JP6329370B2 - 呼吸器系ウイルスによる疾患の同時診断キット - Google Patents
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- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
Description
本発明は、呼吸器系ウイルスによる疾患の同時診断キットに関し、より詳しくは、呼吸器疾患を誘発する原因ウイルスに特異的な遺伝子を検出することにより、呼吸器系ウイルスによる疾患を診断する方法、該方法に使用される呼吸器系ウイルスによる疾患診断用プライマーセット、該プライマーセットを含む呼吸器系ウイルスによる疾患同時診断用組成物、及び該組成物を含む呼吸器系ウイルスによる疾患の同時診断キットに関する。
呼吸器系ウイルスは急性呼吸器感染の主要原因であり、呼吸器系ウイルスによる疾患は年齢や性別を問わず最もかかり易い病気であるといえる。特に、幼児やお年寄り、心肺機能及び免疫機能が低下した人々などの場合、後遺症を誘発して死亡に至ることもあると知られている。呼吸器系ウイルス関連疾患は、一般に風邪のような症状を示し始め、咽頭炎、慢性喘息の悪化、肺炎に至る様々な症状を示す。このような呼吸器系ウイルスを早期に診断すると、不必要な抗生物質の濫用を防ぐことができ、ウイルス類型を早期に発見して適切な治療を行うことができるという利点がある。
このような呼吸器系ウイルスの診断方法としては、伝統的な細胞培養法、迅速細胞培養法、迅速抗原非免疫蛍光検査法、迅速抗原免疫蛍光検査法、及び電気泳動方式を用いた分子診断法などがある。現在の標準的検査法である細胞培養法の場合は、検査結果の確認に少なくとも５〜９日かかるため呼吸器系ウイルス感染の早期診断及び治療が困難である。このような欠点を補完するために、２４〜７２時間内に結果を確認し且つ伝統的な培養法と同じよな敏感度を示すＲ−ブミックスウイルス培養法などが行われているが、これも早期診断及び治療には限界がある。迅速抗原非免疫蛍光検査法は、短時間で結果を確認することができるものの、 伝統的な培養法に比べ敏感度が低いため、偽陰性が多いという欠点があり、電気泳動方式を用いた分子診断法の場合は、敏感度における問題は解決されるが、２段階で行われるため汚染問題が発生するおそれがあり、長時間かかるという欠点がある。
このような背景の下で、本発明者は、敏感度、汚染、及び長時間を要する呼吸器系ウイルス診断法の問題点を克服し得る方法を見出すために鋭意努力した結果、１４種のウイルスに特異的な遺伝子を増幅することが可能な各プライマーセット及びプローブを開発し、前記開発された各プライマーセット及びプローブを使用する場合、高い敏感度と特異度で１４種の呼吸器系ウイルスを同時に診断することができることを確認し、本発明を完成するに至った。
本発明の目的は、呼吸器疾患を誘発する原因ウイルスに特異的な遺伝子を検出することにより、呼吸器系ウイルスによる疾患を遮断する方法を提供することにある。
また、本発明の他の目的は、前記方法に使用される呼吸器系ウイルスによる疾患診断用プライマーセットを提供することにある。
さらに、本発明の目的は、前記プライマーセットを含む呼吸器系ウイルスによる疾患同時診断用組成物を提供することにある。
さらに、本発明の目的は、前記組成物を含む呼吸器系ウイルスによる疾患の同時診断キットを提供することにある。
前記目的を達成するための一つの実施様態として、本発明は、呼吸器系ウイルスの感染有無を確認することができるように、配列番号１〜１４及び１７〜３３の塩基配列を含むプライマーを提供する。
本発明の用語「診断」とは、病理状態を確認することを意味する。本発明の目的上、診断は、既存の多様な呼吸器系ウイルスに特異的な遺伝子の発現有無を確認し、呼吸器系ウイルスにより引き起こされる疾病の発病有無及び発病後の抗ウイルス薬の治療過程における予後を確認することである。
本発明の用語「プライマー」とは、短い自由３末端水酸基(free 3’ hydroxyl group)を有する核酸配列であって、相補的な鋳型(template)と塩基対(base pair)を形成することができ、鋳型鎖の複製のための開始点として機能する短い核酸配列を意味する。プライマーは、適切な温度及び緩衝溶液で重合反応のための試薬（ＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素）及び異なる４つのｄＮＴＰ(deoxynucleoside triphospate)の存在下でＤＮＡ合成を開始することができる。本発明によれば、前記のプライマーは、１０〜３０個の塩基配列を有するそれぞれの正方向及び逆方向の核酸から構成されることが好ましい。
前記プライマーは、呼吸器系ウイルスの感染有無を確認することができるように呼吸器系ウイルスに特異的な遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応によって増幅させることができるが、前記呼吸器系ウイルスは、特にこれに限定されないが、コロナウイルス２２９Ｅ(Corona Virus 229E)、コロナウイルスＯＣ４３(Corona Virus OC43)、コロナウイルスＮＬ６３(Corona Virus NL63)、Ａ型インフルエンザウイルス(Influenza A Virus)、Ｂ型インフルエンザウイルス(Influenza B Virus)、パラインフルエンザウイルス１(Parainfluenza Virus 1)、パラインフルエンザウイルス２(Parainfluenza Virus 2)、パラインフルエンザウイルス３(Parainfluenza Virus 3)、ＲｓウイルスＡ型(RS Virus B)、ＲｓウイルスＢ型(RS Virus B)、アデノウイルス(Adeno Virus)、ライノウイルスＡ型(Rhino Virus A)、ライノウイルスＢ型、ライノウイルスＣ型、メタニューモウイルス(Metapneumovirus)、ボカウイルス(Boca Virus)などを挙げることができ、前記各呼吸器系ウイルスを他のウイルスと区別させることが可能な遺伝子は、特にこれに限定されないが、コロナウイルス２２９Ｅの核タンパク質（Ｎ）遺伝子(nucleoprotein(N) gene)、コロナウイルスＯＣ４３の核タンパク質遺伝子(nucleoprotein(N) gene)、コロナウイルスＮＬ６３のポリタンパク質（１ａ）遺伝子(polyprotein(la) gene)、 Ａ型インフルエンザウイルスの基質タンパク質（Ｍ）遺伝子(matrix protein(M) gene)、Ｂ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）遺伝子(hemagglutinin(HA) gene)、パラインフルエンザウイルス１のヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）遺伝子(hemagglutinin-neuraminidase(HN) gene)、パラインフルエンザウイルス２のヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）遺伝子(hemagglutinin-neuraminidase(HN) gene)、パラインフルエンザウイルス３のヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）遺伝子(hemagglutinin-neuraminidase(HN) gene)、ＲｓウイルスＡ型の融合タンパク質遺伝子(fusion protein gene)、ＲｓウイルスＢ型型の融合タンパク質遺伝子(fusion protein gene)、アデノウイルスのヘキソンタンパク質遺伝子(hexon protein gene)、またはライノウイルスＡ型、Ｂ型、Ｃ型の５’ＴＲ、メタニューモウイルス(メタニューモウイルス)の核タンパク質（Ｎ）遺伝子(nucleoprotein(N) gene)、ボカウイルスのヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）遺伝子(nucleocapsid protein(NP) gene, Viral protein(VP) gene)などを挙げることができる。
本発明で提供するプライマーは、特にこれに限定されないが、コロナウイルス２２９Ｅの核タンパク質（Ｎ）遺伝子を増幅させることが可能な配列番号１または２の塩基配列を有するプライマー、コロナウイルスＯＣ４３の核タンパク質（Ｎ）遺伝子を増幅させることが可能な配列番号３または４の塩基配列を有するプライマー、コロナウイルスＮＬ６３のポリタンパク質（１ａ）遺伝子を増幅させることが可能な配列番号５または６の塩基配列を有するプライマー、パラインフルエンザウイルス１のヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）遺伝子を増幅させることが可能な配列番号７及び８の塩基配列を有するプライマー、パラインフルエンザウイルス２のヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）遺伝子を増幅させることが可能な配列番号９及び１０の塩基配列を有するプライマー、パラインフルエンザウイルス３のヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）遺伝子を増幅させることが可能な配列番号１１及び１２の塩基配列を有するプライマー、Ａ型インフルエンザウイルスの基質タンパク質（Ｍ）遺伝子を増幅させることが可能な配列番号１３及び１４の塩基配列を有するプライマー、Ｂ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）遺伝子を増幅させることが可能な配列番号１７及び１８の塩基配列を有するプライマー、ＲｓウイルスＡ型の融合タンパク質遺伝子を増幅させることが可能な配列番号１９及び２０の塩基配列を有するプライマー、ＲｓウイルスＢ型の融合タンパク質遺伝子を増幅させることが可能な配列番号２１及び２２の塩基配列を有するプライマー、アデノウイルスのヘキソンタンパク質遺伝子を増幅させることが可能な配列番号２５及び２６の塩基配列を有するプライマー、ライノウイルスＡ型、Ｂ型、Ｃ型の５’ＵＴＲを増幅させることが可能な配列番号２７〜３１の塩基配列を有するプライマー、メタニューモウイルスの核タンパク質（Ｎ）遺伝子を増幅させることが可能な配列番号２３及び２４の塩基配列を有するプライマー、及びボカウイルスのヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）遺伝子を増幅させることが可能な配列番号３２及び３３の塩基配列を有するプライマーなどを使用することが好ましい。
また、前記プライマーは、ＤＮＡ合成の開始点として作用するプライマーの基本性質を変化させないという特徴をさらに含むことができる。また、本発明のプライマー核酸配列は、必要に応じて、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的または化学的手段によって直接または間接的に検出可能な標識を含むことができる。標識の例としては、酵素（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ）、放射性同位元素（例えば、３２Ｐ）、蛍光性分子、化学基（例えば、ビオチン）などがある。
また、前記プライマーは、ホスホルアミダイト固体支持体による方法、またはその他公知の方法を用いて化学的に合成することができる。このような核酸配列は、また、当該分野における公知の様々な手段を用いて変形させることができるが、好ましくはメチル化、キャップ化、少なくとも一つの天然ヌクレオチドの同属体への置換、多様な連結体（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミダート、カルバメート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）の付加などの方法で変形させることができるが、特にこれに限定されない。
前記目的を達成するための他の実施様態として、本発明は、前記プライマーセットを含む呼吸器系ウイルス同時診断用組成物を提供する。
本発明の呼吸器系ウイルスの同時診断用組成物は、上述したコロナウイルス２２９Ｅの核タンパク質（Ｎ）遺伝子を増幅させることが可能な配列番号１または２の塩基配列を有するプライマー、コロナウイルスＯＣ４３の核タンパク質（Ｎ）遺伝子を増幅させることが可能な配列番号３または４の塩基配列を有するプライマー、コロナウイルスＮＬ６３のポリタンパク質（１ａ）遺伝子を増幅させることが可能な配列番号５または６の塩基配列を有するプライマー、パラインフルエンザウイルス１のヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）遺伝子を増幅させることが可能な配列番号７及び８の塩基配列を有するプライマー、パラインフルエンザウイルス２のヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）遺伝子を増幅させることが可能な配列番号９及び１０の塩基配列を有するプライマー、パラインフルエンザウイルス３のヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）遺伝子を増幅させることが可能な配列番号１１及び１２の塩基配列を有するプライマー、Ａ型インフルエンザウイルスの基質タンパク質（Ｍ）遺伝子を増幅させることが可能な配列番号１３及び１４の塩基配列を有するプライマー、Ｂ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）遺伝子を増幅させることが可能な配列番号１７及び１８の塩基配列を有するプライマー、ＲｓウイルスＡ型の融合タンパク質遺伝子を増幅させることが可能な配列番号１９及び２０の塩基配列を有するプライマー、ＲｓウイルスＢ型の融合タンパク質遺伝子を増幅させることが可能な配列番号２１及び２２の塩基配列を有するプライマー、アデノウイルスのヘキソンタンパク質遺伝子を増幅させることが可能な配列番号２５及び２６の塩基配列を有するプライマー、ライノウイルスＡ型、Ｂ型、Ｃ型の５’ＵＴＲを増幅させることが可能な配列番号２７〜３１の塩基配列を有するプライマー、メタニューモウイルスの核タンパク質（Ｎ）遺伝子を増幅させることが可能な配列番号２３及び２４の塩基配列を有するプライマー、及びボカウイルスのヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）遺伝子を増幅させることが可能な配列番号３２及び３３の塩基配列を有するプライマーを含み、好ましくは前記プライマー対から構成されたセットのうち２つ以上を含んで、上述した呼吸器系ウイルスの中でも２つ以上を同時に診断することに使用できる。
前記組成物は、呼吸器系ウイルスの特異的な遺伝子をより効果的に検出することができるように配列番号３４〜４０及び４２〜５２の塩基配列を有するプローブをさらに含むことができる。
本発明の用語「プローブ」とは、相補的な塩基配列と特異的結合を成すことが可能な、短いものは数塩基から長いものでは数百塩基のＲＮＡまたはＤＮＡなどの核酸断片を意味し、標識化されているため特定塩基配列の存在有無を確認することができる。プローブはオリゴヌクレオチド(oligonucleotide)プローブ、一本鎖ＤＮＡ(single stranded DNA)プローブ、二本鎖ＤＮＡ(double stranded DNA)プローブ、ＲＮＡプローブなどの形で製作できる。また、リアルタイムＰＣＲを行うためには、蛍光標識されたプローブを用いることができる。より具体的に、ＴａｑＭａｎプローブを用いる場合は５’末端は蛍光物質、３’末端はクエンチャー物質でそれぞれ修飾したオリゴヌクレオチドをＰＣＲ反応液に添加する。また、サイリングプローブを用いたリアルタイムＰＣＲは、ＲＮＡ及びＤＮＡからなるキメラプローブとＲＮＡｓｅ Ｈとからなる高感度の検出方法である。これも同様に、プローブの５’末端は蛍光物質、３’末端はクエンチャー物質でそれぞれ標識する。
本発明者らは、リアルタイムＰＣＲを行い、その増幅産物を検出する場合にはその増幅産物の増加をリアルタイムでモニタリングすることができるのでＤＮＡ及びＲＮＡの正確な定量が可能であり、電気泳動が不要であるので迅速かつ簡便に解釈することができるうえ、汚染の危険が少ないことに着目し、リアルタイムＰＣＲ方法を用いて呼吸器系ウイルスをより効果的に診断するために蛍光標識プローブを製作した。前記プローブは、特にこれに限定されないが、コロナウイルス２２９Ｅの核タンパク質（Ｎ）遺伝子を検出することが可能な配列番号３４の塩基配列を有するプローブ、コロナウイルスＯＣ４３の核タンパク質（Ｎ）遺伝子を検出することが可能な配列番号３５の塩基配列を有するプローブ、コロナウイルスＮＬ６３のポリタンパク質（１ａ）遺伝子を検出することが可能な配列番号３６の塩基配列を有するプローブ、パラインフルエンザウイルス１のヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）遺伝子を検出することが可能な配列番号３７の塩基配列を有するプローブ、パラインフルエンザウイルス２のヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）遺伝子を検出することが可能な配列番号３８の塩基配列を有するプローブ、パラインフルエンザウイルス３のヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）遺伝子を検出することが可能な配列番号３９の塩基配列を有するプローブ、Ａ型インフルエンザウイルスの基質タンパク質（Ｍ）遺伝子を検出することが可能な配列番号４０の塩基配列を有するプローブ、Ｂ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）遺伝子を検出することが可能な配列番号４２の塩基配列を有するプローブ、ＲｓウイルスＡ型の融合タンパク質遺伝子を検出することが可能な配列番号４３の塩基配列を有するプローブ、ＲｓウイルスＢ型の融合タンパク質遺伝子を検出することが可能な配列番号４４の塩基配列を有するプローブ、メタニューモウイルスの核タンパク質（Ｎ）遺伝子を検出することが可能な配列番号４５の塩基配列を有するプローブ、アデノウイルスのヘキソンタンパク質遺伝子を検出することが可能な配列番号４６〜４９の塩基配列を有するプローブ、ライノウイルスＡ、Ｂ、Ｃの５’ＵＴＲを検出することが可能な配列番号５０〜５１の塩基配列を有するプローブ、ボカウイルスのヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）遺伝子(nucleocapsid protein(NP) gene, Viral protein(VP) gene)を検出することが可能な配列番号５２の塩基配列を有するプローブなどを使用することが好ましい。
また、ＲＮＡ抽出過程の有効性に対する判断基準を提供するために、ヒトＲＮａｓｅ Ｐを標的とする内部対照群プライマーとして、配列番号１５及び１６の塩基配列を有するプライマー、または配列番号４１の塩基配列を有するプローブをさらに含むことができる。
また、上述したプライマーと同様に、本発明で提供するプローブは、ホスホルアミダイト固体支持体による方法、または公知の方法を用いて化学的に合成することができる。このような核酸配列は、また、当該分野における公知の様々な手段を用いて変形させることができるが、好ましくはメチル化、キャップ化、少なくとも一つの天然ヌクレオチドの同属体への置換、多様な連結体（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミダート、カルバメート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）の付加などの方法で変形させることができるが、特にこれに限定されない。
本発明の呼吸器系ウイルス診断用組成物は、前記プローブだけでなく、ポリメラーゼ連鎖反応を行うためのＤＮＡポリメラーゼをさらに含むこともでき、前記ＤＮＡポリメラーゼは、特にこれに限定されないが、ホットスタートＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを使用することが好ましい。
また、本発明の呼吸器系ウイルス診断用組成物は、試料から抽出されたＲＮＡを試料として用いることもできるが、このようにＲＮＡを試料として用いるためには逆転写ポリメラーゼ連鎖反応をさらに行い、前記逆転写ＰＣＲ反応の反応産物を対象として呼吸器系ウイルスの特異的な遺伝子が存在有無を確認しなければならない。よって、前記組成物は、前記プローブとＤＮＡポリメラーゼの他にも、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を行うための逆転写酵素をさらに含むことができる。
前記目的を達成するための別の様態として、本発明は、前記プライマーセットまたは組成物を含む呼吸器系ウイルス同時診断キットを提供する。
本発明の呼吸器系ウイルス診断用キットは、上述した呼吸器系ウイルス診断組成物と同様に、前記プライマーセットのうち２つ以上または前記組成物を含み、上述した呼吸器系ウイルスのうち２つ以上を同時に診断することに使用できる。
また、本発明のキットは、分析方法に適した１種またはそれ以上の異なる構成成分組成物、溶液または装置をさらに含むことができる。例えば、本発明の診断用キットは、検出遺伝子に対する特異的なそれぞれのプライマー対の他にも、逆転写反応及びリアルタイム多重ＰＣＲ(real-time multiplex PCR)を行うために必要な構成要素である呼吸器系ウイルスの遺伝子ＲＮＡから相補的なｃＤＮＡを合成するための逆転写酵素、相補的なＤＮＡを増幅するためのＤＮＡポリメラーゼ、チューブまたは他の適切なコンテナー、反応緩衝液（さまざまな濃度のｐＨ及びマグネシウム）、デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰｓ）、ホットスタート Ｔａｑ−ポリメラーゼや逆転写酵素などの酵素、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ阻害剤、ＤＥＰＣ−水(DEPC-water)、及び滅菌水などをさらに含む、呼吸器系ウイルス同時診断キットであってもよいが、特にこれに限定されない。
前記目的を達成するための別の様態として、本発明は、前記組成物またはキットを用いた呼吸器系ウイルスによる疾患の診断方法または呼吸器系ウイルスによる疾患の診断のための情報の提供方法を提供する。
より具体的には、本発明の呼吸器系ウイルスによる疾患の診断方法は、（ｉ）前記プライマー、前記プローブ、ＤＮＡポリメラーゼ及び逆転写酵素を混合して反応混合物を得る段階と、（ｉｉ）前記反応混合物に検体から得たＤＮＡまたはＲＮＡを加え、逆転写反応及びリアルタイムＰＣＲ反応を順次行って反応産物を得る段階、及び（ｉｉｉ）前記反応産物を分析して１〜１４種の前記原因ウイルスを同時に検出する段階とを含んでなる。この際、前記呼吸器系ウイルスは、特にこれに限定されないが、コロウイルス２２９Ｅ、コロナウイルスＯＣ４３、コロナウイルスＮＬ６３、 Ａ型インフルエンザウイルス、 Ｂ型インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス１、パラインフルエンザウイルス２、パラインフルエンザウイルス３、ＲｓウイルスＡ型、ＲｓウイルスＢ型、アデノウイルス、ライノウイルスＡ型、Ｂ型、Ｃ型、メタニューモウイルス、ボカウイルスなどを使用することが好ましい。
本発明の用語「検体」とは、様々な呼吸器系ウイルスの感染によって前記各ウイルスに特異的な遺伝子の発現レベルが異なる唾または痰（ＮＰＳ(Nasopharyngeal swabs)、ＮＳ(Nasla swabs)、ＴＳ(Throat swabs)、ＮＡ(Nasal aspirates)）などの試料を含むが、特にこれに限定されない。
本発明の呼吸器系ウイルス診断用プライマーセットを用いると、多重リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応によって１回の反応のみで１４種の呼吸器系ウイルスを同時に検出し、これらのウイルスによる呼吸器疾患の発病有無を診断することができるので、より迅速な呼吸器疾患の診断及び治療に広く活用できる。
以下、実施例によって本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのもので、本発明の範囲を限定するものではない。
呼吸器系ウイルスの特異的なプライマー及びプローブの製作
鼻咽頭の吸引物或いはスワブ(swab)検体（ＮＰＳ(Nasopharyngeal swabs)、ＮＳ(Nasla swabs)、ＴＳ(Throat swabs)、ＮＡ(Nasal aspirates)）を対象として１４種の呼吸器系ウイルスの検出及び区分を行うためのプライマー及びプローブを製作した。
鼻咽頭の吸引物或いはスワブ(swab)検体（ＮＰＳ(Nasopharyngeal swabs)、ＮＳ(Nasla swabs)、ＴＳ(Throat swabs)、ＮＡ(Nasal aspirates)）を対象として１４種の呼吸器系ウイルスの検出及び区分を行うためのプライマー及びプローブを製作した。
実施例１−１：呼吸器系ウイルスの特異的なプライマーの製作
本発明者は、コロナウイルス２２９Ｅの核タンパク質（Ｎ）遺伝子を増幅させることが可能な配列番号１及び２の塩基配列を有するプライマー、コロナウイルスＯＣ４３の核タンパク質（Ｎ）遺伝子を増幅させることが可能な配列番号３及び４の塩基配列を有するプライマー、コロナウイルスＮＬ６３のポリタンパク質（１ａ）遺伝子を増幅させることが可能な配列番号５及び６の塩基配列を有するプライマー、パラインフルエンザウイルス１のヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）遺伝子を増幅させることが可能な配列番号７及び８の塩基配列を有するプライマー、パラインフルエンザウイルス２のヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）遺伝子を増幅させることが可能な配列番号９及び１０の塩基配列を有するプライマー、パラインフルエンザウイルス３のヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）遺伝子を増幅させることが可能な配列番号１１及び１２の塩基配列を有するプライマー、Ａ型インフルエンザウイルスの基質タンパク質（Ｍ）遺伝子を増幅させることが可能な配列番号１３及び１４の塩基配列を有するプライマー、ＲＮａｓｅ Ｐを標的とする内部対照群であって、ＲＮＡ抽出過程の有効性に対する判断基準を提供する配列番号１５及び１６の塩基配列を有するプライマー、Ｂ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）遺伝子を増幅させることが可能な配列番号１７及び１８の塩基配列を有するプライマー、ＲｓウイルスＡ型の融合タンパク質遺伝子を増幅させることが可能な配列番号１９及び２０の塩基配列を有するプライマー、ＲｓウイルスＢ型の融合タンパク質遺伝子を増幅させることが可能な配列番号２１及び２２の塩基配列を有するプライマー、アデノウイルスのヘキソンタンパク質遺伝子を増幅させることが可能な配列番号２５及び２６の塩基配列を有するプライマー、ライノーウイルスＡ、Ｂ、Ｃの５’ＵＴＲを増幅させることが可能な配列番号２７及び３１の塩基配列を有するプライマー、メタニューモウイルスの核タンパク質（Ｎ）遺伝子を増幅させることが可能な配列番号２３及び２４の塩基配列を有するプライマー、及びボカウイルスのＮＰ(nucleocapsid protein)遺伝子、ＶＰ(Viral protein)遺伝子を増幅させることが可能な配列番号３２及び３３の塩基配列を有するプライマーを通常の方法を用いてそれぞれ作製した（表１参照）。
本発明者は、コロナウイルス２２９Ｅの核タンパク質（Ｎ）遺伝子を増幅させることが可能な配列番号１及び２の塩基配列を有するプライマー、コロナウイルスＯＣ４３の核タンパク質（Ｎ）遺伝子を増幅させることが可能な配列番号３及び４の塩基配列を有するプライマー、コロナウイルスＮＬ６３のポリタンパク質（１ａ）遺伝子を増幅させることが可能な配列番号５及び６の塩基配列を有するプライマー、パラインフルエンザウイルス１のヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）遺伝子を増幅させることが可能な配列番号７及び８の塩基配列を有するプライマー、パラインフルエンザウイルス２のヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）遺伝子を増幅させることが可能な配列番号９及び１０の塩基配列を有するプライマー、パラインフルエンザウイルス３のヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）遺伝子を増幅させることが可能な配列番号１１及び１２の塩基配列を有するプライマー、Ａ型インフルエンザウイルスの基質タンパク質（Ｍ）遺伝子を増幅させることが可能な配列番号１３及び１４の塩基配列を有するプライマー、ＲＮａｓｅ Ｐを標的とする内部対照群であって、ＲＮＡ抽出過程の有効性に対する判断基準を提供する配列番号１５及び１６の塩基配列を有するプライマー、Ｂ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）遺伝子を増幅させることが可能な配列番号１７及び１８の塩基配列を有するプライマー、ＲｓウイルスＡ型の融合タンパク質遺伝子を増幅させることが可能な配列番号１９及び２０の塩基配列を有するプライマー、ＲｓウイルスＢ型の融合タンパク質遺伝子を増幅させることが可能な配列番号２１及び２２の塩基配列を有するプライマー、アデノウイルスのヘキソンタンパク質遺伝子を増幅させることが可能な配列番号２５及び２６の塩基配列を有するプライマー、ライノーウイルスＡ、Ｂ、Ｃの５’ＵＴＲを増幅させることが可能な配列番号２７及び３１の塩基配列を有するプライマー、メタニューモウイルスの核タンパク質（Ｎ）遺伝子を増幅させることが可能な配列番号２３及び２４の塩基配列を有するプライマー、及びボカウイルスのＮＰ(nucleocapsid protein)遺伝子、ＶＰ(Viral protein)遺伝子を増幅させることが可能な配列番号３２及び３３の塩基配列を有するプライマーを通常の方法を用いてそれぞれ作製した（表１参照）。
実施例１−２：呼吸器系ウイルスの特異的なプローブの製作
本発明者らは、コロナウイルス２２９Ｅの核タンパク質（Ｎ）遺伝子を検出することが可能な配列番号３４の塩基配列を有するプローブ、コロナウイルスＯＣ４３の核タンパク質（Ｎ）遺伝子を検出することが可能な配列番号３５の塩基配列を有するプローブ、コロナウイルスＮＬ６３のポリタンパク質（１ａ）遺伝子を検出することが可能な配列番号３６の塩基配列を有するプローブ、パラインフルエンザウイルス１のヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）遺伝子を検出することが可能な配列番号３７の塩基配列を有するプローブ、パラインフルエンザウイルス２のヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）遺伝子を検出することが可能な配列番号３８の塩基配列を有するプローブ、パラインフルエンザウイルス３のヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）遺伝子を検出することが可能な配列番号３９の塩基配列を有するプローブ、Ａ型インフルエンザウイルスの基質タンパク質（Ｍ）遺伝子を検出することが可能な配列番号４０の塩基配列を有するプローブ、内部対照群として、ＲＮａｓｅ Ｐを検出することが可能な配列番号４１の塩基配列を有するプローブ、Ｂ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）遺伝子を検出することが可能な配列番号４２の塩基配列を有するプローブ、ＲｓウイルスＡ型の融合タンパク質遺伝子を検出することが可能な配列番号４３の塩基配列を有するプローブ、ＲｓウイルスＢ型の融合タンパク質遺伝子を検出することが可能な配列番号４４の塩基配列を有するプローブ、メタニューモウイルスの核タンパク質（Ｎ）遺伝子を検出することが可能な配列番号４５の塩基配列を有するプローブ、アデノウイルスのヘキソンタンパク質遺伝子を検出することが可能な配列番号４６〜４９の塩基配列を有するプローブ、ライノーウイルスＡ、Ｂ、Ｃの５’ＵＴＲを検出することが可能な配列番号５０及び５１の塩基配列を有するプローブ、ボカウイルスのヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）遺伝子を検出することが可能な配列番号５２の塩基配列を有するプローブを、通常の方法を用いてそれぞれ製作した（表２参照）。
本発明者らは、コロナウイルス２２９Ｅの核タンパク質（Ｎ）遺伝子を検出することが可能な配列番号３４の塩基配列を有するプローブ、コロナウイルスＯＣ４３の核タンパク質（Ｎ）遺伝子を検出することが可能な配列番号３５の塩基配列を有するプローブ、コロナウイルスＮＬ６３のポリタンパク質（１ａ）遺伝子を検出することが可能な配列番号３６の塩基配列を有するプローブ、パラインフルエンザウイルス１のヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）遺伝子を検出することが可能な配列番号３７の塩基配列を有するプローブ、パラインフルエンザウイルス２のヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）遺伝子を検出することが可能な配列番号３８の塩基配列を有するプローブ、パラインフルエンザウイルス３のヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）遺伝子を検出することが可能な配列番号３９の塩基配列を有するプローブ、Ａ型インフルエンザウイルスの基質タンパク質（Ｍ）遺伝子を検出することが可能な配列番号４０の塩基配列を有するプローブ、内部対照群として、ＲＮａｓｅ Ｐを検出することが可能な配列番号４１の塩基配列を有するプローブ、Ｂ型インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）遺伝子を検出することが可能な配列番号４２の塩基配列を有するプローブ、ＲｓウイルスＡ型の融合タンパク質遺伝子を検出することが可能な配列番号４３の塩基配列を有するプローブ、ＲｓウイルスＢ型の融合タンパク質遺伝子を検出することが可能な配列番号４４の塩基配列を有するプローブ、メタニューモウイルスの核タンパク質（Ｎ）遺伝子を検出することが可能な配列番号４５の塩基配列を有するプローブ、アデノウイルスのヘキソンタンパク質遺伝子を検出することが可能な配列番号４６〜４９の塩基配列を有するプローブ、ライノーウイルスＡ、Ｂ、Ｃの５’ＵＴＲを検出することが可能な配列番号５０及び５１の塩基配列を有するプローブ、ボカウイルスのヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）遺伝子を検出することが可能な配列番号５２の塩基配列を有するプローブを、通常の方法を用いてそれぞれ製作した（表２参照）。
呼吸器系ウイルスの診断
実施例２−１：必要な溶液の準備
下記表３に示す試薬を準備した。これらは使用前に常温で放置し、解凍した。常温で３０分以上放置しないことが好ましい。
実施例２−１：必要な溶液の準備
下記表３に示す試薬を準備した。これらは使用前に常温で放置し、解凍した。常温で３０分以上放置しないことが好ましい。
実施例２−２：検体の準備
鼻咽頭の吸引物或いはスワブ(swab)検体（ＮＰＳ(Nasopharyngeal swabs)、ＮＳ(Nasla swabs)、ＴＳ(Throat swabs)、ＮＡ(Nasal aspirates)）を使用した。
鼻咽頭の吸引物或いはスワブ(swab)検体（ＮＰＳ(Nasopharyngeal swabs)、ＮＳ(Nasla swabs)、ＴＳ(Throat swabs)、ＮＡ(Nasal aspirates)）を使用した。
実施例２−３：呼吸器系ウイルスの診断方法
実施例２−２で準備された検体からＲＮＡ抽出キットを用いてＲＮＡを抽出した。ＲＴ−ＰＣＲ プレミックスが１０μＬずつ分注されている２００μＬのＰＣＲチューブを、試料、陽性対照液及び陰性対照液を加えた個数の分を準備した。予め分注されて提供された各ＲＴ−ＰＣＲ プレミックスチューブにＲＶＰプライマー／プローブの混合液５μＬと抽出した試料、陽性対照液または陰性対照液を５μＬずつ添加した（表４参照）。
実施例２−２で準備された検体からＲＮＡ抽出キットを用いてＲＮＡを抽出した。ＲＴ−ＰＣＲ プレミックスが１０μＬずつ分注されている２００μＬのＰＣＲチューブを、試料、陽性対照液及び陰性対照液を加えた個数の分を準備した。予め分注されて提供された各ＲＴ−ＰＣＲ プレミックスチューブにＲＶＰプライマー／プローブの混合液５μＬと抽出した試料、陽性対照液または陰性対照液を５μＬずつ添加した（表４参照）。
蓋を閉めて遠心分離した後、よく混ぜた。遠心分離の後、リアルタイムＰＣＲサイクラー(real-time PCR cycler)に入れて反応を行った。具体的なリアルタイムＰＣＲ反応の条件は次のとおりである（表５参照）。
ＰＣＲ反応結果は、リアルタイムＰＣＲ検出システムによりリアルタイムで測定し、反応完了後にカットオフ値(Cut-off value)（機器名：ＳＬＡＮ、ＦＡＭ：０．０６、ＨＥＸ：０．０６、ＣＹ５：０．０４）を入力した。
実施例２−４：結果の判定
（１）各対照群別Ｃｔ値
対照群を対象として反応したときのＣｔ値（threshold cycle：カットオフ値 を通過するサイクル数）は次のとおりであり（表６及び表７参照）、試料のＣｔ値が各項目（ＦＡＭ、ＨＥＸ及びＣＹ５）において全て３７以下の場合に陽性と判定した（表６及び表７参照）。
（１）各対照群別Ｃｔ値
対照群を対象として反応したときのＣｔ値（threshold cycle：カットオフ値 を通過するサイクル数）は次のとおりであり（表６及び表７参照）、試料のＣｔ値が各項目（ＦＡＭ、ＨＥＸ及びＣＹ５）において全て３７以下の場合に陽性と判定した（表６及び表７参照）。
表６及び表７に示すように、陽性対照液の場合はＣｔ値が各波長別に３０±３の範囲内に入らなければならず、陰性対照液の場合はインターナルコントロールであるＲＮａｓｅ ＰのみＣｔ値が現れ、残りの呼吸器系ウイルスはＣｔ値が現れなければ（Ｎｏ Ｃｔ）結果が有効であることが分かる。
（２）結果の分析
各反応別にＦＡＭ、ＨＥＸ、ＣＹ５波長のシグナル形成を確認し、下記表のとおり反応有効性と陽性、陰性を分析した（表８参照）。
各反応別にＦＡＭ、ＨＥＸ、ＣＹ５波長のシグナル形成を確認し、下記表のとおり反応有効性と陽性、陰性を分析した（表８参照）。
表８は呼吸器系ウイルスの陰／陽性判断を示す各類型別結果分析表である。例えば、プライマー／プローブの混合液１を用いてＦＡＭ項目でのみＣｔ値が３７より小さい数字として現れる場合（陽性）、コロナウイルス２２９Ｅに感染したことを意味する。しかも、前記表における記載「再試験」は、インターナルコントロールが検出されないためさらに実験しなければならないことを意味する。
Claims (6)
- （１）配列番号１３及び１４の塩基配列を有するプライマーペア、及び配列番号１７及び１８の塩基配列を有するプライマーペアを含むプライマーセット、並びに配列番号４０及び４２の塩基配列を有するプローブのセットの混合物、
（２）配列番号１９及び２０の塩基配列を有するプライマーペア、配列番号２１及び２２の塩基配列を有するプライマーペアを含むプライマーセット、並びに配列番号４３及び４４の塩基配列を有するプローブのセットの混合物、並びに
（３）配列番号２５及び２６の塩基配列を有するプライマーペア、配列番号２７〜２９からなる群から選択される塩基配列を有する正方向プライマーと、配列番号３０及び３１からなる群から選択される塩基配列を有する逆方向プライマーの組み合わせからなるプライマーペアを含むプライマーセット、並びに配列番号４６〜５１の塩基配列を有するプローブのセットの混合物、
からなる群から選ばれる混合物を含む、マルチプレックスリアルタイムＰＣＲに好適な、呼吸器系ウイルスによる疾患の同時診断用組成物。 - （２）の前記混合物が、配列番号２３及び２４の塩基配列を有するプライマーペア及び配列番号４５の塩基配列を有するプローブ、および／または（３）の前記混合物が、配列番号３２及び３３の塩基配列を有するプライマーペア及び配列番号５２の塩基配列を有するプローブ、をさらに含む、請求項１に記載の同時診断用組成物。
- ホットスタートＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ及び逆転写酵素をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
- 内部コントロールとして、ＲＮａｓｅＰの増幅のための、配列番号１５及び１６の塩基配列を有するプライマーペアをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
- 内部コントロールとして、ＲＮａｓｅＰを検出するための、配列番号４１の塩基配列を有するプローブをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
- 請求項１〜５のいずれか１項の組成物を含む、マルチプレックスリアルタイムＰＣＲに好適な、呼吸器系ウイルスによる疾患の同時診断キット。
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