CN103540687B - 对虾白斑综合症病毒(wssv)的lamp检测引物组及试剂盒 - Google Patents
对虾白斑综合症病毒(wssv)的lamp检测引物组及试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种WSSV对虾白斑综合症病毒（WSSV）LAMP检测引物组、检测试剂盒。检测引物组包括一对外引物、一对内引物和一对环引物；检测试剂盒包括引物液、反应液、DNA聚合酶和对照品；试剂盒还包含显色剂。本发明的试剂盒操作简便快速，适合现场检测；特异性强；检测灵敏度高，可达到1fg/μL；准确率高、可靠，具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及海洋水产养殖业的检测方法，具体涉及一种对虾白斑综合症病毒（WSSV）的LAMP检测引物组及检测试剂盒。
背景技术
白斑综合征病毒(white spot syndrome virus，WSSV)是1993年世界范围内对虾暴发性流行病的主要病原，迄今仍然没有能有效控制WSSV疫情的技术措施。国内外学者普遍认为，综合预防是相对有效的方法，即尽早发现疾病并采取诸多措施阻止病毒传播。因此，建立灵敏、准确、快捷、方便的WSSV病原检测方法是减少白斑综合征发生和危害的重要途径。目前WSSV病原的检测方法主要有目视观察法、组织学方法、电子显微技术、生化检验法、免疫学方法和分子生物学方法等。目前检测方法正向更特异、更快速、更便捷、更安全、集成化、微量化、定量化、费用低廉化的方向发展，但这种方法耗时、特异性和灵敏度低，远不能满足日常快速检测工作的需要。自问世以来，PCR 技术凭借灵敏、特异、快速等优点，被普遍应用于水产养殖病原的检测中。但PCR 技术对实验环境和操作要求苛刻，产物容易污染，导致假阳性。与一般PCR 技术相比，荧光PCR 检测技术简化了操作步骤，而且可消除扩增产物引起的交叉污染，减少假阳性的发生。但实时荧光PCR 成本较高，目前在水产养殖动物的常规病原体检测中的应用还不多。建立检测WSSV快速准确的方法，是适应口岸快速检测和大通关的时代要求，对促进中国海洋养殖及其产品的贸易有重要作用。
环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是NOTOMI等建立的一种新的核酸扩增技术，在60~65 ℃的恒温条件下，历时30~60 min，即可完成核酸扩增反应。LAMP 反应中可形成明显的白色焦磷酸镁沉淀，可通过对浊度的观察或加入荧光染料，直接通过颜色变化来判定反应结果。该技术具有高特异性、高效性、快速、简便、易检测等特点，已广泛应用于细菌、病毒、寄生虫等病原体的检测研究，并取得了较理想的效果。
德国QIAGEN公司研发的恒温反应及检测仪器ESE-Quant tube scanner通过吸收荧光来实时判断反应的进行。比传统LAMP终点判断产物的浊度或颜色变化更客观可靠。由于过程的数据化和自动化，可用于科研，开发新的检测方法。由于其便携、易操作，比起定量PCR仪，节约了大量成本，适合基层推广检测，符合疾病检测的快速、准确的诊断需要。
由于ESE-Quant tube scanner通过吸收荧光来判断反应是否进行，前期研究发现，常用的荧光显色剂SYBR Green I过于灵敏，在ESE-Quant tube scanner上常造成阴性反应孔出现非特异性的扩增曲线，影响结果判断。尤其在样品不纯的情况下。此反应对模板纯度要求较高，如果样品杂质含量较多，ESE-Quant tube scanner上的扩增曲线将呈现不集中，倾斜向上等。SYTO-9作为SYBR Green I的下一代产品荧光显色剂可以避免上述缺陷。
对于WSSV病毒DNA的提取可采用研磨法提取上清中的病毒核酸，而不采用蛋白酶消化组织的方法。样品为成年虾的，主要采集消化腺、前足等，虾苗则直接研磨。对于虾仁的检测，先用匀浆机对数个虾仁进行匀浆，再取少量虾肉进行研磨提取。这样节省了蛋白酶作用的时间，更重要的是消除了大量杂质及色素，减少了对后续LAMP反应的抑制。
发明内容
本发明的目的在于提供一种对虾白斑综合症病毒的LAMP检测引物组。
本发明的另一个目的在于提供一种对虾白斑综合症病毒的LAMP检测试剂盒。
本发明的另一个目的在于提供对虾白斑综合症病毒的LAMP检测方法。
本发明所采用的技术方案如下：
一种对虾白斑综合症病毒（WSSV）的LAMP检测引物组，包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示：
WSSV-F3：ACAACACTGTGACCAAGAC（SEQ ID NO:1）；
WSSV-B3：GTTCCACACCTTGAATGTTC（SEQ ID NO:2）；
WSSV-FIP：CCCAAGGTGTCGCTGTCAACTGTGACTGCTGAGGTTG（SEQ ID NO:3）；
WSSV-BIP：CCGCAATGGAAAGTCTGATGCCACGGGAGTGATGACAAG（SEQ ID NO:4）；
WSSV-LF：CAGTCATCTTGAAGTAGCCTGA（SEQ ID NO:5）；
WSSV-LB：ATGAAGGAAGAAGATGCGGAT（SEQ ID NO:6）。
一种对虾白斑综合症病毒（WSSV）的LAMP检测试剂盒，包括上述3对检测引物组。
上述检测试剂盒，还包括DNA聚合酶、LAMP反应液、阳性对照和阴性对照。
上述检测试剂盒，其引物组中外引物、内引物、环引物的摩尔比为1︰8︰4。
上述检测试剂盒，所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶。
上述检测试剂盒，所述LAMP反应液由10mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、150mM MgSO4水溶液三者按体积比8︰5︰2组成。
上述检测试剂盒，所述阳性对照为含有对虾白斑综合症病毒（WSSV）囊膜蛋白基因片段的T载体，阴性对照为超纯水。
上述检测试剂盒中还可以含有显色剂，所述显色剂为荧光染料SYTO-9。
上述的试剂盒检测对虾白斑综合症病毒（WSSV）的方法，包括如下步骤：
1）待检样品DNA的提取：采用病毒DNA提取试剂盒提取样品DNA；
2）恒温基因扩增反应：25μl反应体系含有：WSSV-F3 0.2μM，WSSV-B3 0.2μM，WSSV-FIP 1.6μM，WSSV-BIP 1.6μM，WSSV-LF 0.8μM，WSSV-LB 0.8μM，LAMP反应液12.5μl，DNA聚合酶10U，待检DNA 1~100ng，用超纯水补齐到25μl；设置阳性对照和阴性对照；将配制好的反应管混匀后离心，并于浊度仪上63℃反应30～60min，并在80℃持续2min；
3）结果判断：通过浊度仪软件自行分析反应管中的浊度变化来判断反应扩增结果。浊度仪软件界面出现“S”形扩增曲线为阳性，否则为阴性。
在上述试剂盒中含有显色剂的情况下，其LAMP检测方法包括如下步骤：
1）待检样品DNA的提取：采用病毒DNA提取试剂盒提取样品DNA；
2）恒温基因扩增反应：25μl反应体系含有：WSSV-F3 0.2μM，WSSV-B3 0.2μM，WSSV-FIP 1.6μM，WSSV-BIP 1.6μM，WSSV-LF 0.8μM，WSSV-LB 0.8μM，LAMP反应液12.5μL，DNA聚合酶10U，待检DNA 1~100ng，10×SYTO-9 0.5μL，用超纯水补齐到25μl；设置阳性对照和阴性对照；将配制好的反应管混匀后离心，并于浊度仪上63℃反应30～60min，并在80℃持续2min；
3）将反应管中置于ESE-Quant Tube Scanner中，根据仪器实时读取的荧光信号来判断扩增结果。
本发明的有益效果是：
1）快速高效：整个扩增只用30～60min即可完成，扩增产量可达109～1010个拷贝；
2）操作简便：不需要复杂的仪器，不需要特殊试剂，不需要预先进行双链DNA的变性等繁琐步骤，只需要一部恒定温度仪就能反应和检测，条件比较温和；
3）高特异性：本发明对病毒 IHHNV（infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus）、副溶血弧菌（Vibrio Parahemolyticus）、创伤弧菌（Vibrio vulnificus）、O1群霍乱弧菌（Vibrio cholera O1）、O139群霍乱弧菌（Vibrio cholera O139）的 DNA均不发生扩增。
本发明设计的六条特异性引物，扩增靶序列的6个区域，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，故其特异性极高，且非常稳定，形成引物二聚体概率低，保证了反应的顺利进行；
4）高灵敏度：本发明的最低检测极限可达到2fg /反应；
5）鉴定简便：本发明可通过是否存在焦磷酸镁沉淀，或者加入SYTO-9，根据仪器实时读取的荧光信号来判断扩增结果。无需电泳等其他任何分析步骤，适合现场检测。
附图说明
图1为LAMP检测方法对WSSV病毒的特异性实验图；
图2为LAMP检测方法对WSSV病毒的灵敏度实验图，从左到右的曲线依次为10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL 、10fg/μL、1fg/μL、100ag/μL、10ag/μL、1ag/μL的阳性标准品的扩增结果；
图3为不同检测方法对WSSV病毒检测灵敏度的比较，A为本发明的LAMP检测方法对不同稀释倍数的WSSV病毒DAN样品检测的灵敏度，B为现有Real-time PCR检测方法对不同稀释倍数的WSSV病毒DAN样品检测的灵敏度，C为现有巢式PCR检测方法对不同稀释倍数的WSSV病毒DAN样品检测的灵敏度，D、E、F、G分别为现有不同的LAMP检测方法对不同稀释倍数的WSSV病毒DAN样品检测的灵敏度。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
实施例1：
一、对虾白斑综合症病毒LAMP检测试剂盒的建立
对虾白斑综合症病毒的LAMP检测试剂盒，包括LAMP引物组、LAMP反应液、BstDNA聚合酶、阳性对照和阴性对照。
1）LAMP引物设计：根据从Genbank上检索到的对虾白斑综合症病毒（WSSV）的核酸序列，选取保守序列，设计用于检测WSSV的特异性引物，其序列见下表1：
表1 引物序列表
2）LAMP反应液：将10mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、150mM MgSO4水溶液三者按体积比8︰5︰2混合。
3）阳性对照为含有靶序列片段的T载体，其制备方法为：以分离鉴定的对虾白斑综合症病毒DNA为模板，利用表1中的外引物（SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2）对WSSV DNA进行扩增，所得基因片段长度为290bp，序列如SEQ ID NO:7所示，回收该扩增片段，利用常规方法连接到T载体中，即为阳性对照。
4）阴性对照为超纯水。
二、使用浊度仪的对虾白斑综合症病毒LAMP检测
利用本发明试剂盒检测对虾白斑综合症病毒，包括如下步骤：
1） 待检样品DNA的提取：采用病毒DNA提取试剂盒提取样品DNA；
2）恒温基因扩增反应：25μL反应体系含有：0.2μM WSSV-F3，0.2μM WSSV-B3，1.6μM WSSV-FIP，1.6μM WSSV-BIP，0.8μM WSSV-LF，0.8μM WSSV-LB，LAMP反应液12.5μL，BstDNA聚合酶10U，待检DNA 1~100ng，用超纯水补齐到25μl；设置阳性对照和阴性对照；将配制好的反应管混匀后离心，并于浊度仪上63℃反应30～60min，并在80℃持续2min；
3）结果判断：通过浊度仪软件自行分析反应管中的浊度变化来判断反应扩增结果。浊度仪软件界面出现“S”形扩增曲线为阳性，否则为阴性。
三、使用ESE-Quant tube scanner的对虾白斑综合症病毒LAMP检测
利用本发明试剂盒（选用SYTO-9荧光显色剂）检测对虾白斑综合症病毒，包括如下步骤：
1）待检样品DNA的提取：采用病毒DNA提取试剂盒提取纯化待测样品DNA；
2）恒温基因扩增反应：25μL反应体系含有：0.2μM WSSV-F3，0.2μM WSSV-B3，1.6μM WSSV-FIP，1.6μM WSSV-BIP，0.8μM WSSV-LF，0.8μM WSSV-LB，LAMP反应液12.5μL，BstDNA聚合酶10U，10×SYTO-9 0.5μL，待检DNA1~100ng，用超纯水补齐到25μL；设置阳性对照和阴性对照；将配制好的反应管混匀后离心，于63℃反应60min，并在80℃持续2min；
3）结果判断：将反应管放置在ESE-Quant tube scanner中进行反应，观察ESE-Quant tube scanner软件判断扩增结果，如果出现“S”型曲线则为阳性，无“S”型曲线则为阴性。
四、特异性实验
为了检测本发明试剂盒的特异性，采用上述3中的LAMP检测方法，分别对病毒WSSV、IHHNV、Vibrio Parahemolyticus、Vibrio vulnificus、Vibrio cholera O1和Vibrio cholera O139进行检测，分析本试剂盒对WSSV病毒和对虾其他常见病毒的检测情况。
检测结果表明：仅病毒WSSV 样品出现正常扩增，阴性对照（超纯水）及病毒IHHNV、Vibrio Parahemolyticus、Vibrio vulnificus、Vibrio cholera O1和Vibrio cholera O139样品均未出现扩增（如图1所示）。上述结果说明，本发明LAMP检测试剂盒能特异性扩增出病毒WSSV中的靶序列，而不与其它病毒核酸发生交叉反应。说明本发明方法及试剂盒特异性好，未出现假阳性。
五、灵敏度实验
提取阳性质粒（含有靶序列片段的T载体），并用紫外分光光度计测量阳性质粒的浓度，并将其分别稀释到10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL 、10fg/μL、1fg/μL、100ag/μL、10ag/μL、1ag/μL。采用上述3中的LAMP检测方法，分别对稀释后不同浓度的阳性标准品进行扩增检测。
检测结果如图2所示，从左到右的曲线依次为10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL 、10fg/μL、1fg/μL、100ag/μL、10ag/μL、1ag/μL的阳性标准品的扩增结果，从中可以看出本发明的LAMP试剂盒检测的灵敏度可达1fg/μL，精确性优于普通PCR检测方法，表明本发明的LAMP试剂盒和检测方法对病毒WSSV的诊断具有高度的灵敏性。
六、不同检测方法的灵敏度比较
为了进一步明确本发明LAMP检测灵敏度的优越性，提取WSSV的DNA，并以10的倍数进行系列稀释，即100至107倍稀释的样品，以所有稀释倍数的样品分别为模板，分别用本发明的LAMP检测方法、Real-time PCR法（Zhu et al., 2012：Zhu F, Quan H. A new method for quantifying white spot syndrome virus: Experimental challenge dose using TaqMan real-time PCR assay. J Virol Methods, 2012,184(1-2):121-124）、巢式PCR法（OIE，2009：OIE. Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals. 2012, 177-190）及另外4种已报道的LAMP方法进行病毒WSSV的检测（如图3所示），比较各种检测方法的灵敏度。其中，4种已报道的LAMP方法分别源自文章Kono et al., 2004：Kono T, Savan R, Sakai M, Itami T. Detection of white spot syndrome virus in shrimp by loop-mediated isothermal amplification [J]. J Virol Methods. 2004 Jan;115(1):59-65；Mekata et al., 2009：Mekata T, Sudhakaran R, Kono T, et al. Real-time quantitative loop-mediated isothermal amplification as simple method for detecting white spotsyndrome virus [J]. Lett Appl Microbiol, 2009, 48(1):25-32；Jaroenram et al., 2009：Jaroenram W, Kiatpathomchai W, Flegel TW. Rapid and sensitive detection of white spot syndrome virus by loop-mediated isothermalamplification combined with a lateral flow dipstick [J]. Mol Cell Probes, 2009, 23(2):65-70；Chou et al., 2011：Chou PH, Lin YC, Teng PH, et al. Real-time target-specific detection of loop-mediated isothermal amplification for white spot syndrome virus using fluorescence energy transfer-based probes. J Virol Methods, 2011, 173(1):67-74。
从图3所示的检测结果中，可获知本发明的LAMP检测方法可检测出稀释到105倍的样品（如图3 A）；Real-time PCR方法（Zhu et al., 2012）也能检测出稀释到105倍的样品（如图3 B），其中，扩增目的片段长度为154bp，反应在Applied Bio systems 7500实时定量PCR仪进行；巢式PCR方法（OIE，2009）能检测出稀释到104倍的样品（如图3 C），其中，外引物扩增目的片段为l447bp，内引物扩增目的片段为941bp，PCR反应结束后取5μL产物，在1%的琼脂糖凝胶上进行电泳分析；Kono et al., 2004和 Jaroenram et al., 2009的LAMP方法均能检测出稀释到104倍的样品（如图3 D和E），而Mekata et al., 2009和 Chou et al., 2011的LAMP方法均只能检测出稀释到103倍的样品（如图3 F和G）。
综合上述的检测结果，本发明的LAMP检测方法与Real-time PCR检测方法具有相同的灵敏度，但LAMP检测方法只需在恒温条件下进行，对设备要求低，且不需要荧光标记的探针，与荧光定量Real-time PCR相比，节约了大量成本，更适合水产养殖的检测；本发明的LAMP方法对WSSV检测的灵敏度均高于巢式PCR和4种现有LAMP检测方法的灵敏度（如图3所示）。
七、本发明LAMP检测试剂盒在临床实际应用中的评估
采用本发明试剂盒进行临床盲检的实验，检测66份对虾样品，采用上述3中的LAMP检测方法。同时应用巢式PCR检测方法对66份样品的检测作为对比。
结果显示，本发明试剂盒标本检测阳性率为7.57%（66份样品中有5份阳性），巢式PCR方法的阳性率为6.06%（66份样品中有4份阳性），两种检测结果中的4份阳性结果相同，存在一个阳性结果不同，对这个样品DNA进PCR扩增并测序，测序结果显示该样品为阳性。说明本发明的LAMP检测试剂盒具有更高的准确率。
本发明的LAMP检测试剂盒经过多次不同的重复实验证实，具有良好的重复性和稳定性。
<110> 广州迪澳生物科技有限公司
<120> 对虾白斑综合症病毒（WSSV）的LAMP检测引物组及试剂盒
<130>
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<170> PatentIn version 3.5
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<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 对虾白斑综合症病毒
<400> 7
acaacactgt gaccaagacc atcgaaaccc acacagacaa tatcgagaca aacatggatg 60
aaaacctccg cattcctgtg actgctgagg ttggatcagg ctacttcaag atgactgatg 120
tgtcctttga cagcgacacc ttgggcaaaa tcaagatccg caatggaaag tctgatgcac 180
agatgaagga agaagatgcg gatcttgtca tcactcccgt ggagggccga gcactcgaag 240
tgactgtggg gcagaatctc acctttgagg gaacattcaa ggtgtggaac 290
Claims (3)
1.一种对虾白斑综合症病毒的LAMP检测引物组，包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示：
WSSV-F3：ACAACACTGTGACCAAGAC；
WSSV-B3：GTTCCACACCTTGAATGTTC；
WSSV-FIP：CCCAAGGTGTCGCTGTCAACTGTGACTGCTGAGGTTG；
WSSV-BIP：CCGCAATGGAAAGTCTGATGCCACGGGAGTGATGACAAG；
WSSV-LF：CAGTCATCTTGAAGTAGCCTGA；
WSSV-LB：ATGAAGGAAGAAGATGCGGAT。
2.一种对虾白斑综合症病毒的LAMP检测试剂盒，其特征在于：检测试剂盒包括权利要求1所述的检测引物组。
3.根据权利要求2所述的对虾白斑综合症病毒的LAMP检测试剂盒，其特征在于：还包括DNA聚合酶、LAMP反应液、阳性对照和阴性对照。
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