CN108018379A

CN108018379A - 一种对虾虹彩病毒实时荧光定量pcr检测试剂盒

Info

Publication number: CN108018379A
Application number: CN201810011276.8A
Authority: CN
Inventors: 周俊芳; 程家骅; 房文红; 姜亚洲; 李新苍; 李楠英; 赵姝; 王元; 马清扬
Original assignee: East China Sea Fishery Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Current assignee: East China Sea Fishery Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Priority date: 2018-01-05
Filing date: 2018-01-05
Publication date: 2018-05-11

Abstract

本发明涉及一种对虾虹彩病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括特异性引物：IVQF：CAATCATGTTGTTGTATCCATCCTTCT；IVQR：GGTTTCATTCAACGTAAACGATCTCG。本发明基于实时荧光定量PCR方法，适用于对虾虹彩病毒病暴发风险的准确评估；检测灵敏性比常规PCR方法大幅提高，适用于对虾虹彩病毒隐性感染的早期监测。本发明具有良好的稳定性以及组内重复性，相对于探针法成本更低、操作更为简便，因此，具有良好的应用与推广前景。

Description

一种对虾虹彩病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒

技术领域

本发明属于对虾虹彩病毒疾病检测领域，特别涉及一种对虾虹彩病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒。

背景技术

虹彩病毒属于虹彩病毒科，是一种二十面体对称的胞浆型、双链DNA病毒。该科可分5个属，即蛙病毒属(Ranavirus)、淋巴囊肿病毒属(Lymphocystivirus)、细胞肿大病毒属(Megalocytivirus)、虹彩病毒属(Iridovirus)和绿虹彩病毒属(Chloriridovirus)。因此，宿主范围非常广泛，能够感染鱼类、两栖类和无脊椎动物，其中，虹彩病毒属和绿虹彩病毒属主要感染无脊椎动物。

对虾是我国重要的水产养殖经济品种，日本囊对虾和中国对虾还是我国重要的增殖渔业对象。然而，近两年调查研究发现，我国养殖日本囊对虾、中国对虾和凡纳滨对虾均存在对虾虹彩病毒感染，其中，养殖日本囊对虾和凡纳滨对虾的虹彩病毒感染率均在10％以上，流行地区野生日本囊对虾的虹彩病毒感染率更是高达50％以上，预示着很高的养殖和放流风险。

常规的病毒检测技术如组织病理、免疫组化等具有周期长、损伤大、不能一次确诊等缺点，而聚合酶链式反应(PCR)技术具有快速、灵敏和组织样品需要量极小的特点，特别适用于对育苗亲虾的筛选(损伤小)和对放流虾苗的病原监测。与常规PCR相比，实时荧光定量PCR技术具有灵敏度更高和可量化的特性，不仅能够大幅提高病原检出率，还能对疾病暴发的风险程度进行准确评估，从而大幅提升疾病防控策略的精准性。建立对虾虹彩病毒实时荧光定量PCR技术，可实现对对虾虹彩病毒病的早期预警和精准防控，为对虾的健康养殖和增殖放流等提供技术支撑。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种对虾虹彩病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，该试剂盒比常规PCR方法具有更高的检测灵敏性，大幅提高了病毒微量感染样品的检出率，因此，适用于对虾虹彩病毒隐性感染的早期监测以及对虾虹彩病毒病暴发风险的准确评估。

本发明提供了一种对虾虹彩病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括特异性引物：

IVQF：5'-CAATCATGTTGTTGTATCCATCCTTCT-3'；

IVQR：5'-GGTTTCATTCAACGTAAACGATCTCG-3'。

所述试剂盒的PCR反应体系为：总体积20μl，其中，Hot start DNApolymerase(5U/μl)0.12μl，10×Hot start DNA polymerase buffer(Mg²⁺20mM)2.4μl，dNTPs(各2.5mM)1.6μl，引物IVQF(10μM)0.6μl，引物IVQR(10μM)0.6μl，DNA模板2μl，1×SYBR Green I 1.6μl，无DNA酶水11.08μl；最后添加ROX Reference Dye 0.4μl。

所述试剂盒的PCR反应条件为：95℃30s预变性；然后95℃5s，60℃20s，循环40次。

本发明是基于SYBR Green I染料法建立的对虾虹彩病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，具有成本低、操作简便的特点。特异性实验显示，本发明对宿主对虾及其养殖过程中的常见病原——气单胞菌、副溶血弧菌和对虾白斑综合征病毒等的DNA模板都没有产生有效扩增，而对对虾虹彩病毒阳性DNA模板和阳性质粒扩增良好，形成典型的“S”形扩增曲线，显示本发明具有很强的病原特异性；灵敏性实验表明，当反应体系中的质粒标准品或对虾阳性样品DNA的模板量为10拷贝/μl时，仍能保持有效扩增；而且，在实际应用中，本发明的试剂盒也比常规PCR方法显示出更高的基因扩增效率，大幅提高了病毒检出率，因此，本发明建立的对虾虹彩病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒具有很高的病原特异性和灵敏性。另外，组内与组间重复性试验也表明，该试剂盒具有良好的稳定性和组内重复性，因此，适用于对虾虹彩病毒微量隐性感染时期的监测。综上，本发明基于SYBR Green I染料法建立的对虾虹彩病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒具有很高的病原特异性、灵敏性和实用性，可作为对虾虹彩病毒防控过程的技术支撑。

有益效果

本发明具有成本低、操作简便的特点，具有良好的稳定性以及组内和组间重复性；本发明比常规PCR方法具有更高的检测灵敏性，大幅提高了病毒微量感染样品的检出率，因此，适用于对虾虹彩病毒隐性感染的早期监测以及对虾虹彩病毒病暴发风险的准确评估；同时，也具有较高的检出率，显示了很高的检测灵敏性，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为实施例1实时荧光定量PCR检测试剂盒对不同浓度标准品的扩增曲线；

图2为图1中的7种标准品对应的熔解曲线；

图3为实施例1实时荧光定量PCR检测试剂盒的标准曲线；

图4为实施例1实时荧光定量PCR检测试剂盒的灵敏性实验；

图5为实施例1实时荧光定量PCR检测试剂盒的特异性实验；其中，1为质粒标准品(1.0×10⁴copies/μl)，2为对虾虹彩病毒阳性样品，3为白斑综合征病毒，4为健康凡纳滨对虾，5为气单胞菌，6为副溶血弧菌，7为无DNA酶水。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

1.引物设计与合成

根据对虾虹彩病毒MCP基因序列设计了5对特异性引物，并经生工生物工程股份有限公司合成备用。

2.DNA提取

取对虾鳃丝和头胸部组织约40-50mg，用水生动物组织DNA提取试剂盒提取总DNA作为扩增模板。

3.对虾虹彩病毒实时荧光定量PCR试剂盒

3.1最佳引物和反应程序

根据熔解曲线形态等条件，本发明经过一系列实验筛选出一对最佳引物，即：IVQF：5'-CAATCATGTTGTTGTATCCATCCTTCT-3'；IVQR：5'-GGTTTCATTCAACGTAAACGATCTCG-3'。其反应程序为95℃30s预变性；然后，95℃5s，60℃20s，循环40次。并经过系列实验，确定试剂盒最佳组成为：总体积20μl，其中，Hot start DNA polymerase(5U/μl)0.12μl，10×Hotstart DNA polymerase buffer(Mg²⁺20mM)2.4μl，dNTPs(各2.5mM)1.6μl，引物IVQF(10μM)0.6μl，引物IVQR(10μM)0.6μl，DNA模板2μl，1×SYBR Green I 1.6μl，无DNA酶水11.08μl；最后添加ROX Reference Dye 0.4μl。在此条件下，不同浓度标准品均能获得典型的“S”形扩增曲线(图1)，并且熔解曲线均为单一尖锐峰(图2)。

3.2标准曲线

运用优化好的实时荧光定量PCR试剂盒组成和反应条件，取浓度为1.0×10⁸～1.0×10²copies/μl的质粒标准品作为模板进行实时定量PCR检测，获得定量PCR试剂盒的扩增标准曲线，如图3所示。该标准曲线的线性方程为Ct＝-3.5043X+39.516(X为质粒拷贝数的对数)，相关系数R²＝0.9967。如表1所示，取浓度为1.0×10⁸～1.0×10²copies/μl的质粒标准品作为模板用试剂盒进行检测，得到的组内变异系数小于1.0％。以上系列标准品置于-80℃冰箱保存60天后，重复上述检测，结果如表2所示，7个浓度梯度的显著性分析结果均为P＞0.05，说明储存-80℃下60d和即时稀释的标准品扩增的标准曲线差异不显著。以上实验结果表明，本试剂盒具有良好的重复性和稳定性。

表1实时荧光定量PCR试剂盒的组内重复性

表2实时荧光定量PCR试剂盒的组间重复性

3.3试剂盒的检测敏感性

以浓度为1.0×10⁴～1.0×10¹copies/μl的质粒标准品作为模板，用本发明的试剂盒检测，结果所有模板均得到良好的“S”型扩增曲线(图4)，并且熔解曲线均呈现为单一尖锐峰，表明本试剂盒至模板浓度为10copies/μl时仍能有效检测对虾虹彩病毒，显示了试剂盒很高的检测灵敏性。

3.4试剂盒的检测特异性

运用本发明试剂盒对对虾虹彩病毒阳性样品DNA模板进行扩增后，获得了与质粒标准品类似的“S”形扩增曲线(图5的1、2)，而对其他样品如白斑综合征病毒、健康凡纳滨对虾、气单胞菌、副溶血弧菌和无DNA酶水(图5的3-7)的DNA模板均未出现扩增。检测结果表明，本发明的试剂盒具有良好的病原特异性。

实施例2

分别运用本发明的实时荧光定量PCR检测试剂盒和对虾虹彩病毒常规PCR检测方法，对采集的一批养殖日本囊对虾样品进行检测，结果如表3所示：本发明的实时荧光定量PCR检测试剂盒从14份样品中检出12份阳性，检出率为85.71％，而常规PCR方法到病毒含量为946copies/μl时已经检测不出，只检出9份阳性，检出率为64.29％。可见，本发明构建的实时荧光定量PCR检测试剂盒大幅提高了病毒检测灵敏性，大幅增加了对虾虹彩病毒隐性感染情况下的病原检出率。

表3不同方法对日本囊对虾体内对虾虹彩病毒的检测结果

样品编号	定量PCR(copies/ul)	常规PCR
			R16122101	1942	+
R16122102	3942	+
			R16122103	2216	+
R16122104	0	-
			R16122105	2391	+
R16122106	1709	+
			R16122107	4433	+
R16122108	55	-
			R16122109	3424	+
R16122110	0	-
			R16122111	979	+
R16122112	946	-
			R16122113	27	-
R16122114	1011	+

注：“-”表示阴性，“+”表示阳性

SEQUENCE LISTING

<110> 中国水产科学研究院东海水产研究所

<120> 一种对虾虹彩病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒

<130> 1

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

caatcatgtt gttgtatcca tccttct 27

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggtttcattc aacgtaaacg atctcg 26

Claims

1.一种对虾虹彩病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括特异性引物：

IVQF：5'-CAATCATGTTGTTGTATCCATCCTTCT-3'；

IVQR：5'-GGTTTCATTCAACGTAAACGATCTCG-3'。

2.根据权利要求1所述的一种对虾虹彩病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒的PCR反应体系为：总体积为20μl，其中，Hot start DNA polymerase 0.12μl，10×Hot start DNA polymerase buffer 2.4μl，dNTPs 1.6μl，引物IVQF 0.6μl，引物IVQR 0.6μl，DNA模板2μl，1×SYBR Green I 1.6μl，无DNA酶水11.08μl；最后添加ROXReference Dye 0.4μl。

3.根据权利要求1所述的一种对虾虹彩病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒的PCR反应条件为：95℃30s预变性；然后95℃5s，60℃20s，循环40次。