CN105441586A - 一种a型h5n6亚型禽流感病毒双通道实时荧光pcr检测试剂盒和检测方法 - Google Patents

一种a型h5n6亚型禽流感病毒双通道实时荧光pcr检测试剂盒和检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用双重荧光PCR检测A型H5N6亚型禽流感病毒的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括：扩增H5和N6基因的PCR引物及探针，其核苷酸序列如Seq？ID？No：1-6所示，探针5’端标记有荧光报告基团，3端标记有荧光猝灭基团；RT-PCR反应液、酶混合液、阳性标准品、阴性标准品。本发明还公开了利用该试剂盒进行检测的方法，包括：提取样品核酸、配置反应体系、通过荧光定量PCR进行扩增、结果判读等步骤.结果显示，本发明提供的检测试剂盒能够快速检测A型H5N6型禽流感病毒，具有操作简单、灵敏度高，特异性好等优点，能为A型H5N6亚型禽流感病毒的监测和临床诊断提供一种高效的检测手段。

Description

一种A型H5N6亚型禽流感病毒双通道实时荧光PCR检测试剂盒和检测方法
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种A型H5N6亚型禽流感病毒双通道实时荧光PCR检测试剂盒和检测方法。
背景技术
流感病毒是流行性感冒的病原体，属于正粘病毒科，为RNA病毒，根据流感病毒核蛋白(Nucleoprotein，NP)和基质1蛋白(Matrixprotein1，M1)抗原性的不同，流感病毒可分为A、B、C三型，其中A型流感病毒是正粘病毒科的唯一属，根据流感病毒表面血凝素(hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(neuraminidase，NA)抗原性的不同，A型流感病毒可分为18个HA亚型(H1-H18)和11个NA亚型(N1-N11)，H5N1亚型禽流感病毒(Avianinfluenzavirus，AIV)表示一个禽流感病毒具有H5型HA蛋白和N1型NA蛋白。因此，在理论上，根据目前已知的18个HA和11个NA亚型可以组合形成198个亚型流感病毒.人感染A型流感病毒通常局限于3种HA亚型(H1，H2和H3)和2种NA亚型(N1和N2)，而家禽和野生鸟类通常作为其他亚型流感病毒的天然宿主。许多跨物种传播的禽流感病毒已经报道，如H5N1，H5N2，H9N2，H7N7，H7N2，H7N3，H10N7，H7N9和H10N8，尤其是H5N1和H7N9亚型禽流感病毒疫情造成了巨大的经济损失和人感染死亡病例。
2014年2月，一种新型的H5N6亚型重配禽流感病毒造成人类感染，截止2015年7月，全球共报告5例人感染病例，全部病例发生在中国大陆，另外在老挝、越南及中国大陆的禽及禽类市场环境中已检出H5N6亚型禽流感病毒，表明人感染H5N6亚型禽流感疫情形势不容乐观。为了有效地控制人感染H5N6亚型禽流感疫情，早期、快速、特异和敏感的检测方法研究成为当务之急。目前针对H5N6亚型禽流感病毒的检测主要依赖病毒培养、核酸检测和基因测序等方法，其中实时荧光PCR方法因具有快速、特异、敏感的特点，已成为各大研究机构和生物试剂公司优先研究开发的重点方向.
随着分子生物学的快速发展，实时荧光PCR技术在流感分子诊断领域发展最快。2004年JurgenA.Richt等利用real-timeRT-PCR技术进行了北美猪流感病毒的型别和亚型的分子诊断，该体系每次只能进行一个型别或亚型的诊断.2006年multiplexPCR技术被用于呼吸道病毒的分子诊断.2007年有人利用2套multiplexPCR对12种呼吸道病毒进行了分子诊断，但这两种方法都靠凝胶电泳进行结果分析，且自身存在灵敏度差、易交叉污染等不足。2007年real-timePCR被用于同时进行人禽流感病毒H5N1亚型的分子诊断.2008年多重real-timePCR开始被用于常见呼吸道病毒的分子诊断.2009年多管多重荧光定量PCR被用于检测新甲型H1N1流感病毒和季节性流感病毒.2010年单管多重荧光定量PCR开始被用于流感病毒亚型分型.但因为流感病毒的多变性，目前尚没有针对新近发现的A型H5N6流感病毒的单管多重荧光定量PCR试剂盒和诊断方法的报道.
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种快速、特异性强、灵敏度高的A型H5N6亚型禽流感病毒双通道实时荧光PCR检测试剂盒，可用于H5N6亚型禽流感病毒的监测和临床诊断。
本发明所述检测试剂盒具体包括以下组分：
(1)RT-PCR反应液：含有50mMMgSO4、0.4mMdNTPs；
(2)引物和探针混合液：包含H5及N6特异性引物、探针，其中H5-F和N6-F引物浓度均为20μM，H5-R和N6-R引物浓度均为40μM，H5和N6探针浓度为20μM；扩增特异性引物的序列如下：
H5上游引物H5-F：5-ATTGCTCCAGAATATGCATA-3(SeqIDNo：1)；
H5下游引物H5-R：5-AGARTTTATCGCCCCTATTG-3(SeqIDNo：2)；
H5特异性探针H5-probe：5-荧光报告基团-CAAAATWGTCAAGAAAGGGG-荧光猝灭基团-3(SeqIDNo：5)；
N6上游引物N6-F：5-CTAGGGTCGARTGCATAGGATG-3(SeqIDNo：3)；
N6下游引物N6-R：5-TACCACACYACTGCCGATGC-3(SeqIDNo：4)；
N6特异性探针N6-probe：5-荧光报告基团-AAGCACGTCATGCCAYGATG-荧光猝灭基团-3(SeqIDNo：6)；
(3)酶混合液：含有逆转录酶、Taq酶；
(4)阳性标准品为含H5N6亚型禽流感病毒特异性HA和NA基因片段DNA浓度分别为3.6ng/μL和3.3ng/μL的质粒混合物；
(5)阴性标准品为ddH2o。
上述A型H5N6亚型禽流感病毒HA和NA基因的双通道核酸检测试剂盒扩增反应液每管20.0μL，最优组成为：RT-PCR反应液16.0μL、引物和探针混合液3.0μL、酶混合液1.0μL.
本发明的双通道荧光PCR检测用引物具体包括两对引物及其各自对应的探针，分别扩增、检测H5基因和N6基因.
本发明的探针一端标记有荧光报告基团，探针另一端标记有荧光猝灭基团，荧光报告基团可以为常见的所述的荧光报告基团包括：MAR、JUP、URA、NEP、PLU、FAM、HEX、JOE、NED、TET、ROX或CY5；荧光猝灭基团包括：TAMRA、BHQ1、BHQ2，两条探针的荧光报告基团不相同即可.优选的，H5探针标记的荧光报告基团为FAM荧光基团，N6探针标记的荧光报告基团为Hex，所述的荧光猝灭基团均为BHQ1.
本发明的酶混合物，由逆转录酶和Taq酶组成，所述的逆转录酶为鼠白血病病毒逆转录酶，Taq酶为常见的耐热Taq聚合酶。两种酶的浓度分别为2IU/μL和2IU/μL。
本发明的反应体系中，所述的RT-PCR反应液、引物和探针混合液、酶混合液可以分开单独保存，也可以混合在一起，优选混合在一起保存.
本发明所述的阳性标准品，可以为含有H5基因和N6基因的DNA片段，该DNA片段可以为PCR扩增后产物、质粒、人工合成基因.
本发明样本核酸的提取，可参考现有病毒RNA提取技术，优选试剂盒提取法。
本发明试剂盒的PCR扩增程序为：①50℃30min，②95℃10min，③95℃15sec，④55℃45sec，其中③-④循环40次，荧光收集在步骤④。
本发明的另一目的在于提供一种利用本试剂盒进行检测的方法，包括以下步骤：
(1)病毒RNA的提取；
(2)试剂配置：在标明编号的PCR反应管中加入扩增反应液16.0μL、引物和探针混合液3.0μL、待检模板5.0μL和酶混合液1.0μL；阳性标准品反应管和阴性标准品反应管中各加入5.0μL标准品；
(3)PCR扩增：将上述PCR反应管混匀、离心后置于荧光定量PCR仪上，设置扩增程序：①50℃30min，②95℃10min，③95℃15sec，④55℃45sec，其中③-④循环40次，④收集信号.
(4)PCR反应结束后，检测PCR反应体系的荧光信号值，阈值设定原则以阈值线刚好超过阴性标准品样本荧光值最高点，荧光通道优先FAM和HEX通道.
结果判读：在仪器正常、阳性标准品和阴性标准品均正常的情况下进行结果分析，阳性标准品Ct≤35.0，阴性标准品Ct≥38.0，PCR扩增有效.
FAM通道：1)阳性：待测样本检测结果Ct≤35.0，扩增曲线呈S型且有明显指数增长期，判断为H5亚型禽流感病毒阳性；2)阴性：待测样本检测结果Ct＞38.0，判断为H5亚型禽流感病毒阴性；3)可疑：待测样本结果35.0＜Ct＜38.0，重复检测，如果结果一致，判断为H5亚型禽流感病毒阳性，如无扩增信号，则判断为H5亚型禽流感病毒阴性。
HEX通道：1)阳性：待测样本检测结果Ct≤35.0，扩增曲线呈S型且有明显指数增长期，判断为N6亚型禽流感病毒阳性；2)阴性：待测样本检测结果Ct＞38.0，判断为N6亚型禽流感病毒阴性；3)可疑：待测样本结果35.0＜Ct＜38.0，重复检测，如果结果一致，判断为N6亚型禽流感病毒阳性，如无扩增信号，则判断为N6亚型禽流感病毒阴性。
本发明通过两对引物在同一管中进行扩增，实现了双重检测，大大缩短了检测时间，操作简便，特异性引物和探针的设计包含了引物和探针的高度保守和特异性，避免了两对引物和探针间无互补配对和交叉扩增的情况.本发明选用的两个荧光基团波长相差较大且信号强度相近，避免了信号之间的相互干扰。
发明人对利用上述试剂盒和方法进行H5N6亚型禽流感病毒基因实时荧光RT-PCR扩增阳性的病例咽拭子标本进行病毒核苷酸测序，测序结果表明该病毒为H5N6亚型禽流感病毒，显示了本发明的准确性。
本发明的检测试剂盒能够快速检测A型H5N6型禽流感病毒，具有操作简单、灵敏度高、特异性好的优点，能为A型H5N6亚型禽流感病毒的监测和临床诊断提供一种高效的检测手段.
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图.
图1本发明所述试剂盒及方法进行H5N6亚型禽流感病毒H5和N6基因实时荧光RT-PCR扩增后结果。
H5-基因阳性标准品：为H5基因阳性标准品扩增曲线；N6-基因阳性标准品：为N6基因阳性标准品扩增曲线；H5-病例和N6病例分别为待检测样品咽拭子H5基因和N6基因检测结果，从扩增结果显示，待检测样品为H5N6阳性病例.
图2本发明所述试剂盒及方法H5引物/探针检测H5基因片段的敏感度结果.
H5基因片段10倍系列稀释(H5-2.5×107到H5-2.5×102)后扩增，H5-2.5×107到H5-2.5×102拷贝/反应均出现阳性扩增结果，表明H5引物/探针检测H5基因片段的敏感度结果为2.5×102拷贝/反应。
图3本发明所述试剂盒及方法N6引物/探针检测N6基因片段的敏感度结果。
N6基因片段10倍系列稀释(N6-2.5×107到N6-2.5×101)后扩增，N6-2.5×107到N6-2.5×101拷贝/反应均出现阳性扩增结果，表明N6引物/探针检测N6基因片段的敏感度结果为2.5×101拷贝/反应.
具体实施方式
下列实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内.
实施例1：H5N6亚型禽流感病毒双通道实时荧光PCR检测试剂盒中引物对、探针的设计和合成
针对H5N6病毒的HA基因和NA基因，寻找其保守序列位点，设计特异性扩增H5基因、N6基因的引物对和探针。
H5探针的5’标记有FAM荧光基团，3’标记有BHQ1猝灭基因；
N6探针的5’标记有HEX荧光基团，3’标记有BHQ1猝灭基团；
所述的引物对1为扩增H5基因的引物对，其上游引物H5-F为SeqIDNo.1所示序列，下游引物H5-R为SeqIDNo.2所示序列；
SeqIDNo.1：5-ATTGCTCCAGAATATGCATA-3；
SeqIDNo.2：5-AGARTTTATCGCCCCTATTG-3；
所述的引物对2为扩增N6基因的引物对，其上游引物N6-F为SeqIDNo.3所示序列，
下游引物N6-R为SeqIDNo.4所示序列；
SeqIDNo.3：5-GGGTCGARTGCAYAGGATG-3；
SeqIDNo.4：5-TACCACACYACTRCCGATG-3；
所述引物对1对应的探针H5-probe为SeqIDNo.5所示的序列，
SeqIDNo.5：5-FAM-CAAAATWGTCAAGAAAGGGG-BHQ1-3；
所述的引物对2对应的探针N6-probe为SeqIDNo.6所示的序列；
SeqIDNo.6：5-Hex-AAGCACGYCATGCCAYGATG-BHQ1-3；
实施例2：H5N6亚型禽流感病毒双通道核酸检测试剂盒的制备
H5N6亚型禽流感病毒HA和NA基因的双通道核酸检测试剂盒反应体系由RT-PCR反应液、引物和探针混合液、酶混合液、阳性标准品、阴性标准品组成.
RT-PCR反应液中：含有50mMMgSO4、0.4mMdNTPs、ddH2O；
引物和探针混合液：将实施例1中H5及N6特异性引物、探针用水溶解，按照H5-F和N6-F引物浓度均为20μM，H5-R和N6-R引物浓度均为40μM，H5和N6探针浓度为20μM混合，即为引物和探针混合液；
酶混合液：含有逆转录酶、Taq酶，浓度为2IU/μL；
试剂盒每管20.0μL，其中RT-PCR反应液16.0μL、引物和探针混合液3.0μL、酶混合液1.0μL。
使用时，加入5.0uL待检测样品提取的RNA模板即可。
实施例3：H5N6亚型禽流感病毒双通道核酸检测试剂盒特异性检测
诊断试剂性能评估中，灵敏度和特异性是两个关键的指标，能够反映试剂盒的诊断能力。特异性是指诊断试剂能够将从阴性样品中准确判断出真阴性的能力。
取9份流感病毒毒株或样本，其中包括A型季节性流感毒株3株，B型季节性流感病毒2株，H5N1亚型禽流感病毒样本1份，H9N2亚型禽流感病毒样本1份，H7N9亚型禽流感病毒样本1份，疑似人感染H5N6亚型禽流感病毒样本1份.
该9份样品信息分别为疑似人感染H5N6亚型禽流感病毒标本(A/changsha/1/2014)、A型季节性流感病毒毒株(H1N1：A/Yuelu/314/2009，H1N1pdm09：A/changsha/78/2009，H3N2：A/湖南开福/1648/2015)，B型季节性流感病毒毒株(BY：B/Changsha/138/2012，BV：B/Changsha/118/2012)，H5N1亚型禽流感病毒阳性样本(A/environment/Changsha/1/2009)、H9N2亚型禽流感病毒阳性样本(A/environment/Changsha/6/2009)和H7N9亚型禽流感病毒阳性样本(A/Changsha/2/2013)，上述供试毒株及阳性样本，由申请人保存。
将上述9份流感病毒毒株或样本，提取病毒RNA的提取.具体为取200μL待测毒株及样本，利用Qiagen公司的QIAampViralRNAMiniKit提取RNA.
实时荧光RT-PCR扩增，在标明编号的PCR反应管中加入扩增反应液16.0μL、引物混合液3.0μL、待检模板5.0μL和酶混合液1.0μL；并单独加入阳性标准品和阴性标准品，一同进行PCR扩增。
将上述PCR反应管混匀短暂离心后，置于AB7300real-timePCRsystem或Roche480IIPCR仪内进行以下反应：①50℃30min，②95℃10min，③95℃15sec，④55℃45sec，其中③-④循环40次.其中在④步骤收集荧光信号，其中FAM通道为H5，HEX通道为N6.
当PCR结束后，在仪器正常，阳性标准品和阴性标准品均正常的情况下进行结果分析(FAM通道为H5，HEX通道为N6).
FAM通道：1)阳性：待测样本检测结果Ct≤35.0，扩增曲线呈S型且有明显指数增长期，判断为H5亚型禽流感病毒阳性；2)阴性：待测样本检测结果Ct＞38.0，判断为H5亚型禽流感病毒阴性；3)可疑：待测样本结果35.0＜Ct＜38.0，重复检测，如果结果一致，判断为H5亚型禽流感病毒阳性，如无扩增信号，则判断为H5亚型禽流感病毒阴性。
HEX通道：1)阳性：待测样本检测结果Ct≤35.0，扩增曲线呈S型且有明显指数增长期，判断为N6亚型禽流感病毒阳性；2)阴性：待测样本检测结果Ct＞38.0，判断为N6亚型禽流感病毒阴性；3)可疑：待测样本结果35.0＜Ct＜38.0，重复检测，如果结果一致，判断为N6亚型禽流感病毒阳性，如无扩增信号，则判断为N6亚型禽流感病毒阴性。
扩增结果参见附图1，图1中H5-基因阳性标准品：为H5基因阳性标准品扩增曲线；N6-基因阳性标准品：为N6基因阳性标准品扩增曲线；H5-病例和N6病例分别为待检测样品咽拭子H5基因和N6基因检测结果，从扩增结果显示，待检测样品为H5N6阳性病例.
结果显示，疑似人感染H5N6亚型禽流感病例咽拭子标本H5和N6均出现阳性扩增结果，而选取的8份流感病毒毒株和样本，其中包括A型季节性流感毒株3株，B型季节性流感病毒2株，H5N1亚型禽流感病毒样本1份，H9N2亚型禽流感病毒样本1份，H7N9亚型禽流感病毒样本1份均未有阳性扩增，表明本试剂盒具有良好的特异性.
实施例4：H5N6亚型禽流感病毒H5和N6基因的双通道核酸检测试剂盒灵敏度检测
以人工合成的H5N6亚型禽流感病毒H5和N6基因特异性扩增区域片段质粒DNA为检测模板，将2.5×108拷贝/μL的H5片段和2.5×108拷贝/μL的N6基因片段质粒DNA分别进行系列10倍稀释，利用本试剂盒和上述检测方法同时进行实时荧光RT-PCR方法检测.
两种基因检测模板梯度稀释后进行的扩增曲线如图2、图3所示，检测结果表明本试剂盒H5引物/探针检测H5基因片段的敏感度为2.5×102拷贝/反应，N6引物/探针检测N6基因片段的敏感度为2.5×101拷贝/反应，显示了良好的敏感度。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换.凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种A型H5N6亚型禽流感病毒双通道实时荧光PCR检测试剂盒，主要由以下组分组成：
(1)RT-PCR反应液：含有50mMMgSO4、0.4mMdNTPs；
(2)引物和探针混合液：含扩增H5基因的引物对1、N6基因的特异性引物对2及分别对应的特异性探针；
所述引物对1为扩增H5基因的引物对，其上游引物H5-F为SeqIDNo.1所示序列，下游引物H5-R为SeqIDNo.2所示序列：
SeqIDNo.1：5-ATTGCTCCAGAATATGCATA-3；
SeqIDNo.2：5-AGARTTTATCGCCCCTATTG-3；
所述引物对2为扩增N6基因的引物对，其上游引物N6-F为SeqIDNo.3所示序列，下游引物N6-R为SeqIDNo.4所示序列：
SeqIDNo.3：5-GGGTCGARTGCAYAGGATG-3；
SeqIDNo.4：5-TACCACACYACTRCCGATG-3；
所述H5基因对应的探针H5-probe为SeqIDNo.5所示的序列：
SeqIDNo.5：5-CAAAATWGTCAAGAAAGGGG-3；
所述N6基因对应的探针N6-probe为SeqIDNo.6所示的序列：
SeqIDNo.6：5-AAGCACGYCATGCCAYGATG-3；
(3)酶混合液：逆转录酶、Taq酶；
(4)含有H5N6亚型禽流感病毒特异性HA和NA基因片段DNA的阳性标准品。
2.权利要求1所述的A型H5N6亚型禽流感病毒双通道实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述引物对1、2中的H5和N6的上游引物浓度为20μM，H5和N6下游引物浓度均为40μM，H5和N6探针浓度为20μM。
3.权利要求1所述的A型H5N6亚型禽流感病毒双通道实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述H5、N6对应的探针5’端含有荧光报告基因，3’端含有荧光猝灭基因，所述荧光报告基团包括：MAR、JUP、URA、NEP、PLU、FAM、HEX、JOE、NED、TET、ROX或CY5；所述荧光猝灭基团包括：TAMRA、BHQ1、BHQ2。
4.权利要求1所述的A型H5N6亚型禽流感病毒双通道实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述含有A型H5N6亚型禽流感病毒特异性HA和NA基因片段DNA的阳性标准品，HA片段的DNA浓度为3.6ng/ul，NA片段的DNA浓度为3.3ng/ul。
5.权利要求1所述的A型H5N6亚型禽流感病毒双通道实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述含有H5N6亚型禽流感病毒特异性HA和NA基因片段DNA的阳性标准品，所述的DNA片段可以为质粒、PCR扩增产物或人工合成基因。
6.权利要求1所述A型H5N6亚型禽流感病毒双通道实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，试剂盒中反应体系组成为：扩增反应液每管20.0μL，包括RT-PCR反应液16.0μL、H5/N6反应混合液3.0μL、酶混合液1.0μL。
7.一种利用权利要求1所述的A型H5N6亚型禽流感病毒双通道核酸检测试剂盒进行检测的方法，包括以下步骤：
(1)病毒RNA的提取：取待测样本，提取RNA；
(2)A型H5N6亚型禽流感病毒的实时荧光RT-PCR扩增，利用SeqIDNo.1-6所述针对H5基因和N6基因的扩增引物对和探针，在荧光定量PCR仪中对H5N6亚型禽流感病毒的HA和NA基因进行扩增：
A.在标明编号的PCR反应管中加入扩增反应液16.0μL、引物混合液3.0μL、待检模板5μL和酶混合液1.0μL；
B.将上述PCR反应管混匀离心后置于荧光定量PCR仪内进行以下反应：①50℃保温30分钟，②95℃保温10分钟，③95℃变性15秒，④55℃退火45秒，其中③④循环40次；
(3)结果判读：在仪器正常，阳性标准品和阴性标准品均正常的情况下进行结果分析：
阳性：待测样本检测结果Ct≤35.0，扩增曲线呈S型且有明显指数增长期，判断为H5N6亚型禽流感病毒阳性；
阴性：待测样本检测结果Ct＞38.0，判断为H5N6亚型禽流感病毒阴性；
可疑：待测样本结果35.0＜Ct＜38.0，重复检测，如果结果一致，判断为H5N6亚型禽流感病毒阳性，如无扩增信号，则判断为H5N6亚型禽流感病毒阴性。
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