CN108220483A

CN108220483A - 一种用于罗非鱼湖病毒检测的试剂、检测方法及应用

Info

Publication number: CN108220483A
Application number: CN201810146973.4A
Authority: CN
Inventors: 郑晓聪; 刘荭; 史秀杰; 温智清; 黄建德; 王津津; 蔡汮龙; 贾鹏
Original assignee: Jin Ruihong Jie (xiamen) Biological Technology Co Ltd; Animal and Plant Inspection and Quarantine Technology Center of Shenzhen Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau
Current assignee: Jin Ruihong Jie (xiamen) Biological Technology Co Ltd; Animal and Plant Inspection and Quarantine Technology Center of Shenzhen Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau
Priority date: 2018-02-12
Filing date: 2018-02-12
Publication date: 2018-06-29

Abstract

本申请公开了一种用于罗非鱼湖病毒检测的试剂、检测方法及应用。本申请的试剂包括特异性引物对和探针，特异性引物对的上游引物为Seq ID No.1所示序列，下游引物为Seq ID No.2所示序列，探针为Seq ID No.3所示序列或者Seq ID No.3所示序列的反向互补序列，其中，探针序列的5’端具有荧光基团，3’端具有荧光淬灭基团。本申请为罗非鱼湖病毒的检测提供了一种新的特异性好、灵敏度高，且使用简单、方便、安全的检测试剂，特别适用于罗非鱼湖病毒的检验检疫，以及生产实践中对罗非鱼湖病毒的快速检测；对罗非鱼湖病毒的快速检疫和防控，最大限度的保障生产和贸易安全具有重大意义。

Description

一种用于罗非鱼湖病毒检测的试剂、检测方法及应用

技术领域

本申请涉及罗非鱼湖病毒检测领域，特别是涉及一种用于罗非鱼湖病毒检测的试剂、检测方法及应用。

背景技术

罗非鱼湖病毒(Tilapia Lake Virus，缩写TiLV)是近年来新发现的病毒，其分类地位尚未被确认。根据其生物学特性，目前TiLV被归类为正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的一种新的病毒。病毒粒子为具包膜的二十面体结构，大小为55～75nm。TiLV为分段、单链的负链RNA病毒，由10个基因片段组成。每一个片段都有1个开放阅读框(ORF)，编码10种蛋白。

罗非鱼湖病毒是引发罗非鱼合胞体肝炎(syncytical hepatitis of tilapia，SHT)的病原，感染TiLV可导致罗非鱼死亡率高达70％-90％，罗非鱼是全球第二大重要养殖鱼类，也是我国重要的养殖和出口产品。2000年至今，我国罗非鱼养殖量一直居世界第一，近年来，我国罗非鱼养殖产量仍保持增长态势，2015年总产量约178万吨，约占全球总产量的30％。罗非鱼产业作为我国出口导向型产业，主要依靠出口贸易来维持产业运转。国内共有133家罗非鱼加工出口企业，总出口量约40万吨，销往97个国家和地区。2002年开始我国罗非鱼的出口量与出口额基本都呈持续增长的态势，2005年罗非鱼出口量为10.74万吨，2009年为25.89万吨，2013年为40.67万吨，创下历史最高水平，总出口额为15.13亿美元。罗非鱼养殖已成为我国出口创汇和渔民增收的重要途径。自2009年开始，以色列、厄瓜多尔、埃及、泰国、印度等国相继暴发罗非鱼湖病毒，给全世界的罗非鱼养殖带来巨大威胁和严峻挑战。2017年5月，OIE、联合国粮农组织(FAO)、亚太地区水产养殖中心网(NACA)和国际农业研究磋商组织(CGIAR)等国际组织都针对TiLV发布了公告或预警，要求所有成员加强对该病毒的检疫和防范。

目前，有报道的TiLV的检测方法有四种，第一种是电镜观察法，第二种是病理切片法，第三种是逆转录PCR，第四种是SybrGreen qRT-PCR检测法。前三种检测方法操作复杂，耗费时间较长，一般在实验室确诊中使用，并且其检测灵敏度较低，只能用于发病罗非鱼或即将发病的罗非鱼进行检测。SybrGreenqRT-PCR检测法虽然灵敏度略高于前三种方法，但也存在特异性较低的缺点，容易出现假阳性，这在一定程度上也限制了该方法在生产中的推广应用。所以建立定量、快速和高灵敏的检测方法对检验检疫以及生产实践来说就显得尤为迫切和必要。

发明内容

本申请的目的是提供一种新的用于罗非鱼湖病毒检测的试剂、检测方法及应用。。

本申请采用了以下技术方案：

本申请的一方面公开了一种用于罗非鱼湖病毒检测的试剂，该试剂包括特异性引物对和与之配对的探针，特异性引物对的上游引物为Seq ID No.1所示序列，下游引物为Seq ID No.2所示序列，探针为Seq ID No.3所示序列或者Seq IDNo.3所示序列的反向互补序列；

Seq ID No.1：5’-CGAACTGTTGCCTTTGGAAATT-3’

Seq ID No.2：5’-TGAAGAATAAGTGGATTGCCTTTG-3’

Seq ID No.3：5’-CCGCGGCTGGCCTTCCAG-3’

其中，探针序列中，5’端具有荧光基团，3’端具有荧光淬灭基团。

需要说明的是，本申请的试剂，其引物对和探针是针对罗非鱼湖病毒设计的，能够特异性的对罗非鱼湖病毒进行快速、灵敏的检测。在本申请的一种实现方式中，具体设计了多组引物对和探针，最终筛选出扩增和检测效果最佳的特异性引物对和探针，即Seq IDNo.1和Seq ID No.2所示序列的引物对和Seq IDNo.3所示序列的探针。

优选的，荧光基团为FAM、TET、JOE、HEX、CY3或CY5。

优选的，荧光淬灭基团为BHQ1。

可以理解，荧光基团的选择是根据所使用的荧光检测仪的荧光通道进行的，不同的荧光检测仪具有检测一种或多种荧光基团的通道，例如FAM、TET、JOE、HEX、CY3、CY5等；而荧光淬灭基团则是根据荧光基团进行选择的，荧光淬灭基团的吸收光谱只要能够覆盖荧光基团的发射光谱即可，不只限于BHQ1。

本申请的另一面公开了本申请的用于罗非鱼湖病毒检测的试剂在罗非鱼湖病毒检测中的应用。

本申请的另一面公开了本申请的用于罗非鱼湖病毒检测的试剂在制备罗非鱼湖病毒检测试剂盒或设备中的应用。

本申请的另一面公开了一种用于罗非鱼湖病毒检测的试剂盒，该试剂盒中含有本申请的用于罗非鱼湖病毒检测的试剂。

优选的，试剂盒中还含有TaqMan探针法实时荧光定量逆转录PCR反应的缓冲液、酶或反应液mix。

优选的，试剂盒中还含有阳性对照样品，阳性对照样品为含有特异性引物对扩增靶标的阳性质粒。

本申请的再一面公开了一种罗非鱼湖病毒的检测方法，包括采用本申请的用于罗非鱼湖病毒检测的试剂，或本申请的试剂盒，对待测样品的核酸进行TaqMan探针法实时荧光定量逆转录PCR扩增，并采用荧光检测仪收集荧光。

本申请的有益效果在于：

本申请为罗非鱼湖病毒的检测提供了一种新的特异性好、灵敏度高，且使用简单、方便、安全的检测试剂，特别适用于罗非鱼湖病毒的检验检疫，以及生产实践中对罗非鱼湖病毒的快速检测；对罗非鱼湖病毒的快速检疫和防控，最大限度的保障生产和贸易安全具有重大意义。

附图说明

图1是本申请实施例中罗非鱼湖病毒检测引物筛选的试验结果；

图2是本申请实施例中罗非鱼湖病毒特异性检测结果；

图3是本申请实施例中罗非鱼湖病毒灵敏度检测结果。

具体实施方式

目前虽然已经有罗非鱼湖病毒的逆转录PCR检测法和SybrGreen qRT-PCR检测法，但是，这两种分子检测方法都存在灵敏度低、特异性差的问题；特别是SybrGreen qRT-PCR检测法，容易出现假阳性，这直接影响了其在检验检疫和生产实践中的应用。

基于以上问题，本申请特别研发了以TaqMan探针的实时荧光定量逆转录PCR扩增技术为基础的罗非鱼湖病毒特异性检测试剂。本申请的试剂中，引物本身具有很好的特异性，保障了罗非鱼湖病毒的检测特异性；与此同时，与引物配对的探针，同样具有很好的特异性，进一步保障了检测的特异性；因此，相比于现有的SybrGreen qRT-PCR检测法，本申请的试剂具有更好的特异性，并且不容易出现假阳性，这极大的保障了检验检疫或生产实践中罗非鱼湖病毒检测的准确性。并且，本申请的试剂灵敏度高，在本申请的一种实现方式中，对罗非鱼湖病毒的检测灵敏度高达10个拷贝/μL，能够很好的满足检验检疫和生产实践的使用需求。

下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。

实施例

一、材料和方法

1.供试核酸

本例供试病毒包括罗非鱼湖病毒(TILV)、传染性鲑鱼贫血症病毒(ISAV)、病毒性神经坏死病毒(VNNV)、草鱼呼肠孤病毒(GCHV)、病毒性败血病病毒(VHSV)、传染性造血器官坏死病毒(IHNV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)、牙鲆弹状病毒(HRV)、鲤疱疹病毒3型(CyHV-3)和鲤疱疹病毒2型(CyHV-2)。

2.主要的试剂和仪器

本例使用的试剂主要包括，RNA提取试剂盒(Qiagen)、一步法荧光定量RT-PCR试剂盒(宝生物工程(大连)有限公司)、质粒提取试剂盒(Takara公司)，ABI7500实时荧光定量PCR系统等。

3.核酸提取

本例将各样品保存在饱和醋酸铵溶液中，采用商品化的RNA提取试剂盒(Qiagen)按照试剂盒说明书提取RNA，提取的RNA放于-80℃保存备用。

4.引物和探针设计

本例利用软件ClustalW和DNAstar筛选罗非鱼湖病毒基因组的保守片段，借助Primer Premier5.O进行引物、探针的设计和筛选，然后利用GenBank的Blast的功能确定引物和探针的特异性。本例最后一共设计了3套引物，引物和探针序列送至生工生物工程(上海)有限责任公司进行合成。具体的引物和探针序列如表1所示。

表1罗非鱼湖病毒检测的引物和探针序列

表1中，探针TiLV S3-P1、TiLV S4-P1和TiLV S5-P1的5’端分别具有FAM荧光标记，3’端分别具有BHQ1荧光淬灭基团。

5.反应体系和反应条件

采用商品化的一步法荧光定量RT-PCR试剂盒(宝生物工程(大连)有限公司)，根据试剂盒的说明书配制反应液，反应液总体积为25μL，包括：反应缓冲液12.5μL，TaqHS混液1μL，PrimeScript PLUS RTase混液1μL，ROX参比染料lμL，10mmol/L的探针0.2～0.5μL，10mmol/L的上下游引物各1μL，RNA样品1～5μL，用无RNase水为补齐25μL。

上述反应液由ABI7500实时荧光定量PCR系统进行反应，反应条件包括：(1)逆转录反应：50℃5分钟，95℃10秒；(2)PCR反应包括40个循环的如下步骤：95℃5秒，60℃30秒。

扩增完成后，在荧光基团1通道内荧光曲线呈“S”型曲线且CT≤35.0，判断为阳性；无典型“S”型扩增或CT＞35.0，判断为阴性。

6.RNA标准品的制备和标准曲线的制作

以TILV阳性病料RNA为模板，利用引物TiLV S3-F1和引物TiLV S3-R1进行逆转录PCR，获得片段大小为69bp的PCR产物，对该PCR产物进行胶回收、纯化，以T-Vector pMD-18作为纯化后的PCR产物的转录载体，然后转化入DH5a感受态细胞中利用质粒提取试剂盒(Takara公司)进行质粒的提取，利用EcoRⅠ(TaKaRa公司)37℃单酶切2小时，使质粒线性化，利用SP6RNAPolymerase(TakaRa公司)进行体外转录，合成后的RNA利用DNase I进行质粒DNA降解，然后使用Rneasy Mini Kit(QIAGEN)进行RNA纯化，并用紫外分光光度计测定RNA的浓度与纯度，根据测定的浓度计算拷贝数。然后用DEPC水将RNA进行10倍梯度稀释，稀释成10⁷～10⁰copies/μL，作为RNA标准品以制作标准曲线。具体如下：

(1)逆转录PCR扩增

逆转录PCR扩增参考“5.反应体系和反应条件”，所不同的是，不添加探针，其余均相同。

(2)PCR产物回收

本例采用DNA凝胶回收试剂盒(宝生物工程(大连)有限公司)对PCR扩增产物进行切胶回收，具体方法和步骤参考说明书。

(3)阳性质粒制备

本例采用T-Vector pMD-18质粒作为载体，将纯化回收的PCR扩增产物转录入载体中，然后转化入DH5a感受态细胞中，利用质粒提取试剂盒(Takara公司)进行质粒的提取。

(4)酶切

本例采用EcoR Ⅰ(TaKaRa公司)37℃单酶切2小时，使阳性质粒线性化，酶切反应体系为：EcoRI 1μL，10×H Buffer 2μL，质粒DNA 5μL，DEPC水12μL。

(5)体外转录

本例采用SP6RNA Polymerase(TakaRa公司)进行体外转录，37℃反应1小时，反应体系为：10×SP6RNA polymerase Buffer 2μL，100mM的DTT 2μL，0.1％BSA 2μL，dNTPs 1μL，RNase Inhibitor 0.5μL，线性质粒DNA 1μL，DEPC水11.5μL。

合成后的RNA利用DNase I进行质粒DNA降解，反应条件为：37℃反应30min，体系为：体外转录RNA 20μL，10×Dnase I Buffer 5μL，Recombinant DnaseI 2μL，RNaseInhibitor 1μL，DEPC水22μL。

然后使用Rneasy Mini Kit(QIAGEN)进行RNA纯化，具体步骤和条件参考试剂盒使用说明书。

纯化产物采用紫外分光光度计测定RNA的浓度和纯度，根据测定的浓度计算拷贝数。然后用DEPC水将RNA进行10倍梯度稀释，稀释成10⁷～10⁰copies/μL，作为RNA标准品以测试灵敏度。

7.引物筛选实验

以TILV核酸为模板对三组引物和探针进行测试，筛选特异性好，且扩增效果好的引物探针组合。

8.特异性试验

分别以罗非鱼湖病毒(TILV)、传染性鲑鱼贫血症病毒(ISAV)、病毒性神经坏死病毒(VNNV)、草鱼呼肠孤病毒(GCHV)、病毒性败血病病毒(VHSV)、传染性造血器官坏死病毒(IHNV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)、牙鲆弹状病毒(HRV)、鲤疱疹病毒3型(CyHV-3)、鲤疱疹病毒2型(CyHV-2)的核酸为模板，采用本例设计的引物和探针进行检测，反应体系和条件参考“5.反应体系和反应条件”。

9.灵敏度试验

采用“7.引物筛选实验”筛选获得的引物探针组合，对“6.RNA标准品的制备和标准曲线的制作”的RNA标准品进行灵敏度检测。

10.临床测试

对收集的30份罗非鱼样品，采用“7.引物筛选实验”筛选获得的引物探针组合进行检测。

同时采用文献《Detection of Tilapia Lake Virus in Clinical Samples byCulturing and Nested Reverse Transcription-PCR》报道的巢式逆转录PCR方法进行对比测试，巢式逆转录PCR的反应体系和条件参考文献报道。

二、结果和分析

1.引物筛选

以TILV核酸为模板对三组引物和探针进行测试，结果如图1所示。图1中，曲线末端由上到下的曲线依序为第一组试剂、第二组试剂和第三组试剂的扩增曲线，第一组试剂即引物对TiLV S3-F1、TiLV S3-R1和探针TiLV S3-P1，第二组试剂即引物对TiLV S4-F1、TiLVS4-R1和探针TiLV S4-P1，第二组试剂即引物对TiLV S5-F1、TiLV S5-R1和探针TiLV S5-P1。图1的结果显示，三组引物探针都能够得到扩增曲线，证明三组引物探针都可以有效的对罗非鱼湖病毒进行扩增检测；但是，其中第二组试剂和第三组试剂的荧光信号相对较弱，第一组试剂能够得到较强的荧光信号，说明第一组试剂的扩增效果或效率远高于其他两组引物探针。因此，本例的后续试验中以第一组试剂进行特异性和灵敏度的检测。

2.特异性试验结果

第一组试剂的引物探针对罗非鱼湖病毒及其它供试毒株的特异性检测，结果如图2所示。图2的结果显示，第一组试剂的引物只对罗非鱼湖病毒有特异性扩增，而对其它供试毒株没有扩增。

3.敏感性试验结果

采用第一组试剂对RNA标准品进行灵敏度测试，结果如图3所示，图3中，由左至右的曲线依序为10⁷copies/μL、10⁶copies/μL、10⁵copies/μL、10⁴copies/μL、10³copies/μL、10²copies/μL、10¹copies/μL的检测曲线，100copies/μL没有扩增曲线。图3的结果显示，本例的第一组试剂对罗非鱼湖病毒的检测灵敏度高达10个拷贝/μL。

4.样品检测结果

采用第一组试剂对30份罗非鱼样品的检测结果显示，本例的试剂和方法能够检出24份阳性样品，并且扩增曲线的Ct值均不到35；而作为对比的巢式逆转录PCR仅能检出20份阳性样品，详见表2，可见本例的试剂和方法具有更高的灵敏度。

表2样品检测结果汇总表

表1中“十”表示检出结果为阳性，“一”表示没有检出

以上各项测试的结果显示，本申请提供了一种能够定量、快速、实时检测罗非鱼湖病毒的方法和试剂，克服了现有技术的不足，使罗非鱼湖病毒的检测更准确、灵敏、快速、安全和方便。

以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本申请的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心

金瑞鸿捷(厦门)生物科技有限公司

<120> 一种用于罗非鱼湖病毒检测的试剂、检测方法及应用

<130> 18I26011

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cgaactgttg cctttggaaa tt 22

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tgaagaataa gtggattgcc tttg 24

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccgcggctgg ccttccag 18

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gaggctttta tcaccttcat ctttg 25

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aaccagcaga tggactgaat actg 24

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cccagtgcag gcacacaggt tgc 23

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

catcccaaac actattgcaa gaat 24

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

atccctcgtc tgtaaatctg ataaca 26

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ccccaaaggc tgcaaattgc tcc 23

Claims

1.一种用于罗非鱼湖病毒检测的试剂，其特征在于：所述试剂包括特异性引物对和与之配对的探针，所述特异性引物对的上游引物为Seq ID No.1所示序列，下游引物为Seq IDNo.2所示序列，所述探针为Seq ID No.3所示序列或者Seq ID No.3所示序列的反向互补序列；

Seq ID No.1：5’-CGAACTGTTGCCTTTGGAAATT-3’

Seq ID No.2：5’-TGAAGAATAAGTGGATTGCCTTTG-3’

Seq ID No.3：5’-CCGCGGCTGGCCTTCCAG-3’

其中，探针序列的5’端具有荧光基团，3’端具有荧光淬灭基团。

2.根据权利要求1所述的用于罗非鱼湖病毒检测的试剂，其特征在于：所述荧光基团为FAM、TET、JOE、HEX、CY3或CY5。

3.根据权利要求1所述的用于罗非鱼湖病毒检测的试剂，其特征在于：所述荧光淬灭基团为BHQ1。

4.根据权利要求1-3任一项所述的用于罗非鱼湖病毒检测的试剂在罗非鱼湖病毒检测中的应用。

5.根据权利要求1-3任一项所述的用于罗非鱼湖病毒检测的试剂在制备罗非鱼湖病毒检测试剂盒或设备中的应用。

6.一种用于罗非鱼湖病毒检测的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有权利要求1-3任一项所述的用于罗非鱼湖病毒检测的试剂。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还含有TaqMan探针法实时荧光定量逆转录PCR反应的缓冲液、酶或反应液mix。

8.根据权利要求6或7所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还含有阳性对照样品，所述阳性对照样品为含有所述特异性引物对扩增靶标的阳性质粒。

9.一种罗非鱼湖病毒的检测方法，其特征在于：包括采用权利要求1-3任一项所述的用于罗非鱼湖病毒检测的试剂，或权利要求6-8任一项所述的试剂盒，对待测样品的核酸进行TaqMan探针法实时荧光定量逆转录PCR扩增，并采用荧光检测仪收集荧光。