游：5'-GCTGTTTGTCTCCAACTGTATTTGA-3'；

WSSV上游：5'-CGACAGACTACTAACTTCAGCCTAT-3'；

WSSV下游：5'-AAGAGGATACCAGATGCTCGTT-3'；

SHIV上游：5'-CAATCATGTTGTTGTATCCATCCTTCT-3'；

SHIV下游：5'-GGTTTCATTCAACGTAAACGATCTCG-3'。

所述3种重要虾类病原为白斑综合征病毒(WSSV)、虾虹彩病毒(SHIV)和虾肝肠胞虫(EHP)。

所述试剂盒(20μL)的组分为：2×TB Green Premix Ex TaqⅡ10μL，上游引物(10μM)0.6μL，下游引物(10μM)0.6μL，DNA模板2μL，无DNA酶水6.8μL。

所述试剂盒的反应程序为：95℃30s预变性；然后95℃5s，60℃20s，循环40次。

本发明是基于SHIV实时定量PCR检测方法建立的同步检测3种对虾病原的实时定量PCR检测试剂盒，具有成本低、操作简便和通量化特点。检测标准曲线分析显示，该试剂盒对3种病原的标准曲线相关系数(R²)均大于0.99。当总DNA中靶基因含量低至10拷贝/μL时，对每种病原均能保持良好的组内和组间重复性，尤其是对WSSV，当病毒基因拷贝数低至1拷贝/μL时仍能保持较好的组内和组间重复性；检测熔解曲线分析显示，该试剂盒对对虾样品的扩增产物只在78.4℃、79.7℃和83.5℃处出现3个尖锐峰，分别与3种病原(SHIV、EHP和WSSV)扩增产物的T_m值相对应。以上实验表明，本发明的试剂盒不仅具有较高的检测灵敏度和良好的病原特异性，并且可以在50min内完成对3种病原的快速鉴定和组织内病原含量的确定，因此，本发明既可用于对虾育苗场内对3种病原的监测，也适用于对养殖对虾病原感染与病害发生的风险预测。

有益效果

(1)本发明基于定量PCR检测方法，具有成本低、操作简便和通量化特点，不仅具有良好的稳定性和病原特异性，而且比常规PCR检测方法具有更高的检测灵敏度，大幅提高了病原微量感染样品的检出率。

(2)本发明具有检测结果定量化和检测过程通量化的特点，可确保在50min内同步完成对3种病原的快速监测和感染程度的准确评估，因此，适用于对对虾中3种病原隐性感染的早期监测，尤其适用于对取样量和带毒量双低的虾苗样品的批量检测，特别适用于样品检测量大、病原含量低的大型苗场的检测需求，可为苗场生物安保技术体系的建立与推广提供有力支撑。

附图说明

图1为实施例1对EHP质粒标准品的扩增曲线、熔解曲线、特异性实验和标准曲线；其中，A为不同浓度质粒标准品扩增曲线(1-8：质粒标准品浓度分别为1.0×10⁸-1.0×10¹拷贝/μL)；B为熔解曲线；C为特异性实验(1：EHP阳性样品DNA；2：EHP质粒标准品(1.0×10⁴拷贝/μL)；3：SPF对虾；4：哈维弧菌；5：维氏气单胞菌；6：副溶血弧菌；7：无DNA酶水)；D为标准曲线。

图2为实施例2对WSSV质粒标准品的扩增曲线、熔解曲线、特异性实验和标准曲线；其中，A为不同浓度质粒标准品扩增曲线(1-8:质粒标准品浓度分别为1.0×10⁷-1.0×10⁰拷贝/μL)；B为熔解曲线；C为特异性实验(1：WSSV质粒标准品(1.0×10⁴拷贝/μL)，2：WSSV阳性样品DNA；3：SPF对虾；4：哈维弧菌；5：维氏气单胞菌；6：副溶血弧菌；7：无DNA酶水)；D为标准曲线。

图3为实施例3对对虾样品检测的熔解曲线；其中，1：SHIV阳性DNA；2：EHP阳性DNA；3：WSSV阳性DNA；4：SHIV、EHP和WSSV阴性DNA以及无DNA酶水。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

1同步扩增EHP的引物和程序

基于先前研究，在经过灵敏性、特异性实验和熔解曲线分析等研究后，确定了SHIV的定量检测方法，其引物为上游：5'-CAATCATGTTGTTGTATCCATCCTTCT-3'和下游：5'-GGTTTCATTCAACGTAAACGATCTCG-3'；试剂盒(20μL)的最佳组分为：2×TB Green Premix ExTaqⅡ10μL，上游引物(10μM)0.6μL，下游引物(10μM)0.6μL，DNA模板2μL，无DNA酶水6.8μL；最佳反应程序为95℃30s预变性，然后，95℃5s，60℃20s，循环40次。

为了建立同步扩增方法，基于上述试剂盒组分和反应程序，筛选EHP定量检测方法的最优引物。通过扩增实验和灵敏度、熔解曲线等分析，最终确定EHP的最佳检测引物为：

上游：5'-GCAGAGTGTTGTTAAGGGTTTAAGT-3'；

下游：5'-GCTGTTTGTCTCCAACTGTATTTGA-3'。

2对EHP质粒标准品的检测

取浓度为1.0×10⁸-1.0×10¹拷贝/μL的EHP质粒标准品作为模板，运用上述组分、程序和EHP引物进行实时定量PCR检测，不同浓度标准品均能获得典型的“S”形扩增曲线(图1A)，熔解曲线均为单一尖锐峰(图1B)，标准曲线(图1D)的线性方程和相关系数(R²)分别为y＝-3.3815x+37.718和0.997，组内变异系数小于1.06％(表1)。以上实验结果表明，该试剂盒对EHP具有很高的灵敏度和良好的稳定性。

表1EHP实时定量PCR技术的组内重复性

3特异性实验

运用该试剂盒对EHP阳性样品DNA模板进行扩增后，获得了与质粒标准品类似的“S”形扩增曲线(图1C)，而对其他样品如SPF对虾、哈维弧菌、维氏气单胞菌、副溶血弧菌和无DNA酶水等均未出现扩增。检测结果表明，该试剂盒对EHP具有良好的病原特异性。

实施例2

1同步扩增WSSV的引物和程序

为了建立同步扩增方法，基于实施例1中SHIV的试剂盒组分和反应程序，筛选WSSV定量检测方法的最优引物。通过扩增实验和灵敏度、熔解曲线等分析，最终确定WSSV的最佳检测引物为：

上游：5'-CGACAGACTACTAACTTCAGCCTAT-3'；

下游：5'-AAGAGGATACCAGATGCTCGTT-3'。

2对WSSV质粒标准品的检测

取浓度为1.0×10⁷-1.0×10⁰拷贝/μL的WSSV质粒标准品作为模板，运用上述组分、程序和WSSV引物进行实时定量PCR检测，不同浓度标准品均能获得典型的“S”形扩增曲线(图2A)，熔解曲线均为单一尖锐峰(图2B)，标准曲线(图2D)的线性方程和相关系数(R²)分别为y＝-3.1129x+35.626和0.999，组内变异系数小于0.6％(表2)。以上实验结果表明，该试剂盒对WSSV具有极高的灵敏度与稳定性。

表2 WSSV实时定量PCR技术的组内重复性

3特异性实验

运用该试剂盒对WSSV阳性样品DNA模板进行扩增后，获得了与质粒标准品类似的“S”形扩增曲线(图2C)，而对其他样品如SPF对虾、哈维弧菌、维氏气单胞菌、副溶血弧菌和无DNA酶水等均未出现扩增。检测结果表明，该试剂盒对WSSV具有良好的病原特异性。

实施例3

运用本发明试剂盒对经套式PCR检测过的15份对虾样品进行同步扩增，并以无DNA酶水作对照，检测后的熔解曲线如图3所示。在同一块定量PCR板上，熔解曲线只在78.4℃、79.7℃和83.5℃处出现3个尖锐峰，分别与SHIV、EHP和WSSV定量扩增产物的T_m值一致，而阴性样品和阴性对照没有出现熔解峰，显示了良好的病原特异性。与套式PCR的对比检测结果如表3所示，本发明试剂盒在15份样品中检测出8份SHIV阳性样品、6份EHP阳性样品和2份WSSV阳性样品，检出病原最低基因拷贝数分别为34(SHIV)、20(EHP)和68(WSSV)拷贝/μL，而常规套式PCR的检测阳性数分别为6份(SHIV)、4份(EHP)和1份(WSSV)，可见，本发明试剂盒的检测灵敏度显著提高。

表3同步定量PCR和套式PCR对对虾样品中3种病原的检测结果对比

SEQUENCE LISTING

<110> 中国水产科学研究院东海水产研究所

上海市动物疫病预防控制中心

<120> 一种同步定量检测3种重要虾类病原的试剂盒

<130> 1

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gcagagtgtt gttaagggtt taagt 25

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gctgtttgtc tccaactgta tttga 25

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cgacagacta ctaacttcag cctat 25

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aagaggatac cagatgctcg tt 22

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

caatcatgtt gttgtatcca tccttct 27

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ggtttcattc aacgtaaacg atctcg 26

Claims (4)

1.一种同步定量检测3种重要虾类病原的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括如下引物：

EHP上游：5'-GCAGAGTGTTGTTAAGGGTTTAAGT-3'；

EHP下游：5'-GCTGTTTGTCTCCAACTGTATTTGA-3'；

WSSV上游：5'-CGACAGACTACTAACTTCAGCCTAT-3'；

WSSV下游：5'-AAGAGGATACCAGATGCTCGTT-3'；

SHIV上游：5'-CAATCATGTTGTTGTATCCATCCTTCT-3'；

SHIV下游：5'-GGTTTCATTCAACGTAAACGATCTCG-3'。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述3种重要虾类病原为白斑综合征病毒WSSV、虾虹彩病毒SHIV和虾肝肠胞虫EHP。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒的组分为：2×TB GreenPremix Ex TaqⅡ10μL，上游引物0.6μL，下游引物0.6μL，DNA模板2μL，无DNA酶水6.8μL。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒的反应程序为：95℃30s预变性；然后95℃5s，60℃20s，循环40次。