CN111004865A - 鱼病原体检测方法 - Google Patents

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陈子翔
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Abstract

本发明涉及一种检测鱼病原体的方法。此外，本发明并涉及用于检测鱼病原体的寡核苷酸对。

Description

鱼病原体检测方法
技术领域
本发明关于检测鱼病原体的方法，特别是关于使用寡核苷酸对检测鱼病原体的方法。
背景技术
水产动物是人类重要的能量、蛋白质与必需营养的来源之一。大量捕捞野生水产动物对海洋资源耗尽的疑虑，使得水产养殖业日益受到重视。根据联合国粮食及农业组织的统计，水产养殖对全球捕捞及养殖总产量的贡献逐步提升，从2000年的25.7％增至2016年的46.8％。然而，密集养殖加上管理不良可能造成水产动物容易感染疾病、死亡，而造成渔民的损失。此外，水产动物的病害多由细菌或病毒引起，细菌性疾病与病毒性疾病的处理方法相差甚远，一旦误诊，处理不当，就会造成巨大的损失。由此可见，在饲养渔场、虾场密集监控疾病对管理而言是不可或缺的一环。本发明即提供了快速、方便的鱼病原体检测方法以供产业利用。
发明内容
于一方面，本发明涉及一种鱼病原体检测方法，包含提供一可能含有一鱼病原体的一或多个核苷酸序列的样本；提供一寡核苷酸引物对，所述寡核苷酸引物对包含一第一引物与一第二引物，所述寡核苷酸引物对定义在所述病原体的一或多个核苷酸序列上一双股目标序列的二互补股的5’端；提供一聚合酶；在一容器中混合所述样本、所述寡核苷酸引物对、所述聚合酶、脱氧腺苷三磷酸(deoxyadenosine triphosphates,dATPs)、脱氧胞核苷三磷酸(deoxycytidine triphosphates,dCTPs)、脱氧鸟苷三磷酸(deoxyguanosinetriphosphates,dGTPs)，以及脱氧胸苷三磷酸(deoxythymidine triphosphates,dTTPs)，以形成一聚合酶链锁反应(polymerase chain reaction,PCR)混合物；透过在一固定温度下加热所述容器的底部，使所述PCR混合物进行热对流聚合酶链锁反应(convectivepolymerase chain reaction,cPCR)，以形成一PCR产物；以及侦测所述PCR产物以辨识所述双股目标序列。
在某些实施方案中，所述聚合酶链锁反应(PCR)混合物进一步包含一寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包含一与所述双股目标序列的一区段互补的寡核苷酸探针序列、一附加于所述寡核苷酸探针上的一第一位置的荧光分子，以及一附加于所述寡核苷酸探针上的一第二位置的荧光抑制分子，当所述寡核苷酸探针未杂合于所述双股目标序列的所述区段时，所述荧光抑制分子大体上抑制所述荧光分子，且当所述寡核苷酸探针杂合于所述双股目标序列的所述区段时，所述荧光分子大体上未被抑制。
于另一方面，本发明涉及一种用于侦测鱼病原体的寡核苷酸对，包含一第一引物与一第二引物。
在某些实施方案中，所述寡核苷酸对进一步包含一寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针具有一寡核苷酸探针序列、一附加于所述寡核苷酸探针上的一第一位置的荧光分子，以及一附加于所述寡核苷酸探针上的一第二位置的荧光抑制分子。
在某些实施方案中，所述病原体为发光杆菌杀鱼亚种(Photobacterium damselaesubsp.Piscicida)，且所述第一引物与所述第二引物的序列组合选自由下列所组成之群组：SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:2与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9与SEQ ID NO:10，以及SEQ ID NO:12与SEQ ID NO:13。
在某些实施方案中，所述病原体为发光杆菌杀鱼亚种，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:2与SEQ ID NO:3时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体发光杆菌杀鱼亚种的青霉素结合蛋白1A(penicillin-binding protein1A,Pbp-1A)基因(GenBank accession No.EU164926)的第1908至第1946个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:5所示。
在某些实施方案中，所述病原体为发光杆菌杀鱼亚种，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:2与SEQ ID NO:4时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体发光杆菌杀鱼亚种的青霉素结合蛋白1A (Pbp-1A)基因(GenBank accession No.EU164926)的第1908至第1939个核苷酸之间的13至30个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:5所示。
在某些实施方案中，所述病原体为发光杆菌杀鱼亚种，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:6与SEQ ID NO:7时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体发光杆菌杀鱼亚种的青霉素结合蛋白1A(Pbp-1A)基因(GenBank accessionNo.EU164926)的第1226至第1291个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:8所示。
在某些实施方案中，所述病原体为发光杆菌杀鱼亚种，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:9与SEQ ID NO:10时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体发光杆菌杀鱼亚种的青霉素结合蛋白1A(Pbp-1A)基因(GenBank accessionNo.EU164926)的第1244至第1304个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:11所示。
在某些实施方案中，所述病原体为发光杆菌杀鱼亚种，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:12与SEQ ID NO:13时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体发光杆菌杀鱼亚种的青霉素结合蛋白1A(Pbp-1A)基因(GenBank accessionNo.EU164926)的第1181至第1243个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:14所示。
在某些实施方案中，所述病原体为罗非鱼病毒(Tilapia Lake Virus,TiLV)，且所述第一引物与所述第二引物的序列组合选自由下列所组成之群组：SEQ ID NO:15与SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:18与SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21与SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24与SEQID NO:27、SEQ ID NO:25与SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:26与SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:24与SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:25与SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:26与SEQ ID NO:28，以及SEQ IDNO:30与SEQ ID NO:31。
在某些实施方案中，所述病原体为罗非鱼病毒(TiLV)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:15与SEQ ID NO:16时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体罗非鱼病毒(TiLV)蛋白基因(GenBank accession No.KJ605629)的第574至第617个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:17所示。
在某些实施方案中，所述病原体为罗非鱼病毒(TiLV)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:18与SEQ ID NO:19时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体罗非鱼病毒(TiLV)蛋白基因(GenBank accession No.KJ605629)的第525至第577个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:20所示。
在某些实施方案中，所述病原体为罗非鱼病毒(TiLV)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:21与SEQ ID NO:22时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体罗非鱼病毒(TiLV)蛋白基因(GenBank accession No.KJ605629)的第1122至第1163个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:23所示。
在某些实施方案中，所述病原体为罗非鱼病毒(TiLV)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:24与SEQ ID NO:27时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体罗非鱼病毒(TiLV)蛋白基因(GenBank accession No.KJ605629)的第486至第529个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:29所示。
在某些实施方案中，所述病原体为罗非鱼病毒(TiLV)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:25与SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:26与SEQ ID NO:27时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体罗非鱼病毒(TiLV)蛋白基因(GenBankaccession No.KJ605629)的第499至第529个核苷酸之间的13至30个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:29所示。
在某些实施方案中，所述病原体为罗非鱼病毒(TiLV)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:24与SEQ ID NO:28时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体罗非鱼病毒(TiLV)蛋白基因(GenBank accession No.KJ605629)的第486至第524个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:29所示。
在某些实施方案中，所述病原体为罗非鱼病毒(TiLV)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:25与SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:26与SEQ ID NO:28时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体罗非鱼病毒(TiLV)蛋白基因(GenBankaccession No.KJ605629)的第499至第524个核苷酸之间的13至25个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:29所示。
在某些实施方案中，所述病原体为罗非鱼病毒(TiLV)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:30与SEQ ID NO:31时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体罗非鱼病毒(TiLV)蛋白基因(GenBank accession No.KJ605629)的第875至第926个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:32所示。
在某些实施方案中，所述病原体为锦鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus,KHV)，且所述第一引物与所述第二引物的序列组合选自由下列所组成之群组：SEQ ID NO:33与SEQ IDNO:34、SEQ ID NO:36与SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39与SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42与SEQID NO:43，以及SEQ ID NO:45与SEQ ID NO:46。
在某些实施方案中，所述病原体为锦鲤疱疹病毒(KHV)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:33与SEQ ID NO:34时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体锦鲤疱疹病毒(KHV)基因组(GenBank accession No.KX544848)的第164188至第164234个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:35所示。
在某些实施方案中，所述病原体为锦鲤疱疹病毒(KHV)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:36与SEQ ID NO:37时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体锦鲤疱疹病毒(KHV)基因组(GenBank accession No.KX544848)的第163929至第163986个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:38所示。
在某些实施方案中，所述病原体为锦鲤疱疹病毒(KHV)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:39与SEQ ID NO:40时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体锦鲤疱疹病毒(KHV)基因组(GenBank accession No.KX544848)的第164882至第164918个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:41所示。
在某些实施方案中，所述病原体为锦鲤疱疹病毒(KHV)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:42与SEQ ID NO:43时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体锦鲤疱疹病毒(KHV)基因组(GenBank accession No.KX544848)的第164100至第164129个核苷酸之间的13至30个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:44所示。
在某些实施方案中，所述病原体为锦鲤疱疹病毒(KHV)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:45与SEQ ID NO:46时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体锦鲤疱疹病毒(KHV)基因组(GenBank accession No.KX544848)的第164313至第164358个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:47所示。
在某些实施方案中，所述病原体为神经坏死病毒(Nervous necrosis virus,NNV)，且所述第一引物与所述第二引物的序列组合选自由下列所组成之群组：SEQ ID NO:48与SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:52与SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:52与SEQ ID NO:54、SEQ IDNO:55与SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58与SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61与SEQ ID NO:59、SEQID NO:61与SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63与SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:63与SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:63与SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:66与SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:66与SEQ IDNO:68，以及SEQ ID NO:70与SEQ ID NO:71。
在某些实施方案中，所述病原体为神经坏死病毒(NNV)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:48与SEQ ID NO:49时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体神经坏死病毒(NNV)衣壳蛋白(capsid protein)基因(GenBank accessionNo.MF565445)的第349至第396个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:50或SEQ ID NO:51所示。
在某些实施方案中，所述病原体为神经坏死病毒(NNV)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:52与SEQ ID NO:53时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体神经坏死病毒(NNV)衣壳蛋白基因(GenBank accession No.MF565445)的第371至第423个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:51所示。
在某些实施方案中，所述病原体为神经坏死病毒(NNV)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:52与SEQ ID NO:54时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体神经坏死病毒(NNV)衣壳蛋白基因(GenBank accession No.MF565445)的第371至第429个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:51所示。
在某些实施方案中，所述病原体为神经坏死病毒(NNV)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:55与SEQ ID NO:56时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体神经坏死病毒(NNV)衣壳蛋白基因(GenBank accession No.MF565445)的第326至第374个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:57所示。
在某些实施方案中，所述病原体为神经坏死病毒(NNV)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:58与SEQ ID NO:59或SEQ ID NO:61与SEQ ID NO:59时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体神经坏死病毒(NNV)衣壳蛋白基因(GenBankaccession No.MF565445)的第308至第352个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:60所示。
在某些实施方案中，所述病原体为神经坏死病毒(NNV)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:61与SEQ ID NO:62时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体神经坏死病毒(NNV)衣壳蛋白基因(GenBank accession No.MF565445)的第307至第367个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:60所示。
在某些实施方案中，所述病原体为神经坏死病毒(NNV)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:63与SEQ ID NO:64或SEQ ID NO:63与SEQ ID NO:67时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体神经坏死病毒(NNV)衣壳蛋白基因(GenBankaccession No.MF565445)的第311至第380个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:65或SEQ ID NO:69所示。
在某些实施方案中，所述病原体为神经坏死病毒(NNV)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:63与SEQ ID NO:68时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体神经坏死病毒(NNV)衣壳蛋白基因(GenBank accession No.MF565445)的第351至第380个核苷酸之间的13至30个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:65所示。
在某些实施方案中，所述病原体为神经坏死病毒(NNV)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:66与SEQ ID NO:67时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体神经坏死病毒(NNV)衣壳蛋白基因(GenBank accession No.MF565445)的第310至第371个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:65所示。
在某些实施方案中，所述病原体为神经坏死病毒(NNV)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:66与SEQ ID NO:68时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体神经坏死病毒(NNV)衣壳蛋白基因(GenBank accession No.MF565445)的第351至第371个核苷酸之间的13至21个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:65所示。
在某些实施方案中，所述病原体为神经坏死病毒(NNV)，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:70与SEQ ID NO:71时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体神经坏死病毒(NNV)衣壳蛋白基因(GenBank accession No.MF565445)的第345至第363个核苷酸之间的13至19个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如SEQ IDNO:72所示。
在某些实施方案中，所述病原体为淋巴囊肿病毒(Lymphocystis virus)，且所述第一引物与所述第二引物的序列组合选自由下列所组成之群组：SEQ ID NO:73与SEQ IDNO:74、SEQ ID NO:76与SEQ ID NO:77，以及SEQ ID NO:79与SEQ ID NO:80。
在某些实施方案中，所述病原体为淋巴囊肿病毒，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:73与SEQ ID NO:74时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体淋巴囊肿病毒主要衣壳蛋白(major capsid protein,MCP)基因(GenBankaccession No.HE650106)的第942至第981个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:75所示。
在某些实施方案中，所述病原体为淋巴囊肿病毒，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:76与SEQ ID NO:77时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体淋巴囊肿病毒主要衣壳蛋白(MCP)基因(GenBank accession No.HE650106)的第124至第167个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:78所示。
在某些实施方案中，所述病原体为淋巴囊肿病毒，且当所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:79与SEQ ID NO:80时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体淋巴囊肿病毒主要衣壳蛋白(MCP)基因(GenBank accession No.HE650106)的第677至第798个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；在某些较佳实施方案中，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:81所示。
本说明书中所述的所有技术性及科学术语，除非另外有所定义，皆为该所属领域具有通常技艺者可共同了解的意义。
本发明以下面的实施例予以示范阐明，但本发明不受下述实施例所限制。
具体实施方式
于一方面，本发明涉及一种鱼病原体检测方法。在某些实施方案中，所述方法为聚合酶链锁反应(polymerase chain reaction,PCR)。在某些实施方案中，所述方法为反转录聚合酶链锁反应(reverse-transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)。在某些实施方案中，所述方法为热对流聚合酶链锁反应(convective polymerase chainreaction,cPCR)。在某些实施方案中，所述方法为实时聚合酶链锁反应(real-timepolymerase chain reaction,real-time PCR)。
于一方面，本发明涉及一种鱼病原体检测方法，包含:
提供一可能含有鱼病原体的一或多个核苷酸序列的样本；
提供一寡核苷酸引物对，所述寡核苷酸引物对包含一第一引物与一第二引物，所述寡核苷酸引物对定义在所述病原体的一或多个核苷酸序列上一双股目标序列的二互补股的5’端；
提供一聚合酶；
在一容器中混合所述样本、所述寡核苷酸引物对、所述聚合酶、脱氧腺苷三磷酸(dATPs)、脱氧胞核苷三磷酸(dCTPs)、脱氧鸟苷三磷酸(dGTPs)，以及脱氧胸苷三磷酸(dTTPs)，以形成一聚合酶链锁反应(PCR)混合物；
透过在一固定温度下加热所述容器的底部，使所述PCR混合物进行热对流聚合酶链锁反应(cPCR)，以形成一PCR产物；以及侦测所述PCR产物以辨识所述双股目标序列。
于另一方面，本发明涉及一种鱼病原体检测方法，包含:
提供一可能含有鱼病原体的一或多个核苷酸序列的样本；
提供一寡核苷酸引物对，所述寡核苷酸引物对包含一第一引物与一第二引物，所述寡核苷酸引物对定义在所述病原体的一或多个核苷酸序列上一双股目标序列的二互补股的5’端；
提供一寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包含一与所述双股目标序列的一区段互补的寡核苷酸探针序列、一附加于所述寡核苷酸探针上的一第一位置的荧光分子，以及一附加于所述寡核苷酸探针上的一第二位置的荧光抑制分子，当所述寡核苷酸探针未杂合于所述双股目标序列的所述区段时，所述荧光抑制分子大体上抑制所述荧光分子，且当所述寡核苷酸探针杂合于所述双股目标序列的所述区段时，所述荧光分子大体上未被抑制；
提供一聚合酶；
在一容器中混合所述样本、所述寡核苷酸引物对、所述聚合酶、脱氧腺苷三磷酸(dATPs)、脱氧胞核苷三磷酸(dCTPs)、脱氧鸟苷三磷酸(dGTPs)，以及脱氧胸苷三磷酸(dTTPs)，以形成一聚合酶链锁反应(PCR)混合物；
透过在一固定温度下加热所述容器的底部，使所述PCR混合物进行热对流聚合酶链锁反应(cPCR)，以形成一PCR产物；以及侦测所述PCR产物以辨识所述双股目标序列。
于又一方面，本发明涉及一种用于侦测鱼病原体的寡核苷酸对。
于再一方面，本发明涉及一种用于侦测鱼病原体的寡核苷酸对与寡核苷酸探针。
应当进一步理解的是，在某些实施方案中，本文揭露的寡核苷酸对及/或寡核苷酸探针可用于各种基础PCR技术之变异，例如，但不限于，反转录聚合酶链锁反应(RT-PCR)、热对流聚合酶链锁反应(cPCR)、实时聚合酶链锁反应(real-time PCR)、巢式聚合酶链锁反应(nested PCR)，以及热不对称性交错聚合酶链锁反应(thermal asymmetric interlacedPCR,TAIL-PCR)。
如本文所用，术语「鱼病原体」意指在鱼生物体内外发现的病毒性、细菌性及寄生性病原体。鱼病原体的实例如，但不限于：发光杆菌杀鱼亚种(P.damselaesubsp.Piscicida)、罗非鱼病毒(TiLV)、锦鲤疱疹病毒(KHV)、神经坏死病毒(NNV)，以及淋巴囊肿病毒(Lymphocystis virus)。
如本文所用，术语「热对流聚合酶链锁反应(cPCR)」是指一种聚合酶链锁反应，其中，将一装有一PCR样品的管状容器底部嵌入一稳定热源中，并控制所述PCR的参数，包括所述PCR样品的总体积、黏度、表面温度，以及所述管状容器的内径，使得所述PCR样品的底部到顶部的温度梯度下降，诱导热对流并且使得PCR样品的变性、黏合、聚合在所述管状容器的不同区域中依序且重复发生。热对流聚合酶链锁反应(cPCR)的详细描述请参见如美国专利号8,187,813，其以引用的方式将其整体并入本文。
如本文所用，术语「荧光分子」意指一物质或其一部份，其系能够在可侦测的范围内显示荧光。如本文所用，术语「荧光抑制分子」意指一物质或其一部份，其系能够抑制当由一光源激发时由所述荧光分子所发射的荧光。在某些实施方案中，术语「荧光分子」与「荧光抑制分子」为TaqManTM分析套组(Applied Biosystems Inc.，加州，美国)的荧光分子与荧光抑制分子。TaqManTM分析套组的详细描述请参见如，Holland et al.,Proc.Natl.Acad.Sci,U.S.A.(1991)88:7276-7280；美国专利号5,538,848、5,723,591、5,876,930，以及7,413,708皆以引用的方式将其整体并入本文。
所述荧光分子的例子包括，但不限于，3-(ε-羧)-3'-乙基-5,5'-二甲基己羰花青(3-(ε-carboxypentyl)-3'-ethyl-5,5'-dimethyloxa-carbocyanine,CYA)、6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein,FAM)、5,6-羧基罗丹明-L LO(5,6-carboxyrhodamine-l lO,R110)、6羧基罗丹明-6G(6-carboxyrhodamine-6G,R6G)、N’,N’,N’,N’-四甲基-6-羧基罗丹明
(N’,N’,N’,N’-tetramethyl-6-carboxyrhodamine,TAMRA)、6-羧基-X-罗丹明(6-carboxy-X-rhodamine,ROX)、2’,4’,5’,7’-四氯4-7-二氯荧光素(2’,4’,5’,7’-tetrachloro-4-7-dichlorofluorescein,TET)、2',7-二甲氧基-4',5'-6羧基罗丹明(2’,7-dimethoxy-4’,5’-6carboxyrhodamine,JOE)、6-羧基-2',4,4',5',7,7'-六氯荧光素(6-carboxy-2’,4,4’,5’,7,7’-hexachlorofluorescein,HEX)、ALEXA荧光、Cy3荧光与Cy5荧光。所述荧光抑制分子的例子包括，但不限于，4-(4'-二甲基氨基-苯偶氮基)苯甲酸(4-(4’-dimethylamino-phenylazo)-benzoic acid,Dabcyl)、黑洞荧光抑制剂1(Black HoleQuencher 1,BHQ1)、黑洞荧光抑制剂2(BlackHole Quencher 2,BHQ2)、黑洞荧光抑制剂3(BlackHole Quencher3,BHQ3)、二氢环吡咯并吲哚三肽小沟结合物(dihydro cyclopyrrolo indole tripeptide minor groove binder,MGB)、四甲基罗丹明(tetramethylrhodamine,TAMRA)。在某些实施方案中，所述荧光分子为6-羧基荧光素(FAM)，且所述荧光抑制分子为二氢环吡咯并吲哚三肽小沟结合物(MGB)。在某些实施方案中，所述荧光分子为6-羧基荧光素(FAM)，且所述荧光抑制分子为黑洞荧光抑制剂1(BHQ1)或二氢环吡咯并吲哚三肽小沟结合物(MGB)。
除非本文另有定义，否则用以与本文结合的科学与技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。本发明的方法与技术一般可根据本领域已知的常规方法进行。一般而言，本文所描述之用以连结以下技术的命名法，以及生物化学、酵素学、分子及细胞生物学、微生物学、遗传学与蛋白质及核酸化学及杂合反应的技术皆为本领域已知且经常使用者。除非另有说明，本发明的方法与技术一般可根据本领域已知的常规方法进行，且被描述于在本说明书中被引用且讨论的各种一般及更具体的参考文献中。
本发明进一步透过以下的实施例阐释，其不应以任何方式被解释为进一步的限缩。本申请案中引用的所有引用文件(包括参考文献、核准的专利、公开的专利申请，以及一同在申请中的专利申请案)的整体内容，在此透过引用的方式明确地并入本案中。
实施例
实施例1病原体发光杆菌杀鱼亚种(P.damselae subsp.Piscicida)的检测
病原体发光杆菌杀鱼亚种(P.damselae subsp.Piscicida)的青霉素结合蛋白1A(penicillin-binding protein 1A,Pbp-1A)基因(GenBankaccessionNo.EU164926)的片段被插入一选殖载体中，所述选殖载体可为，但不限于，pUC57、pGEM-T，以得到pPhoto质粒。
1.传统聚合酶链锁反应
进行传统PCR所用的50μlPCR混合物含有：106个拷贝数的pPhoto质粒、0.01-2μM正向引物、0.01-2μM反向引物、0.2μM dNTP以及1.25U Taq DNA聚合酶。在一热循环仪(例如，但不限于PC818,Astec Co.Ltd.，日本)中进行扩增反应，且包含一个变性的初始循环94℃持续3分钟，以及35个循环的94℃30秒、60℃30秒以及72℃延展30秒。扩增的产物接着以15％聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel)在TAE缓冲液(40mM Tris,20mM acetic acid,1mM EDTA)中分析，并且以溴化乙锭(ethidium bromide)染色显现。
传统PCR的结果如表1所示，各引物对扩增了各目标序列的正确大小的片段，而在负对照组中则无目标序列被扩增(结果未显示)。所述结果表明，各引物对可用于传统PCR扩增反应以检测发光杆菌杀鱼亚种(P.damselae subsp.Piscicida)的存在。
表1各引物对与探针组合进行传统PCR的结果
正向引物 反向引物 合成片段大小(bp)
Photo-F1(SEQ ID NO:1) Photo-R1(SEQ ID NO:3) 83
Photo-F1(SEQ ID NO:1) Photo-R2(SEQ ID NO:4) 76
Photo-F2(SEQ ID NO:2) Photo-R1(SEQ ID NO:3) 86
Photo-F2(SEQ ID NO:2) Photo-R2(SEQ ID NO:4) 79
Photo-OF1(SEQ ID NO:6) Photo-OR1(SEQ ID NO:7) 100
Photo-OF2(SEQ ID NO:9) Photo-OR2(SEQ ID NO:10) 100
Photo-OF3(SEQ ID NO:12) Photo-OR3(SEQ ID NO:13) 100
2.热对流聚合酶链锁反应(cPCR)
50μl的PCR混合物含有5μl发光杆菌杀鱼亚种的青霉素结合蛋白1A(Pbp-1A)基因的RNA(分别为102,103,104,105,106拷贝数/μl)或pPhoto质粒(分别为102,103,104,105,106个拷贝数)、0.01-2μM正向引物、0.01-2μM反向引物、0.01-2μM探针(各探针序列的5’端及3’端分别接合一荧光分子6-羧基荧光素(FAM)以及一荧光抑制分子黑洞荧光抑制剂1(BHQ1))、0.2μM dNTP、1X cPCR缓冲液，以及1-5U Taq DNA聚合酶、1-5U反转录酶。将PCR混合物加入一反应试管中，并置于一热对流聚合酶链锁反应(cPCR)仪中一段指定的时间(约30～45分钟)。以所述cPCR仪侦测每个样本中的FAM荧光。重复上述cPCR分析试验8次(n＝8)以评各估引物对与探针的敏感度。
敏感度测试的结果如表2所示，各引物对及探针的组合皆可100％正确侦测到样品中含有102拷贝数/μl的发光杆菌杀鱼亚种的青霉素结合蛋白1A(Pbp-1A)基因的RNA或102个拷贝数的pPhoto质粒，其敏感度可达102拷贝数/μl及102个拷贝数。
表2各引物对与探针组合的敏感度测试结果(n＝8)
Figure BDA0002218639640000111
此外，以不同的鱼病原体基因质粒(106拷贝数/μl)作为cPCR模板分析上述各引物对及探针组合的专一性。cPCR方法如上所述。专一性测试的结果如表3所示，各引物对及探针的组合皆可正确侦测到含有发光杆菌杀鱼亚种(Photo)的样品，而侦测不到含有罗非鱼病毒(TiLV)、锦鲤疱疹病毒(KHV)、神经坏死病毒(NNV)，以及淋巴囊肿病毒(Lym)的样品。所述结果显示各引物对及探针组合具有专一性。
表3各引物对与探针组合的专一性测试结果
Figure BDA0002218639640000112
Figure BDA0002218639640000121
“+”表示在所述样本中侦测到荧光讯号，而“-”表示在所述样本中未侦测到荧光讯号。
3.实时聚合酶链锁反应(real-time PCR,qPCR)
以稀释的pPhoto质粒(分别为101,102,103,104,105,106,107个拷贝数)于一实时PCR仪(例如，但不限于ABI StepOnePlusTM；Applied BioSystem,Life Technologies，加州，美国)中进行实时PCR分析。以含有2μl pPhoto质粒、0.01-2μM正向引物、0.01-2μM反向引物、0.01-2μM探针(各探针序列的5’端及3’端分别接合一荧光分子6-羧基荧光素(FAM)以及一荧光抑制分子黑洞荧光抑制剂1(BHQ1))，总体积为20μl的商用RT-PCR套组(例如，但不限于，OneStep PrimeScriptTM RT-PCR Kit；Takara Bio Inc.，日本)进行实时PCR分析。实时PCR的程序为42℃5分钟、94℃10秒，以及40个循环的94℃10秒以及60℃30分钟。在60℃的步骤中记录荧光测量的结果并计算。连续稀释(10倍)的pPhoto质粒的实时PCR分析的标准曲线。结果显示，至少102个拷贝数的pPhoto质粒可被侦测到，且各引物对与探针组合的标准曲线的R2值皆大于0.99，表示本发明的引物对与探针可以被用于实时PCR，并产生可信的结果。
上述实施例结果表明，本发明的引物对与探针可用于cPCR扩增反应以检测发光杆菌杀鱼亚种(P.damselae subsp.Piscicida)的存在，并且具有高度敏感度及专一性。
实施例2病原体罗非鱼病毒(TiLV)的检测
病原体罗非鱼病毒(TiLV)的蛋白基因(GenBankaccessionNo.KJ605629)的片段被插入一选殖载体中，所述选殖载体可为，但不限于，pUC57、pGEM-T，以得到pTiLV质粒。
1.传统聚合酶链锁反应
进行传统PCR所用的50μl PCR混合物含有：106个拷贝数的pTiLV质粒、0.01-2μM正向引物、0.01-2μM反向引物、0.2μM dNTP以及1.25U Taq DNA聚合酶。在一热循环仪(例如，但不限于PC818,Astec Co.Ltd.，日本)中进行扩增反应，且包含一个变性的初始循环94℃持续3分钟，以及35个循环的94℃30秒、60℃30秒以及72℃延展30秒。扩增的产物接着以15％聚丙烯酰胺凝胶在TAE缓冲液(40mM Tris,20mM acetic acid,1mM EDTA)中分析，并且以溴化乙锭染色显现。
传统PCR的结果如表4所示，各引物对扩增了各目标序列的正确大小的片段，而在负对照组中则无目标序列被扩增(结果未显示)。所述结果表明，各引物对可用于传统PCR扩增反应以检测罗非鱼病毒(TiLV)的存在。
表4各引物对与探针组合进行传统PCR的结果
正向引物 反向引物 合成片段大小(bp)
TiLV-F1(SEQ ID NO:15) TiLV-R1(SEQ ID NO:16) 91
TiLV-F2(SEQ ID NO:18) TiLV-R2(SEQ ID NO:19) 93
TiLV-F3(SEQ ID NO:21) TiLV-R3(SEQ ID NO:22) 87
TiLV-F4(SEQ ID NO:24) TiLV-R4(SEQ ID NO:27) 92
TiLV-F5(SEQ ID NO:25) TiLV-R4(SEQ ID NO:27) 80
TiLV-F6(SEQ ID NO:26) TiLV-R4(SEQ ID NO:27) 78
TiLV-F4(SEQ ID NO:24) TiLV-R5(SEQ ID NO:28) 87
TiLV-F5(SEQ ID NO:25) TiLV-R5(SEQ ID NO:28) 75
TiLV-F6(SEQ ID NO:26) TiLV-R5(SEQ ID NO:28) 73
TiLV-F7(SEQ ID NO:30) TiLV-R7(SEQ ID NO:31) 98
2.热对流聚合酶链锁反应(cPCR)
50μl的PCR混合物含有5μl罗非鱼病毒(TiLV)的蛋白基因的RNA(分别为102,103,104,105,106拷贝数/μl)或pTiLV质粒(分别为102,103,104,105,106个拷贝数)、0.01-2μM正向引物、0.01-2μM反向引物、0.01-2μM探针(各探针序列的5’端及3’端分别接合一荧光分子6-羧基荧光素(FAM)以及一荧光抑制分子黑洞荧光抑制剂1(BHQ1))、0.2μM dNTP、1XcPCR缓冲液，以及1-5U Taq DNA聚合酶、1-5U反转录酶。将PCR混合物加入一反应试管中，并置于一热对流聚合酶链锁反应(cPCR)仪中一段指定的时间(约30～45分钟)。以所述cPCR仪侦测每个样本中的FAM荧光。重复上述cPCR分析试验8次(n＝8)以评各估引物对与探针的敏感度。
敏感度测试的结果如表5所示，各引物对及探针的组合皆可100％正确侦测到样品中含有102拷贝数/μl的罗非鱼病毒(TiLV)的RNA或102个拷贝数的pTiLV质粒，其敏感度可达102拷贝数/μl及102个拷贝数。
表5各引物对与探针组合的敏感度测试结果(n＝8)
Figure BDA0002218639640000141
此外，以不同的鱼病原体基因质粒(106拷贝数/μl)作为cPCR模板分析上述各引物对及探针组合的专一性。cPCR方法如上所述。专一性测试的结果如表6所示，各引物对及探针的组合皆可正确侦测到含有罗非鱼病毒(TiLV)的样品，而侦测不到含有发光杆菌杀鱼亚种(Photo)、锦鲤疱疹病毒(KHV)、神经坏死病毒(NNV)，以及淋巴囊肿病毒(Lym)的样品。所述结果显示各引物对及探针组合具有专一性。
表6各引物对与探针组合的专一性测试结果
Figure BDA0002218639640000151
“+”表示在所述样本中侦测到荧光讯号，而“-”表示在所述样本中未侦测到荧光讯号。
3.实时聚合酶链锁反应(real-time PCR,qPCR)
以稀释的pTiLV质粒(分别为101,102,103,104,105,106,107个拷贝数)于一实时PCR仪(例如，但不限于ABI StepOnePlusTM；Applied BioSystem,Life Technologies，加州，美国)中进行实时PCR分析。以含有2μl pTiLV质粒、0.01-2μM正向引物、0.01-2μM反向引物、0.01-2μM探针(各探针序列的5’端及3’端分别接合一荧光分子6-羧基荧光素(FAM)以及一荧光抑制分子黑洞荧光抑制剂1(BHQ1))，总体积为20μl的商用RT-PCR套组(例如，但不限于，OneStep PrimeScriptTM RT-PCR Kit；Takara Bio Inc.，日本)进行实时PCR分析。实时PCR的程序为42℃5分钟、94℃10秒，以及40个循环的94℃10秒以及60℃30分钟。在60℃的步骤中记录荧光测量的结果并计算。连续稀释(10倍)的pTiLV质粒的实时PCR分析的标准曲线。结果显示，至少10个拷贝数的pTiLV质粒可被侦测到，且各引物对与探针组合的标准曲线的R2值皆大于0.99，表示本发明的引物对与探针可以被用于实时PCR，并产生可信的结果。
上述实施例结果表明，本发明的引物对与探针可用于cPCR扩增反应以检测罗非鱼病毒(TiLV)的存在，并且具有高度敏感度及专一性。
实施例3病原体锦鲤疱疹病毒(KHV)的检测
病原体锦鲤疱疹病毒(KHV)的基因组(GenBank accession No.KX544848)的片段被插入一选殖载体中，所述选殖载体可为，但不限于，pUC57、pGEM-T，以得到pKHV质粒。
1.传统聚合酶链锁反应
进行传统PCR所用的50μl PCR混合物含有：106个拷贝数的pKHV质粒、0.01-2μM正向引物、0.01-2μM反向引物、0.2μM dNTP以及1.25U Taq DNA聚合酶。在一热循环仪(例如，但不限于PC818,Astec Co.Ltd.，日本)中进行扩增反应，且包含一个变性的初始循环94℃持续3分钟，以及35个循环的94℃30秒、60℃30秒以及72℃延展30秒。扩增的产物接着以15％聚丙烯酰胺凝胶在TAE缓冲液(40mM Tris,20mM acetic acid,1mM EDTA)中分析，并且以溴化乙锭染色显现。
传统PCR的结果如表7所示，各引物对扩增了各目标序列的正确大小的片段，而在负对照组中则无目标序列被扩增(结果未显示)。所述结果表明，各引物对可用于传统PCR扩增反应以检测锦鲤疱疹病毒(KHV)的存在。
表7各引物对与探针组合进行传统PCR的结果
正向引物 反向引物 合成片段大小(bp)
KHV-F1(SEQ ID NO:33) KHV-R1(SEQ ID NO:34) 87
KHV-F2(SEQ ID NO:36) KHV-R2(SEQ ID NO:37) 97
KHV-F3(SEQ ID NO:39) KHV-R3(SEQ ID NO:40) 77
KHV-F4(SEQ ID NO:42) KHV-R4(SEQ ID NO:43) 69
KHV-F5(SEQ ID NO:45) KHV-R5(SEQ ID NO:46) 86
2.热对流聚合酶链锁反应(cPCR)
50μl的PCR混合物含有5μl锦鲤疱疹病毒(KHV)基因组片段的RNA(分别为102,103,104,105,106拷贝数/μl)或pKHV质粒(分别为102,103,104,105,106个拷贝数)、0.01-2μM正向引物、0.01-2μM反向引物、0.01-2μM探针(各探针序列的5’端及3’端分别接合一荧光分子6-羧基荧光素(FAM)以及一荧光抑制分子黑洞荧光抑制剂1(BHQ1))、0.2μM dNTP、1X cPCR缓冲液，以及1-5U Taq DNA聚合酶、1-5U反转录酶。将PCR混合物加入一反应试管中，并置于一热对流聚合酶链锁反应(cPCR)仪中一段指定的时间(约30～45分钟)。以所述cPCR仪侦测每个样本中的FAM荧光。重复上述cPCR分析试验8次(n＝8)以评各估引物对与探针的敏感度。
敏感度测试的结果如表8所示，各引物对及探针的组合皆可100％正确侦测到样品中含有102拷贝数/μl的锦鲤疱疹病毒(KHV)基因组片段的RNA或102个拷贝数的pKHV质粒，其敏感度可达102拷贝数/μl及102个拷贝数。
表8各引物对与探针组合的敏感度测试结果(n＝8)
Figure BDA0002218639640000171
此外，以不同的鱼病原体基因质粒(106拷贝数/μl)作为cPCR模板分析上述各引物对及探针组合的专一性。cPCR方法如上所述。专一性测试的结果如表9所示，各引物对及探针的组合皆可正确侦测到含有锦鲤疱疹病毒(KHV)的样品，而侦测不到含有发光杆菌杀鱼亚种(Photo)、罗非鱼病毒(TiLV)、神经坏死病毒(NNV)，以及淋巴囊肿病毒(Lym)的样品。所述结果显示各引物对及探针组合具有专一性。
表9各引物对与探针组合的专一性测试结果
Figure BDA0002218639640000172
Figure BDA0002218639640000181
“+”表示在所述样本中侦测到荧光讯号，而“-”表示在所述样本中未侦测到荧光讯号。
3.实时聚合酶链锁反应(real-time PCR,qPCR)
以稀释的pKHV质粒(分别为101,102,103,104,105,106,107个拷贝数)于一实时PCR仪(例如，但不限于ABI StepOnePlusTM；Applied BioSystem,Life Technologies，加州，美国)中进行实时PCR分析。以含有2μl pKHV质粒、0.01-2μM正向引物、0.01-2μM反向引物、0.01-2μM探针(各探针序列的5’端及3’端分别接合一荧光分子6-羧基荧光素(FAM)以及一荧光抑制分子黑洞荧光抑制剂1(BHQ1))，总体积为20μl的商用RT-PCR套组(例如，但不限于，OneStep PrimeScriptTM RT-PCR Kit；Takara Bio Inc.，日本)进行实时PCR分析。实时PCR的程序为42℃5分钟、94℃10秒，以及40个循环的94℃10秒以及60℃30分钟。在60℃的步骤中记录荧光测量的结果并计算。连续稀释(10倍)的pKHV质粒的实时PCR分析的标准曲线。结果显示，至少102个拷贝数的pKHV质粒可被侦测到，且各引物对与探针组合的标准曲线的R2值皆大于0.99，表示本发明的引物对与探针可以被用于实时PCR，并产生可信的结果。
上述实施例结果表明，本发明的引物对与探针可用于cPCR扩增反应以检测锦鲤疱疹病毒(KHV)的存在，并且具有高度敏感度及专一性。
实施例4病原体神经坏死病毒(NNV)的检测
病原体神经坏死病毒(NNV)的衣壳蛋白(capsid protein)基因(GenBankaccession No.MF565445)的片段被插入一选殖载体中，所述选殖载体可为，但不限于，pUC57、pGEM-T，以得到pNNV质粒。
1.传统聚合酶链锁反应
进行传统PCR所用的50μl PCR混合物含有：106个拷贝数的pNNV质粒、0.01-2μM正向引物、0.01-2μM反向引物、0.2μM dNTP以及1.25U Taq DNA聚合酶。在一热循环仪(例如，但不限于PC818,Astec Co.Ltd.，日本)中进行扩增反应，且包含一个变性的初始循环94℃持续3分钟，以及35个循环的94℃30秒、60℃30秒以及72℃延展30秒。扩增的产物接着以15％聚丙烯酰胺凝胶在TAE缓冲液(40mM Tris,20mM acetic acid,1mM EDTA)中分析，并且以溴化乙锭染色显现。
传统PCR的结果如表10所示，各引物对扩增了各目标序列的正确大小的片段，而在负对照组中则无目标序列被扩增(结果未显示)。所述结果表明，各引物对可用于传统PCR扩增反应以检测神经坏死病毒(NNV)的存在。
表10各引物对与探针组合进行传统PCR的结果
正向引物 反向引物 合成片段大小(bp)
NNV-F1(SEQ ID NO:48) NNV-R1(SEQ ID NO:49) 86
NNV-F2(SEQ ID NO:52) NNV-R2(SEQ ID NO:53) 89
NNV-F2(SEQ ID NO:52) NNV-R3(SEQ ID NO:54) 94
NNV-F4(SEQ ID NO:55) NNV-R4(SEQ ID NO:56) 91
NNV-F5(SEQ ID NO:58) NNV-R5(SEQ ID NO:59) 84
NNV-F6(SEQ ID NO:61) NNV-R5(SEQ ID NO:59) 86
NNV-F6(SEQ ID NO:61) NNV-R6(SEQ ID NO:62) 102
NNV-F7(SEQ ID NO:63) NNV-R7(SEQ ID NO:64) 111
NNV-F7(SEQ ID NO:63) NNV-R8(SEQ ID NO:67) 111
NNV-F7(SEQ ID NO:63) NNV-R9(SEQ ID NO:68) 69
NNV-F8(SEQ ID NO:66) NNV-R8(SEQ ID NO:67) 103
NNV-F8(SEQ ID NO:66) NNV-R9(SEQ ID NO:68) 61
NNV-F10(SEQ ID NO:70) NNV-R10(SEQ ID NO:71) 59
2.热对流聚合酶链锁反应(cPCR)
50μl的PCR混合物含有5μl神经坏死病毒(NNV)的衣壳蛋白基因的RNA(分别为102,103,104,105,106拷贝数/μl)或pNNV质粒(分别为102,103,104,105,106个拷贝数)、0.01-2μM正向引物、0.01-2μM反向引物、0.01-2μM探针(各探针序列的5’端及3’端分别接合一荧光分子6-羧基荧光素(FAM)以及一荧光抑制分子黑洞荧光抑制剂1(BHQ1))、0.2μM dNTP、1XcPCR缓冲液，以及1-5U Taq DNA聚合酶、1-5U反转录酶。将PCR混合物加入一反应试管中，并置于一热对流聚合酶链锁反应(cPCR)仪中一段指定的时间(约30～45分钟)。以所述cPCR仪侦测每个样本中的FAM荧光。重复上述cPCR分析试验8次(n＝8)以评各估引物对与探针的敏感度。
敏感度测试的结果如表11所示，各引物对及探针的组合皆可100％正确侦测到样品中含有102拷贝数/μl的神经坏死病毒(NNV)的衣壳蛋白基因的RNA或102个拷贝数的pNNV质粒，其敏感度可达102拷贝数/μl及102个拷贝数。
表11各引物对与探针组合的敏感度测试结果(n＝8)
Figure BDA0002218639640000191
Figure BDA0002218639640000201
Figure BDA0002218639640000211
此外，以不同的鱼病原体基因质粒(106拷贝数/μl)作为cPCR模板分析上述各引物对及探针组合的专一性。cPCR方法如上所述。专一性测试的结果如表12所示，各引物对及探针的组合皆可正确侦测到含有神经坏死病毒(NNV)的样品，而侦测不到含有发光杆菌杀鱼亚种(Photo)、罗非鱼病毒(TiLV)、锦鲤疱疹病毒(KHV)，以及淋巴囊肿病毒(Lym)的样品。所述结果显示各引物对及探针组合具有专一性。
表12各引物对与探针组合的专一性测试结果
Figure BDA0002218639640000212
Figure BDA0002218639640000221
“+”表示在所述样本中侦测到荧光讯号，而“-”表示在所述样本中未侦测到荧光讯号。
3.实时聚合酶链锁反应(real-time PCR,qPCR)
以稀释的pNNV质粒(分别为101,102,103,104,105,106,107个拷贝数)于一实时PCR仪(例如，但不限于ABI StepOnePlusTM；Applied BioSystem,Life Technologies，加州，美国)中进行实时PCR分析。以含有2μl pNNV质粒、0.01-2μM正向引物、0.01-2μM反向引物、0.01-2μM探针(各探针序列的5’端及3’端分别接合一荧光分子6-羧基荧光素(FAM)以及一荧光抑制分子黑洞荧光抑制剂1(BHQ1))，总体积为20μl的商用RT-PCR套组(例如，但不限于，OneStep PrimeScriptTM RT-PCR Kit；Takara Bio Inc.，日本)进行实时PCR分析。实时PCR的程序为42℃5分钟、94℃10秒，以及40个循环的94℃10秒以及60℃30分钟。在60℃的步骤中记录荧光测量的结果并计算。连续稀释(10倍)的pNNV质粒的实时PCR分析的标准曲线。结果显示，至少102个拷贝数的pNNV质粒可被侦测到，且各引物对与探针组合的标准曲线的R2值皆大于0.99，表示本发明的引物对与探针可以被用于实时PCR，并产生可信的结果。
上述实施例结果表明，本发明的引物对与探针可用于cPCR扩增反应以检测神经坏死病毒(NNV)的存在，并且具有高度敏感度及专一性。
实施例5病原体淋巴囊肿病毒(Lymphocystis virus)的检测
病原体淋巴囊肿病毒(Lymphocystis virus)的主要衣壳蛋白(major capsidprotein,MCP)基因(GenBank accession No.HE650106)的片段被插入一选殖载体中，所述选殖载体可为，但不限于，pUC57、pGEM-T，以得到pLym质粒。
1.传统聚合酶链锁反应
进行传统PCR所用的50μl PCR混合物含有：106个拷贝数的pLym质粒、0.01-2μM正向引物、0.01-2μM反向引物、0.2μM dNTP以及1.25U Taq DNA聚合酶。在一热循环仪(例如，但不限于PC818,Astec Co.Ltd.，日本)中进行扩增反应，且包含一个变性的初始循环94℃持续3分钟，以及35个循环的94℃30秒、60℃30秒以及72℃延展30秒。扩增的产物接着以15％聚丙烯酰胺凝胶在TAE缓冲液(40mM Tris,20mM acetic acid,1mM EDTA)中分析，并且以溴化乙锭染色显现。
传统PCR的结果如表13所示，各引物对扩增了各目标序列的正确大小的片段，而在负对照组中则无目标序列被扩增(结果未显示)。所述结果表明，各引物对可用于传统PCR扩增反应以检测淋巴囊肿病毒的存在。
表13各引物对与探针组合进行传统PCR的结果
正向引物 反向引物 合成片段大小(bp)
Lym-OF1(SEQ ID NO:73) Lym-OR1(SEQ ID NO:74) 83
Lym-OF2(SEQ ID NO:76) Lym-OR2(SEQ ID NO:77) 85
Lym-F1(SEQ ID NO:79) Lym-R1(SEQ ID NO:80) 171
2.热对流聚合酶链锁反应(cPCR)
50μl的PCR混合物含有5μl淋巴囊肿病毒的主要衣壳蛋白(MCP)基因的RNA(分别为102,103,104,105,106拷贝数/μl)或pLym质粒(分别为102,103,104,105,106个拷贝数)、0.01-2μM正向引物、0.01-2μM反向引物、0.01-2μM探针(各探针序列的5’端及3’端分别接合一荧光分子6-羧基荧光素(FAM)以及一荧光抑制分子黑洞荧光抑制剂1(BHQ1))、0.2μMdNTP、1X cPCR缓冲液，以及1-5U Taq DNA聚合酶、1-5U反转录酶。将PCR混合物加入一反应试管中，并置于一热对流聚合酶链锁反应(cPCR)仪中一段指定的时间(约30～45分钟)。以所述cPCR仪侦测每个样本中的FAM荧光。重复上述cPCR分析试验8次(n＝8)以评各估引物对与探针的敏感度。
敏感度测试的结果如表14所示，各引物对及探针的组合皆可100％正确侦测到样品中含有102拷贝数/μl的淋巴囊肿病毒的主要衣壳蛋白(MCP)基因的RNA或102个拷贝数的pLym质粒，其敏感度可达102拷贝数/μl及102个拷贝数。
表14各引物对与探针组合的敏感度测试结果(n＝8)
Figure BDA0002218639640000231
Figure BDA0002218639640000241
此外，以不同的鱼病原体基因质粒(106拷贝数/μl)作为cPCR模板分析上述各引物对及探针组合的专一性。cPCR方法如上所述。专一性测试的结果如表15所示，各引物对及探针的组合皆可正确侦测到含有淋巴囊肿病毒(Lym)的样品，而侦测不到含有发光杆菌杀鱼亚种(Photo)、罗非鱼病毒(TiLV)、锦鲤疱疹病毒(KHV)，以及神经坏死病毒(NNV)的样品。所述结果显示各引物对及探针组合具有专一性。
表15各引物对与探针组合的专一性测试结果
Figure BDA0002218639640000242
“+”表示在所述样本中侦测到荧光讯号，而“-”表示在所述样本中未侦测到荧光讯号。
3.实时聚合酶链锁反应(real-time PCR,qPCR)
以稀释的pLym质粒(分别为101,102,103,104,105,106,107个拷贝数)于一实时PCR仪(例如，但不限于ABI StepOnePlusTM；Applied BioSystem,Life Technologies，加州，美国)中进行实时PCR分析。以含有2μl pLym质粒、0.01-2μM正向引物、0.01-2μM反向引物、0.01-2μM探针(各探针序列的5’端及3’端分别接合一荧光分子6-羧基荧光素(FAM)以及一荧光抑制分子黑洞荧光抑制剂1(BHQ1))，总体积为20μl的商用RT-PCR套组(例如，但不限于，OneStep PrimeScriptTM RT-PCR Kit；Takara Bio Inc.，日本)进行实时PCR分析。实时PCR的程序为42℃5分钟、94℃10秒，以及40个循环的94℃10秒以及60℃30分钟。在60℃的步骤中记录荧光测量的结果并计算。连续稀释(10倍)的pLym质粒的实时PCR分析的标准曲线。结果显示，至少102个拷贝数的pLym质粒可被侦测到，且各引物对与探针组合的标准曲线的R2值皆大于0.99，表示本发明的引物对与探针可以被用于实时PCR，并产生可信的结果。
上述实施例结果表明，本发明的引物对与探针可用于cPCR扩增反应以检测淋巴囊肿病毒的存在，并且具有高度敏感度及专一性。
上列详细说明系针对本发明之一可行实施例的具体说明，惟该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明技艺精神所为的等效实施或变更，均应包含于本案的专利范围中。
序列表
<110> 福又达生物科技股份有限公司
<120> 鱼病原体检测方法
<130> P19-0205
<160> 81
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cacgacgtga caaccgact 19
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gatcacgacg tgacaaccga ctc 23
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
actaagaaag cattctgctc cgta 24
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aagcattctg ctccgtaata actt 24
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctacagatca cccagtcaaa tacgcaccg 29
<210> 6
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ccagatccca agtgcaa 17
<210> 7
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aaacttgctg tgagcgt 17
<210> 8
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
agcatttgtt gccatctcac ctgaaaatgg t 31
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
caaatacagc atttgttgcc a 21
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tgggttgcac ggttaaac 18
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gcagtacttg cgatggtggg tggct 25
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ctaccgatac gaaagcgg 18
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gcaccatttt caggtgaga 19
<210> 14
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gctggatgct aagccagatc ccaagtgca 29
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
aacgagtacg cacgtgatag agaa 24
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tctgtgtagc aggcttgtga gaa 23
<210> 17
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gagttccgca atggagggtg gatacaa 27
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cggtgaggag tgtggtcttg a 21
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
caccctccat tgcggaact 19
<210> 20
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
caagaggcaa gagaact 17
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
aacattttaa taggcaccgg ct 22
<210> 22
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
taccccttat ctcagaagcc agc 23
<210> 23
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gtctgtaagg acgagttca 19
<210> 24
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
aggcaatatg gattcttcga gtg 23
<210> 25
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
ttcttcgagt gctcaaagtt cct 23
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
cttcgagtgc tcaaagttcc tc 22
<210> 27
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
tcgttcagta taagttctct tgcct 25
<210> 28
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
cagtataagt tctcttgcct cttgg 25
<210> 29
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
cctgcggtga ggagtgtggt cttga 25
<210> 30
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
cacgattttg agtttgacgg gt 22
<210> 31
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
gtactcacaa agtcttgctc ccct 24
<210> 32
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
gcacctagat cccaagcaat cggctaa 27
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
gcgtcctcct ctttgtcctc 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
tttcttgccc tcaccctcac 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
accgctgtcc tcctcggacg 20
<210> 36
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
ttccagaaga agggcaagg 19
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
tgaagtcgat cagcctgtgg 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
tcgccgtaca ccagccggca 20
<210> 39
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
acgccggaga ccttgtg 17
<210> 40
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
cgggttctta tttttgtcct tgt 23
<210> 41
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
cctctgctcg gcgagcacg 19
<210> 42
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
caggaagatc ccgaggtga 19
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
gtcctcggaa gaggacgaag 20
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
tgagctccgg ctcgggctcc 20
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
accaaagtcc aaggccatca 20
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
tatcctcgct gctgtcgcta 20
<210> 47
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
actgctgcta ctactgct 18
<210> 48
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
attcagccaa tgtgcccc 18
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
tcgaaggtgt ggtcgttgtc 20
<210> 50
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
ggtggttacg ttgctggctt cctgc 25
<210> 51
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
gctggcttcc tgc 13
<210> 52
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
acgggcggtg gttacg 16
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
actgcaccac gagttgcttg 20
<210> 54
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
caacgactgc accacgagt 19
<210> 55
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
gatacgctgt tgaaacactg gagt 24
<210> 56
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
ggatcaggca ggaagcca 18
<210> 57
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
gaaattcagc caatgtgccc cgc 23
<210> 58
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
gctagaatct tccagcgata cg 22
<210> 59
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
gtaaccaccg cccgtgt 17
<210> 60
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
ttcagccaat gtgcc 15
<210> 61
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
ctgctagaat cttccagcga tac 23
<210> 62
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
gcaggaagcc agcaacgt 18
<210> 63
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
tgtcagttgg atcaggcagg 20
<210> 64
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
gaatcttcca gcgatacgct g 21
<210> 65
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
cgtaaccacc gcccg 15
<210> 66
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
tgctggcttc ctgcctgatc c 21
<210> 67
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
gaatcttcca gcgatacgct 20
<210> 68
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
ttcagccaat gtgccccgc 19
<210> 69
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
cgtaaccacc gcccgtgttt gc 22
<210> 70
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
gtttgaaatt cagccaatgt g 21
<210> 71
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
ggaagccagc aacgtaacc 19
<210> 72
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
cccgcaaaca cggg 14
<210> 73
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
ttcctctccg gtcatttttg a 21
<210> 74
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
ccaacgtcac gtctgaaata gg 22
<210> 75
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
ccagtgattt accgggcatc gcc 23
<210> 76
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 76
ttcagtaaat tgccggtgct t 21
<210> 77
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 77
cgcctcgaga aacgttaacg 20
<210> 78
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 78
acgcgttgtt ctggatcgcc ca 22
<210> 79
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 79
gggagattta gaatggggta aac 23
<210> 80
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 80
ctggggatag ttaaaggttg aaatac 26
<210> 81
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 81
ccgtacccat caatcgacgt tcttcg 26

Claims (12)

1.一种用于侦测鱼病原体的寡核苷酸对，包含一第一引物与一第二引物，所述病原体选自由下列所组成之群组：发光杆菌杀鱼亚种(Photobacterium damselaesubsp.Piscicida)、罗非鱼病毒(Tilapia Lake Virus,TiLV)、锦鲤疱疹病毒(Koiherpesvirus,KHV)、神经坏死病毒(Nervous necrosis virus,NNV)，以及淋巴囊肿病毒(Lymphocystis virus)；
其中所述病原体为发光杆菌杀鱼亚种时，所述第一引物与所述第二引物的序列组合选自由下列所组成之群组：SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:2与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:2与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6与SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:9与SEQ ID NO:10，以及SEQ ID NO:12与SEQ ID NO:13；
其中所述病原体为罗非鱼病毒(TiLV)时，所述第一引物与所述第二引物的序列组合选自由下列所组成之群组：SEQ ID NO:15与SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18与SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21与SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24与SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:25与SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:26与SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:24与SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:25与SEQID NO:28、SEQ ID NO:26与SEQ ID NO:28，以及SEQ ID NO:30与SEQ ID NO:31；
其中所述病原体为锦鲤疱疹病毒(KHV)时，所述第一引物与所述第二引物的序列组合选自由下列所组成之群组：SEQ ID NO:33与SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36与SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39与SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42与SEQ ID NO:43，以及SEQ ID NO:45与SEQID NO:46；
其中所述病原体为神经坏死病毒(NNV)时，所述第一引物与所述第二引物的序列组合选自由下列所组成之群组：SEQ ID NO:48与SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:52与SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:52与SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55与SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58与SEQ IDNO:59、SEQ ID NO:61与SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61与SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63与SEQID NO:64、SEQ ID NO:63与SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:63与SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:66与SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:66与SEQ ID NO:68，以及SEQ ID NO:70与SEQ ID NO:71；以及
其中所述病原体为淋巴囊肿病毒时，所述第一引物与所述第二引物的序列组合选自由下列所组成之群组：SEQ ID NO:73与SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76与SEQ ID NO:77，以及SEQ ID NO:79与SEQ ID NO:80。
2.如权利要求1所述的寡核苷酸对，进一步包含一寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针具有一寡核苷酸探针序列、一附加于所述寡核苷酸探针上的一第一位置的荧光分子，以及一附加于所述寡核苷酸探针上的一第二位置的荧光抑制分子。
3.如权利要求2所述的寡核苷酸对，其中所述病原体为发光杆菌杀鱼亚种，且
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:2与SEQ ID NO:3时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体发光杆菌杀鱼亚种的青霉素结合蛋白1A(penicillin-binding protein 1A,Pbp-1A)基因的第1908至第1946个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:4或SEQ IDNO:2与SEQ ID NO:4时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体发光杆菌杀鱼亚种的青霉素结合蛋白1A(Pbp-1A)基因的第1908至第1939个核苷酸之间的13至30个碱基对的寡核苷酸；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:6与SEQ ID NO:7时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体发光杆菌杀鱼亚种的青霉素结合蛋白1A(Pbp-1A)基因的第1226至第1291个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:9与SEQ ID NO:10时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体发光杆菌杀鱼亚种的青霉素结合蛋白1A(Pbp-1A)基因的第1244至第1304个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；以及
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:12与SEQ ID NO:13时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体发光杆菌杀鱼亚种的青霉素结合蛋白1A(Pbp-1A)基因的第1181至第1243个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸。
4.如权利要求2所述的寡核苷酸对，其中所述病原体为发光杆菌杀鱼亚种，且
所述第一引物与所述第二引物的序列组合选自由下列所组成之群组：SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:2与SEQ ID NO:4时，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:5所示；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:6与SEQ ID NO:7时，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:8所示；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:9与SEQ ID NO:10时，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:11所示；以及
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:12与SEQ ID NO:13时，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:14所示。
5.如权利要求2所述的寡核苷酸对，其中所述病原体为罗非鱼病毒(TiLV)，且
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:15与SEQ ID NO:16时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体罗非鱼病毒(TiLV)蛋白基因的第574至第617个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:18与SEQ ID NO:19时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体罗非鱼病毒(TiLV)蛋白基因的第525至第577个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:21与SEQ ID NO:22时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体罗非鱼病毒(TiLV)蛋白基因的第1122至第1163个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:24与SEQ ID NO:27时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体罗非鱼病毒(TiLV)蛋白基因的第486至第529个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:25与SEQ ID NO:27或SEQ IDNO:26与SEQ ID NO:27时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体罗非鱼病毒(TiLV)蛋白基因的第499至第529个核苷酸之间的13至30个碱基对的寡核苷酸；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:24与SEQ ID NO:28时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体罗非鱼病毒(TiLV)蛋白基因的第486至第524个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:25与SEQ ID NO:28或SEQ IDNO:26与SEQ ID NO:28时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体罗非鱼病毒(TiLV)蛋白基因的第499至第524个核苷酸之间的13至25个碱基对的寡核苷酸；以及
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:30与SEQ ID NO:31时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体罗非鱼病毒(TiLV)蛋白基因的第875至第926个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸。
6.如权利要求2所述的寡核苷酸对，其中所述病原体为罗非鱼病毒(TiLV)，且
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:15与SEQ ID NO:16时，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:17所示；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:18与SEQ ID NO:19时，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:20所示；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:21与SEQ ID NO:22时，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:23所示；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合选自由下列所组成之群组：SEQ ID NO:24与SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:25与SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:26与SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:24与SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:25与SEQ ID NO:28，以及SEQ ID NO:26与SEQ ID NO:28时，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:29所示；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:30与SEQ ID NO:31时，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:32所示。
7.如权利要求2所述的寡核苷酸对，其中所述病原体为锦鲤疱疹病毒(KHV)，且
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:33与SEQ ID NO:34时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体锦鲤疱疹病毒(KHV)基因组的第164188至第164234个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:36与SEQ ID NO:37时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体锦鲤疱疹病毒(KHV)基因组的第163929至第163986个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:39与SEQ ID NO:40时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体锦鲤疱疹病毒(KHV)基因组的第164882至第164918个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:42与SEQ ID NO:43时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体锦鲤疱疹病毒(KHV)基因组的第164100至第164129个核苷酸之间的13至30个碱基对的寡核苷酸；以及
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:45与SEQ ID NO:46时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体锦鲤疱疹病毒(KHV)基因组的第164313至第164358个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸。
8.如权利要求2所述的寡核苷酸对，其中所述病原体为锦鲤疱疹病毒(KHV)，且
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:33与SEQ ID NO:34时，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:35所示；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:36与SEQ ID NO:37时，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:38所示；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:39与SEQ ID NO:40时，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:41所示；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:42与SEQ ID NO:43时，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:44所示；以及
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:45与SEQ ID NO:46时，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:47所示。
9.如权利要求2所述的寡核苷酸对，其中所述病原体为神经坏死病毒(NNV)，且
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:48与SEQ ID NO:49时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体神经坏死病毒(NNV)衣壳蛋白(capsid protein)基因的第349至第396个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:52与SEQ ID NO:53时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体神经坏死病毒(NNV)衣壳蛋白基因的第371至第423个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:52与SEQ ID NO:54时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体神经坏死病毒(NNV)衣壳蛋白基因的第371至第429个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:55与SEQ ID NO:56时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体神经坏死病毒(NNV)衣壳蛋白基因的第326至第374个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:58与SEQ ID NO:59或SEQ IDNO:61与SEQ ID NO:59时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体神经坏死病毒(NNV)衣壳蛋白基因的第308至第352个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:61与SEQ ID NO:62时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体神经坏死病毒(NNV)衣壳蛋白基因的第307至第367个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:63与SEQ ID NO:64或SEQ IDNO:63与SEQ ID NO:67时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体神经坏死病毒(NNV)衣壳蛋白基因的第311至第380个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:63与SEQ ID NO:68时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体神经坏死病毒(NNV)衣壳蛋白基因的第351至第380个核苷酸之间的13至30个碱基对的寡核苷酸；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:66与SEQ ID NO:67时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体神经坏死病毒(NNV)衣壳蛋白基因的第310至第371个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:66与SEQ ID NO:68时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体神经坏死病毒(NNV)衣壳蛋白基因的第351至第371个核苷酸之间的13至21个碱基对的寡核苷酸；以及
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:70与SEQ ID NO:71时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体神经坏死病毒(NNV)衣壳蛋白基因的第345至第363个核苷酸之间的13至19个碱基对的寡核苷酸。
10.如权利要求2所述的寡核苷酸对，其中所述病原体为神经坏死病毒(NNV)，且
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:48与SEQ ID NO:49时，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:50或SEQ ID NO:51所示；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:52与SEQ ID NO:53或SEQ IDNO:52与SEQ ID NO:54时，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:51所示；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:55与SEQ ID NO:56时，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:57所示；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合选自由下列所组成之群组：SEQ ID NO:58与SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61与SEQ ID NO:59，以及SEQ ID NO:61与SEQ ID NO:62时，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:60所示；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:63与SEQ ID NO:64或SEQ IDNO:63与SEQ ID NO:67时，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:65或SEQ ID NO:69所示；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合选自由下列所组成之群组：SEQ ID NO:63与SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:66与SEQ ID NO:67，以及SEQ ID NO:66与SEQ ID NO:68时，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:65所示；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:70与SEQ ID NO:71时，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:72所示。
11.如权利要求2所述的寡核苷酸对，其中所述病原体为淋巴囊肿病毒，且
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:73与SEQ ID NO:74时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体淋巴囊肿病毒主要衣壳蛋白(major capsidprotein,MCP)基因的第942至第981个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:76与SEQ ID NO:77时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体淋巴囊肿病毒主要衣壳蛋白(MCP)基因的第124至第167个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸；以及
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:79与SEQ ID NO:80时，所述寡核苷酸探针序列为一介于所述病原体淋巴囊肿病毒主要衣壳蛋白(MCP)基因的第677至第798个核苷酸之间的13至35个碱基对的寡核苷酸。
12.如权利要求2所述的寡核苷酸对，其中所述病原体为淋巴囊肿病毒，且
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:73与SEQ ID NO:74时，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:75所示；
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:76与SEQ ID NO:77时，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:78所示；以及
所述第一引物与所述第二引物的序列组合为SEQ ID NO:79与SEQ ID NO:80时，所述寡核苷酸探针序列如SEQ ID NO:81所示。
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