KR20230030639A - Sars-cov-2, 인플루엔자 및 rsv를 검출하는 방법 - Google Patents

Sars-cov-2, 인플루엔자 및 rsv를 검출하는 방법 Download PDF

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Abstract

중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2), 인플루엔자 A, 인플루엔자 B 및 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV)를 검출하기 위한 조성물 및 방법이 제공된다.

Description

SARS-COV-2, 인플루엔자 및 RSV를 검출하는 방법
1. 관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 6월 26일에 출원된 미국 가출원 번호 63/044,902 및 2020년 9월 4일에 출원된 미국 가출원 번호 63/074,809의 우선권의 이익을 주장하며, 이들 각각은 임의의 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
2. 발명의 분야
중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2), 인플루엔자 및 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV)를 검출하기 위한 조성물 및 방법이 제공된다. 특히, SARS-CoV-2, 인플루엔자 및 RSV 마커, 및 SARS-CoV-2, 인플루엔자 및 RSV 바이러스의 검출에 유용한 마커 패널이 제공된다.
3. 배경
2019년 12월 31일에, 원인 불명의 호흡기 질병의 발병이 세계보건기구 (WHO)에 보고되었다. 신규 코로나바이러스 (2019-nCoV)가 식별되었으며, 이는 전 세계 여러 지역에서 수천 명의 확인된 인간 감염을 초래하였다. 중증 질병 사례 및 일부 사망 사례가 보고되었다. 국제 바이러스 분류 위원회 (ICTV)는 바이러스 SARS-CoV-2의 명칭을 변경하였으며, 이는 "중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2"의 약칭이다. 세계보건기구는 SARS-CoV-2에 의해 야기되는 질환을 코로나바이러스 질환 2019 (COVID-19)로 명명하였다. COVID-19는 무증상 감염, 경증 상부 호흡기 감염, 중증 하부 호흡기 질환 (폐렴 및 호흡 부전 포함), 및 일부 경우에 사망을 포함하는 다양한 임상 결과와 연관된다. 미국 질병통제예방센터 (미국 CDC)에 따르면 2020년 6월 현재 COVID-19를 갖는 환자는 경증 증상 내지 중증 질병 범위의 광범위한 증상을 나타내는 것으로 공지되어 있다. 발열 또는 오한, 기침, 숨가쁨 또는 호흡 곤란, 피로, 근육통 또는 몸살, 두통, 새로운 미각 또는 후각 상실, 인후통, 충혈 또는 콧물, 오심 또는 구토, 및/또는 설사를 포함하나 이에 제한되지는 않는 증상이 바이러스에 노출 후 2-14일에 나타날 수 있다.
인플루엔자 또는 플루는 기도의 전염성 바이러스 감염이다. 인플루엔자의 전파는 주로 공기매개 (즉, 기침 또는 재채기)이며; 전파의 피크는 대개 겨울철에 발생한다. 증상은 일반적으로 발열, 오한, 두통, 근육통, 권태감, 기침 및 부비강 충혈을 포함한다. 위장 증상 (즉, 오심, 구토 또는 설사)은 또한 주로 어린이에서 발생할 수 있지만 성인에서 덜 흔하다. 증상은 일반적으로 감염된 사람에게 노출된 후 2일 이내에 나타난다. 폐렴은 인플루엔자 감염의 합병증으로 발전하여, 소아, 노인 및 면역약화된 인구에서 증가된 이환율 및 사망률을 야기할 수 있다. 인플루엔자 바이러스는 유형 A, B 및 C로 분류되며, 이들 중 전자 두 가지가 대부분의 인간 감염을 야기한다. 인플루엔자 A는 인간에서 가장 흔한 유형의 인플루엔자 바이러스이며, 일반적으로 계절성 플루 유행병 및 때때로 팬데믹의 원인이 된다. 인플루엔자 A 바이러스는 또한 동물, 예컨대 새, 돼지 및 말을 감염시킬 수 있다. 인플루엔자 B 바이러스에 의한 감염은 일반적으로 인간에게 국한되며 유행병의 덜 빈번한 원인이다. 인플루엔자 A 바이러스는 2개의 표면 단백질: 헤마글루티닌 (H) 및 뉴라미니다제 (N)에 기초하여 아형으로 추가로 나뉜다. 계절성 플루는 정상적으로 아형 H1, H2, H3, 및 N1 및 N2에 의해 야기된다. 계절성 플루 이외에, 2009년 초에 미국에서 인간에서 신규 H1N1 균주가 식별되었다.
2개의 균주 (서브그룹 A 및 B)로 이루어진 뉴모비리대 과 (이전에 파라믹소비리대 과)의 구성원인 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV)는 또한 면역약화된 (예를 들어, 만성 폐 또는 심장 질환) 또는 면역 체계의 강도를 감소시키는 병태에 대한 치료를 받고 있는 영아 및 노인을 주로 괴롭히는 전염성 질환의 원인이다. 바이러스는 카운터탑 및 장난감에서 몇 시간 동안 살 수 있으며, 상부 호흡기 감염, 예컨대 감기, 및 세기관지염 및 폐렴으로서 나타나는 하부 호흡기 감염을 모두 야기할 수 있다. 2세가 되면, 대부분의 어린이는 이미 RSV에 의해 감염되지만, 약한 면역성만 발달하기 때문에 어린이 및 성인 모두가 재감염될 수 있다. 증상은 대개 감염 후 4 내지 6일에 나타난다. 질환은 전형적으로 자가-제한적이며 영아에서 약 1 내지 2주 동안 지속된다. 성인에서, 감염은 약 5일 동안 지속되며, 감기와 일치하는 증상, 예컨대 비루, 피로, 두통 및 발열을 나타낸다. RSV 시즌은 가을 동안 감염이 상승하기 시작하여 이른 봄까지 계속되기 때문에 인플루엔자 시즌과 다소 겹친다. 그러나, RSV 감염은 또한 드물기는 하지만 연중 다른 시기에 발생한다.
감염 통제 예방책과 함께 적극적인 감시 프로그램은 SARS-CoV-2, 인플루엔자 및 RSV의 전파를 예방하는데 중요한 구성성분이다. 이들 감염으로 감염된 환자를 식별하기 위해 신속한 결과를 제공하는 검정의 사용은 또한 효과적인 제어, 적절한 치료 선택, 및 광범위한 발병 예방을 위한 중요한 인자이다.
인플루엔자 바이러스의 게놈은 함께 대략 13.5 kb에 걸쳐 있고 11개의 단백질을 코딩하는 0.9-2.3 kb의 8개의 RNA 세그먼트를 포함한다. PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, MP 및 NS로 명명된 이들 8개의 세그먼트는 신속한 서열 변화 (항원성 드리프트)를 초래하는 일정한 선택적 압력 하에 있다. 서열 수준의 변화에 더하여 인플루엔자 A는 다른 인플루엔자 A 바이러스와 전체 세그먼트를 교환하는 능력을 갖는다 (항원성 시프트). 이 프로세스는 팬데믹 인플루엔자 균주 (즉, 인플루엔자 A H1N1pdm09, 돼지 기원 H3N2)의 출현을 유발한다.
2개의 단백질, 헤마글루티닌 (HA) 및 뉴라미니다제 (NA)는 인플루엔자 A 바이러스의 아형 (각각 H 및 N)을 결정한다. 16개의 H 아형 및 9개의 N 아형이 있다. H1N1 및 H3N2 아형은 인간에서 대다수의 인플루엔자 감염을 야기한다. 인플루엔자 B 바이러스는 유사한 구조의 RNA 세그먼트를 갖지만; 플루 B 바이러스는 아형을 갖지 않는다.
이러한 일정한 항원성 드리프트 및 항원성 시프트는 계절에 따라 인플루엔자 검출 검정을 유지하는 것을 어렵게 만든다. 또한, 특히 향후 호흡기 바이러스 시즌 동안 COVID-19의 확산에 맞서 싸우기 위한 전 세계적 노력을 돕기 위한 차세대 테스트에 대한 필요성이 있다. 강력한 SARS-CoV-2, 인플루엔자 및 RSV 검출 검정은 바이러스 게놈이 유전적 드리프트를 겪더라도 정확성을 유지할 필요가 있다. COVID-19, 플루 및 RSV를 갖는 환자는 중첩 임상 증상을 갖지만, 근본적으로 상이한 치료 및 관리 경로를 갖는다. 바이러스에 의한 감염은 종종 발열 및 특히 노인에서 중증 결과와 커플링될 수 있는 다른 전신 증상과 연관된다. 그러므로, 단일 환자 샘플로부터 SARS-CoV-2, 플루 A, 플루 B 및 RSV의 정성적 검출 및 구별을 전달할 수 있는 테스트에 대한 필요성 및 요구가 있다. 또한, 짧은 시간에 결과를 수득하는 것이 유리하다.
4. 요약
일부 예에서, 하기 비제한적인 실시양태가 제공된다:
실시양태 1. 하기를 포함하는, 대상체로부터의 생물학적 샘플에서 인플루엔자 A, 인플루엔자 B, RSV 및 SARS-CoV-2의 존재 또는 부재를 검출하는 방법:
a) 인플루엔자 A 유전자, 인플루엔자 B 유전자, RSV 유전자 및 SARS-CoV-2 유전자를 검출하는 프라이머 세트와 대상체로부터의 생물학적 샘플을 접촉시키는 단계;
b) 하나 이상의 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 수행하는 단계; 및
c) PCR에 의해 생산된 앰플리콘을 검출하는 단계.
실시양태 2. 하기를 포함하는, 대상체로부터의 샘플에서 인플루엔자 A 또는 인플루엔자 B, RSV 및 SARS-CoV-2로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함하는, 대상체가 인플루엔자, RSV 및/또는 COVID-19를 갖는지 여부를 결정하는 방법:
a) 인플루엔자 A 유전자, 인플루엔자 B 유전자, RSV 유전자 및 SARS-CoV-2 유전자를 검출하는 프라이머 세트와 대상체로부터의 생물학적 샘플을 접촉시키는 단계;
b) 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 수행하는 단계; 및
c) PCR에 의해 생산된 앰플리콘을 검출하는 단계.
실시양태 3. 실시양태 1 또는 실시양태 2에 있어서,
a) 여기서 인플루엔자 A의 존재 또는 부재를 검출하는 프라이머 세트가 하기 중 적어도 하나를 포함하고:
i) 하기로부터 선택된 인플루엔자 A PB2를 검출하는 프라이머 세트:
1) 인플루엔자 PB2 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머;
2) 서열식별번호: 1의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 1의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
3) 서열식별번호: 17의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 18의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머;
ii) 하기로부터 선택된 인플루엔자 A PA를 검출하는 프라이머 세트:
1) 인플루엔자 PA 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머;
2) 서열식별번호: 2의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 2의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
3) 서열식별번호: 20의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 21의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머;
iii) 하기로부터 선택된 인플루엔자 A MP를 검출하는 프라이머 세트:
1) 인플루엔자 A MP 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머;
2) 서열식별번호: 3의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 3의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
3) 서열식별번호: 23의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 24의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머;
iv) 하기로부터 선택된 조류 인플루엔자 MP를 검출하는 프라이머 세트:
1) 조류 인플루엔자 MP 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머;
2) 서열식별번호: 4의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 4의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
3) 서열식별번호: 26의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 27의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머;
b) 여기서 인플루엔자 B의 존재 또는 부재를 검출하는 프라이머 세트가 하기 중 적어도 하나를 포함하고:
i) 하기로부터 선택된 인플루엔자 B MP를 검출하는 프라이머 세트:
1) 인플루엔자 B MP 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머;
2) 서열식별번호: 6의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 6의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
3) 서열식별번호: 32의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 33의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머;
ii) 하기로부터 선택된 인플루엔자 B NS를 검출하는 프라이머 세트:
1) 인플루엔자 B NS 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머;
2) 서열식별번호: 7의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 7의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
3) 서열식별번호: 35의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 36의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머;
c) 여기서 RSV의 존재 또는 부재를 검출하는 프라이머 세트가 하기 중 적어도 하나를 포함하고:
i) 하기로부터 선택된 RSV A를 검출하는 프라이머 세트:
1) RSV A 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머; 및
2) 서열식별번호: 38의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 39의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
ii) 하기로부터 선택된 RSV B를 검출하는 프라이머 세트:
1) RSV B 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머; 및
2) 서열식별번호: 41의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 42의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머;
d) 여기서 SARS-CoV-2의 존재 또는 부재를 검출하는 프라이머 세트가 하기 중 적어도 하나를 포함하는 것인 방법:
i) 하기로부터 선택된 SARS-CoV-2 E를 검출하는 프라이머 세트:
1) SARS-CoV-2 E 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머;
2) 서열식별번호: 44의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 44의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
3) 서열식별번호: 48의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 49의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
ii) 하기로부터 선택된 SARS-CoV-2 N2를 검출하는 프라이머 세트:
1) SARS-CoV-2 N2 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머;
2) 서열식별번호: 45의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 45의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
3) 서열식별번호: 51의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 52의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머.
실시양태 4. 실시양태 1 또는 실시양태 2에 있어서,
a) 여기서 인플루엔자 A의 존재 또는 부재를 검출하는 프라이머 세트가 하기 중 적어도 하나를 포함하고:
i) 하기로부터 선택된 인플루엔자 A PB2를 검출하는 프라이머 세트:
1) 인플루엔자 PB2 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머;
2) 서열식별번호: 1의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 1의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
3) 서열식별번호: 17의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 18의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머;
ii) 하기로부터 선택된 인플루엔자 A PA를 검출하는 프라이머 세트:
1) 인플루엔자 PA 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머;
2) 서열식별번호: 2의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 2의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
3) 서열식별번호: 20의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 21의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머;
iii) 하기로부터 선택된 인플루엔자 A MP를 검출하는 프라이머 세트:
1) 인플루엔자 A MP 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머;
2) 서열식별번호: 3의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 3의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
3) 서열식별번호: 23의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 24의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머;
iv) 하기로부터 선택된 조류 인플루엔자 MP를 검출하는 프라이머 세트:
1) 조류 인플루엔자 MP 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머;
2) 서열식별번호: 4의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 4의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
3) 서열식별번호: 26의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 27의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머;
b) 여기서 인플루엔자 B의 존재 또는 부재를 검출하는 프라이머 세트가 하기 중 적어도 하나를 포함하고:
i) 하기로부터 선택된 인플루엔자 B MP를 검출하는 프라이머 세트:
1) 인플루엔자 B MP 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머;
2) 서열식별번호: 6의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 6의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
3) 서열식별번호: 32의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 33의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머;
ii) 하기로부터 선택된 인플루엔자 B NS를 검출하는 프라이머 세트:
1) 인플루엔자 B NS 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머;
2) 서열식별번호: 7의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 7의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
3) 서열식별번호: 35의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 36의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머;
c) 여기서 RSV의 존재 또는 부재를 검출하는 프라이머 세트가 하기 중 적어도 하나를 포함하고:
i) 하기로부터 선택된 RSV A를 검출하는 프라이머 세트:
1) RSV A 유전자의 서열을 검출하기 위한 적어도 하나의 정방향 및 적어도 하나의 역방향 프라이머; 및
2) 서열식별번호: 38 및/또는 서열식별번호: 67의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 적어도 하나의 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 39, 서열식별번호: 68 및/또는 서열식별번호: 69의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 적어도 하나의 역방향 프라이머; 및
ii) 하기로부터 선택된 RSV B를 검출하는 프라이머 세트:
1) RSV B 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머; 및
2) 서열식별번호: 41의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 42의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머;
d) 여기서 SARS-CoV-2의 존재 또는 부재를 검출하는 프라이머 세트가 하기 중 적어도 하나를 포함하는 것인 방법:
i) 하기로부터 선택된 SARS-CoV-2 E를 검출하는 프라이머 세트:
1) SARS-CoV-2 E 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머;
2) 서열식별번호: 44의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 44의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 역방향 프라이머;
3) 서열식별번호: 70의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 71의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
4) 서열식별번호: 48의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 49의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머;
ii) 하기로부터 선택된 SARS-CoV-2 N2를 검출하는 프라이머 세트:
1) SARS-CoV-2 N2 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머;
2) 서열식별번호: 45의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 45의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
3) 서열식별번호: 73 또는 서열식별번호: 51의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 52의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머;
iii) 하기로부터 선택된 SARS-CoV-2 RdRP를 검출하는 프라이머 세트:
1) SARS-CoV-2 RdRP 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 적어도 하나의 역방향 프라이머;
2) 서열식별번호: 76의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 61 및/또는 서열식별번호: 78의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 적어도 하나의 역방향 프라이머.
실시양태 5. 실시양태 1 또는 실시양태 2에 있어서,
a) 여기서 인플루엔자 A의 존재 또는 부재를 검출하는 프라이머 세트가 하기 중 적어도 하나를 포함하고:
i) 서열식별번호: 17의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 18의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머를 포함하는 인플루엔자 A PB2를 검출하는 프라이머 세트;
ii) 서열식별번호: 20의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 21의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머를 포함하는 인플루엔자 A PA를 검출하는 프라이머 세트;
iii) 서열식별번호: 23의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 24의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머를 포함하는 인플루엔자 A MP를 검출하는 프라이머 세트; 및
iv) 서열식별번호: 26의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 27의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머를 포함하는 조류 인플루엔자 MP를 검출하는 프라이머 세트;
b) 여기서 인플루엔자 B의 존재 또는 부재를 검출하는 프라이머 세트가 하기 중 적어도 하나를 포함하고:
i) 서열식별번호: 32의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 33의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머를 포함하는 인플루엔자 B MP를 검출하는 프라이머 세트; 및
ii) 서열식별번호: 35의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 36의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머를 포함하는 인플루엔자 B NS를 검출하는 프라이머 세트;
c) 여기서 RSV의 존재 또는 부재를 검출하는 프라이머 세트가 하기 중 적어도 하나를 포함하고:
i) 서열식별번호: 38 및/또는 서열식별번호: 67의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 적어도 하나의 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 39, 서열식별번호: 68 및/또는 서열식별번호: 69의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 적어도 하나의 역방향 프라이머를 포함하는 RSV A를 검출하는 프라이머 세트; 및
ii) 서열식별번호: 41의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 42의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머를 포함하는 RSV B를 검출하는 프라이머 세트;
d) 여기서 SARS-CoV-2의 존재 또는 부재를 검출하는 프라이머 세트가 하기 중 적어도 하나를 포함하는 것인 방법:
i) 서열식별번호: 70의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 71의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머를 포함하는 SARS-CoV-2 E를 검출하는 프라이머 세트;
ii) 서열식별번호: 73의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 52의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머를 포함하는 SARS-CoV-2 N2를 검출하는 프라이머 세트; 및
iii) 서열식별번호: 76의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 61 및/또는 서열식별번호: 78의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 적어도 하나의 역방향 프라이머를 포함하는 SARS-CoV-2 RdRP를 검출하는 프라이머 세트.
실시양태 6. 선행 실시양태 중 어느 하나에 있어서:
a) 인플루엔자 A PA 앰플리콘이 서열식별번호: 9와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하고/거나;
b) 인플루엔자 A PB2 앰플리콘이 서열식별번호: 8과 적어도 85% 동일한 서열을 포함하고/거나;
c) 인플루엔자 A MP 앰플리콘이 서열식별번호: 10과 적어도 85% 동일한 서열을 포함하고/거나;
d) 조류 인플루엔자 MP 앰플리콘이 서열식별번호: 11과 적어도 85% 동일한 서열을 포함하고/거나;
e) 인플루엔자 B MP 앰플리콘이 서열식별번호: 13과 적어도 85% 동일한 서열을 포함하고/거나;
f) 인플루엔자 B NS 앰플리콘이 서열식별번호: 14와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하고/거나;
g) RSV A 앰플리콘이 서열식별번호: 15와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하고/거나;
h) RSV B 앰플리콘이 서열식별번호: 16과 적어도 85% 동일한 서열을 포함하고/거나;
i) SARS-CoV-2 E 앰플리콘이 서열식별번호: 46 또는 서열식별번호: 79와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하고/거나;
j) SARS-CoV-2 N2 앰플리콘이 서열식별번호: 47과 적어도 85% 동일한 서열을 포함하고/거나; 및/또는
k) SARS-CoV-2 RdRP 앰플리콘이 서열식별번호: 80 및/또는 서열식별번호: 81과 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 것인 방법.
실시양태 7. 선행 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 인플루엔자 A PA 프로브, 인플루엔자 A PB2 프로브, 인플루엔자 A MP 프로브, 조류 인플루엔자 MP 프로브, 인플루엔자 B MP 프로브, 인플루엔자 B NS 프로브, RSV A 프로브, RSV B 프로브, SARS-CoV-2 E 프로브, SARS-CoV-2 N2 프로브 및 SARS-CoV-2 RdRP 프로브로부터 선택된 적어도 하나의 프로브와 앰플리콘을 접촉시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
실시양태 8. 실시양태 7에 있어서,
a) 인플루엔자 A PA 프로브가 서열식별번호: 22의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함하고/거나;
b) 인플루엔자 A PB2 프로브가 서열식별번호: 19의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함하고/거나;
c) 인플루엔자 A MP 프로브가 서열식별번호: 25의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함하고/거나;
d) 조류 인플루엔자 MP 프로브가 서열식별번호: 28의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함하고/거나;
e) 인플루엔자 B MP 프로브가 서열식별번호: 34의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함하고/거나;
f) 인플루엔자 B NS 프로브가 서열식별번호: 37의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함하고/거나;
g) RSV A 프로브가 서열식별번호: 40의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함하고/거나;
h) RSV B 프로브가 서열식별번호: 43의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함하고/거나;
i) SARS-CoV-2 E 프로브가 서열식별번호: 72, 서열식별번호: 50 또는 서열식별번호: 56의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함하고/거나;
j) SARS-CoV-2 N2 프로브가 서열식별번호: 74, 서열식별번호: 75 및/또는 서열식별번호: 53의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함하고/거나; 및/또는
k) SARS-CoV-2 RdRP 프로브가 서열식별번호: 77의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함하는 것인 방법.
실시양태 9. 선행 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 외인성 대조군을 검출하는 것을 추가로 포함하는 방법.
실시양태 10. 실시양태 9에 있어서, 외인성 대조군이 샘플 프로세싱 대조군인 방법.
실시양태 11. 실시양태 9 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 외인성 대조군이 박테리오파지 보호 코트에 패키징된 RNA 대조군인 방법.
실시양태 12. 실시양태 9 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 외인성 대조군을 검출하기 위한 대조군 프라이머 쌍과 샘플로부터의 핵산을 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
실시양태 13. 실시양태 9 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 외인성 대조군 앰플리콘을 형성하는 것 및 외인성 대조군 앰플리콘과 선택적으로 혼성화할 수 있는 대조군 프로브와 외인성 대조군 앰플리콘을 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
실시양태 14. 실시양태 7 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 각 프로브가 검출가능한 표지를 포함하는 것인 방법.
실시양태 15. 실시양태 7 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 각 프로브가 형광 염료 및 켄쳐 분자를 포함하는 것인 방법.
실시양태 16. 실시양태 7 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 상이한 표적 분자를 검출하기 위한 프로브가 검출가능하게 상이한 검출가능한 표지를 포함하는 것인 방법.
실시양태 17. 실시양태 7 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 상이한 표적 분자를 검출하기 위한 프로브가 검출가능하게 상이하지 않은 검출가능한 표지를 포함하는 것인 방법.
실시양태 18. 선행 실시양태 중 어느 하나에 있어서, PCR이 정량적 PCR인 방법.
실시양태 19. 선행 실시양태 중 어느 하나에 있어서, PCR 반응이 초기 변성 단계로부터 최종 연장 단계까지 2시간 미만이 소요되는 것인 방법.
실시양태 20. 선행 실시양태 중 어느 하나에 있어서, PCR 반응이 초기 변성 단계로부터 최종 연장 단계까지 1시간 미만이 소요되는 것인 방법.
실시양태 21. 선행 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 대상체가 인플루엔자, RSV 및/또는 COVID-19의 하나 이상의 증상을 갖는 것인 방법.
실시양태 22. 선행 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 대상체가 발열, 오한, 기침, 숨가쁨 또는 호흡 곤란, 인후통, 콧물, 비충혈, 근육통 또는 몸살, 두통, 피로, 새로운 미각 또는 후각 상실, 오심 또는 구토, 및 설사로부터 선택된 하나 이상의 증상을 갖는 것인 방법.
실시양태 23. 선행 실시양태 중 어느 하나에 있어서, 샘플이 비인두 스왑 샘플, 구인두 샘플, 비강 흡인물 샘플, 비강 또는 중비갑개 스왑, 비강 흡인물 샘플, 비강 세척액 샘플, 인후 스왑 샘플, 기관지폐포 세정액 샘플, 기관지 흡인물 샘플, 기관지 세척액 샘플, 기관내 흡인물, 기관내 세척액 샘플, 기관 흡인물, 비강 분비물 샘플, 점액 샘플, 가래 샘플, 폐 조직 샘플, 소변 샘플, 타액 샘플 및 대변 샘플로부터 선택되는 것인 방법.
실시양태 24. 인플루엔자 A 유전자, 인플루엔자 B 유전자, RSV 유전자 및 SARS-CoV-2 유전자의 존재를 검출하는 프라이머 세트를 포함하는 조성물로서,
a) 여기서 인플루엔자 A의 존재를 검출하는 프라이머 세트는 하기 중 적어도 하나를 포함하고:
i) 하기로부터 선택된 인플루엔자 A PB2를 검출하는 프라이머 세트:
1) 인플루엔자 PB2 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머;
2) 서열식별번호: 1의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 1의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
3) 서열식별번호: 17의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 18의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머;
ii) 하기로부터 선택된 인플루엔자 A PA를 검출하는 프라이머 세트:
1) 인플루엔자 PA 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머;
2) 서열식별번호: 2의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 2의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
3) 서열식별번호: 20의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 21의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머;
iii) 하기로부터 선택된 인플루엔자 A MP를 검출하는 프라이머 세트:
1) 인플루엔자 A MP 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머;
2) 서열식별번호: 3의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 3의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
3) 서열식별번호: 23의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 24의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머;
iv) 하기로부터 선택된 조류 인플루엔자 MP를 검출하는 프라이머 세트:
1) 조류 인플루엔자 MP 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머;
2) 서열식별번호: 4의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 4의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
3) 서열식별번호: 26의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 27의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머;
b) 여기서 인플루엔자 B의 존재를 검출하는 프라이머 세트는 하기 중 적어도 하나를 포함하고:
i) 하기로부터 선택된 인플루엔자 B MP를 검출하는 프라이머 세트:
1) 인플루엔자 B MP 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머;
2) 서열식별번호: 6의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 6의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
3) 서열식별번호: 32의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 33의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머;
ii) 하기로부터 선택된 인플루엔자 B NS를 검출하는 프라이머 세트:
1) 인플루엔자 B NS 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머;
2) 서열식별번호: 7의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 7의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
3) 서열식별번호: 35의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 36의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머;
c) 여기서 RSV의 존재를 검출하는 프라이머 세트는 하기 중 적어도 하나를 포함하고:
i) 하기로부터 선택된 RSV A를 검출하는 프라이머 세트:
1) RSV A 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머; 및
2) 서열식별번호: 38의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 39의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
ii) 하기로부터 선택된 RSV B를 검출하는 프라이머 세트:
1) RSV B 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머; 및
2) 서열식별번호: 41의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 42의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머;
d) 여기서 SARS-CoV-2의 존재를 검출하는 프라이머 세트는 하기 중 적어도 하나를 포함하는 것인 조성물:
i) 하기로부터 선택된 SARS-CoV-2 E를 검출하는 프라이머 세트:
1) SARS-CoV-2 E 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머;
2) 서열식별번호: 44의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 44의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
3) 서열식별번호: 48의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 49의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
ii) 하기로부터 선택된 SARS-CoV-2 N2를 검출하는 프라이머 세트:
1) SARS-CoV-2 N2 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머;
2) 서열식별번호: 45의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 45의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
3) 서열식별번호: 51의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 52의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머.
실시양태 25. 인플루엔자 A 유전자, 인플루엔자 B 유전자, RSV 유전자 및 SARS-CoV-2 유전자의 존재를 검출하는 프라이머 세트를 포함하는 조성물로서,
a) 여기서 인플루엔자 A의 존재 또는 부재를 검출하는 프라이머 세트는 하기 중 적어도 하나를 포함하고:
i) 하기로부터 선택된 인플루엔자 A PB2를 검출하는 프라이머 세트:
1) 인플루엔자 PB2 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머;
2) 서열식별번호: 1의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 1의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
3) 서열식별번호: 17의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 18의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머;
ii) 하기로부터 선택된 인플루엔자 A PA를 검출하는 프라이머 세트:
1) 인플루엔자 PA 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머;
2) 서열식별번호: 2의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 2의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
3) 서열식별번호: 20의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 21의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머;
iii) 하기로부터 선택된 인플루엔자 A MP를 검출하는 프라이머 세트:
1) 인플루엔자 A MP 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머;
2) 서열식별번호: 3의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 3의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
3) 서열식별번호: 23의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 24의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머;
iv) 하기로부터 선택된 조류 인플루엔자 MP를 검출하는 프라이머 세트:
1) 조류 인플루엔자 MP 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머;
2) 서열식별번호: 4의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 4의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
3) 서열식별번호: 26의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 27의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머;
b) 여기서 인플루엔자 B의 존재 또는 부재를 검출하는 프라이머 세트는 하기 중 적어도 하나를 포함하고:
i) 하기로부터 선택된 인플루엔자 B MP를 검출하는 프라이머 세트:
1) 인플루엔자 B MP 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머;
2) 서열식별번호: 6의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 6의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
3) 서열식별번호: 32의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 33의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머;
ii) 하기로부터 선택된 인플루엔자 B NS를 검출하는 프라이머 세트:
1) 인플루엔자 B NS 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머;
2) 서열식별번호: 7의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 7의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
3) 서열식별번호: 35의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 36의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머;
c) 여기서 RSV의 존재 또는 부재를 검출하는 프라이머 세트는 하기 중 적어도 하나를 포함하고:
i) 하기로부터 선택된 RSV A를 검출하는 프라이머 세트:
1) RSV A 유전자의 서열을 검출하기 위한 적어도 하나의 정방향 및 적어도 하나의 역방향 프라이머; 및
2) 서열식별번호: 38 및/또는 서열식별번호: 67의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 적어도 하나의 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 39, 서열식별번호: 68 및/또는 서열식별번호: 69의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 적어도 하나의 역방향 프라이머; 및
ii) 하기로부터 선택된 RSV B를 검출하는 프라이머 세트:
1) RSV B 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머; 및
2) 서열식별번호: 41의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 42의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머;
d) 여기서 SARS-CoV-2의 존재 또는 부재를 검출하는 프라이머 세트는 하기 중 적어도 하나를 포함하는 것인 조성물:
i) 하기로부터 선택된 SARS-CoV-2 E를 검출하는 프라이머 세트:
1) SARS-CoV-2 E 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머;
2) 서열식별번호: 44의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 44의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 역방향 프라이머;
3) 서열식별번호: 70의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 71의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
4) 서열식별번호: 48의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 49의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머;
ii) 하기로부터 선택된 SARS-CoV-2 N2를 검출하는 프라이머 세트:
1) SARS-CoV-2 N2 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머;
2) 서열식별번호: 45의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 45의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
3) 서열식별번호: 73 또는 서열식별번호: 51의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 52의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머
iii) 하기로부터 선택된 SARS-CoV-2 RdRP를 검출하는 프라이머 세트:
1) SARS-CoV-2 RdRP 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 적어도 하나의 역방향 프라이머;
2) 서열식별번호: 76의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 61 및/또는 서열식별번호: 78의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 적어도 하나의 역방향 프라이머.
실시양태 26. 인플루엔자 A 유전자, 인플루엔자 B 유전자, RSV 유전자 및 SARS-CoV-2 유전자의 존재를 검출하는 프라이머 세트를 포함하는 조성물로서,
a) 여기서 인플루엔자 A의 존재 또는 부재를 검출하는 프라이머 세트는 하기 중 적어도 하나를 포함하고:
i) 서열식별번호: 17의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 18의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머를 포함하는 인플루엔자 A PB2를 검출하는 프라이머 세트;
ii) 서열식별번호: 20의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 21의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머를 포함하는 인플루엔자 A PA를 검출하는 프라이머 세트;
iii) 서열식별번호: 23의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 24의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머를 포함하는 인플루엔자 A MP를 검출하는 프라이머 세트; 및
iv) 서열식별번호: 26의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 27의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머를 포함하는 조류 인플루엔자 MP를 검출하는 프라이머 세트;
b) 여기서 인플루엔자 B의 존재 또는 부재를 검출하는 프라이머 세트는 하기 중 적어도 하나를 포함하고:
i) 서열식별번호: 32의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 33의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머를 포함하는 인플루엔자 B MP를 검출하는 프라이머 세트; 및
ii) 서열식별번호: 35의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 36의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머를 포함하는 인플루엔자 B NS를 검출하는 프라이머 세트;
c) 여기서 RSV의 존재 또는 부재를 검출하는 프라이머 세트는 하기 중 적어도 하나를 포함하고:
i) 서열식별번호: 38 및/또는 서열식별번호: 67의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 적어도 하나의 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 39, 서열식별번호: 68 및/또는 서열식별번호: 69의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 적어도 하나의 역방향 프라이머를 포함하는 RSV A를 검출하는 프라이머 세트; 및
ii) 서열식별번호: 41의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 42의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머를 포함하는 RSV B를 검출하는 프라이머 세트;
d) 여기서 SARS-CoV-2의 존재 또는 부재를 검출하는 프라이머 세트는 하기 중 적어도 하나를 포함하는 것인 조성물:
i) 서열식별번호: 70의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 71의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머를 포함하는 SARS-CoV-2 E를 검출하는 프라이머 세트;
ii) 서열식별번호: 73의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 52의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머를 포함하는 SARS-CoV-2 N2를 검출하는 프라이머 세트; 및
iii) 서열식별번호: 76의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 61 및/또는 서열식별번호: 78의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 적어도 하나의 역방향 프라이머를 포함하는 SARS-CoV-2 RdRP를 검출하는 프라이머 세트.
실시양태 27. 실시양태 24 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 외인성 대조군을 검출하기 위한 프라이머 쌍을 추가로 포함하는 조성물.
실시양태 28. 실시양태 27에 있어서, 외인성 대조군이 샘플 프로세싱 대조군인 조성물.
실시양태 29. 실시양태 24 내지 27 중 어느 하나에 있어서, 외인성 대조군이 박테리오파지 보호 코트에 패키징된 RNA 대조군인 방법.
실시양태 30. 실시양태 24 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 인플루엔자 A PA 프로브, 인플루엔자 A PB2 프로브, 인플루엔자 A MP 프로브, 조류 인플루엔자 MP 프로브, 인플루엔자 B MP 프로브, 인플루엔자 B NS 프로브, RSV A 프로브, RSV B 프로브, SARS-CoV-2 E 프로브, SARS-CoV-2 N2 프로브 및 SARS-CoV-2 RdRP 프로브로부터 선택된 적어도 하나의 프로브를 추가로 포함하는 조성물.
실시양태 31. 실시양태 30에 있어서,
a) 인플루엔자 A PA 프로브가 서열식별번호: 22의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함하고/거나;
b) 인플루엔자 A PB2 프로브가 서열식별번호: 19의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함하고/거나;
c) 인플루엔자 A MP 프로브가 서열식별번호: 25의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함하고/거나;
d) 조류 인플루엔자 MP 프로브가 서열식별번호: 28의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함하고/거나;
e) 인플루엔자 B MP 프로브가 서열식별번호: 34의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함하고/거나;
f) 인플루엔자 B NS 프로브가 서열식별번호: 37의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함하고/거나;
g) RSV A 프로브가 서열식별번호: 40의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함하고/거나;
h) RSV B 프로브가 서열식별번호: 43의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함하고/거나;
i) SARS-CoV-2 E 프로브가 서열식별번호: 72, 서열식별번호: 50 또는 서열식별번호: 56의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함하고/거나;
j) SARS-CoV-2 N2 프로브가 서열식별번호: 74, 서열식별번호: 75 및/또는 서열식별번호: 53의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함하고/거나; 및/또는
k) SARS-CoV-2 RdRP 프로브가 서열식별번호: 77의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함하는 것인 조성물.
실시양태 32. 실시양태 24 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 외인성 대조군을 검출하기 위한 프로브를 추가로 포함하는 조성물.
실시양태 33. 실시양태 24 내지 32 중 어느 하나에 있어서, 각 프로브가 검출가능한 표지를 포함하는 것인 조성물.
실시양태 34. 실시양태 33에 있어서, 각 프로브가 형광 염료 및 켄쳐 분자를 포함하는 것인 조성물.
실시양태 35. 실시양태 24 내지 34 중 어느 하나에 있어서, 동결건조된 프라이머 세트를 포함하는 조성물.
실시양태 36. 실시양태 24 내지 34 중 어느 하나에 있어서, 용액 중의 프라이머 세트를 포함하는 조성물.
실시양태 37. 실시양태 24 내지 36 중 어느 하나에 있어서, 인플루엔자, RSV 및/또는 COVID-19의 존재 또는 부재에 대해 테스트되는 대상체로부터의 샘플로부터의 핵산을 포함하는 조성물.
실시양태 38. 실시양태 37에 있어서, 샘플이 비인두 스왑 샘플, 구인두 샘플, 비강 흡인물 샘플, 비강 또는 중비갑개 스왑, 비강 흡인물 샘플, 비강 세척액 샘플, 인후 스왑 샘플, 기관지폐포 세정액 샘플, 기관지 흡인물 샘플, 기관지 세척액 샘플, 기관내 흡인물, 기관내 세척액 샘플, 기관 흡인물, 비강 분비물 샘플, 점액 샘플, 가래 샘플, 폐 조직 샘플, 소변 샘플, 타액 샘플 및 대변 샘플로부터 선택되는 것인 조성물.
실시양태 39. 실시양태 24 내지 38 중 어느 하나의 조성물을 포함하는 키트.
실시양태 40. 실시양태 39에 있어서, 외인성 대조군을 추가로 포함하는 키트.
실시양태 41. 실시양태 40에 있어서, 외인성 대조군이 박테리오파지 보호 코트에 패키징된 RNA 대조군인 키트.
실시양태 42. 실시양태 39 내지 41 중 어느 하나에 있어서, dNTP 및/또는 열안정성 폴리머라제를 포함하는 키트.
실시양태 43. 실시양태 39 내지 42 중 어느 하나에 있어서, 역전사효소를 포함하는 키트.
실시양태 44. 실시양태 1 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 단일 멀티플렉스 반응에서 적어도 하나의 인플루엔자 A 유전자, 적어도 하나의 인플루엔자 B 유전자, 적어도 하나의 RSV 유전자, 적어도 하나의 SARS-CoV-2 유전자, 및 외인성 대조군의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함하는 방법.
실시양태 45. 실시양태 44에 있어서, 반응의 사이클 역치 (Ct)가 40 사이클 미만인 방법.
실시양태 46. 하기를 포함하는, 대상체로부터의 생물학적 샘플에서 SARS-CoV-2의 존재 또는 부재를 검출하고/거나 대상체가 COVID-19를 갖는지 여부를 결정하는 방법:
a) SARS-CoV-2 E 및/또는 N2 유전자를 검출하는 프라이머 세트와 대상체로부터의 생물학적 샘플을 접촉시키는 단계;
b) 하나 이상의 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 수행하는 단계; 및
c) PCR에 의해 생산된 앰플리콘을 검출하는 단계;
여기서 SARS-CoV-2 E 및/또는 N2 유전자의 존재 또는 부재를 검출하는 프라이머 세트는 하기 중 적어도 하나를 포함한다:
a) 하기로부터 선택된 SARS-CoV-2 E를 검출하는 프라이머 세트:
i) SARS-CoV-2 E 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머;
ii) 서열식별번호: 44의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 44의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
iii) 서열식별번호: 48의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 49의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
b) 하기로부터 선택된 SARS-CoV-2 N2를 검출하는 프라이머 세트:
i) SARS-CoV-2 N2 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머;
ii) 서열식별번호: 45의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 45의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
iii) 서열식별번호: 51의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 52의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머.
실시양태 47. 하기를 포함하는, 대상체로부터의 생물학적 샘플에서 SARS-CoV-2의 존재 또는 부재를 검출하고/거나 대상체가 COVID-19를 갖는지 여부를 결정하는 방법:
a) SARS-CoV-2 E, SARS-CoV-2 N2 유전자 및/또는 SARS-CoV-2 RdRP 유전자를 검출하는 프라이머 세트와 대상체로부터의 생물학적 샘플을 접촉시키는 단계;
b) 하나 이상의 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 수행하는 단계; 및
c) PCR에 의해 생산된 앰플리콘을 검출하는 단계;
여기서 SARS-CoV-2 E, SARS-CoV-2 N2 유전자 및/또는 SARS-CoV-2 RdRP 유전자의 존재 또는 부재를 검출하는 프라이머 세트는 하기 중 적어도 하나를 포함한다:
a) 하기로부터 선택된 SARS-CoV-2 E를 검출하는 프라이머 세트:
i) SARS-CoV-2 E 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머;
ii) 서열식별번호: 44의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 44의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
iii) 서열식별번호: 70의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 71의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
iv) 서열식별번호: 48의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 49의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머;
b) 하기로부터 선택된 SARS-CoV-2 N2를 검출하는 프라이머 세트:
i) SARS-CoV-2 N2 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머;
ii) 서열식별번호: 45의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 45의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
iii) 서열식별번호: 73 또는 서열식별번호: 51의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 52의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
d) 하기로부터 선택된 SARS-CoV-2 RdRP를 검출하는 프라이머 세트:
i) SARS-CoV-2 RdRP 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 적어도 하나의 역방향 프라이머;
ii) 서열식별번호: 76의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 61 및/또는 서열식별번호: 78의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 적어도 하나의 역방향 프라이머.
실시양태 48. 실시양태 47에 있어서,
a) SARS-CoV-2 E를 검출하는 프라이머 세트가 서열식별번호: 70의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 71의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머를 포함하고;
b) SARS-CoV-2 N2를 검출하는 프라이머 세트가 서열식별번호: 73의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 52의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머를 포함하고;
c) SARS-CoV-2 RdRP를 검출하는 프라이머 세트가 서열식별번호: 76의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 61 및/또는 서열식별번호: 78의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 적어도 하나의 역방향 프라이머를 포함하는 것인 방법.
실시양태 49. 실시양태 47 또는 실시양태 48에 있어서,
a) SARS-CoV-2 E 앰플리콘이 서열식별번호: 79와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하고/거나;
b) SARS-CoV-2 N2 앰플리콘이 서열식별번호: 47과 적어도 85% 동일한 서열을 포함하고/거나; 및/또는
c) SARS-CoV-2 RdRP 앰플리콘이 서열식별번호: 80 및/또는 서열식별번호: 81과 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 것인 방법.
실시양태 50. 실시양태 47 내지 49 중 어느 하나에 있어서, 방법이 SARS-CoV-2 E 프로브, SARS-CoV-2 N2 프로브 및 SARS-CoV-2 RdRP 프로브로부터 선택된 적어도 하나의 프로브와 앰플리콘을 접촉시키는 것을 추가로 포함하고, 여기서
a) SARS-CoV-2 E 프로브가 서열식별번호: 72의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함하고;
b) SARS-CoV-2 N2 프로브가 서열식별번호: 74 및/또는 서열식별번호: 75의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함하고;
c) SARS-CoV-2 RdRP 프로브가 서열식별번호: 77의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함하는 것인 방법.
일부 실시양태에서, 대상체로부터의 샘플에서 SARS-CoV-2 및 인플루엔자 A 및/또는 인플루엔자 B의 존재 또는 부재를 검출하는 방법이 제공된다. 방법은 RSV 유전자의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 방법은 샘플에서 SARS-CoV-2 유전자 및 폴리머라제 산성 (PA), 폴리머라제 염기성 2 (PB2) 및 MP로부터 선택된 적어도 하나의 인플루엔자 A 유전자의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 대상체로부터의 샘플에서 SARS-CoV-2 엔벨로프 단백질 (E) 유전자, SARS-CoV-2 핵단백질 (N 유전자의 N2 영역) 유전자, 및 ORF1ab 서열의 RNA-의존적 RNA 폴리머라제 (RdRP) 유전자로부터 선택된 SARS-CoV-2 유전자; 및 폴리머라제 산성 (PA) 유전자, 폴리머라제 염기성 2 (PB2) 및 MP로부터 선택된 적어도 하나의 인플루엔자 A 유전자의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함한다. 방법은 RSV 유전자의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 방법은 SARS-CoV-2 유전자 및 인플루엔자 A PA 유전자의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 SARS-CoV-2 유전자 및 인플루엔자 A PB2 유전자의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 SARS-CoV-2, 인플루엔자 A PA 유전자 및 인플루엔자 A PB2 유전자의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, PA 유전자의 서열은 서열식별번호: 2의 서열과 적어도 95% 동일하다. 일부 실시양태에서, PB2 유전자의 서열은 서열식별번호: 1의 서열과 적어도 95% 동일하다.
일부 실시양태에서, 방법은 인플루엔자 B 유전자를 검출하는 것을 추가로 포함하고, 여기서 유전자는 인플루엔자 B MP 또는 인플루엔자 B NS로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 여기서 방법은 적어도 하나의 인플루엔자 A 및/또는 인플루엔자 B 매트릭스 단백질 (MP) 유전자의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함하고, 인플루엔자 A MP 유전자의 서열은 서열식별번호: 3의 서열과 적어도 95% 동일하다. 일부 실시양태에서, 인플루엔자 B MP 유전자의 서열은 서열식별번호: 6의 서열과 적어도 95% 동일하다. 일부 실시양태에서, 방법은 조류 인플루엔자 MP 유전자의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 조류 인플루엔자 MP 유전자의 서열은 서열식별번호: 4의 서열과 적어도 95% 동일하다. 일부 실시양태에서, 조류 인플루엔자 MP 유전자는 헤마글루티닌 (H) 5 또는 H7 아형이다. 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 하나의 인플루엔자 헤마글루티닌 (HA) 유전자의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 인플루엔자 A HA 유전자의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 조류 인플루엔자 HA 유전자의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조류 인플루엔자는 H7 아형이다. 일부 실시양태에서, 인플루엔자 HA 유전자의 서열은 서열식별번호: 5의 서열과 적어도 95% 동일하다.
일부 실시양태에서, 방법은 적어도 하나의 인플루엔자 비구조적 (NS) 유전자의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 인플루엔자 B NS 유전자의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인플루엔자 B NS 유전자의 서열은 서열식별번호: 7의 서열과 적어도 95% 동일하다.
일부 실시양태에서, 방법은 인플루엔자 B MP 유전자 및/또는 인플루엔자 B NS 유전자의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 인플루엔자 B MP 유전자의 서열은 서열식별번호: 6과 적어도 95% 동일하고, 인플루엔자 B NS 유전자의 서열은 서열식별번호: 7과 적어도 95% 동일하다.
일부 실시양태에서, 방법은 대상체로부터의 샘플에서 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV)의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 RSV A의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 RSV B의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 RSV A 및 RSV B의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, SARS-CoV-2 유전자 중 어느 하나의 존재의 검출은 샘플 내의 SARS-CoV-2의 존재를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 인플루엔자 유전자 중 어느 하나의 존재의 검출은 샘플 내의 인플루엔자의 존재를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 방법은 인플루엔자 A 및 인플루엔자 B를 구별한다. 일부 실시양태에서, 방법은 인플루엔자 A 및 인플루엔자 B를 구별하지 않는다. 일부 실시양태에서, RSV A 또는 RSV B의 존재의 검출은 샘플 내의 RSV의 존재를 나타낸다.
일부 실시양태에서, 방법은 SARS-CoV-2 유전자, 인플루엔자 A 유전자 및 인플루엔자 B 유전자의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 SARS-CoV-2 유전자, 인플루엔자 A PA 유전자, 인플루엔자 A PB2 유전자, 인플루엔자 A MP 유전자, 및 조류 인플루엔자 MP 유전자 및 조류 인플루엔자 HA 유전자의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, SARS-CoV-2 E 유전자의 서열은 서열식별번호: 44와 적어도 95% 동일하고, SARS-CoV-2 N2 유전자의 서열은 서열식별번호: 45와 적어도 95% 동일하고, 인플루엔자 A PA 유전자의 서열은 서열식별번호: 2와 적어도 95% 동일하고, 인플루엔자 A PB2 유전자의 서열은 서열식별번호: 1과 적어도 95% 동일하고, 인플루엔자 A MP 유전자의 서열은 서열식별번호: 3과 적어도 95% 동일하고, 조류 인플루엔자 MP 유전자의 서열은 서열식별번호: 4와 적어도 95% 동일하고, 조류 인플루엔자 HA 유전자의 서열은 서열식별번호: 5와 적어도 95% 동일하다.
일부 실시양태에서, 대상체는 COVID-19, 인플루엔자 및/또는 RSV의 하나 이상의 증상을 갖는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 발열, 오한, 기침, 숨가쁨 또는 호흡 곤란, 인후통, 콧물, 비충혈, 근육통 또는 몸살, 두통, 피로, 새로운 미각 또는 후각 상실, 오심 또는 구토, 및 설사로부터 선택된 하나 이상의 증상을 갖는다.
일부 실시양태에서, 방법은 외인성 대조군을 검출하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 외인성 대조군은 샘플 프로세싱 대조군이다. 일부 실시양태에서, 외인성 대조군은 샘플에 존재할 것으로 예상되지 않는 RNA 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 외인성 대조군은 RNA 대조군이다. 일부 실시양태에서, RNA 대조군은 박테리오파지 보호 코트에 패키징된다 (예를 들어, 아머드(ARMORED)® RNA).
일부 실시양태에서, 방법은 PCR을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 정량적 PCR을 포함한다. 일부 실시양태에서, PCR 반응은 초기 변성 단계로부터 최종 연장 단계까지 2시간 미만이 소요된다. 일부 실시양태에서, 반응은 초기 변성으로부터 마지막 연장까지 2시간 미만, 1시간 미만, 45분 미만, 40분 미만, 35분 미만, 또는 30분 미만이 소요된다.
일부 실시양태에서, 방법은 인플루엔자 A PA 유전자를 검출하기 위한 프라이머 쌍과 샘플로부터의 핵산을 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프라이머 쌍은 제1 프라이머 및 제2 프라이머를 포함하고, 여기서 제1 프라이머는 서열식별번호: 2의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 서열을 포함하고, 여기서 제2 프라이머는 서열식별번호: 2의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 상보적인 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프라이머 쌍은 제1 프라이머 및 제2 프라이머를 포함하고, 여기서 제1 프라이머는 서열식별번호: 20의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 서열을 포함하고, 여기서 제2 프라이머는 서열식별번호: 21의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개 또는 적어도 20개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 프라이머는 서열식별번호: 20의 서열을 갖고, 제2 프라이머는 서열식별번호: 21의 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 방법은 인플루엔자 A PB2 유전자를 검출하기 위한 프라이머 쌍과 샘플로부터의 핵산을 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프라이머 쌍은 서열식별번호: 1의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 프라이머, 및 서열식별번호: 1의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 상보적인 서열을 포함하는 프라이머를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프라이머 쌍은 서열식별번호: 17의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개 또는 적어도 20개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 프라이머, 및 서열식별번호: 18의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개 또는 적어도 20개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 프라이머를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프라이머 쌍은 서열식별번호: 17의 서열을 포함하는 프라이머 및 서열식별번호: 18의 서열을 포함하는 프라이머를 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 적어도 하나의 추가 프라이머 쌍과 샘플로부터의 핵산을 접촉시키는 것을 포함하고, 여기서 각각의 추가 프라이머 쌍은 인플루엔자 A MP 유전자, 조류 인플루엔자 MP 유전자 및 조류 인플루엔자 HA 유전자로부터 선택된 상이한 인플루엔자 유전자를 검출하기 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 각각의 추가 프라이머 쌍은 하기로부터 독립적으로 선택된 프라이머 세트를 포함한다:
(a) 서열식별번호: 3의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 프라이머, 및 서열식별번호: 3의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 상보적인 서열을 포함하는 프라이머;
(b) 서열식별번호: 4의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 프라이머, 및 서열식별번호: 4의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 상보적인 서열을 포함하는 프라이머;
(c) 서열식별번호: 5의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 프라이머, 및 서열식별번호: 5의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 상보적인 서열을 포함하는 프라이머;
(d) 서열식별번호: 23의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 프라이머, 및 서열식별번호: 24의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 프라이머; 및
(e) 서열식별번호: 26의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 프라이머, 및 서열식별번호: 27의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 프라이머.
일부 실시양태에서, 방법은 적어도 하나의 추가 프라이머 쌍과 샘플로부터의 핵산을 접촉시키는 것을 포함하고, 여기서 각각의 추가 프라이머 쌍은 인플루엔자 B MP 유전자 및 인플루엔자 B NS 유전자로부터 선택된 상이한 인플루엔자 유전자를 검출하기 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 각각의 추가 프라이머 쌍은 하기로부터 독립적으로 선택된 프라이머 세트를 포함한다:
(a) 서열식별번호: 6의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 프라이머, 및 서열식별번호: 6의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 상보적인 서열을 포함하는 프라이머;
(b) 서열식별번호: 7의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 프라이머, 및 서열식별번호: 7의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 상보적인 서열을 포함하는 프라이머;
(c) 서열식별번호: 32의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 프라이머, 및 서열식별번호: 33의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 프라이머; 및
(d) 서열식별번호: 35의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 프라이머, 및 서열식별번호: 36의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 프라이머.
일부 실시양태에서, 방법은 적어도 하나의 추가 프라이머 쌍과 샘플로부터의 핵산을 접촉시키는 것을 포함하고, 여기서 각각의 추가 프라이머 쌍은 RSV A 및/또는 RSV B를 검출하기 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 각각의 추가 프라이머 쌍은 하기로부터 독립적으로 선택된 프라이머 세트를 포함한다:
(a) 서열식별번호: 38 및/또는 서열식별번호: 67의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 적어도 하나의 프라이머, 및 서열식별번호: 39, 서열식별번호: 68 및/또는 서열식별번호: 69의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 적어도 하나의 프라이머; 및
(b) 서열식별번호: 41의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 프라이머, 및 서열식별번호: 42의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 프라이머.
일부 실시양태에서, 방법은 적어도 하나의 추가 프라이머 쌍과 샘플로부터의 핵산을 접촉시키는 것을 포함하고, 여기서 각각의 추가 프라이머 쌍은 SARS-CoV-2를 검출하기 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 각각의 추가 프라이머 쌍은 하기로부터 독립적으로 선택된 프라이머 세트를 포함한다:
(a) 서열식별번호: 44의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 프라이머, 및 서열식별번호: 44의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 상보적인 서열을 포함하는 프라이머; 및
(b) 서열식별번호: 70 또는 서열식별번호: 48의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 프라이머, 및 서열식별번호: 71 또는 서열식별번호: 49의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 프라이머;
(c) 서열식별번호: 45의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 프라이머, 및 서열식별번호: 45의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 상보적인 서열을 포함하는 프라이머; 및
(d) 서열식별번호: 73 또는 서열식별번호: 51의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 프라이머, 및 서열식별번호: 52의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 프라이머.
(e) 서열식별번호: 76의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 프라이머, 및 서열식별번호: 61 및/또는 서열식별번호: 78의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 적어도 하나의 프라이머.
일부 실시양태에서, 방법은 인플루엔자 A 유전자, 인플루엔자 B 유전자, SARS-CoV-2 유전자 및 RSV 유전자를 검출하기 위한 프라이머 쌍과 샘플로부터의 핵산을 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 정방향 프라이머 및/또는 적어도 하나의 역방향 프라이머가 유전자를 검출하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 방법은 SARS-CoV-2 및 인플루엔자 A 유전자, 인플루엔자 B 유전자 및 RSV 유전자로부터 선택된 하나 이상의 유전자를 검출하기 위한 프라이머 쌍과 샘플로부터의 핵산을 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 SARS-CoV-2 E 및/또는 SARS-CoV-2 N2 및/또는 SARS-CoV-2 RdRP를 검출하기 위한 프라이머 쌍과 샘플로부터의 핵산을 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 인플루엔자 A PA 유전자, 인플루엔자 A PB2 유전자, 인플루엔자 A MP 유전자, 조류 인플루엔자 MP 유전자 및 조류 인플루엔자 HA 유전자를 검출하기 위한 프라이머 쌍과 샘플로부터의 핵산을 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 인플루엔자 B MP 유전자 및 인플루엔자 B NS 유전자를 검출하기 위한 프라이머 쌍과 샘플로부터의 핵산을 접촉시키는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 RSV A 및 RSV B를 검출하기 위한 프라이머 쌍과 샘플로부터의 핵산을 접촉시키는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 외인성 대조군을 검출하기 위한 대조군 프라이머 쌍과 샘플로부터의 핵산을 접촉시키는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 각각의 프라이머 쌍은 50 내지 500개의 뉴클레오티드 길이, 50 내지 400개의 뉴클레오티드 길이, 50 내지 300개의 뉴클레오티드 길이, 50 내지 200개의 뉴클레오티드 길이, 또는 50 내지 150개의 뉴클레오티드 길이인 앰플리콘을 생산한다.
일부 실시양태에서, 방법은 프라이머 쌍의 표적이 존재할 때 각각의 프라이머 쌍으로부터 앰플리콘을 형성하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 인플루엔자 A PA 앰플리콘, 인플루엔자 A PB2 앰플리콘으로부터 선택된 적어도 하나의 앰플리콘을 형성하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인플루엔자 A PA 앰플리콘은 서열식별번호: 9의 서열을 갖고, 인플루엔자 A PB2 앰플리콘은 서열식별번호: 8의 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 인플루엔자 A MP 앰플리콘, 조류 인플루엔자 MP 앰플리콘 및 조류 인플루엔자 HA 앰플리콘으로부터 선택된 적어도 하나의 앰플리콘을 형성하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인플루엔자 A MP 앰플리콘은 서열식별번호: 10의 서열을 포함하고, 조류 인플루엔자 MP 앰플리콘은 서열식별번호: 11의 서열을 포함하고, 조류 인플루엔자 HA 앰플리콘은 서열식별번호: 12의 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 인플루엔자 B MP 앰플리콘 및/또는 인플루엔자 B NS 앰플리콘을 형성하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 인플루엔자 B MP 앰플리콘은 서열식별번호: 13의 서열을 포함하고, 인플루엔자 B NS 앰플리콘은 서열식별번호: 14의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 RSV A 앰플리콘 및/또는 RSV B 앰플리콘을 형성하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, RSV A 앰플리콘은 서열식별번호: 15의 서열을 갖고, RSV B 앰플리콘은 서열식별번호: 16의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 적어도 하나의 SARS-CoV-2 E 및/또는 SARS-CoV-2 N2 및/또는 SARS-CoV-2 RdRP 앰플리콘을 형성하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, SARS-CoV-2 E 앰플리콘은 서열식별번호: 46 또는 서열식별번호: 79의 서열을 포함하고, SARS-CoV-2 N2 앰플리콘은 서열식별번호: 47의 서열을 포함하고, SARS-CoV-2 RdRP 앰플리콘은 서열식별번호: 80 및/또는 서열식별번호: 81의 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 인플루엔자 A PA 프로브 및 인플루엔자 A PB2 프로브로부터 선택된 적어도 하나의 프로브와 앰플리콘을 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인플루엔자 PA 프로브는 서열식별번호: 2의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함하고, 인플루엔자 PB2 프로브는 서열식별번호: 1의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인플루엔자 PA 프로브는 서열식별번호: 22의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함하고, 인플루엔자 PB2 프로브는 서열식별번호: 19의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 인플루엔자 A MP 프로브, 조류 인플루엔자 MP 프로브 및 조류 인플루엔자 HA 프로브로부터 선택된 적어도 하나의 프로브와 앰플리콘을 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인플루엔자 MP 프로브는 서열식별번호: 3의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함하고, 조류 인플루엔자 MP 프로브는 서열식별번호: 4의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함하고, 조류 인플루엔자 HA 프로브는 서열식별번호: 5의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인플루엔자 MP 프로브는 서열식별번호: 25의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함하고, 조류 인플루엔자 MP 프로브는 서열식별번호: 28의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 인플루엔자 B MP 프로브 및 인플루엔자 B NS 프로브로부터 선택된 적어도 하나의 프로브와 앰플리콘을 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인플루엔자 B MP 프로브는 서열식별번호: 6의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함하고, 인플루엔자 B NS 프로브는 서열식별번호: 7의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인플루엔자 B MP 프로브는 서열식별번호: 34의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함하고, 인플루엔자 B NS 프로브는 서열식별번호: 37의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 RSV A 프로브 및 RSV B 프로브로부터 선택된 적어도 하나의 프로브와 앰플리콘을 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, RSV A 프로브는 서열식별번호: 15의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함하고, RSV B 프로브는 서열식별번호: 16의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, RSV A 프로브는 서열식별번호: 40의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함하고, RSV B 프로브는 서열식별번호: 43의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 SARS-CoV-2 E 프로브, SARS-CoV-2 N2 프로브 및 SARS-CoV-2 RdRP 프로브로부터 선택된 적어도 하나의 프로브와 앰플리콘을 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, SARS-CoV-2 E 프로브는 서열식별번호: 44의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함하고, SARS-CoV-2 N2 프로브는 서열식별번호: 45 또는 서열식별번호: 79의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, SARS-CoV-2 RdRP 프로브는 서열식별번호: 80 및/또는 서열식별번호: 81의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, SARS-CoV-2 E 프로브는 서열식별번호: 50 또는 서열식별번호: 72의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개 또는 적어도 21개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함하고, SARS-CoV-2 N2 프로브는 서열식별번호: 53, 서열식별번호: 74 및/또는 서열식별번호: 75의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개 또는 적어도 24개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, SARS-CoV-2 RdRP 프로브는 서열식별번호: 77의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개 또는 적어도 21개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, SARS-CoV-2 N2에 대한 2개의 프로브, 서열식별번호: 53 또는 서열식별번호: 74의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개 또는 적어도 24개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함하는 제1 프로브, 및 서열식별번호: 75의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개 또는 적어도 24개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함하는 제2 프로브가 포함된다.
일부 실시양태에서, 각 프로브는 검출가능한 표지를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각 프로브는 형광 염료 및 켄쳐 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로브는 검출가능하게 상이한 검출가능한 표지를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로브는 검출가능하게 상이하지 않은 검출가능한 표지를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각 프로브는 15 내지 30개의 뉴클레오티드로 이루어진다. 일부 실시양태에서 단일 유기체에 대한 프로브는 검출가능하게 상이하지 않고, 상이한 유기체에 대한 프로브는 검출가능하게 상이하다.
일부 실시양태에서, 방법은 외인성 대조군 앰플리콘을 형성하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 외인성 대조군 앰플리콘과 선택적으로 혼성화할 수 있는 대조군 프로브와 외인성 대조군 앰플리콘을 접촉시키는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 단일 멀티플렉스 반응에서 적어도 하나의 인플루엔자 A 아형 및 적어도 하나의 인플루엔자 B 아형 및 외인성 대조군의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 인플루엔자 A 아형은 적어도 하나의 조류 인플루엔자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 동일한 멀티플렉스 반응에서 RSV A 및/또는 RSV B 및 SARS-CoV-2 E 및/또는 SARS-CoV-2 N2 및/또는 SARS-CoV-2 RdRP를 검출하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 멀티플렉스 반응을 사용하는 것은 제한된 이용가능성을 가질 수 있는 테스트 재료의 보존을 초래하거나, 검정을 단일 테스트로서 실행하는데 드는 비용 증가의 회피를 초래하므로, 테스트 이용가능성을 증가시키고, 테스트 비용을 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 샘플은 비인두 스왑 샘플, 비강 흡인물 샘플 및 비강 세척액 샘플로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 조성물이 제공된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 인플루엔자 PA 유전자를 검출하기 위한 제1 프라이머 쌍을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 프라이머 쌍은 제1 프라이머 및 제2 프라이머를 포함하고, 여기서 제1 프라이머는 서열식별번호: 2의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 서열을 포함하고, 여기서 제2 프라이머는 서열식별번호: 2의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 상보적인 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 프라이머 쌍은 제1 프라이머 및 제2 프라이머를 포함하고, 여기서 제1 프라이머는 서열식별번호: 20의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 서열을 포함하고, 여기서 제2 프라이머는 서열식별번호: 21의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개 또는 적어도 20개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 프라이머는 서열식별번호: 20의 서열을 갖고, 제2 프라이머는 서열식별번호: 21의 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 인플루엔자 PB2 유전자를 검출하기 위한 제2 프라이머 쌍을 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 실시양태에서, 제2 프라이머 쌍은 제3 프라이머 및 제4 프라이머를 포함하고, 여기서 제3 프라이머는 서열식별번호: 1의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 서열을 포함하고, 여기서 제4 프라이머는 서열식별번호: 1의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 상보적인 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 프라이머 쌍은 제3 프라이머 및 제4 프라이머를 포함하고, 여기서 제3 프라이머는 서열식별번호: 17의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개 또는 적어도 20개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 서열을 포함하고, 여기서 제4 프라이머는 서열식별번호: 18의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개 또는 적어도 20개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제3 프라이머는 서열식별번호: 17의 서열을 갖고, 제4 프라이머는 서열식별번호: 18의 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 조성물은 적어도 하나의 추가 프라이머 쌍을 포함하고, 여기서 각각의 추가 프라이머 쌍은 인플루엔자 A MP 유전자, 조류 인플루엔자 MP 유전자 및 조류 인플루엔자 HA 유전자로부터 선택된 상이한 인플루엔자 유전자를 검출하기 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 각각의 추가 프라이머 쌍은 하기로부터 독립적으로 선택된 제5 프라이머 및 제6 프라이머를 포함한다: (a) 서열식별번호: 3의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 제5 프라이머, 및 서열식별번호: 3의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 상보적인 서열을 포함하는 제6 프라이머; (b) 서열식별번호: 4의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 제5 프라이머, 및 서열식별번호: 4의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 상보적인 서열을 포함하는 제6 프라이머; (c) 서열식별번호: 5의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 제5 프라이머, 및 서열식별번호: 5의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 상보적인 서열을 포함하는 제6 프라이머; (d) 서열식별번호: 23의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 제5 프라이머, 및 서열식별번호: 24의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 제6 프라이머; 및 (e) 서열식별번호: 26의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 제5 프라이머, 및 서열식별번호: 27의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 제6 프라이머.
일부 실시양태에서, 조성물은 적어도 하나의 추가 프라이머 쌍을 추가로 포함하고, 여기서 각각의 추가 프라이머 쌍은 인플루엔자 B MP 유전자 및 인플루엔자 B NS 유전자로부터 선택된 상이한 인플루엔자 유전자를 검출하기 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 각각의 추가 프라이머 쌍은 하기로부터 독립적으로 선택된 제7 프라이머 및 제8 프라이머를 포함한다: (a) 서열식별번호: 6의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 제7 프라이머, 및 서열식별번호: 6의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 상보적인 서열을 포함하는 제8 프라이머; (b) 서열식별번호: 7의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 제7 프라이머, 및 서열식별번호: 7의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 상보적인 서열을 포함하는 제8 프라이머; (c) 서열식별번호: 32의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 제7 프라이머, 및 서열식별번호: 33의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 제8 프라이머; 및 (d) 서열식별번호: 35의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 제7 프라이머, 및 서열식별번호: 36의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 제8 프라이머.
일부 실시양태에서, 조성물은 적어도 하나의 추가 프라이머 쌍을 추가로 포함하고, 여기서 각각의 추가 프라이머 쌍은 RSV A 또는 RSV B를 검출하기 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 각각의 추가 프라이머 쌍은 하기로부터 독립적으로 선택된 제9 프라이머 및 제10 프라이머를 포함한다: (a) 서열식별번호: 38 및/또는 서열식별번호: 67의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 제9 프라이머, 및 서열식별번호: 39, 서열식별번호: 68 및/또는 서열식별번호: 69의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 제10 프라이머; 및 (b) 서열식별번호: 41의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 제9 프라이머, 및 서열식별번호: 42의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 제10 프라이머. 일부 실시양태에서 적어도 2개의 정방향 프라이머 및/또는 적어도 2개의 역방향 프라이머는 RSV A 및/또는 RSV B를 검출하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, RSV A를 검출하는데 사용되는 프라이머는 서열식별번호: 38의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머 및/또는 서열식별번호: 67의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머; 및 서열식별번호: 39의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 역방향 프라이머 및/또는 서열식별번호: 68의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 역방향 프라이머 및/또는 서열식별번호: 69의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 역방향 프라이머를 포함한다.
일부 실시양태에서, 조성물은 적어도 하나의 추가 프라이머 쌍을 추가로 포함하고, 여기서 각각의 추가 프라이머 쌍은 SARS-CoV-2 E 유전자 및/또는 SARS-CoV-2 N2 유전자 및/또는 SARS-CoV-2 RdRP 유전자를 검출하기 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 각각의 추가 프라이머 쌍은 하기로부터 독립적으로 선택된 제11 프라이머 및 제12 프라이머를 포함한다: (a) 서열식별번호: 44의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 제11 프라이머, 및 서열식별번호: 44의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 상보적인 서열을 포함하는 제12 프라이머; (b) 서열식별번호: 70의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 제11 프라이머, 및 서열식별번호: 71의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 상보적인 서열을 포함하는 제12 프라이머; (c) 서열식별번호: 48의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 제11 프라이머, 및 서열식별번호: 49의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 제12 프라이머; (d) 서열식별번호: 45의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 제11 프라이머, 및 서열식별번호: 45의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 상보적인 서열을 포함하는 제12 프라이머; (e) 서열식별번호: 73 또는 서열식별번호: 51의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 제11 프라이머, 및 서열식별번호: 52의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 제12 프라이머; 및 (f) 서열식별번호: 76의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 제11 프라이머, 및 서열식별번호: 61 및/또는 서열식별번호: 78의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 제12 프라이머.
일부 실시양태에서, 조성물은 적어도 하나의 인플루엔자 A 유전자, 인플루엔자 B 유전자, SARS-CoV-2 유전자 및 RSV 유전자를 검출하기 위한 프라이머 쌍을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 SARS-CoV-2 E 및/또는 SARS-CoV-2 N2 및/또는 SARS-CoV-2 RdRP를 검출하기 위한 프라이머 쌍을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 인플루엔자 A PA 유전자, 인플루엔자 A PB2 유전자, 인플루엔자 A MP 유전자, 및/또는 조류 인플루엔자 MP 유전자를 검출하기 위한 프라이머 쌍을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 인플루엔자 B MP 유전자 및/또는 인플루엔자 B NS 유전자를 검출하기 위한 프라이머 쌍을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 RSV A 및/또는 RSV B를 검출하기 위한 프라이머 쌍을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 외인성 대조군을 검출하기 위한 프라이머 쌍을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 외인성 대조군은 샘플 프로세싱 대조군이다.
일부 실시양태에서, 조성물은 인플루엔자 A PA 프로브 및 인플루엔자 A PB2 프로브로부터 선택된 적어도 하나의 프로브를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인플루엔자 PA 프로브는 서열식별번호: 2의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함하고, 인플루엔자 PB2 프로브는 서열식별번호: 1의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인플루엔자 PA 프로브는 서열식별번호: 22의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함하고, 인플루엔자 PB2 프로브는 서열식별번호: 19의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 조성물은 인플루엔자 A MP 프로브, 조류 인플루엔자 MP 프로브 및 조류 인플루엔자 HA 프로브로부터 선택된 적어도 하나의 프로브를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 인플루엔자 MP 프로브는 서열식별번호: 3의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함하고, 조류 인플루엔자 MP 프로브는 서열식별번호: 4의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함하고, 조류 인플루엔자 HA 프로브는 서열식별번호: 5의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인플루엔자 MP 프로브는 서열식별번호: 25의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함하고, 조류 인플루엔자 MP 프로브는 서열식별번호: 28의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 조성물은 인플루엔자 B MP 프로브 및 인플루엔자 B NS 프로브로부터 선택된 적어도 하나의 프로브를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 인플루엔자 B MP 프로브는 서열식별번호: 6의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함하고, 인플루엔자 B NS 프로브는 서열식별번호: 7의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인플루엔자 B MP 프로브는 서열식별번호: 34의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함하고, 인플루엔자 B NS 프로브는 서열식별번호: 37의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 조성물은 RSV A 프로브 및 RSV B 프로브로부터 선택된 적어도 하나의 프로브를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, RSV A 프로브는 서열식별번호: 15의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함하고, 인플루엔자 B NS 프로브는 서열식별번호: 16의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, RSV A 프로브는 서열식별번호: 40의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함하고, RSV B 프로브는 서열식별번호: 43의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 조성물은 SARS-CoV-2 E 프로브 및/또는 SARS-CoV-2 N2 프로브 및/또는 SARS CoV-2 RdRP 프로브로부터 선택된 적어도 하나의 프로브를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, SARS-CoV-2 E 프로브는 서열식별번호: 44의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함하고, SARS-CoV-2 N2 프로브는 서열식별번호: 45 또는 서열식별번호: 79의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, SARS-CoV-2 RdRP 프로브는 서열식별번호: 80 및/또는 서열식별번호: 81의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, SARS-CoV-2 E 프로브는 서열식별번호: 50 또는 서열식별번호: 72의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개 또는 적어도 21개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함하고, SARS-CoV-2 N2 프로브는 서열식별번호: 53, 서열식별번호: 74 및/또는 서열식별번호: 75의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개 또는 적어도 24개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, SARS-CoV-2 RdRP 프로브는 서열식별번호: 77의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개 또는 적어도 21개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, SARS-CoV-2 N2에 대한 2개의 프로브, 서열식별번호: 53 또는 서열식별번호: 74의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개 또는 적어도 24개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함하는 제1 프로브, 및 서열식별번호: 75의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개 또는 적어도 24개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함하는 제2 프로브가 포함된다.
일부 실시양태에서, 조성물은 외인성 대조군을 검출하기 위한 프로브를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 각 프로브는 검출가능한 표지를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각 프로브는 형광 염료 및 켄쳐 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각 프로브는 15 내지 30개의 뉴클레오티드로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 조성물은 동결건조된 조성물이다. 일부 실시양태에서, 조성물은 용액 상태이다. 일부 실시양태에서, 조성물은 COVID-19, 인플루엔자 및/또는 RSV의 존재 또는 부재에 대해 테스트되는 대상체로부터의 샘플로부터의 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 샘플은 비인두 스왑 샘플, 비강 흡인물 샘플, 타액 샘플 및 비강 세척액 샘플로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 키트가 제공된다. 일부 실시양태에서, 키트는 본원에 기재된 조성물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 외인성 대조군을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 외인성 대조군은 RNA 대조군이다. 일부 실시양태에서, RNA 대조군은 박테리오파지 보호 코트에 패키징된다 (예를 들어, 아머드® RNA). 일부 실시양태에서, 키트는 dNTP 및/또는 열안정성 폴리머라제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 역전사효소를 포함한다.
일부 실시양태에서, 서열식별번호: 17 내지 28, 32 내지 43, 48 내지 65, 및 67 내지 78로부터 선택된 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드가 제공된다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 검출가능한 표지를 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 형광 염료 및 켄쳐 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 형광 공명 에너지 전달 (FRET) 프로브이다.
5. 상세한 설명
5.1. 정의
본 발명의 이해를 용이하게 하기 위해, 다수의 용어 및 어구가 하기 정의된다:
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "검출하다", "검출하는" 또는 "검출"은 일반적으로 발견 또는 분별하는 행위 또는 검출가능하게 표지된 조성물의 특정 관찰을 기술할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "검출가능하게 상이한"은 동시에 검출 및 구별될 수 있는 표지 (예컨대 염료) 세트를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "환자" 및 "대상체"는 인간을 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 비인간 동물로부터의 샘플에 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "올리고뉴클레오티드", "폴리뉴클레오티드", "핵산 분자" 등은 DNA 또는 RNA를 포함하나 이에 제한되지는 않는 핵산-함유 분자를 지칭한다. 상기 용어는 4-아세틸시토신, 8-히드록시-N6-메틸아데노신, 아지리디닐시토신, 슈도이소시토신, 5-(카르복시히드록실-메틸) 우라실, 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우라실, 5-카르복시메틸-아미노메틸우라실, 디히드로우라실, 이노신, N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸아데닌, 1-메틸슈도-우라실, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸-구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸-시토신, 5-메틸시토신, N6-메틸아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시-아미노-메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실퀘오신, 5'-메톡시카르보닐메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산, 옥시부톡소신, 슈도우라실, 퀘오신, 2-티오시토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, N-우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산, 슈도우라실, 퀘오신, 2-티오시토신, 및 2,6-디아미노퓨린을 포함하나 이에 제한되지는 않는 DNA 및 RNA의 공지된 염기 유사체 중 임의의 것을 포함하는 서열을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "올리고뉴클레오티드"는 500개 미만의 뉴클레오티드를 갖는 단일-가닥 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 8 내지 200개, 8 내지 100개, 12 내지 200개, 12 내지 100개, 12 내지 75개, 또는 12 내지 50개의 뉴클레오티드 길이이다. 올리고뉴클레오티드는 이들의 길이에 의해 지칭될 수 있고, 예를 들어 24 잔기 올리고뉴클레오티드는 "24-mer"로 지칭될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 표적 RNA (또는 이의 표적 영역)와 "상보적인"이라는 용어 및 표적 RNA 서열에 대한 프로브 서열의 백분율 "상보성"은 표적 RNA의 서열 또는 표적 RNA의 서열의 역상보체에 대한 백분율 "동일성"이다. 본원에 기재된 조성물에 사용된 프로브 (또는 이의 영역) 및 표적 RNA, 예컨대 본원에 개시된 것들 사이의 "상보성" 정도의 결정에서, "상보성" 정도는 프로브 서열 (또는 이의 영역) 및 표적 RNA 서열 또는 그것과 가장 잘 정렬되는 표적 RNA 서열의 역상보체 사이의 백분율 동일성으로 표현된다. 백분율은 2개의 서열 사이에서 동일한 정렬된 염기의 수를 계수하고, 프로브 내의 인접 뉴클레오티드의 총 수로 나누고, 100을 곱하여 계산된다. 용어 "상보적"이 사용되는 경우, 대상체 올리고뉴클레오티드는 달리 표시되지 않는 한 표적 분자에 적어도 90% 상보적이다. 일부 실시양태에서, 대상체 올리고뉴클레오티드는 표적 분자에 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 상보적이다.
본원에서 사용된 바와 같은 "프라이머" 또는 "프로브"는 표적 핵산 분자, 예컨대 DNA (예를 들어, 표적 유전자) 또는 mRNA (또는 mRNA로부터 역전사된 DNA)의 적어도 8개의 인접 뉴클레오티드의 서열에 상보적인 영역을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 프라이머 또는 프로브는 표적 분자의 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개, 적어도 25개, 적어도 26개, 적어도 27개, 적어도 28개, 적어도 29개 또는 적어도 30개의 인접 뉴클레오티드의 서열에 상보적인 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개, 적어도 25개, 적어도 26개, 적어도 27개, 적어도 28개, 적어도 29개 또는 적어도 30개의 인접 뉴클레오티드의 영역을 포함한다. 프라이머 또는 프로브가 표적 분자의 "적어도 x개의 인접 뉴클레오티드에 상보적인" 영역 또는 표적 분자의 영역 또는 이의 서열을 포함하는 경우, 프라이머 또는 프로브는 표적 분자의 적어도 x개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 95% 상보적이다. 일부 실시양태에서, 프라이머 또는 프로브는 표적 분자에 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 상보적이다. 일부 실시양태에서, 2개 이상의 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및/또는 프로브는 표적을 검출하는데 사용된다.
용어 "핵산 증폭"은 핵산 서열을 선형적으로 또는 기하급수적으로 증폭시키기 위한 광범위한 기술을 제한 없이 포함하여, 적어도 하나의 표적 핵산의 적어도 일부가 전형적으로 주형-의존적 방식으로 재생산되는 임의의 수단을 포함한다. 증폭 단계를 수행하기 위한 예시적인 수단은 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR), 리가제 연쇄 반응 (LCR), 리가제 검출 반응 (LDR), 멀티플렉스 라이게이션-의존적 프로브 증폭 (MLPA), 라이게이션 후 Q-레플리카제 증폭, 프라이머 연장, 가닥 변위 증폭 (SDA), 과분지형 가닥 변위 증폭, 다중 변위 증폭 (MDA), 핵산 가닥-기반 증폭 (NASBA), 2-단계 멀티플렉스 증폭, 롤링 서클 증폭 (RCA) 등 (멀티플렉스 버전 및 이들의 조합 포함), 예를 들어 OLA/PCR, PCR/OLA, LDR/PCR, PCR/PCR/LDR, PCR/LDR, LCR/PCR, PCR/LCR (또한 조합된 연쇄 반응--CCR로 공지됨), 디지털 증폭 등 (그러나 이에 제한되지는 않음)을 포함한다. 이러한 기술의 설명은 다른 공급원 중에서 문헌 [Ausbel et al.; PCR Primer: A Laboratory Manual, Diffenbach, Ed., Cold Spring Harbor Press (1995)]; [The Electronic Protocol Book, Chang Bioscience (2002)]; [Msuih et al., J. Clin. Micro. 34:501-07 (1996)]; [The Nucleic Acid Protocols Handbook, R. Rapley, ed., Humana Press, Totowa, N.J. (2002)]; [Abramson et al., Curr Opin Biotechnol. 1993 Feb.;4(1):41-7], 미국 특허 번호 6,027,998; 미국 특허 번호 6,605,451, Barany et al., PCT 공개 번호 WO 97/31256; Wenz et al., PCT 공개 번호 WO 01/92579; [Day et al., Genomics, 29(1): 152-162 (1995)], [Ehrlich et al., Science 252:1643-50 (1991)]; [Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990)]; [Favis et al., Nature Biotechnology 18:561-64 (2000)]; 및 [Rabenau et al., Infection 28:97-102 (2000)]; [Belgrader, Barany, and Lubin, Development of a Multiplex Ligation Detection Reaction DNA Typing Assay, Sixth International Symposium on Human Identification, 1995 (월드와이드웹 promega.com/geneticidproc/ussymp6proc/blegrad.html에서 이용가능함); [LCR Kit Instruction Manual, Cat. #200520, Rev. #050002, Stratagene, 2002]; [Barany, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:188-93 (1991)]; [Bi and Sambrook, Nucl. Acids Res. 25:2924-2951 (1997)]; [Zirvi et al., Nucl. Acid Res. 27:e40i-viii (1999)]; [Dean et al., Proc Natl Acad Sci USA 99:5261-66 (2002)]; [Barany and Gelfand, Gene 109:1-11 (1991)]; [Walker et al., Nucl. Acid Res. 20:1691-96 (1992)]; [Polstra et al., BMC Inf. Dis. 2:18- (2002)]; [Lage et al., Genome Res. 2003 Feb.;13(2):294-307], 및 [Landegren et al., Science 241:1077-80 (1988)], [Demidov, V., Expert Rev Mol Diagn. 2002 Nov.;2(6):542-8.], [Cook et al., J Microbiol Methods. 2003 May;53(2):165-74], [Schweitzer et al., Curr Opin Biotechnol. 2001 Feb.;12(1):21-7], 미국 특허 번호 5,830,711, 미국 특허 번호 6,027,889, 미국 특허 번호 5,686,243, PCT 공개 번호 WO0056927A3, 및 PCT 공개 번호 WO9803673A1에서 찾을 수 있다.
일부 실시양태에서, 증폭은 적어도 하나의 표적 핵산에서 상보적이거나 실질적으로 상보적인 서열로 적어도 하나의 프라이머를 어닐링하는 단계; 폴리머라제를 사용하여 주형-의존적 방식으로 적어도 하나의 뉴클레오티드 가닥을 합성하는 단계; 및 새롭게-형성된 핵산 이중체를 변성시켜 가닥을 분리하는 단계의 순차적 절차의 적어도 하나의 사이클을 포함한다. 사이클은 반복될 수 있거나 반복되지 않을 수 있다. 증폭은 열순환을 포함할 수 있거나 등온적으로 수행될 수 있다.
달리 표시되지 않는 한, 용어 "혼성화하다"는 본원에서 일부 실시양태에서 엄격한 조건 하에 핵산 분자를 특정 뉴클레오티드 서열에 우선적으로 결합, 듀플렉싱 또는 혼성화하는 "특이적 혼성화"를 지칭하는데 사용된다. 용어 "엄격한 조건"은 프로브가 그의 표적 서열에 우선적으로 혼성화하고 다른 서열에는 덜 혼성화하거나 전혀 혼성화하지 않는 조건을 지칭한다. 핵산 혼성화 (예를 들어, 어레이, 서던 또는 노던 혼성화에서와 같이)의 맥락에서 "엄격한 혼성화" 및 "엄격한 혼성화 세척 조건"은 서열-의존적이며, 상이한 환경 파라미터 하에 상이하다. 핵산의 혼성화에 대한 광범위한 가이드는 예를 들어, 문헌 [Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes part I, Ch. 2, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays," Elsevier, NY ("Tijssen")]에서 찾을 수 있다. 일반적으로, 필터 혼성화를 위한 고도로 엄격한 혼성화 및 세척 조건은 정의된 이온 강도 및 pH에서 특이적 서열에 대한 열 융점 (Tm)보다 약 5℃ 낮도록 선택된다. Tm은 표적 서열의 50%가 완벽하게 메칭된 프로브에 혼성화하는 온도 (정의된 이온 강도 및 pH 하에)이다. 특정 프로브에 대한 Tm과 동일하도록 매우 엄격한 조건이 선택된다. 완충액 조성, 온도 및 프로브 길이에 대한 혼성화 엄격성의 의존성은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.) Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, NY] 참조).
본원에서 사용된 바와 같은 "샘플"은 다양한 비강 샘플, 예컨대 비인두 스왑 샘플, 구인두 샘플, 비강 흡인물 샘플, 비강 또는 중비갑개 스왑 및 비강 세척액/흡인물 표본, 타액 샘플, 및 다른 유형의 인간 샘플 (대변 또는 소변 샘플 포함)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 비강 샘플은 완충액, 예컨대 보존제를 포함한다. 추가의 비제한적인 예시적인 샘플은 비강 스왑, 구인두 스왑, 인후 스왑, 기관지폐포 세정액 샘플, 기관지 흡인물, 기관지 세척액, 기관내 흡인물, 기관내 세척액, 기관 흡인물, 비강 분비물 샘플, 점액 샘플, 가래 샘플 및 폐 조직 샘플을 포함한다. 일부 실시양태에서, 샘플은 완충액, 예컨대 보존제를 포함한다. 일부 실시양태에서 샘플은 2명 이상의 대상체로부터의 샘플을 함유하는 풀링된 샘플이다.
본원에서 사용된 바와 같은 "내인성 대조군"은 검출을 위해 사용되는 샘플에 자연적으로 존재하는 모이어티를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 내인성 대조군은 "샘플 적절성 대조군" (SAC)이며, 이는 검정에 사용된 샘플이 충분한지 여부, 또는 샘플이 충분한 생물학적 물질, 예컨대 세포를 포함하는지 여부를 결정하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 내인성 대조군은 RNA (예컨대 mRNA, tRNA, 리보솜 RNA 등), 예컨대 인간 RNA이다. 비제한적인 예시적인 내인성 대조군은 ABL mRNA, GUSB mRNA, GAPDH mRNA, TUBB mRNA 및 UPK1a mRNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 RNA가 검출되는 것과 동일한 방식으로 및 일부 실시양태에서 표적 RNA와 동시에 검출될 수 있는 내인성 대조군, 예컨대 SAC가 선택된다.
본원에서 사용된 바와 같은 "외인성 대조군"은 샘플 또는 검정에 첨가되는 모이어티, 예컨대 "샘플 프로세싱 대조군" (SPC)을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 외인성 대조군이 검정 시약과 함께 포함된다. 전형적으로 검출을 위해 사용되는 샘플에 존재할 것으로 예상되지 않거나, 샘플에 자연적으로 존재하는 모이어티의 양이 검출불가능하거나 외인성 대조군으로서 샘플에 첨가된 양보다 훨씬 더 낮은 수준에서 검출가능하도록 샘플에 매우 낮은 수준으로 존재하는 외인성 대조군이 선택된다. 일부 실시양태에서, 외인성 대조군은 표적 RNA의 검출을 위해 사용되는 샘플 유형에 존재할 것으로 예상되지 않는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 외인성 대조군은 샘플을 채취한 종에 존재하는 것으로 공지되어 있지 않은 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 외인성 대조군은 샘플을 채취한 대상체와 상이한 종으로부터의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 외인성 대조군은 임의의 종에 존재하는 것으로 공지되어 있지 않은 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 RNA가 검출되는 것과 동일한 방식으로 및 일부 실시양태에서 표적 RNA와 동시에 검출될 수 있는 외인성 대조군이 선택된다. 일부 실시양태에서, 외인성 대조군은 RNA이다. 일부 이러한 실시양태에서, 외인성 대조군은 박테리오파지 보호 코트에 패키징된 RNA를 포함하는 아머드® RNA이다. 예를 들어, 문헌 [WalkerPeach et al., Clin. Chem. 45:12: 2079-2085 (1999)]을 참조한다.
본원의 서열에서, "U" 및 "T"는 상호교환적으로 사용되며, 두 글자 모두는 해당 위치에서 우라실 또는 티민을 나타낸다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 맥락 및/또는 의도된 용도로부터 우라실 또는 티민이 의도되고/거나 서열의 해당 위치에서 사용되어야 하는지 여부를 이해할 것이다. 예를 들어, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 천연 RNA 분자가 전형적으로 우라실을 포함하는 반면, 천연 DNA 분자는 전형적으로 티민을 포함한다는 것을 이해할 것이다. 그러므로, RNA 서열이 "T"를 포함하는 경우, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 천연 RNA에서의 해당 위치가 우라실일 가능성이 있음을 이해할 것이다.
본 개시내용에서, "로부터 선택된 서열"은 "로부터 선택된 하나의 서열" 및 "로부터 선택된 하나 이상의 서열"을 모두 포함한다. 그러므로, "로부터 선택된 서열"이 사용될 때, 나열된 서열 중 하나 또는 하나 초과가 선택될 수 있음을 이해해야 한다.
본 개시내용에서, "SARS-CoV-2"는 2019년에 식별된 신규 코로나바이러스 (2019-nCoV)인 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2를 지칭한다. 본 개시내용에서, "COVID-19"는 SARS-CoV-2 코로나바이러스에 의해 야기된 질환을 지칭한다. 본 개시내용에서, "SARS-CoV-2 E"는 SARS-CoV-2 엔벨로프 단백질 (E) 유전자를 지칭하고, "SARS-CoV-2 N2"는 SARS-CoV-2 핵단백질 유전자의 N2 영역을 지칭한다. SARS-CoV-2 E 유전자 및 SARS-CoV-2 N2 유전자는 환자로부터의 샘플에서 SARS-CoV-2를 검출하기 위한 마커로서 식별되었다. ORF1ab 서열의 RNA-의존적 RNA 폴리머라제 (RdRP) 유전자 및 다른 ORF1ab 유전자와 관련된 부분을 포함하나 이에 제한되지는 않는 SARS-CoV-2 게놈의 다른 부분이 또한 마커로서 기능할 수 있다.
5.2. 인플루엔자 A, 인플루엔자 B, RSV 및 SARS-CoV-2의 검출
본 발명자들은 인플루엔자 A, 인플루엔자 B, RSV 및 SARS-CoV-2를 검출하기 위한 조합 검정을 개발하였다. 일부 실시양태에서 검정은 인플루엔자 A, 인플루엔자 B, RSV 및 SARS-CoV-2의 존재를 검출하는데 있어서 적어도 95% 정확도를 갖고, 인플루엔자 A, 인플루엔자 B, RSV 및 SARS-CoV-2의 부재를 검출하는데 있어서 적어도 95% 정확도를 갖는다.
일부 실시양태에서, 검정은 대상체로부터의 샘플에서 플루 A 폴리머라제 염기성 2 (PB2) 유전자, 플루 A 폴리머라제 산성 (PA) 유전자, 및 플루 A 매트릭스 단백질 (MP) 유전자의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 검정은 표 A에 나타낸 바와 같은 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 인플루엔자 A PB2, PA, MP 및/또는 조류 MP 유전자를 검출하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로브는 인플루엔자 A PB2, PA, MP 및/또는 조류 MP 유전자를 검출하는데 사용되며, 이는 정방향 및 역방향 프라이머에 의해 생산된 앰플리콘에 선택적으로 혼성화한다. 인플루엔자 A의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 비제한적인 예시적인 프라이머 및 프로브는 표 A에 나타낸다.
일부 실시양태에서, 검정은 대상체로부터의 샘플에서 인플루엔자 B MP 유전자 및/또는 인플루엔자 B NS 유전자의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 검정은 표 A에 나타낸 바와 같은 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 인플루엔자 B MP 및/또는 NS 유전자를 검출하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로브는 인플루엔자 B MP 및/또는 NS 유전자를 검출하는데 사용되며, 이는 정방향 및 역방향 프라이머에 의해 생산된 앰플리콘에 선택적으로 혼성화한다. 인플루엔자 B의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 비제한적인 예시적인 프라이머 및 프로브는 표 A에 나타낸다.
일부 실시양태에서, 검정은 대상체로부터의 샘플에서 RSV A 및/또는 RSV B의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 검정은 표 A에 나타낸 바와 같은 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 RSV A 및/또는 RSV B를 검출하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로브는 RSV A 및/또는 RSV B를 검출하는데 사용되며, 이는 정방향 및 역방향 프라이머에 의해 생산된 앰플리콘에 선택적으로 혼성화한다. 일부 실시양태에서, 2개 이상의 정방향 프라이머 및/또는 2개 이상의 역방향 프라이머가 유전자를 검출하는데 사용된다. RSV의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 비제한적인 예시적인 프라이머 및 프로브는 표 A에 나타낸다.
일부 실시양태에서, 검정은 대상체로부터의 샘플에서 SARS-CoV-2 E 유전자 및/또는 SARS-CoV-2 N2 유전자 및/또는 SARS-CoV-2 RdRP 유전자의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 검정은 표 A에 나타낸 바와 같은 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 SARS-CoV-2 E 유전자 및/또는 SARS-CoV-2 N2 유전자 및/또는 SARS CoV-2 RdRP 유전자를 검출하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로브는 SARS-CoV-2 E 유전자 및/또는 SARS-CoV-2 N2 유전자 및/또는 SARS CoV-2 RdRP 유전자를 검출하는데 사용되며, 이는 정방향 및 역방향 프라이머에 의해 생산된 앰플리콘에 선택적으로 혼성화한다. 일부 실시양태에서, 2개 이상의 프로브가 유전자를 검출하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 2개 이상의 정방향 프라이머 및/또는 2개 이상의 역방향 프라이머가 유전자를 검출하는데 사용된다. SARS-CoV-2의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 비제한적인 예시적인 프라이머 및 프로브는 표 A에 나타낸다.
본 검정은 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의존하며, 상업적으로 입수가능한 핵산 증폭 시스템을 사용하여 실질적으로 자동화된 방식으로 수행될 수 있다. 본 발명의 방법을 수행하기 위해 사용될 수 있는 예시적인 비제한적인 핵산 증폭 시스템은 진엑스퍼트(GENEXPERT)® 시스템, 진엑스퍼트® 인피니티 시스템, 및 진엑스퍼트® 엑스프레스(Xpress) 시스템 (세페이드(Cepheid), 미국 캘리포니아주 서니베일)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 증폭 시스템은 건강관리 제공자의 사무실, 클리닉, 또는 지역사회 병원과 같이 테스트되는 개체와 동일한 위치에서 이용가능할 수 있으므로, 샘플을 또 다른 시설로 수송함으로써 프로세싱이 지연되지 않는다. 본 검정은 자동화된 시스템, 예를 들어, 진엑스퍼트® 시스템을 사용하여 3시간 이내에, 일부 실시양태에서 2시간 이내에, 일부 실시양태에서 1시간 이내에, 일부 실시양태에서 45분 이내에, 일부 실시양태에서 35분 이내에, 및 일부 실시양태에서 30분 이내에 완료될 수 있다.
5.2.1. 일반적인 방법
인플루엔자 A, 인플루엔자 B, RSV 및 SARS-CoV-2를 검출하기 위한 조성물 및 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법은 인플루엔자 A PB2 유전자, 인플루엔자 A PA 유전자, 인플루엔자 A MP 유전자, 및/또는 조류 MP 유전자를 검출하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 인플루엔자 B MP 유전자 및/또는 인플루엔자 B NS 유전자를 검출하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 RSV A 및/또는 RSV B를 검출하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 SARS-CoV-2 E 유전자 및/또는 SARS-CoV-2 N2 유전자 및/또는 SARS CoV-2 RdRP 유전자를 검출하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 SARS-CoV-2, 플루 A, 조류 플루, 플루 B 및 RSV 중 하나 이상을 검출하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 대상체에서 플루 A, 플루 B, RSV 및/또는 SARS-CoV-2를 검출하는 방법은 대상체로부터의 샘플에서 SARS-CoV-2, 플루 A, 조류 플루, 플루 B 및 RSV 유전자 중 하나 이상의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 샘플은 비인두 스왑 샘플, 비강 흡인물 샘플 및 비강 세척액 샘플로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 대상체에서 플루 A, 플루 B, RSV 및/또는 SARS-CoV-2를 검출하는 방법은 적어도 하나의 내인성 대조군, 예컨대 샘플 적절성 대조군 (SAC)을 검출하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상체에서 플루 A, 플루 B, RSV 및/또는 SARS-CoV-2를 검출하는 방법은 적어도 하나의 외인성 대조군, 예컨대 샘플 프로세싱 대조군 (SPC)을 검출하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, SPC는 RNA 대조군이다. 일부 실시양태에서, SPC는 아머드® RNA이다.
본 개시내용에서, 용어 "표적 RNA" 및 "표적 유전자"는 본원에 기재된 플루 A, 플루 B, RSV, 조류 및/또는 SARS-CoV-2 유전자 중 임의의 것, 뿐만 아니라 외인성 및/또는 내인성 대조군을 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 그러므로, 표적 유전자에 관한 논의가 제시될 때 논의는 구체적으로 플루 A, 플루 B, RSV, 조류 및/또는 SARS-CoV-2 유전자, 임의의 내인성 대조군(들) (예를 들어, SAC), 및 임의의 외인성 대조군(들) (예를 들어, SPC)을 포함하도록 의도됨을 이해해야 한다.
일부 실시양태에서, 플루 A, 플루 B, RSV, 조류 및/또는 SARS-CoV-2 유전자의 존재는 비강 샘플에서 검출된다. 일부 실시양태에서, 표적 유전자는 비강 흡인물 샘플 또는 비강 세척액 샘플에서 검출된다. 일부 실시양태에서, 표적 유전자는 완충액 (예컨대 보존제)이 첨가된 샘플에서 검출된다. 일부 실시양태에서, 플루 A, 플루 B, RSV, 조류 및/또는 SARS-CoV-2 유전자의 존재는 비인두 스왑 샘플에서 검출된다. 일부 실시양태에서, 표적 유전자는 완충액 (예컨대 보존제)에 배치된 비인두 스왑 샘플에서 검출된다.
일부 실시양태에서, 대상체로부터의 샘플에서 인플루엔자 A PB2, PA, MP, 및/또는 조류 MP 유전자의 검출은 대상체 내의 플루 A의 존재를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 대상체로부터의 샘플에서 인플루엔자 B MP 및/또는 NS 유전자의 검출은 대상체 내의 플루 B의 존재를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 대상체로부터의 샘플에서 RSV A 및/또는 RSV B의 검출은 대상체 내의 RSV의 존재를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 대상체로부터의 샘플에서 SARS-CoV-2 E 및/또는 SARS-CoV-2 N2 및/또는 SARS CoV-2 RdRP 유전자의 검출은 대상체 내의 SARS-CoV-2의 존재를 나타낸다.
일부 실시양태에서, 인플루엔자 A PA 유전자의 서열은 서열식별번호: 2와 적어도 95% 동일하다. 일부 실시양태에서, 인플루엔자 A PB2 유전자의 서열은 서열식별번호: 1과 적어도 95% 동일하다. 일부 실시양태에서, 인플루엔자 A MP 유전자의 서열은 서열식별번호: 3과 적어도 95% 동일하다. 일부 실시양태에서, 조류 인플루엔자 MP 유전자의 서열은 서열식별번호: 4와 적어도 95% 동일하다. 일부 실시양태에서, 인플루엔자 B MP 유전자의 서열은 서열식별번호: 6과 적어도 95% 동일하다. 일부 실시양태에서, 인플루엔자 B NS 유전자의 서열은 서열식별번호: 7과 적어도 95% 동일하다. 일부 실시양태에서, SARS-CoV-2 E 유전자의 서열은 서열식별번호: 44와 적어도 95% 동일하다. 일부 실시양태에서, SARS-CoV-2 N2 유전자의 서열은 서열식별번호: 45와 적어도 95% 동일하다.
일부 실시양태에서, 검출은 정량적으로 수행된다. 다른 실시양태에서, 검출은 정성적으로 수행된다. 일부 실시양태에서, 표적 유전자를 검출하는 것은 표적 유전자, 표적 유전자로부터 역전사된 cDNA, 표적 유전자의 DNA 앰플리콘, 및 표적 유전자의 상보체로부터 선택된 핵산 및 폴리뉴클레오티드를 포함하는 복합체를 형성하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 유전자를 검출하는 것은 RT-PCR (역전사효소-PCR)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 유전자를 검출하는 것은 정량적 RT-PCR 또는 실시간 RT-PCR을 포함한다. 일부 실시양태에서, 샘플 적절성 대조군 (SAC) 및/또는 샘플 프로세싱 대조군 (SPC)은 표적 유전자와 동일한 검정에서 검출된다. 일부 실시양태에서, 플루 A, 플루 B, RSV, 조류 및/또는 SARS-CoV-2 유전자가 검출되는 경우, SPC가 검정에서 검출되지 않더라도 검출되는 것으로 간주된다. 일부 실시양태에서, 플루 A, 플루 B, RSV, 조류 및/또는 SARS-CoV-2 유전자가 검출되지 않는 경우, SPC가 검정에서 검출되는 경우에만 검출되지 않는 것으로 간주된다.
일부 실시양태에서, 플루 A, 플루 B, RSV, 조류 및/또는 SARS-CoV-2 유전자의 존재는 대상체에서 플루, RSV 또는 COVID-19에 대한 치료를 모니터링하기 위해 대상체로부터 1회 이상 수집된 샘플에서 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 검정은 예를 들어 이들의 건강관리 제공자와 상의한 후 기도 감염이 의심되는 대상체에서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 검정은 대상체를 위한 일상적 및/또는 예방적 건강관리의 일부로서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 검정은 대상체를 위한 일상적 및/또는 예방적 건강관리의 일부로서 계절적으로 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 검정은 플루, RSV 또는 COVID-19로부터 특정 위험에 있는 대상체, 예컨대 면역약화된 및 노인 대상체를 위한 일상적 및/또는 예방적 건강관리의 일부로서 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 테스트되는 샘플은 비강 흡인물 샘플 또는 비강 세척액 샘플이거나, 비강 흡인물 샘플 또는 비강 세척액 샘플로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 완충액 (예컨대 보존제)이 비강 흡인물 샘플 또는 비강 세척액 샘플에 첨가된다. 일부 실시양태에서, 완충액은 샘플 수집 5분 이내, 10분 이내, 30분 이내, 1시간 이내, 또는 2시간 이내에 비강 흡인물 샘플 또는 비강 세척액 샘플에 첨가된다.
일부 실시양태에서, 테스트되는 샘플은 비인두 스왑 샘플이다. 일부 실시양태에서, 스왑은 완충액에 배치된다. 일부 실시양태에서, 스왑은 완충액에 즉시 배치된다. 일부 실시양태에서, 스왑은 샘플 수집 5분 이내, 10분 이내, 30분 이내, 1시간 이내, 또는 2시간 이내에 완충액에 배치된다.
일부 실시양태에서, 5 ml 미만, 4 ml 미만, 3 ml 미만, 2 ml 미만, 1 ml 미만, 또는 0.75 ml 미만의 샘플 또는 완충된 샘플이 본 방법에서 사용된다. 일부 실시양태에서, 0.1 ml 내지 1 ml의 샘플 또는 완충된 샘플이 본 방법에서 사용된다.
일부 실시양태에서, 테스트되는 샘플은 또 다른 체액, 예컨대 타액, 비강 스왑, 구인두 스왑, 인후 스왑, 비강 흡인물 샘플, 비강, 또는 중비갑개 스왑 및 비강 세척액/흡인물 샘플, 기관지폐포 세정액 샘플, 기관지 흡인물, 기관지 세척액, 기관내 흡인물, 기관내 세척액, 기관 흡인물, 비강 분비물 샘플, 점액 샘플, 가래 샘플, 폐 조직 샘플 등이다. 일부 실시양태에서, 테스트되는 샘플은 대변 또는 소변 샘플을 포함한 다른 유형의 인간 샘플로부터 유래된다.
테스트되는 임상 샘플은 일부 실시양태에서 신선하다 (즉, 동결되지 않음). 다른 실시양태에서, 샘플은 동결된 표본이다. 일부 실시양태에서, 샘플은 조직 샘플, 예컨대 포르말린-고정 파라핀 포매 샘플이다. 일부 실시양태에서, 샘플은 액체 세포학 샘플이다.
일부 실시양태에서, 테스트되는 샘플은 인플루엔자, RSV 또는 COVID-19 감염의 하나 이상의 증상을 갖는 개체로부터 수득된다. 인플루엔자의 비제한적인 예시적인 증상은 발열, 오한, 기침, 인후통, 콧물, 비충혈, 근육통, 두통, 피로, 구토, 설사, 및 이들 증상의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 개체는 인플루엔자 및 COVID-19 감염 사이에 흔한 하나 이상의 증상, 예컨대 발열, 오한, 기침, 숨가쁨 또는 호흡 곤란, 피로, 인후통, 콧물 또는 코막힘, 근육통 또는 몸살, 두통, 구토 및 설사를 가질 수 있으며, 이는 건강관리 제공자가 증상에 기초하여 인플루엔자 및 COVID-19를 구별하기 어렵게 만든다. 다른 실시양태에서, 개체는 COVID-19의 특징적인 증상을 가질 수 있지만, 전형적으로 인플루엔자 또는 RSV 감염에서는 관찰되지 않는 증상, 예컨대 후각 또는 미각 상실을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 테스트되는 샘플은 이전에 인플루엔자, RSV 또는 COVID-19로 진단된 개체로부터 수득된다. 일부 이러한 실시양태에서, 개체는 인플루엔자, RSV 또는 COVID-19의 재발에 대해 모니터링된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 위험 인자를 갖지 않는 건강한 개체의 일상적인 스크리닝에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 예를 들어 일상적 또는 예방적 케어 동안 무증상 개체를 스크리닝하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 임신 중이거나 임신을 시도 중인 여성을 스크리닝하는데 사용된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 환자에서 인플루엔자, RSV 또는 COVID-19 감염에 대한 치료 유효성을 평가하는데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 플루 A를 검출하기 위한 폴리머라제 산성 (PA) 유전자, 폴리머라제 염기성 2 (PB2) 유전자, 및/또는 매트릭스 단백질 (MP) 유전자의 용도가 제공된다. 일부 실시양태에서, 플루 B를 검출하기 위한 MP 및/또는 NS 유전자의 용도가 제공된다. 일부 실시양태에서, RSV를 검출하기 위한 RSV A 및/또는 RSV B 유전자의 용도가 제공된다. 일부 실시양태에서, SARS-CoV-2를 검출하기 위한 SARS-CoV-2E 및/또는 SARS-CoV-2 N2 유전자 및/또는 SARS CoV-2 RdRP 유전자의 용도가 제공된다. 일부 실시양태에서, 조류 플루를 검출하기 위한 조류 MP 인플루엔자 유전자의 용도가 또한 제공된다.
본원에 기재된 임의의 실시양태에서, 플루 A, 플루 B, RSV, 조류 및/또는 SARS-CoV-2 유전자는 샘플 프로세싱 대조군 (SPC)과 동일한 검정 반응에서 검출될 수 있다.
일부 실시양태에서, 대상체에서 플루 A, 플루 B, RSV, 조류 및/또는 SARS-CoV-2 유전자 감염의 검출을 용이하게 하는 방법이 제공된다. 이러한 방법은 대상체로부터의 샘플에서 플루 A PB2 유전자, 플루 A PA 유전자, 및/또는 플루 A MP 유전자의 존재 또는 부재를 검출하는 단계; 대상체로부터의 샘플에서 플루 B MP 및/또는 플루 B NS 유전자의 존재 또는 부재를 검출하는 단계; 대상체로부터의 샘플에서 RSV A 및/또는 RSV B 유전자의 존재 또는 부재를 결정하는 단계; 대상체로부터의 샘플에서 SARS-CoV-2E 및/또는 SARS-CoV-2 N2 및/또는 SARS CoV-2 RdRP 유전자의 존재 또는 부재를 결정하는 단계; 및/또는 대상체로부터의 샘플에서 조류 플루 유전자의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상체로부터의 샘플에서 플루 A, 플루 B, RSV, 조류 및/또는 SARS-CoV-2 유전자의 존재 또는 부재에 관한 정보는 의료 종사자에게 통신된다. 본원에서 사용된 바와 같은 "의료 종사자"은 환자를 진단 및/또는 치료하는 개체 또는 실체, 예컨대 병원, 클리닉, 내과의사 진료실, 내과의사, 간호사, 또는 앞서 언급된 임의의 실체 및 개체의 대리인을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 플루 A, 플루 B, RSV, 조류 및/또는 SARS-CoV-2 유전자의 존재 또는 부재를 검출하는 것은 의료 종사자 또는 의료 종사자의 대리인으로부터 대상체의 샘플을 받은 실험실에서 수행된다. 실험실은 본원에 기재된 것들을 포함하여 임의의 방법에 의해 검출을 수행한 후, 결과를 의료 종사자에게 통신한다. 의료 종사자에게 임의의 수단에 의해 결과가 제공되는 경우 본원에서 사용된 바와 같이 결과가 "통신"된다. 일부 실시양태에서, 이러한 통신은 구두 또는 서면일 수 있거나, 전화, 대면, 이메일, 우편 또는 기타 택배에 의해 이루어질 수 있거나, 정보를 예를 들어, 의료 종사자에 의해 제어되지 않는 데이터베이스를 포함하여 의료 종사자에 의해 액세스가능한 데이터베이스에 직접적으로 기탁함으로써 이루어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 정보는 전자 형태로 유지된다. 일부 실시양태에서, 정보는 메모리 또는 다른 컴퓨터 판독가능 매체, 예컨대 RAM, ROM, EEPROM, 플래시 메모리, 컴퓨터 칩, 디지털 비디오 디스크 (DVD), 컴팩트 디스크 (CD), 하드 디스크 드라이브 (HDD), 자기 테이프 등에 저장될 수 있다.
일부 실시양태에서, 플루 A, 플루 B, RSV, 조류 및/또는 SARS-CoV-2를 검출하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 플루 A, 플루 B, RSV, 조류 및/또는 SARS-CoV-2 감염을 진단하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법은 대상체로부터 샘플을 수득하는 단계 및 샘플에서 플루 A, 플루 B, RSV, 조류 및/또는 SARS-CoV-2 유전자의 검출을 위해 샘플을 실험실에 제공하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 샘플에서 플루 A, 플루 B, RSV, 조류 및/또는 SARS-CoV-2 유전자의 존재 또는 부재를 나타내는 실험실로부터의 통신을 수신하는 단계를 추가로 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같은 "실험실"은 본원에 기재된 방법을 포함하여 임의의 방법에 의해 샘플에서 표적 유전자를 검출하고 결과를 의료 종사자에게 통신하는 임의의 시설이다. 일부 실시양태에서, 실험실은 의료 종사자의 제어 하에 있다. 일부 실시양태에서, 실험실은 의료 종사자의 제어 하에 있지 않다.
실험실이 플루 A, 플루 B, RSV, 조류 및/또는 SARS-CoV-2 유전자의 존재 또는 부재를 검출한 결과를 의료 종사자에게 통신하는 경우, 일부 실시양태에서, 실험실은 플루 A, 플루 B, RSV, 조류 및/또는 SARS-CoV-2 유전자가 샘플에서 검출되었는지 여부를 나타낸다.
본원에서 사용된 바와 같이, 방법이 플루 A, 플루 B, RSV, 조류 및/또는 SARS-CoV-2를 검출하는 것; 플루 A, 플루 B, RSV, 조류 및/또는 SARS-CoV-2의 존재를 결정하는 것; 플루 A, 플루 B, RSV, 조류 및/또는 SARS-CoV-2에 대해 모니터링하는 것; 및/또는 플루 A, 플루 B, RSV, 조류 및/또는 SARS-CoV-2 감염을 진단하는 것과 관련된 경우, 방법은 방법의 단계를 수행하는 활동을 포함하지만, 결과는 플루 A, 플루 B, RSV, 조류 및/또는 SARS-CoV-2의 존재에 대해 음성이다. 즉, 플루 A, 플루 B, RSV, 조류 및/또는 SARS-CoV-2 감염을 검출, 결정, 모니터링 및 진단하는 것은 양성 또는 음성 결과를 초래하는 방법을 수행하는 예를 포함한다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 내인성 대조군 (예를 들어, SAC) 및/또는 적어도 하나의 외인성 대조군 (예를 들어, SPC)은 단일 반응에서 플루 A, 플루 B, RSV, 조류 및/또는 SARS-CoV-2 유전자와 동시에 검출된다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 외인성 대조군 (예를 들어, SPC)은 단일 반응에서 플루 A, 플루 B, RSV, 조류 및/또는 SARS-CoV-2 유전자와 동시에 검출된다.
5.2.2. 예시적인 대조군
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 검정은 플루 A, 플루 B, RSV, 조류 및/또는 SARS-CoV-2 유전자 및 적어도 하나의 내인성 대조군을 검출하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 내인성 대조군은 샘플 적절성 대조군 (SAC)이다. 일부 이러한 실시양태에서, 플루 A, 플루 B, RSV, 조류 및/또는 SARS-CoV-2 유전자 중 어느 것도 샘플에 없고 SAC가 또한 샘플에서 검출되지 않는 경우, 샘플이 불충분할 수 있기 때문에 검정 결과는 "무효"로 간주된다. 임의의 특정 이론에 얽매이려는 의도는 아니지만, 불충분한 샘플은 너무 희석되거나, 너무 적은 세포 물질을 함유하거나, 검정 억제제를 함유할 수 있거나, 기타일 수 있다. 일부 실시양태에서, SAC 검출 실패는 검정 반응이 실패하였음을 나타낼 수 있다. 일부 실시양태에서, 내인성 대조군은 RNA (예컨대 mRNA, tRNA, 리보솜 RNA 등)이다. 비제한적인 예시적인 내인성 대조군은 ABL mRNA, GUSB mRNA, GAPDH mRNA, TUBB mRNA, 및 UPK1a mRNA를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 검정은 플루 A, 플루 B, RSV, 조류 및/또는 SARS-CoV-2 유전자 및 적어도 하나의 외인성 대조군을 검출하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 외인성 대조군은 샘플 프로세싱 대조군이다 (SPC). 일부 이러한 실시양태에서, 예를 들어, PB2 유전자 및/또는 PA 유전자가 샘플에서 검출되지 않고 SPC가 또한 샘플에서 검출되지 않는 경우, 검정 실패를 포함하나 이에 제한되지는 않는 샘플 프로세싱 오류가 있을 수 있기 때문에 검정 결과는 "무효"로 간주된다. 비제한적인 예시적인 샘플 프로세싱 오류는 부적절한 샘플 프로세싱, 검정 억제제의 존재, 뉴클레아제 (예컨대 RNase)의 존재, 약화된 시약 등을 포함한다. 일부 실시양태에서, 외인성 대조군 (예컨대 SPC)이 샘플에 첨가된다. 일부 실시양태에서, 예컨대 하나 이상의 완충액 또는 시약을 사용하여 검정을 수행하는 동안 외인성 대조군 (예컨대 SPC)이 첨가된다. 일부 실시양태에서, 진엑스퍼트® 시스템이 사용될 때, SPC가 진엑스퍼트® 카트리지에 포함된다. 일부 실시양태에서, 외인성 대조군 (예컨대 SPC)은 박테리오파지 코트에 의해 보호되는 아머드® RNA이다.
일부 실시양태에서, 내인성 대조군 및/또는 외인성 대조군은 플루 A, 플루 B, RSV, 조류 및/또는 SARS-CoV-2 유전자의 검출과 동일한 검정에서와 같이 동시에 검출된다. 일부 실시양태에서, 검정은 동일한 검정 반응에서 동시에 플루 A, 플루 B, RSV, 조류 및/또는 SARS-CoV-2 유전자를 검출하기 위한 시약 및 외인성 대조군을 포함한다. 일부 이러한 실시양태에서, 예를 들어, 검정 반응은 플루 A, 플루 B, RSV, 조류 및/또는 SARS-CoV-2 유전자 각각을 증폭시키기 위한 프라이머 세트, 및 외인성 대조군을 증폭시키기 위한 프라이머 세트, 및 증폭 생성물을 검출하기 위한 표지된 프로브 (예컨대, 예를 들어, 태크맨® 프로브)을 포함한다.
5.2.3. 예시적인 샘플 제조
5.2.3.1. 예시적인 완충액
일부 실시양태에서, 완충액이 샘플에 첨가된다. 일부 실시양태에서, 완충액은 샘플이 수집된 시간의 1시간, 2시간, 3시간 또는 6시간 이내에 첨가된다. 일부 실시양태에서, 샘플이 본원에 기재된 방법에 의해 분석되기 전 1시간, 2시간, 3시간 또는 6시간 이내에 완충액이 샘플에 첨가된다.
일부 실시양태에서, 스왑 샘플이 완충액에 배치된다. 일부 실시양태에서, 스왑 샘플이 수집된 시간의 1시간, 2시간, 3시간 또는 6시간 이내에 스왑 샘플이 완충액에 배치된다. 일부 실시양태에서, 샘플이 본원에 기재된 방법에 의해 분석되기 전 1시간, 2시간, 3시간 또는 6시간 이내에 스왑 샘플이 완충액에 배치된다.
비제한적인 예시적인 상업용 완충액은 진엑스퍼트® 비인두 수집 키트와 함께 제공되는 바이러스 수송 배지 (세페이드, 미국 캘리포니아주 서니베일); 분자 검정에 최적화된 표본 수집 및 수송 장치 (e-NAT™, 코판(Copan), 미국 캘리포니아주 무리에타); 범용 수송 배지 (UTM™, 코판, 미국 캘리포니아주 무리에타); 범용 바이러스 수송 배지 (UVT, BD, 미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스); M4, M4RT, M5 및 M6 (써모 사이언티픽)을 포함한다. 추가의 비제한적인 예시적인 완충액은 액체 아미스(Amies) 배지, PBS/0.5% BSA, PBS/0.5% 젤라틴, 바텔 비라트랜스(Bartel BiraTrans)™ 배지, EMEM, PBS, EMEM/1% BSA, 수크로스 포스페이트, 트립티카제™ 대두 브로쓰 (0.5% 젤라틴 또는 0.5% BSA 함유 또는 비함유), 변형된 스튜어트 배지, 송아지고기 주입 브로쓰 (0.5% BSA 함유 또는 비함유), 및 염수를 포함한다. 카오트로픽제, 예컨대 구아니딘 티오시아네이트, 구아니딘 히드로클로라이드 및 구아니딘 이소티오네이트를 함유하는 완충액이 또한 사용될 수 있다. 이들 완충액은 임의로 하나 이상의 세제, 하나 이상의 환원제 및 하나 이상의 킬레이트제를 함유할 수 있다.
5.2.3.2. 예시적인 RNA 제조
표적 RNA는 임의의 적절한 방법에 의해 제조될 수 있다. 총 RNA는 문헌 [Wilkinson, M. (1988) Nucl. Acids Res. 16(22):10,933]; 및 [Wilkinson, M. (1988) Nucl. Acids Res. 16(22): 10934]에 제시된 프로토콜을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 방법에 의해, 또는 상업적으로 입수가능한 키트 또는 시약, 예컨대 TRIzol® 시약 (인비트로젠(Invitrogen)), 총 RNA 추출 키트 (인트론 바이오테크놀로지(iNtRON Biotechnology)), 총 RNA 정제 키트 (노르겐 바이오텍 코포레이션(Norgen Biotek Corp.)), RNAqueous™ (인비트로젠), MagMAX™ (어플라이드 바이오시스템스), RecoverAll™ (인비트로젠), RNAeasy (퀴아젠) 등을 사용함으로써 단리될 수 있다.
일부 실시양태에서, RNA 수준은 RNA가 먼저 세포로부터 정제되지 않은 샘플에서 측정된다. 일부 이러한 실시양태에서, 세포는 RNA를 방출하기 위한 용해 단계를 거친다. 비제한적인 예시적인 용해 방법은 초음파처리 (예를 들어, 2-15초 동안, 36 kHz에서 8-18 μm); 예를 들어 세제를 사용한 화학적 용해; 및 다양한 상업적으로 입수가능한 용해 시약 (예컨대 RNAeasy 용해 완충액, 퀴아젠)을 포함한다. 일부 실시양태에서, RNA 수준은 RNA가 단리된 샘플에서 측정된다.
일부 실시양태에서, RNA는 표적 RNA가 검출되기 전에 변형된다. 일부 실시양태에서, 샘플 내 모든 RNA는 변형된다. 일부 실시양태에서, 분석될 특정 표적 RNA만이 예를 들어 서열-특이적 방식으로 변형된다. 일부 실시양태에서, RNA는 역전사된다. 일부 이러한 실시양태에서, RNA는 특징, 예컨대 감소된 RNAse H 활성 및 증가된 진행성, 민감도, 및/또는 열안정성을 갖도록 조작된 역전사효소 효소, 예컨대 MMLV, AMV 또는 이의 변이체를 사용하여 역전사된다. MMLV 역전사효소를 사용하여 RNA를 역전사하기 위한 비제한적인 예시적인 조건은 40℃ 내지 50℃에서 5 내지 20분 동안의 인큐베이션을 포함한다.
표적 RNA가 역전사되는 경우, 표적 RNA의 DNA 상보체가 형성된다. 일부 실시양태에서, 표적 RNA 자체 (또는 RNA 자체의 DNA 카피)보다는 표적 RNA의 상보체가 검출된다. 그러므로, 본원에서 논의된 방법이 표적 RNA가 검출되거나 표적 RNA의 수준이 결정됨을 나타내는 경우, 이러한 검출 또는 결정은 표적 RNA 자체 대신에 또는 그에 더하여 표적 RNA의 상보체에 대해 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 RNA보다는 표적 RNA의 상보체가 검출되는 경우, 표적 RNA의 상보체에 상보적인 검출용 폴리뉴클레오티드가 사용된다. 일부 이러한 실시양태에서, 검출용 폴리뉴클레오티드는 표적 RNA와 서열이 동일한 부분을 적어도 포함하지만, 우리딘 대신에 티미딘을 함유할 수 있고/거나 다른 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
5.2.4. 예시적인 분석적 방법
상기 기재된 바와 같이, SARS-CoV-2, 인플루엔자 및 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV)를 검출하기 위한 방법이 제시된다. 일부 실시양태에서, 방법은 대상체로부터의 샘플에서 플루 A 폴리머라제 염기성 2 (PB2) 유전자, 폴리머라제 산성 (PA) 유전자, 플루 A 매트릭스 단백질 (MP) 유전자, 및/또는 조류 인플루엔자 MP 유전자의 존재를 검출하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 플루 B 비구조적 단백질 (NS) 유전자 및/또는 플루 B 매트릭스 단백질 (MP) 유전자의 존재를 검출하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 RSV A 게놈 및/또는 RSV B 게놈의 존재를 검출하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 SARS-CoV-2 E 및/또는 SARS-CoV-2 N2 및/또는 SARS-CoV-2 RdRP 유전자의 존재를 검출하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 임의로 적어도 하나의 외인성 대조군 (예컨대 SPC)의 존재를 검출하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 플루 A 폴리머라제 염기성 2 (PB2) 유전자, 폴리머라제 산성 (PA) 유전자, 플루 A 매트릭스 단백질 (MP) 유전자, 플루 B 비구조적 단백질 (NS) 유전자, 플루 B 매트릭스 단백질 (MP) 유전자, 및 조류 매트릭스 단백질 (MP) 유전자로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 검출은 검정에서 내인성 대조군 및/또는 외인성 대조군이 검출되지 않더라도 인플루엔자의 존재를 나타낸다. 일부 실시양태에서, RSV A 또는 RSV B의 검출은 검정에서 내인성 대조군 및/또는 외인성 대조군이 검출되지 않더라도 RSV의 존재를 나타낸다. 일부 실시양태에서, SARS-CoV-2 E 및/또는 SARS-CoV-2 N2 및/또는 SARS-CoV 2 RdRP의 검출은 검정에서 내인성 대조군 및/또는 외인성 대조군이 검출되지 않더라도 SARS-CoV-2의 존재를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 플루 A 또는 B 표적 유전자 (예컨대 플루 A 폴리머라제 염기성 2 (PB2) 유전자, 폴리머라제 산성 (PA) 유전자, 플루 A 매트릭스 단백질 (MP) 유전자, 플루 B 매트릭스 단백질 (MP) 유전자, 플루 B 비구조적 단백질 (NS) 유전자, 및 조류 인플루엔자 매트릭스 단백질 (MP) 유전자) 중 어느 것도 검출되지 않는 경우, 대조군이 검출된 경우에만 결과는 인플루엔자에 대해 음성인 것으로 간주된다. 일부 실시양태에서, RSV 표적 유전자 중 어느 것도 검출되지 않는 경우, 대조군이 검출된 경우에만 결과는 RSV에 대해 음성인 것으로 간주된다. 일부 실시양태에서, SARS-CoV-2 표적 유전자 중 어느 것도 검출되지 않는 경우, 대조군이 검출된 경우에만 결과는 SARS-CoV-2에 대해 음성인 것으로 간주된다.
일부 실시양태에서, 샘플에서 3개의 표적 유전자, SARS-CoV-2 E 또는 SARS-CoV-2 N2 또는 SARS-CoV 2 RdRP 중 임의의 하나, 임의의 2개 또는 3개 모두의 검출은 SARS-CoV-2의 존재를 나타낸다. SARS-CoV-2의 대규모 지속적인 사람-대-사람 전파는 PCR 검정의 민감도 및 특이성에 영향을 미치는 것으로 나타난 많은 돌연변이 사건으로 이어졌다. 검정에서 사용된 임의의 프라이머 또는 프로브에 대한 결합 부위의 돌연변이는 해당 표적의 검출 손실 및 잠재적으로 가음성 결과를 초래할 수 있다. E 및 N 유전자 이내를 포함하여 SARS-CoV-2의 게놈 전체에 걸쳐 돌연변이가 보고되었다 (문헌 [Plante et al. Cell Host Microbe.　2021 Apr 14; 29(4): 508-515], [Ziegler et al. Euro Surveill. 2020;25(39)] 및 [Hasan et al. J Clin Microbiol 59:e03278-20]). 다중 표적 및 중복 프라이머 및 또는 프로브의 사용은 임의의 단일 돌연변이의 영향을 경감시킨다. 표적 중 하나는 검출되지 않지만 제2 또는 제3 표적이 검출되는 경우, 이는 양성 또는 추정 양성 결과로서 해석될 수 있다.
표적 유전자의 특이적 검출을 허용할 수 있는 임의의 분석적 절차는 본원에 제시된 방법에서 사용될 수 있다. 예시적인 비제한적인 분석적 절차는 핵산 증폭 방법, PCR 방법, 등온적 증폭 방법, 및 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 기타 분석적 검출 방법을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 표적 유전자를 검출하는 방법은 유전자 및/또는 이의 상보체를 증폭시키는 것을 포함한다. 이러한 증폭은 임의의 방법에 의해 성취될 수 있다. 예시적인 방법은 등온적 증폭, 실시간 RT-PCR, 종점 RT-PCR, 및 임플렌(Implen) (독일)에서 입수가능한 센스앰프 플러스(SenseAmp Plus)™ 키트에 의해 제공되는 것과 같은 DNA에 어닐링된 T7 프로모터로부터의 T7 폴리머라제를 사용한 증폭을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
표적 유전자가 증폭되는 경우, 일부 실시양태에서, 표적 유전자의 앰플리콘이 형성된다. 앰플리콘은 단일 가닥 또는 이중-가닥일 수 있다. 일부 실시양태에서, 앰플리콘이 단일-가닥인 경우, 앰플리콘의 서열은 센스 또는 안티센스 배향으로 표적 유전자와 관련된다. 일부 실시양태에서, 표적 유전자 자체보다는 표적 유전자의 앰플리콘이 검출된다. 그러므로, 본원에서 논의된 방법이 표적 유전자가 검출됨을 나타내는 경우, 이러한 검출은 표적 유전자 자체 대신에 또는 그에 더하여 표적 유전자의 앰플리콘에 대해 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 유전자보다는 표적 유전자의 앰플리콘이 검출되는 경우, 표적 유전자의 상보체에 상보적인 검출용 폴리뉴클레오티드가 사용된다. 일부 실시양태에서, 표적 유전자보다는 표적 유전자의 앰플리콘이 검출되는 경우, 표적 유전자에 상보적인 검출용 폴리뉴클레오티드가 사용된다. 또한, 일부 실시양태에서, 검출용 다중 폴리뉴클레오티드가 사용될 수 있고, 일부 폴리뉴클레오티드는 표적 유전자에 상보적일 수 있고, 일부 폴리뉴클레오티드는 표적 유전자의 상보체에 상보적일 수 있다.
일부 실시양태에서, 표적 유전자를 검출하는 방법은 하기 기재된 바와 같이 PCR을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 표적 유전자를 검출하는 것은 임의의 방법에 의해 성취될 수 있는 PCR 반응의 실시간 모니터링을 포함한다. 이러한 방법은 태크맨(TAQMAN)®, 분자 비콘 또는 스콜피온 프로브 (즉, 에너지 전달 (ET) 프로브, 예컨대 FRET 프로브)의 사용 및 인터칼레이팅 염료, 예컨대 SYBR 그린, 에바그린(EvaGreen), 티아졸 오렌지, YO-PRO, TO-PRO 등의 사용을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
표적 RNA로부터 역전사된 cDNA를 증폭시키기 위한 비제한적인 예시적인 조건은 하기와 같다. 예시적인 사이클은 90℃ 내지 100℃에서 20초 내지 5분 동안 초기 변성, 이어서 90℃ 내지 100℃에서 1 내지 10초 동안 변성, 이어서 60℃ 내지 75℃에서 10 내지 40초 동안 어닐링 및 증폭을 포함하는 사이클링을 포함한다. 추가의 예시적인 사이클은 94℃에서 20초, 이어서 95℃에서 1초, 62℃에서 35초의 최대 3 사이클, 95℃에서 1초, 62℃에서 20초의 20 사이클, 및 95℃에서 1초, 62℃에서 35초의 14 사이클을 포함한다. 일부 실시양태에서, 초기 변성 단계 이후의 제1 사이클에 대해, 사이클 변성 단계는 생략된다. 일부 실시양태에서, Taq 폴리머라제가 증폭을 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 사이클은 적어도 10회, 적어도 15회, 적어도 20회, 적어도 25회, 적어도 30회, 적어도 35회, 적어도 40회 또는 적어도 45회 수행된다. 일부 실시양태에서, 핫 스타트 기능을 갖는 Taq가 사용된다. 일부 실시양태에서, 증폭 반응은 진엑스퍼트® 카트리지에서 발생하고, 표적 유전자 및 외인성 대조군의 증폭은 동일한 반응에서 발생한다. 일부 실시양태에서, 표적 유전자의 검출은 초기 변성으로부터 마지막 연장까지 3시간 미만, 2.5시간 미만, 2시간 미만, 1시간 미만, 45분 미만, 40분 미만, 35분 미만, 또는 30분 미만에 발생한다.
일부 실시양태에서, 표적 유전자의 검출은 표적 유전자 또는 이의 상보체에 상보적인 폴리뉴클레오티드, 및 표적 유전자, 표적 유전자의 DNA 앰플리콘 및 표적 유전자의 상보체로부터 선택된 핵산을 포함하는 복합체를 형성하는 것을 포함한다. 그러므로, 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 표적 유전자와 복합체를 형성한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 표적 RNA의 상보체, 예컨대 표적 RNA로부터 역전사된 cDNA와 복합체를 형성한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 표적 유전자의 DNA 앰플리콘과 복합체를 형성한다. 이중-가닥 DNA 앰플리콘이 복합체의 일부인 경우, 본원에서 사용된 바와 같이 복합체는 DNA 앰플리콘의 한 가닥 또는 두 가닥 모두를 포함할 수 있다. 그러므로, 일부 실시양태에서, 복합체는 DNA 앰플리콘의 한 가닥만을 포함한다. 일부 실시양태에서, 복합체는 삼중체이고, 폴리뉴클레오티드 및 DNA 앰플리콘의 두 가닥 모두를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복합체는 폴리뉴클레오티드 및 표적 유전자, 표적 유전자의 상보체 또는 표적 유전자의 DNA 앰플리콘 사이의 혼성화에 의해 형성된다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 프라이머 또는 프로브이다.
일부 실시양태에서, 방법은 복합체를 검출하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 복합체는 검출 당시에 회합될 필요가 없다. 즉, 일부 실시양태에서, 복합체가 형성된 후, 복합체는 일부 방식으로 해리 또는 파괴되고, 복합체로부터의 구성성분이 검출된다. 이러한 시스템의 예는 태크맨® 검정이다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드가 프라이머인 경우, 복합체의 검출은 표적 유전자, 표적 유전자의 상보체 또는 표적 유전자의 DNA 앰플리콘의 증폭을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서 본원에 제시된 방법에서 적어도 하나의 표적 유전자를 검출하는데 사용되는 분석적 방법은 실시간 정량적 PCR을 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 표적 유전자를 검출하는데 사용되는 분석적 방법은 태크맨® 프로브의 사용을 포함한다. 검정은 합성된 PCR 생성물을 검출 및 정량하기 위해 에너지 전달 ("ET"), 예컨대 형광 공명 에너지 전달 ("FRET")을 사용한다. 전형적으로, 태크맨® 프로브는 5'-말단에 커플링된 형광 염료 분자 및 3'-말단에 커플링된 켄쳐 분자를 포함하여, 염료 및 켄쳐가 매우 근접하여 켄쳐가 FRET를 통해 염료의 형광 신호를 저해하는 것을 허용한다. 폴리머라제가 태크맨® 프로브가 결합된 키메라 앰플리콘 주형을 복제하는 경우, 폴리머라제의 5'-뉴클레아제가 프로브를 절단하여 염료 및 켄쳐를 탈커플링하여 염료 신호 (예컨대 형광)가 검출되도록 한다. 신호 (예컨대 형광)는 절단되는 프로브의 양에 비례하여 각 PCR 사이클에서 증가한다.
일부 실시양태에서, PCR 사이클링 동안 태크맨® 프로브로부터 임의의 신호가 생성되는 경우 표적 유전자가 검출되는 것으로 간주된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, PCR이 40 사이클을 포함하는 경우, 증폭 동안 임의의 사이클에서 신호가 생성되면, 표적 유전자가 존재하고 검출되는 것으로 간주된다. 일부 실시양태에서, PCR 사이클링의 종료까지 신호가 생성되지 않으면, 표적 유전자가 부재하고 검출되지 않은 것으로 간주된다.
일부 실시양태에서, 실시간 PCR 검정 결과의 정량은 공지된 농도의 핵산으로부터 표준 곡선을 구축한 후 공지되지 않은 농도의 표적 유전자에 대한 정량적 정보를 외삽함으로써 수행된다. 일부 실시양태에서, 표준 곡선을 생성하는데 사용되는 핵산은 DNA (예를 들어, 내인성 대조군 또는 외인성 대조군)이다. 일부 실시양태에서, 표준 곡선을 생성하는데 사용되는 핵산은 정제된 이중-가닥 플라스미드 DNA 또는 시험관내에서 생성된 단일-가닥 DNA이다.
일부 실시양태에서, 플루가 샘플에 존재하지 않는다는 것을 검정이 나타내기 위해, 내인성 대조군 (예컨대 SAC) 및/또는 외인성 대조군 (예컨대 SPC)에 대한 Ct 값은 이전에 결정된 유효 범위 내에 있어야 한다. 즉, 일부 실시양태에서, 대조군이 검출되지 않는 한 플루의 부재는 확인될 수 없으며, 이는 검정이 성공적임을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 검정은 외인성 대조군을 포함한다. Ct 값은 샘플 내 핵산 표적의 양에 반비례한다.
일부 실시양태에서, 그 미만에서 유전자가 검출되는 것으로 간주되는 표적 유전자 (내인성 대조군 및/또는 외인성 대조군 포함)에 대한 역치 Ct (또는 "컷오프 Ct") 값은 이전에 결정되었다. 일부 실시양태에서, 역치 Ct는 샘플이 테스트될 실질적으로 동일한 검정 조건 및 시스템 (예컨대 진엑스퍼트®)을 사용하여 결정된다.
태크맨® 검정 외에도, 본원에 제시된 방법에서 PCR 생성물을 검출 및 정량하는데 유용한 다른 실시간 PCR 화학은 분자 비콘, 스콜피온 프로브 및 인터칼레이팅 염료, 예컨대 SYBR 그린, 에바그린, 티아졸 오렌지, YO-PRO, TO-PRO 등을 포함하나 이에 제한되지는 않으며, 이는 하기 논의된다.
다양한 실시양태에서, 단일 멀티플렉스 반응에서 플루 표적 유전자 및 임의로 하나 이상의 RSV 표적 유전자, 내인성 대조군 및 외인성 대조군을 검출하기 위해 실시간 PCR 검출이 활용된다. 일부 멀티플렉스 실시양태에서, 각각 상이한 표적에 대해 특이적인 복수의 프로브, 예컨대 태크맨® 프로브가 사용된다. 일부 실시양태에서, 각 표적 유전자-특이적 프로브는 동일한 멀티플렉스 반응에서 사용되는 다른 프로브와 분광적으로 구별가능하다. 비제한적인 예시적인 7-색상 멀티플렉스 시스템은 예를 들어 문헌 [Lee et al., BioTechniques, 27: 342-349]에 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, 실시간 RT PCR 생성물의 정량은 이중-가닥 DNA 생성물에 결합하는 염료, 예컨대 SYBR 그린, 에바그린, 티아졸 오렌지, YO-PRO, TO-PRO 등을 사용하여 성취된다. 일부 실시양태에서, 검정은 퀴아젠으로부터의 QuantiTect SYBR® 그린 PCR 검정이다. 이 검정에서, 총 RNA는 먼저 샘플로부터 단리된다. 총 RNA는 후속적으로 3'-말단에서 폴리아데닐화되고, 5'-말단에서 폴리-dT를 갖는 범용 프라이머를 사용하여 역전사된다. 일부 실시양태에서, 단일 역전사 반응은 다중 표적 RNA를 검정하는데 충분하다. 그 후, 실시간 RT-PCR은 5'-말단에 폴리-dT 서열을 포함하는 miScript 범용 프라이머 및 표적 RNA-특이적 프라이머를 사용하여 성취된다. SYBR 그린 염료는 이중-가닥 DNA에 비특이적으로 결합하여 여기 시 빛을 방출한다. 일부 실시양태에서, PCR 주형에 대한 프라이머의 고도로-특이적인 어닐링을 촉진하는 완충액 조건 (예를 들어, 퀴아젠으로부터의 QuantiTect SYBR® 그린 PCR 키트에서 이용가능함)은 SYBR 그린에 결합하여 정량에 부정적인 영향을 미치는 비특이적 DNA 이중체 및 프라이머 이량체의 형성을 회피하는데 사용될 수 있다. 그러므로, PCR 생성물이 축적될수록, SYBR 그린으로부터의 신호가 증가하여 특이적 생성물의 정량을 허용한다.
실시간 PCR은 관련 기술분야에서 이용가능한 임의의 PCR 기구를 사용하여 수행된다. 전형적으로, 실시간 PCR 데이터 수집 및 분석에서 사용되는 기구는 열 사이클러, 형광 여기 및 방출 수집용 광학 장치, 및 임의로 컴퓨터 및 데이터 획득 및 분석 소프트웨어를 포함한다.
일부 실시양태에서, 실시간 PCR 생성물의 검출 및/또는 정량은 이중-가닥 DNA 생성물에 결합하는 염료, 예컨대 SYBR 그린, 에바그린, 티아졸 오렌지, YO-PRO, TO-PRO 등을 사용하여 성취된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에서 사용되는 분석적 방법은 DASL® (DNA-매개 어닐링, 선택, 연장 및 라이게이션) 검정이다. 일부 실시양태에서, 총 RNA는 임의의 방법에 의해 분석될 샘플로부터 단리된다. 그 후, 총 RNA는 폴리아데닐화될 수 있다 (> 18 A 잔기가 반응 혼합물에서 RNA의 3'-말단에 첨가됨). RNA는 5'에서 3' 말단으로 샘플 RNA의 폴리-dA 꼬리에 결합하는 폴리-dT 영역 및 PCR 프라이머 부위를 포함하는 서열을 포함하는 비오틴-표지된 DNA 프라이머를 사용하여 역전사된다. 그 후, 생성된 비오틴화된 cDNA 전사체는 비오틴-스트렙타비딘 상호작용을 통해 고체 지지체에 혼성화되고, 하나 이상의 표적 RNA-특이적 폴리뉴클레오티드와 접촉된다. 표적 RNA-특이적 폴리뉴클레오티드는 5'-말단에서 3'-말단으로 PCR 프라이머 부위를 포함하는 영역, 어드레스 서열을 포함하는 영역, 및 표적 RNA-특이적 서열을 포함한다.
일부 DASL® 실시양태에서, 표적 RNA-특이적 서열은 표적 RNA, 내인성 대조군 RNA 또는 외인성 대조군 RNA의 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개의 인접 뉴클레오티드와 동일한 또는 상보적인 서열을 갖는 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개의 인접 뉴클레오티드를 포함한다.
혼성화 후, 표적 RNA-특이적 폴리뉴클레오티드가 연장된 다음, 연장된 생성물이 고정화된 cDNA 어레이로부터 용리된다. 형광-표지된 범용 프라이머를 사용한 제2 PCR 반응은 표적 RNA-특이적 서열을 포함하는 형광-표지된 DNA를 생성한다. 그 후, 표지된 PCR 생성물은 검출 및 정량을 위해 마이크로비드 어레이에 혼성화된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에서 표적 유전자를 검출 및 정량화하는데 사용되는 분석적 방법은 비드-기반 유동 세포계측 검정이다. 문헌 [Lu J. et al. (2005) Nature 435:834-838]을 참조하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 비드-기반 유동 세포계측 검정의 예는 루미넥스, 인크.(Luminex, Inc.)의 xMAP® 기술이다. luminexcorp.com을 참조한다. 일부 실시양태에서, 총 RNA는 샘플로부터 단리된 후 비오틴으로 표지된다. 그 후, 표지된 RNA는 각각 상이한 형광 세기를 갖는 2개의 염료로 표지된 마이크로비드에 공유결합으로 결합된 표적 RNA-특이적 포획 프로브 (예를 들어, luminexcorp.com에서 루미넥스, 인크.에 의해 판매되는 FlexmiR™ 제품)에 혼성화된다. 스트렙타비딘-결합 리포터 분자 (예를 들어, "SAPE"로도 공지된 스트렙타비딘-피코에리트린)는 포획된 표적 RNA에 부착되고, 각 비드의 고유한 신호는 유동 세포계측을 사용하여 판독된다. 일부 실시양태에서, RNA 샘플은 먼저 폴리아데닐화되고, 후속적으로 샘플 RNA의 폴리-dA 꼬리의 3'-말단 및 비오틴화된 덴드리머에 부착된 폴리뉴클레오티드의 5'-말단에 상보적인 가교 폴리뉴클레오티드를 사용하여 비오틴화된 3DNA™ 덴드리머 (즉, 수많은 비오틴 분자가 결합된 다중-아암 DNA)로 표지된다. 그 후, 스트렙타비딘-결합 리포터 분자는 유동 세포계측에 의한 분석 전에 비오틴화된 덴드리머에 부착된다. 일부 실시양태에서, 비오틴-표지된 RNA는 먼저 SAPE에 노출되고, RNA/SAPE 복합체는 후속적으로 900개만큼 많은 비오틴 분자에 결합될 수 있는 DNA 덴드리머에 부착된 항-피코에리트린 항체에 노출된다. 이는 다중 SAPE 분자가 비오틴-스트렙타비딘 상호작용을 통해 비오틴화된 덴드리머에 결합하는 것을 허용하며, 그러므로 검정으로부터의 신호를 증가시킨다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에서 적어도 하나의 표적 유전자의 수준을 검출 및 정량화하는데 사용되는 분석적 방법은 겔 전기영동 및 표지된 프로브 (예를 들어, 방사성 또는 화학발광 표지로 표지된 프로브)를 사용한 검출, 예컨대 노던 블롯팅에 의한 것이다. 일부 실시양태에서, 총 RNA는 샘플로부터 단리된 후, SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 크기-분리된다. 그 후, 분리된 RNA는 멤브레인에 블롯팅된 후, 방사성표지된 상보적 프로브에 혼성화된다. 일부 실시양태에서, 예시적인 프로브는 데옥시리보스 또는 리보스 당 대신 바이시클릭 당 모이어티를 함유하는 잠긴 핵산 ("LNA") 유사체와 같이 하기 논의된 바와 같은 하나 이상의 친화성-향상 뉴클레오티드 유사체를 함유한다. 예를 들어, 문헌 [Varallyay, E. et al. (2008) Nature Protocols 3(2):190-196]을 참조하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 표적 유전자의 검출 및 정량화는 미세유체 장치 및 단일-분자 검출을 사용하여 성취된다. 일부 실시양태에서, 단리된 총 RNA의 샘플 내 표적 RNA는 2개의 프로브에 혼성화되며, 이들 중 하나는 표적 RNA의 5'-말단에서 핵산에 상보적이고, 이들 중 두번째는 표적 RNA의 3'-말단에 상보적이다. 일부 실시양태에서, 각 프로브는 하나 이상의 친화성-향상 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 LNA 뉴클레오티드 유사체를 포함하고, 각각은 상이한 형광 방출 스펙트럼을 갖는 상이한 형광 염료 (즉, 검출가능하게 상이한 염료)로 표지된다. 그 후, 샘플은 다중 레이저가 형광 프로브를 여기시키는 미세유체 모세관을 통해 유동되므로, 고유한 일치하는 광자 버스트가 특정 표적 RNA를 식별하고, 특정 고유한 일치하는 광자 버스트의 수를 계수하여 샘플 내 표적 RNA의 양을 정량화할 수 있다. 일부 대안적 실시양태에서, 표적 RNA-특이적 프로브는 예를 들어, 형광단, 전자 스핀 표지 등으로부터 선택된 3개 이상의 독특한 표지로 표지된 후 RNA 샘플에 혼성화될 수 있다.
임의로, 샘플 RNA는 혼성화 전에 변형된다. 그 후, 표적 RNA/프로브 이중체는 미세유체 장치의 채널을 통해 통과되며, 3개의 표지의 고유한 신호를 기록하는 검출기를 포함한다. 이러한 방식으로, 개별 분자는 이들의 고유한 신호에 의해 검출되고 계수된다. 예를 들어, 미국 특허 번호 7,402,422 및 7,351,538 (Fuchs et al., U.S. Genomics, Inc.)을 참조하며, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
5.2.5. 예시적인 자동화 및 시스템
일부 실시양태에서, 유전자 발현은 자동화된 샘플 취급 및/또는 분석 플랫폼을 사용하여 검출된다. 일부 실시양태에서, 상업적으로 입수가능한 자동화된 분석 플랫폼이 활용된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 진엑스퍼트® 시스템 (세페이드, 미국 캘리포니아주 서니베일)이 활용된다.
본 발명은 진엑스퍼트® 시스템과 함께 사용하기 위해 예시된다. 예시적인 샘플 제조 및 분석 방법은 하기 기재되어 있다. 그러나, 본 발명은 특정 검출 방법 또는 분석 플랫폼에 제한되지 않는다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 임의의 수의 플랫폼 및 방법이 활용될 수 있음을 인식한다.
진엑스퍼트®는 독립적 일회용 카트리지를 활용한다. 샘플 추출, 증폭 및 검출은 모두 이러한 독립적 "카트리지 내의 실험실" 내에서 수행될 수 있다. (예를 들어, 미국 특허 5,958,349, 6,403,037, 6,440,725, 6,783,736, 6,818,185 참조; 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.)
카트리지의 구성성분은 표적 핵산을 추출, 정제 및 증폭시키는데 유용한 시약, 필터 및 포획 기술을 함유하는 프로세싱 챔버를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 밸브는 챔버로부터 챔버로의 유체 전달을 가능하게 하고, 핵산 용해 및 여과 구성성분을 함유한다. 광학 창은 실시간 광학 검출을 가능하게 한다. 반응 튜브는 매우 신속한 열 사이클링을 가능하게 한다.
일부 실시양태에서, 진엑스퍼트® 시스템은 확장성을 위한 복수의 모듈을 포함한다. 각 모듈은 샘플 취급 및 분석 구성성분과 함께 복수의 카트리지를 포함한다.
샘플이 카트리지에 첨가된 후, 샘플은 용해 완충액과 접촉되고, 방출된 핵산 (NA)은 NA-결합 기판, 예컨대 실리카 또는 유리 기판에 결합된다. 그 후, 샘플 상청액이 제거되고, NA는 용리 완충액, 예컨대 Tris/EDTA 완충액에서 용리된다. 그 후, 용리액은 카트리지에서 프로세싱되어 본원에 기재된 바와 같은 표적 유전자를 검출할 수 있다. 일부 실시양태에서, 용리액은 동결건조된 입자로서 카트리지에 존재하는 PCR 시약의 적어도 일부를 재구성하는데 사용된다.
일부 실시양태에서, RT-PCR은 표적 유전자의 존재를 증폭 및 분석하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 역전사는 MMLV RT 효소 및 40℃ 내지 50℃에서 5 내지 20분의 인큐베이션을 사용한다. 일부 실시양태에서, PCR은 핫 스타트 기능을 갖는 Taq 폴리머라제, 예컨대 AptaTaq (로슈)를 사용한다. 일부 실시양태에서, 초기 변성은 90℃ 내지 100℃에서 20초 내지 5분 동안이고; 사이클링 변성 온도는 1 내지 10초 동안 90℃ 내지 100℃이고; 사이클링 어닐링 및 증폭 온도는 10 내지 40초 동안 60℃ 내지 75℃이고; 최대 50 사이클이 수행된다.
일부 실시양태에서, 이중-변성 방법은 낮은 카피 수 표적을 증폭시키는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 이중-변성 방법은 제1 변성 단계에 이어서, 표적 유전자를 검출하기 위한 프라이머 및/또는 프로브의 첨가를 포함한다. 그 후, 핵산-함유 샘플 (예컨대 DNA 용리액)의 전부 또는 상당 부분은 일부 예에서 샘플의 일부가 표적 유전자의 사이클링 및 검출을 위해 분취되기 전에 두 번째로 변성된다. 임의의 특정 이론에 얽매이려는 의도는 아니지만, 이중-변성 프로토콜은 사이클링을 위해 분취액이 선택되기 전에 제2 변성이 표적의 수를 효과적으로 배가하기 때문에 (즉, 이는 표적 및 그의 상보체를 2개의 별도의 주형으로 분리함) 낮은 카피 수의 표적 유전자 (또는 그의 상보체)가 사이클링 및 검출을 위해 선택된 분취액에 존재할 가능성을 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 변성 단계는 총 30초 내지 5분의 시간 동안 90℃ 내지 100℃의 온도로 가열하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 변성 단계는 총 5초 내지 3분의 시간 동안 90℃ 내지 100℃의 온도로 가열하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 변성 단계 및/또는 제2 변성 단계는 샘플의 분취액을 별도로 가열함으로써 수행된다. 일부 실시양태에서, 각 분취액은 상기 나열된 시간 동안 가열될 수 있다. 비제한적인 예로서, NA-함유 샘플 (예컨대 DNA 용리액)에 대한 제1 변성 단계는 샘플의 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개 또는 적어도 4개의 분취액을 별도로 (순차적으로 또는 동시에) 각각 60초 동안 90℃ 내지 100℃의 온도로 가열하는 것을 포함할 수 있다. 비제한적인 예로서, 효소, 프라이머 및 프로브를 함유하는 NA-함유 샘플 (예컨대 DNA 용리액)에 대한 제2 변성 단계는 용리액의 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개 또는 적어도 4개의 분취액을 별도로 (순차적으로 또는 동시에) 각각 5초 동안 90℃ 내지 100℃의 온도로 가열하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 분취액은 전체 NA-함유 샘플 (예컨대 DNA 용리액)이다. 일부 실시양태에서, 분취액은 전체 NA-함유 샘플 (예컨대 DNA 용리액)보다 적다.
일부 실시양태에서, NA-함유 샘플, 예컨대 DNA 용리액 내의 표적 유전자는 하기 프로토콜을 사용하여 검출된다: NA-함유 샘플의 하나 이상의 분취액을 각각 60초 동안 95℃로 별도로 가열한다. 효소 및 프라이머 및 프로브를 NA-함유 샘플에 첨가하고, 하나 이상의 분취액을 각각 5초 동안 95℃로 별도로 가열한다. 그 후, 효소, 프라이머 및 프로브를 함유하는 NA-함유 샘플의 적어도 하나의 분취액을 60초 동안 94℃로 가열한다. 그 후, 분취액을 하기 2-단계 사이클로 45회 사이클링한다: (1) 5초 동안 94℃, (2) 30초 동안 66℃.
본 발명은 특정 프라이머 및/또는 프로브 서열에 제한되지 않는다. 예시적인 증폭 프라이머 및 검출 프로브는 실시예에 기재되어 있고 표 A에 나타낸다.
일부 실시양태에서, 예를 들어, 낮은 세포 함량을 갖는 샘플에 대해 오프라인 원심분리를 사용한다. 완충액이 첨가되거나 첨가되지 않은 샘플을 원심분리하고, 상청액을 제거한다. 그 후, 펠릿을 더 작은 부피의 상청액 또는 완충액에 재현탁한다. 그 후, 재현탁된 펠릿을 본원에 기재된 바와 같이 분석한다.
5.2.6. 예시적인 데이터 분석
일부 실시양태에서, 플루, RSV 및/또는 SARS-CoV-2의 존재는 플루, RSV 또는 SARS-CoV-2 표적 유전자 (예컨대 PA, PB2, MP, NS, RSV A, RSV B, SARS-CoV-2 E 및 SARS-CoV-2 N2) 중 어느 하나에 대한 Ct 값이 특정 역치 미만인 경우 검출된다. 일부 실시양태에서, Ct 값의 유효 범위는 40 사이클 미만이다. 일부 실시양태에서, Ct 값의 유효 범위는 12 내지 39.9 Ct이다. 일부 이러한 실시양태에서, 40 사이클 후에 플루-특이적 프라이머로부터 배경 초과의 증폭이 관찰되지 않는 경우, 샘플은 플루에 대해 음성인 것으로 간주된다. 일부 이러한 실시양태에서, 외인성 대조군 (SPC)의 증폭이 배경 초과인 경우에만 샘플은 플루에 대해 음성인 것으로 간주된다.
일부 실시양태에서, 컴퓨터-기반 분석 프로그램은 검출 검정에 의해 생성된 원시 데이터를 임상의를 위한 예측 값의 데이터로 번역하는데 사용된다. 임상의는 임의의 적합한 수단을 사용하여 예측 데이터를 액세스할 수 있다. 그러므로, 일부 실시양태에서, 본 발명은 유전학 또는 분자 생물학에 대해 훈련을 받지 않았을 가능성이 있는 임상의가 원시 데이터를 이해할 필요가 없다는 추가 이점을 제공한다. 데이터는 그의 가장 유용한 형태로 임상의에게 직접적으로 제시된다. 그 후, 임상의는 대상체의 케어를 최적화하기 위해 정보를 즉시 활용할 수 있다.
본 발명은 검정을 수행하는 실험실로 및 실험실로부터 정보를 수신, 프로세싱 및 전파하고, 의료 개인 및 대상체에게 정보를 제공할 수 있는 임의의 방법을 고려한다. 예를 들어, 본 발명의 일부 실시양태에서, 샘플 (예를 들어, 생검 또는 혈청 또는 소변 샘플)을 대상체로부터 수득하고, 세계의 임의의 부분 (예를 들어, 대상체가 거주하는 국가 또는 정보가 궁극적으로 사용되는 국가와 상이한 국가)에 위치된 프로파일링 서비스 (예를 들어, 의료 시설의 임상 실험실, 게놈 프로파일링 비즈니스 등)에 제출하여 원시 데이터를 생성한다. 샘플이 조직 또는 다른 생물학적 샘플을 포함하는 경우, 대상체는 의료 센터를 방문하여 샘플을 수득하고 프로파일링 센터로 보낼 수 있거나, 대상체가 직접적으로 샘플 (예를 들어, 소변 샘플 또는 가래 샘플)을 수집하고 이를 직접적으로 프로파일링 센터로 보낼 수 있다. 샘플이 이전에 결정된 생물학적 정보를 포함하는 경우, 정보는 대상체가 프로파일링 서비스로 직접적으로 보낼 수 있다 (예를 들어, 정보를 함유하는 정보 카드는 컴퓨터에 의해 스캔되고, 데이터는 전자 통신 시스템을 사용하여 프로파일링 센터의 컴퓨터로 전파될 수 있음). 프로파일링 서비스에 의해 수신되면, 샘플이 프로세싱되고, 대상체에 대해 원하는 진단 또는 예후 정보에 특이적인 프로파일이 생성된다 (즉, 발현 데이터).
그 후, 프로파일 데이터는 치료하는 임상의에 의한 해석에 적합한 형식으로 준비된다. 예를 들어, 원시 발현 데이터를 제공하는 대신, 준비된 형식은 특정 치료 옵션에 대한 권장사항이 있거나 없는 대상체에 대한 진단 또는 위험 평가 (예를 들어, 플루의 존재)를 나타낼 수 있다. 데이터는 임의의 적합한 방법에 의해 임상의에게 표시될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 프로파일링 서비스는 임상의를 위해 인쇄되거나 (예를 들어, 케어 시점에) 임상의에게 컴퓨터 모니터에 표시될 수 있는 보고서를 생성한다.
일부 실시양태에서, 정보는 먼저 케어 시점에서 또는 지역 시설에서 분석된다. 그 후, 원시 데이터는 추가 분석을 위해 및/또는 원시 데이터를 임상의 또는 환자에게 유용한 정보로 변환하기 위해 중앙 프로세싱 시설로 보내진다. 중앙 프로세싱 시설은 프라이버시 (모든 데이터는 균일한 보안 프로토콜로 중앙 시설에 저장됨), 속도, 및 데이터 분석의 균일성의 장점을 제공한다. 그 후, 중앙 프로세싱 시설은 대상체의 치료 후 데이터의 운명을 제어할 수 있다. 예를 들어, 전자 통신 시스템을 사용하여, 중앙 시설은 임상의, 대상체 또는 연구원에게 데이터를 제공할 수 있다.
일부 실시양태에서, 대상체는 전자 통신 시스템을 사용하여 데이터에 직접적으로 액세스할 수 있다. 대상체는 결과에 기초하여 추가 개입 또는 상담을 선택할 수 있다. 일부 실시양태에서, 데이터는 연구용으로 사용된다. 예를 들어, 데이터는 특정 병태 또는 질환 단계의 유용한 지표로서 또는 행동의 치료 과정을 결정하기 위한 동반 진단으로서 마커의 포함 또는 제거를 추가로 최적화하는데 사용될 수 있다.
5.2.7. 예시적인 폴리뉴클레오티드
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 일부 실시양태에서, 합성 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 본원에서 사용된 바와 같은 합성 폴리뉴클레오티드는 화학적으로 또는 효소적으로 시험관내에서 합성된 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드의 화학적 합성은 폴리뉴클레오티드 합성기, 예컨대 올리고파일로트(OligoPilot)™ (지이 헬스케어(GE Healthcare)), ABI 3900 DNA 합성기 (어플라이드 바이오시스템스) 등을 사용한 합성을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 효소적 합성은 효소적 증폭, 예를 들어, PCR에 의한 폴리뉴클레오티드 생산을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 폴리뉴클레오티드는 본원에서 논의된 하나 이상의 뉴클레오티드 유사체 (즉, 변형된 뉴클레오티드)를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 플루 A 폴리머라제 산성 (PA) 유전자, 플루 A 폴리머라제 염기성 2 (PB2) 유전자, 플루 A 매트릭스 단백질 (MP) 유전자, 플루 B 매트릭스 단백질 (MP) 유전자, 플루 B 비구조적 단백질 (NS) 유전자, 조류 인플루엔자 MP 유전자, RSV A 게놈, RSV B 게놈, SARS-CoV-2 E 유전자, 및/또는 SARS-CoV-2 N2 유전자, 및/또는 SARS CoV-2 RdRP 유전자의 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개, 적어도 25개, 적어도 26개, 적어도 27개, 적어도 28개, 적어도 29개 또는 적어도 30개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한, 또는 이에 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 상보적인 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 일부 실시양태에서, 플루 A 폴리머라제 산성 (PA) 유전자, 플루 A 폴리머라제 염기성 2 (PB2) 유전자, 플루 A 매트릭스 단백질 (MP) 유전자, 플루 B 매트릭스 단백질 (MP) 유전자, 플루 B 비구조적 단백질 (NS) 유전자, 조류 MP 유전자, RSV A 게놈, RSV B 게놈, SARS-CoV-2 E 유전자, 및/또는 SARS-CoV-2 N2 유전자, 및/또는 SARS CoV-2 RdRP 유전자의 6 내지 100개, 8 내지 100개, 8 내지 75개, 8 내지 50개, 8 내지 40개, 또는 8 내지 30개의 인접 뉴클레오티드 범위와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 또는 상보적인 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 비제한적인 예시적인 폴리뉴클레오티드는 표 A에 나타낸다.
일부 실시양태에서 N2 유전자에 대한 프라이머 및 프로브는 SARS-CoV-2에 특이적이며, 사베코바이러스 아속의 다른 밀접하게 관련된 코로나바이러스, 예컨대 SARS-CoV-1을 검출하지 않는다. 이는 SARS-CoV-2에 대해 높은 수준의 특이성을 제공한다.
일부 실시양태에서 E 유전자에 대한 프라이머 및 프로브는 "사베코바이러스 특이적"이며, 또한 SARS-CoV-2 이외에 사베코바이러스 아속의 다른 코로나바이러스를 검출할 것이다. SARS-CoV-2는 현재 인간에서 순환하는 것으로 공지된 사베코바이러스 아속의 유일한 구성원이므로, 사실상 SARS-CoV-2에 특이적이다. 그러나, 미래에 또 다른 사베코바이러스가 인간 집단에 출현하는 경우, E 유전자에 대한 본원에 개시된 프라이머 및 프로브가 검출에 사용될 수 있다.
다양한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 500개 미만, 300개 미만, 200개 미만, 150개 미만, 100개 미만, 75개 미만, 50개 미만, 40개 미만 또는 30개 미만의 뉴클레오티드를 포함한다. 다양한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 6 내지 200개, 8 내지 200개, 8 내지 150개, 8 내지 100개, 8 내지 75개, 8 내지 50개, 8 내지 40개, 8 내지 30개, 15 내지 100개, 15 내지 75개, 15 내지 50개, 15 내지 40개, 또는 15 내지 30개의 뉴클레오티드 길이이다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 프라이머이다. 일부 실시양태에서, 프라이머는 검출가능한 모이어티로 표지된다. 일부 실시양태에서, 프라이머는 표지되지 않는다. 본원에서 사용된 바와 같은 프라이머는 표적 RNA 또는 표적 RNA로부터 역전사된 cDNA, 또는 표적 RNA 또는 cDNA로부터 증폭된 앰플리콘에 선택적으로 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드 (집합적으로 "주형"으로 지칭됨)이고, 주형의 존재 하에, 폴리머라제 및 적합한 완충액 및 시약이 연장되어 프라이머 연장 생성물을 형성할 수 있다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 프로브이다. 일부 실시양태에서, 프로브는 검출가능한 모이어티로 표지된다. 본원에서 사용된 바와 같은 검출가능한 모이어티는 직접적으로 검출가능한 모이어티, 예컨대 형광 염료, 및 간접적으로 검출가능한 모이어티, 예컨대 결합 쌍의 구성원 모두를 포함한다. 검출가능한 모이어티가 결합 쌍의 구성원인 경우, 일부 실시양태에서, 프로브는 결합 쌍의 제2 구성원에 결합된 검출가능한 표지와 함께 프로브를 인큐베이션함으로써 검출가능할 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로브가 예를 들어 마이크로어레이 또는 비드 상의 포획 프로브인 경우와 같이 프로브는 표지되지 않는다. 일부 실시양태에서, 프로브는 예를 들어 폴리머라제에 의해 연장가능하지 않다. 다른 실시양태에서, 프로브는 연장가능하다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 일부 실시양태에서 그룹이 매우 근접할 때 (즉, 동일한 프로브에 부착됨) 염료로부터 형광 방출을 흡수 (즉, 저해)하는 화학적 그룹인 켄쳐 (수용자)로 3'-말단에서 및 형광 염료 (공여자)로 5'-말단에서 표지된 FRET 프로브이다. 그러므로, 일부 실시양태에서, 염료의 방출 스펙트럼은 켄쳐의 흡수 스펙트럼과 상당히 중첩되어야 한다. 다른 실시양태에서, 염료 및 켄쳐는 FRET 프로브의 말단에 있지 않다.
5.2.7.1. 예시적인 폴리뉴클레오티드 변형
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 적어도 하나의 표적 유전자를 검출하는 방법은 변형된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 예컨대 하나 이상의 친화성-향상 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 사용한다. 본원에 기재된 방법에 유용한 변형된 폴리뉴클레오티드는 역전사용 프라이머, PCR 증폭 프라이머 및 프로브를 포함한다. 일부 실시양태에서, 친화성-향상 뉴클레오티드의 혼입은 데옥시리보뉴클레오티드만을 함유하는 폴리뉴클레오티드와 비교하여 그의 표적 핵산에 대한 폴리뉴클레오티드의 결합 친화성 및 특이성을 증가시키고, 더 짧은 폴리뉴클레오티드의 사용 또는 폴리뉴클레오티드 및 표적 핵산 사이의 더 짧은 상보성 영역을 허용한다.
일부 실시양태에서, 친화성-향상 뉴클레오티드 유사체는 하나 이상의 염기 변형, 당 변형 및/또는 백본 변형을 포함하는 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 친화성-향상 뉴클레오티드 유사체에서 사용하기 위한 변형된 염기는 5-메틸시토신, 이소시토신, 슈도이소시토신, 5-브로모우라실, 5-프로피닐우라실, 6-아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 이노신, 디아미노퓨린, 2-클로로-6-아미노퓨린, 크산틴 및 하이포크산틴을 포함한다.
일부 실시양태에서, 친화성-향상 뉴클레오티드 유사체는 변형된 당, 예컨대 2'-치환된 당, 예컨대 2'-O-알킬-리보스 당, 2'-아미노-데옥시리보스 당, 2'-플루오로-데옥시리보스 당, 2'-플루오로-아라비노스 당, 및 2'-O-메톡시에틸-리보스 (2'MOE) 당을 갖는 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 당은 아라비노스 당 또는 d-아라비노-헥시톨 당이다.
일부 실시양태에서, 친화성-향상 뉴클레오티드 유사체는 백본 변형, 예컨대 펩티드 핵산 (PNA; 예를 들어, 아미노산 백본에 의해 함께 연결된 핵염기를 포함하는 올리고머)의 사용을 포함한다. 다른 백본 변형은 포스포로티오에이트 연결, 포스포디에스테르 변형된 핵산, 포스포디에스테르 및 포스포로티오에이트 핵산의 조합, 메틸포스포네이트, 알킬포스포네이트, 포스페이트 에스테르, 알킬포스포노티오에이트, 포스포르아미데이트, 카르바메이트, 카르보네이트, 포스페이트 트리에스테르, 아세트아미데이트, 카르복시메틸 에스테르, 메틸포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, p-에톡시, 및 이들의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 변형된 염기를 갖는 적어도 하나의 친화성-향상 뉴클레오티드 유사체, 변형된 당을 갖는 적어도 뉴클레오티드 (동일한 뉴클레오티드일 수 있음), 및/또는 비-자연 발생인 적어도 하나의 뉴클레오티드간 연결을 포함한다.
일부 실시양태에서, 친화성-향상 뉴클레오티드 유사체는 바이시클릭 당인 잠긴 핵산 ("LNA") 당을 함유한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에서 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드는 LNA 당을 갖는 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 LNA 당을 갖는 뉴클레오티드로 이루어진 하나 이상의 영역을 함유한다. 다른 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드가 산재된 LNA 당을 갖는 뉴클레오티드를 함유한다. 예를 들어, 문헌 [Frieden, M. et al. (2008) Curr. Pharm. Des. 14(11):1138-1142]을 참조한다.
5.2.7.2. 예시적인 프라이머
일부 실시양태에서, 프라이머 및 프라이머 쌍이 제공된다. 일부 실시양태에서, 프라이머는 플루 A 폴리머라제 산성 (PA) 유전자, 플루 A 폴리머라제 염기성 2 (PB2) 유전자, 플루 A 매트릭스 단백질 (MP) 유전자, 플루 B 매트릭스 단백질 (MP) 유전자, 플루 B 비구조적 단백질 (NS) 유전자, 조류 인플루엔자 매트릭스 단백질 (MP) 유전자, RSV A 게놈, RSV B 게놈, SARS-CoV-2 E 유전자, 및/또는 SARS-CoV-2 N2 유전자, 및/또는 SARS CoV-2 RdRP 유전자의 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개, 적어도 25개, 적어도 26개, 적어도 27개, 적어도 28개, 적어도 29개 또는 적어도 30개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일하거나, 또는 이에 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 상보적이다.
일부 실시양태에서, 플루 A 폴리머라제 산성 (PA) 유전자, 플루 A 폴리머라제 염기성 2 (PB2) 유전자, 플루 A 매트릭스 단백질 (MP) 유전자, 플루 B 매트릭스 단백질 (MP) 유전자, 플루 B 비구조적 단백질 (NS) 유전자, 조류 인플루엔자 매트릭스 단백질 (MP) 유전자, RSV A 게놈, RSV B 게놈, SARS-CoV-2 E 유전자, 및/또는 SARS-CoV-2 N2 유전자, 및/또는 SARS CoV-2 RdRP 유전자의 6 내지 100개, 8 내지 100개, 8 내지 75개, 8 내지 50개, 8 내지 40개, 또는 8 내지 30개의 인접 뉴클레오티드 범위와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 또는 상보적인 서열을 갖는 6 내지 100개, 8 내지 100개, 8 내지 75개, 8 내지 50개, 8 내지 40개, 또는 8 내지 30개의 인접 뉴클레오티드의 영역을 포함하는 프라이머가 제공된다. 비제한적인 예시적인 프라이머는 표 A에 나타낸다.
일부 실시양태에서, 프라이머는 또한 표적 유전자와 동일하지 않은 또는 상보적이지 않은 부분 또는 영역을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 유전자와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 또는 상보적인 프라이머의 영역은 인접하여, 표적 유전자와 동일하지 않은 또는 상보적이지 않은 프라이머의 임의의 영역은 동일한 또는 상보적인 영역을 방해하지 않는다.
일부 실시양태에서, 프라이머는 표적 유전자의 영역과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 부분을 포함한다. 일부 이러한 실시양태에서, 표적 유전자의 영역과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 영역을 포함하는 프라이머는 RNA로부터 역전사된 cDNA, 또는 표적 유전자의 증폭에 의해 생산된 앰플리콘에 선택적으로 혼성화할 수 있다. 일부 실시양태에서, 프라이머는 사용되는 특정 검정의 조건 하에 cDNA 또는 앰플리콘에 선택적으로 혼성화하도록 cDNA 또는 앰플리콘의 충분한 부분에 상보적이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "선택적으로 혼성화하다"는 폴리뉴클레오티드, 예컨대 프라이머 또는 프로브가 혼성화 영역에서 상이한 뉴클레오티드 서열을 갖는 동일한 샘플에 존재하는 또 다른 핵산에 혼성화하는 것보다 적어도 5배 더 큰 친화성으로 샘플 내의 특정 핵산에 혼성화할 것임을 의미한다. 예시적인 혼성화 조건은 예를 들어 역전사 반응 또는 PCR 증폭 반응의 맥락에서 본원에서 논의된다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 혼성화 영역에서 상이한 뉴클레오티드 서열을 갖는 동일한 샘플에 존재하는 또 다른 핵산에 혼성화하는 것보다 적어도 10배 더 큰 친화성으로 샘플 내의 특정 핵산에 혼성화할 것이다.
일부 실시양태에서, 프라이머는 예를 들어 본원에서 논의된 바와 같이 표적 RNA를 역전사하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 프라이머는 표적 RNA 또는 그로부터 역전사된 cDNA를 증폭시키는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 이러한 증폭은 예를 들어 본원에서 논의된 바와 같이 정량적 PCR이다.
일부 실시양태에서, 프라이머는 검출가능한 모이어티를 포함한다.
일부 실시양태에서, 프라이머 쌍이 제공된다. 이러한 프라이머 쌍은 표적 유전자, 예컨대 플루 A PA 유전자, 플루 A PB2 유전자, 플루 A 매트릭스 단백질 (MP) 유전자, 플루 B 매트릭스 단백질 (MP) 유전자, 플루 B 비구조적 단백질 (NS) 유전자, 조류 인플루엔자 MP 유전자, RSV A 게놈, RSV B 게놈, SARS-CoV-2 E 유전자, SARS-CoV-2 N2 유전자 또는 SARS CoV-2 RdRP 유전자, 또는 내인성 대조군, 예컨대 샘플 적절성 대조군 (SAC), 또는 외인성 대조군, 예컨대 샘플 프로세싱 대조군 (SPC)의 일부를 증폭시키도록 설계된다. 일부 실시양태에서 2개의 정방향 프라이머 또는 2개의 역방향 프라이머는 표적 유전자를 증폭시켜 2개의 상이한 앰플리콘을 생성하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 프라이머 쌍은 50 내지 1500개의 뉴클레오티드 길이, 50 내지 1000개의 뉴클레오티드 길이, 50 내지 750개의 뉴클레오티드 길이, 50 내지 500개의 뉴클레오티드 길이, 50 내지 400개의 뉴클레오티드 길이, 50 내지 300개의 뉴클레오티드 길이, 50 내지 200개의 뉴클레오티드 길이, 50 내지 150개의 뉴클레오티드 길이, 100 내지 300개의 뉴클레오티드 길이, 100 내지 200개의 뉴클레오티드 길이, 또는 100 내지 150개의 뉴클레오티드 길이인 앰플리콘을 생산하도록 설계된다. 비제한적인 예시적인 프라이머 쌍은 표 A에 나타낸다.
표 A: 플루, RSV 및 SARS-CoV-2를 검출하기 위한 프라이머 및 프로브
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
5.2.7.3. 예시적인 프로브
다양한 실시양태에서, 인플루엔자, RSV 및/또는 SARS-CoV-2의 존재를 검출하는 방법은 샘플의 핵산을 프로브와 혼성화하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 프로브는 표적 유전자, 예컨대 플루 A 폴리머라제 산성 (PA) 유전자, 플루 A 폴리머라제 염기성 2 (PB2) 유전자, 플루 A 매트릭스 단백질 (MP) 유전자, 플루 B 매트릭스 단백질 (MP) 유전자, 플루 B 비구조적 단백질 (NS) 유전자, 조류 인플루엔자 매트릭스 단백질 (MP) 유전자, RSV A 게놈, RSV B 게놈, SARS-CoV-2 E 유전자, SARS-CoV-2 N2 유전자, 및/또는 SARS CoV-2 RdRP 유전자, 또는 내인성 대조군, 예컨대 샘플 적절성 대조군 (SAC), 또는 외인성 대조군, 예컨대 샘플 프로세싱 대조군 (SPC)에 상보적인 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로브는 표적 유전자의 영역과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 부분을 포함한다.
일부 이러한 실시양태에서, 표적 유전자에 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 상보적인 프로브는 사용되는 특정 검정의 조건 하에 표적 유전자에 선택적으로 혼성화하도록 표적 유전자의 충분한 부분에 상보적이다. 일부 실시양태에서, 표적 유전자에 상보적인 프로브는 표적 유전자의 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개, 적어도 25개, 적어도 26개, 적어도 27개, 적어도 28개, 적어도 29개 또는 적어도 30개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 상보적인 서열을 갖는 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개, 적어도 25개, 적어도 26개, 적어도 27개, 적어도 28개, 적어도 29개 또는 적어도 30개의 인접 뉴클레오티드의 영역을 포함한다. 비제한적인 예시적인 프로브는 표 A에 나타낸다.
표적 유전자에 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 상보적인 프로브는 또한 표적 유전자에 상보적이지 않은 부분 또는 영역을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 유전자에 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 상보적인 프로브의 영역은 인접하여, 표적 유전자에 상보적이지 않은 프로브의 임의의 영역은 상보적인 영역을 방해하지 않는다.
일부 실시양태에서, 프로브는 표적 유전자의 영역과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 부분, 또는 내인성 대조군, 예컨대 샘플 적절성 대조군 (SAC), 또는 외인성 대조군, 예컨대 샘플 프로세싱 대조군 (SPC)을 포함한다. 일부 이러한 실시양태에서, 표적 유전자의 영역과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 영역을 포함하는 프로브는 표적 유전자로부터 역전사된 cDNA 또는 표적 유전자의 증폭에 의해 생산된 앰플리콘에 선택적으로 혼성화할 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로브는 사용되는 특정 검정의 조건 하에 cDNA 또는 앰플리콘에 선택적으로 혼성화하도록 cDNA 또는 앰플리콘의 충분한 부분에 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 상보적이다. 일부 실시양태에서, cDNA 또는 앰플리콘에 상보적인 프로브는 cDNA 또는 앰플리콘의 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개, 적어도 25개, 적어도 26개, 적어도 27개, 적어도 28개, 적어도 29개 또는 적어도 30개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 상보적인 영역을 포함한다. cDNA 또는 앰플리콘에 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 상보적인 프로브는 또한 cDNA 또는 앰플리콘에 상보적이지 않은 부분 또는 영역을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, cDNA 또는 앰플리콘에 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 상보적인 프로브의 영역은 인접하여, cDNA 또는 앰플리콘에 상보적이지 않은 프로브의 임의의 영역은 상보적인 영역을 방해하지 않는다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 표적 유전자를 검출하는 방법은 하기를 포함한다: (a) 표적 RNA를 역전사하여 표적 RNA에 상보적인 cDNA를 생산하는 단계; (b) (a)로부터의 cDNA를 증폭시키는 단계; 및 (c) 실시간 RT-PCR 및 검출 프로브를 사용하여 표적 RNA의 양을 검출하는 단계 (이는 증폭 단계 (b)와 동시일 수 있음).
상기 기재된 바와 같이, 일부 실시양태에서, 실시간 RT-PCR 검출은 태크맨® 프로브, 분자 비콘 프로브 및 스콜피온 프로브를 포함하나 이에 제한되지는 않는 FRET 프로브를 사용하여 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 실시간 RT-PCR 검출은 태크맨® 프로브, 즉, 전형적으로 DNA의 한 말단에 공유결합으로 결합된 형광 염료 및 다른 곳에서, 예컨대 DNA의 다른 말단에 공유결합으로 결합된 켄쳐 분자를 갖는 선형 프로브로 수행된다. FRET 프로브는 FRET 프로브가 cDNA 또는 앰플리콘에 혼성화될 때 염료 형광이 켄칭되고, 프로브가 cDNA 또는 앰플리콘의 증폭 동안 소화될 때 염료가 프로브로부터 방출되어 형광 신호를 생성하도록, cDNA 또는 앰플리콘의 영역에 상보적인 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 샘플 내의 표적 유전자의 양은 증폭 동안 측정된 형광의 양에 비례한다.
태크맨® 프로브는 전형적으로 프로브가 표적 유전자의 영역의 PCR 앰플리콘에 선택적으로 혼성화가능하도록 표적 유전자의 영역 또는 표적 RNA 주형으로부터 역전사된 그의 상보적인 cDNA와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 또는 상보적인 서열을 갖는 인접 뉴클레오티드의 영역을 포함한다 (즉, 프로브 영역의 서열은 검출되는 표적 RNA에 상보적이거나 동일하게 존재함). 일부 실시양태에서, 프로브는 표적 유전자로부터 역전사된 cDNA의 영역에 완전히 상보적이거나 동일하게 존재하는 서열을 갖는 적어도 6개의 인접 뉴클레오티드의 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로브는 검출되는 표적 유전자로부터 역전사된 cDNA의 영역에 상보적이거나 동일하게 존재하는 서열을 갖는 적어도 8개의 인접 뉴클레오티드, 적어도 10개의 인접 뉴클레오티드, 적어도 12개의 인접 뉴클레오티드, 적어도 14개의 인접 뉴클레오티드, 또는 적어도 16개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 또는 상보적인 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 태크맨® 프로브 서열에 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 상보적인 서열을 갖는 앰플리콘의 영역은 앰플리콘 분자의 중심에 또는 그 근처에 있다. 일부 실시양태에서, 상보성 영역의 5'-말단 및 3'-말단에 독립적으로 앰플리콘의 적어도 2개의 뉴클레오티드, 예컨대 적어도 3개의 뉴클레오티드, 예컨대 적어도 4개의 뉴클레오티드, 예컨대 적어도 5개의 뉴클레오티드가 존재한다.
일부 실시양태에서, 분자 비콘은 PCR 생성물을 검출하는데 사용될 수 있다. 태크맨® 프로브와 마찬가지로, 분자 비콘은 FRET를 사용하여 프로브의 말단에 부착된 형광 염료 및 켄쳐를 갖는 프로브를 통해 PCR 생성물을 검출한다. 태크맨® 프로브와 달리, 분자 비콘은 PCR 사이클 동안 무손상 상태로 남아있다. 분자 비콘 프로브는 용액에서 유리 상태일 때 스템-루프 구조를 형성하며, 이에 의해 염료 및 켄쳐가 형광 켄칭을 유발할 만큼 충분히 매우 근접하는 것을 허용한다. 분자 비콘이 표적에 혼성화하는 경우, 스템-루프 구조가 폐지되어, 염료 및 켄쳐가 공간에서 분리되고 염료가 형광을 낸다. 분자 비콘은 예를 들어 진 링크(Gene Link)™ (genelink.com 참조)로부터 입수가능하다.
일부 실시양태에서, 스콜피온 프로브는 서열-특이적 프라이머로서 및 PCR 생성물 검출용 둘 모두로서 사용될 수 있다. 분자 비콘과 마찬가지로, 스콜피온 프로브는 표적 핵산에 혼성화되지 않을 때 스템-루프 구조를 형성한다. 그러나, 분자 비콘과 달리, 스콜피온 프로브는 서열-특이적 프라이밍 및 PCR 생성물 검출을 모두 달성한다. 형광 염료 분자는 스콜피온 프로브의 5'-말단에 부착되고, 켄쳐는 다른 곳에, 예컨대 3'-말단에 부착된다. 프로브의 3' 부분은 PCR 프라이머의 연장 생성물에 상보적이고, 이러한 상보적인 부분은 비-증폭가능한 모이어티에 의해 프로브의 5'-말단에 연결된다. 스콜피온 프라이머가 연장된 후, 프로브의 표적-특이적 서열은 연장된 앰플리콘 내의 그의 상보체에 결합하며, 그러므로 스템-루프 구조를 개방하고 5'-말단 상의 염료가 형광을 내고 신호를 생성하는 것을 허용한다. 스콜피온 프로브는 예를 들어 프리미어 바이오소프트 인터내셔날(Premier Biosoft International) (premierbiosoft.com 참조)로부터 입수가능하다.
일부 실시양태에서, FRET 프로브 상에 사용될 수 있는 표지는 하기를 포함한다: 비색 및 형광 염료, 예컨대 알렉사(Alexa) 플루오르 염료, 보디피 염료, 예컨대 보디피 FL; 캐스케이드 블루; 캐스케이드 옐로우; 쿠마린 및 그의 유도체, 예컨대 7-아미노-4-메틸쿠마린, 아미노쿠마린 및 히드록시쿠마린; 시아닌 염료, 예컨대 Cy3 및 Cy5; 에오신 및 에리트로신; 플루오레세인 및 그의 유도체, 예컨대 플루오레세인 이소티오시아네이트; 란타나이드 이온의 마크로시클릭 킬레이트, 예컨대 퀀텀 다이(Quantum Dye)™; 마리나 블루; 오레곤 그린; 로다민 염료, 예컨대 로다민 레드, 테트라메틸로다민 및 로다민 6G; 텍사스 레드; 형광 에너지 전달 염료, 예컨대 티아졸 오렌지-에티듐 이종이량체; 및 TOTAB.
염료의 구체적인 예에는 상기 및 하기 식별된 것들이 포함되나 이에 제한되지는 않는다: 알렉사 플루오르 350, 알렉사 플루오르 405, 알렉사 플루오르 430, 알렉사 플루오르 488, 알렉사 플루오르 500. 알렉사 플루오르 514, 알렉사 플루오르 532, 알렉사 플루오르 546, 알렉사 플루오르 555, 알렉사 플루오르 568, 알렉사 플루오르 594, 알렉사 플루오르 610, 알렉사 플루오르 633, 알렉사 플루오르 647, 알렉사 플루오르 660, 알렉사 플루오르 680, 알렉사 플루오르 700 및 알렉사 플루오르 750; 아민-반응성 보디피 염료, 예컨대 보디피 493/503, 보디피 530/550, 보디피 558/568, 보디피 564/570, 보디피 576/589, 보디피 581/591, 보디피 630/650, 보디피 650/655, 보디피 FL, 보디피 R6G, 보디피 TMR, 및, 보디피-TR; Cy3, Cy5, 6-FAM, 플루오레세인 이소티오시아네이트, HEX, 6-JOE, 오레곤 그린 488, 오레곤 그린 500, 오레곤 그린 514, 퍼시픽 블루, REG, 로다민 그린, 로다민 레드, 레노그라핀, ROX, SYPRO, TAMRA, 2',4',5',7'-테트라브로모술폰플루오레세인, 및 TET.
염료/켄쳐 쌍 (즉, 공여자/수용자 쌍)의 예에는 플루오레세인/테트라메틸로다민; IAEDANS/플루오레세인; EDANS/다브실; 플루오레세인/플루오레세인; 보디피 FL/보디피 FL; 플루오레세인/QSY 7 또는 QSY 9 염료가 포함되나 이에 제한되지는 않는다. 공여자 및 수용자가 동일한 경우, FRET는 일부 실시양태에서 형광 탈분극에 의해 검출될 수 있다. 염료/켄쳐 쌍 (즉, 공여자/수용자 쌍)의 특정 구체적인 예에는 하기가 포함되나 이에 제한되지는 않는다: 알렉사 플루오르 350/알렉사 플루오르488; 알렉사 플루오르 488/알렉사 플루오르 546; 알렉사 플루오르 488/알렉사 플루오르 555; 알렉사 플루오르 488/알렉사 플루오르 568; 알렉사 플루오르 488/알렉사 플루오르 594; 알렉사 플루오르 488/알렉사 플루오르 647; 알렉사 플루오르 546/알렉사 플루오르 568; 알렉사 플루오르 546/알렉사 플루오르 594; 알렉사 플루오르 546/알렉사 플루오르 647; 알렉사 플루오르 555/알렉사 플루오르 594; 알렉사 플루오르 555/알렉사 플루오르 647; 알렉사 플루오르 568/알렉사 플루오르 647; 알렉사 플루오르 594/알렉사 플루오르 647; 알렉사 플루오르 350/QSY35; 알렉사 플루오르 350/다브실; 알렉사 플루오르 488/QSY 35; 알렉사 플루오르 488/다브실; 알렉사 플루오르 488/QSY 7 또는 QSY 9; 알렉사 플루오르 555/QSY 7 또는 QSY9; 알렉사 플루오르 568/QSY 7 또는 QSY 9; 알렉사 플루오르 568/QSY 21; 알렉사 플루오르 594/QSY 21; 및 알렉사 플루오르 647/QSY 21. 일부 예에서, 다중 염료를 위해 동일한 켄쳐, 예를 들어 광범위 스펙트럼 켄쳐, 예컨대 아이오와 블랙® 켄쳐 (인테그레이티드 DNA 테크놀로지스(Integrated DNA Technologies), 미국 아이오와주 코랄빌) 또는 블랙 홀 켄쳐™ (BHQ™; 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 미국 미주리주 세인트 루이스)가 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 예를 들어, 2개 이상의 모이어티 (예컨대 앰플리콘)가 동시에 검출되는 멀티플렉스 반응에서, 각 프로브는 동일한 반응에서 동시에 검출될 때 염료가 구별될 수 있도록 검출가능하게 상이한 염료를 포함한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 멀티플렉스 반응에서 사용하기 위해 검출가능하게 상이한 염료 세트를 선택할 수 있다.
2개 이상의 앰플리콘이 동시에 검출되는 일부 실시양태에서, 2개 이상의 프로브는 동일한 반응에서 동시에 다중 앰플리콘을 검출하기 위해 단일 염료가 사용될 수 있도록 동일한 검출가능한 염료를 함유할 수 있다.
본원에 기재된 방법의 일부 실시양태에서 사용하기 위한 PCR 프로브의 제조에 유용한 형광 표지된 리보뉴클레오티드의 구체적인 예는 몰레큘라 프로브스(Molecular Probes) (인비트로젠)로부터 입수가능하고, 이들은 알렉사 플루오르 488-5-UTP, 플루오레세인-12-UTP, 보디피 FL-14-UTP, 보디피 TMR-14-UTP, 테트라메틸로다민-6-UTP, 알렉사 플루오르 546-14-UTP, 텍사스 레드-5-UTP, 및 보디피 TR-14-UTP를 포함한다. 다른 형광 리보뉴클레오티드, 예컨대 Cy3-UTP 및 Cy5-UTP는 아머샴 바이오사이언시스(Amersham Biosciences) (지이 헬스케어)로부터 입수가능하다.
본원에 기재된 방법에서 사용하기 위한 PCR 프로브의 제조에 유용한 형광 표지된 데옥시리보뉴클레오티드의 예에는 하기가 포함된다: 디니트로페닐 (DNP)-1'-dUTP, 캐스케이드 블루-7-dUTP, 알렉사 플루오르 488-5-dUTP, 플루오레세인-12-dUTP, 오레곤 그린 488-5-dUTP, 보디피 FL-14-dUTP, 로다민 그린-5-dUTP, 알렉사 플루오르 532-5-dUTP, 보디피 TMR-14-dUTP, 테트라메틸로다민-6-dUTP, 알렉사 플루오르 546-14-dUTP, 알렉사 플루오르 568-5-dUTP, 텍사스 레드-12-dUTP, 텍사스 레드-5-dUTP, 보디피 TR-14-dUTP, 알렉사 플루오르 594-5-dUTP, 보디피 630/650-14-dUTP, 보디피 650/665-14-dUTP; 알렉사 플루오르 488-7-OBEA-dCTP, 알렉사 플루오르 546-16-OBEA-dCTP, 알렉사 플루오르 594-7-OBEA-dCTP, 알렉사 플루오르 647-12-OBEA-dCTP. 형광 표지된 뉴클레오티드는 상업적으로 입수가능하고, 예를 들어, 인비트로젠으로부터 구입할 수 있다.
일부 실시양태에서, 염료 및 다른 모이어티, 예컨대 켄쳐는 변형된 뉴클레오티드를 통해 본원에 기재된 방법에서 사용되는 폴리뉴클레오티드, 예컨대 FRET 프로브에 도입된다. "변형된 뉴클레오티드"는 화학적으로 변형되었지만 여전히 뉴클레오티드로서 기능하는 뉴클레오티드를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 변형된 뉴클레오티드는 공유결합으로 부착된 화학적 모이어티, 예컨대 염료 또는 켄쳐를 갖고, 예를 들어 폴리뉴클레오티드의 고체상 합성을 통해 폴리뉴클레오티드에 도입될 수 있다. 다른 실시양태에서, 변형된 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드의 핵산으로의 혼입 전, 동안 또는 후에 염료 또는 켄쳐와 반응할 수 있는 하나 이상의 반응성 기를 포함한다. 특정 실시양태에서, 변형된 뉴클레오티드는 아민-변형된 뉴클레오티드, 즉 반응성 아민 기를 갖도록 변형된 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 변형된 뉴클레오티드는 변형된 염기 모이어티, 예컨대 우리딘, 아데노신, 구아노신 및/또는 시토신을 포함한다. 특정 실시양태에서, 아민-변형된 뉴클레오티드는 5-(3-아미노알릴)-UTP; 8-[(4-아미노)부틸]-아미노-ATP 및 8-[(6-아미노)부틸]-아미노-ATP; N6-(4-아미노)부틸-ATP, N6-(6-아미노)부틸-ATP, N4-[2,2-옥시-비스-(에틸아민)]-CTP; N6-(6-아미노)헥실-ATP; 8-[(6-아미노)헥실]-아미노-ATP; 5-프로파길아미노-CTP, 5-프로파길아미노-UTP로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 상이한 핵염기 모이어티를 갖는 뉴클레오티드는 유사하게 변형된다 (예를 들어, 5-(3-아미노알릴)-UTP 대신에 5-(3-아미노알릴)-GTP). 많은 아민 변형된 뉴클레오티드는 예를 들어 어플라이드 바이오시스템스, 시그마, 제나 바이오사이언스(Jena Bioscience) 및 트리링크(TriLink)로부터 상업적으로 입수가능하다.
예시적인 검출가능한 모이어티는 또한 결합 쌍의 구성원을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 이러한 실시양태에서, 결합 쌍의 제1 구성원은 폴리뉴클레오티드에 연결된다. 결합 쌍의 제2 구성원은 검출가능한 표지, 예컨대 형광 표지에 연결된다. 결합 쌍의 제1 구성원에 연결된 폴리뉴클레오티드가 검출가능한 표지에 연결된 결합 쌍의 제2 구성원과 함께 인큐베이션되는 경우, 결합 쌍의 제1 및 제2 구성원이 회합하고, 폴리뉴클레오티드가 검출될 수 있다. 예시적인 결합 쌍은 비오틴 및 스트렙타비딘, 항체 및 항원 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 다중 표적 유전자는 단일 멀티플렉스 반응에서 검출된다. 일부 이러한 실시양태에서, 고유한 앰플리콘에 표적화된 각 프로브는 프로브로부터 방출될 때 분광적으로 구별가능하며, 이 경우 각 표적 유전자는 고유한 형광 신호에 의해 검출된다. 일부 실시양태에서, 2개 이상의 표적 유전자는 동일한 형광 신호를 사용하여 검출되며, 이 경우 해당 신호의 검출은 표적 유전자 중 하나 또는 둘 모두의 존재를 나타낸다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 선택된 검정, 예를 들어 실시간 RT-PCR 검정에 적합한 검출 방법을 선택할 수 있다. 선택된 검출 방법은 상기 기재된 방법일 필요는 없으며, 임의의 방법일 수 있다.
5.3. 예시적인 조성물 및 키트
또 다른 측면에서, 조성물이 제공된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에서 사용하기 위한 조성물이 제공된다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 표적 유전자-특이적 프라이머를 포함하는 조성물이 제공된다. 용어 "표적 유전자-특이적 프라이머" 및 "표적 RNA-특이적 프라이머"는 상호교환적으로 사용되며, (i) 표적 유전자의 영역과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일하거나, 또는 (ii) 표적 유전자에서 발견되는 인접 뉴클레오티드의 영역의 서열에 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 상보적인 서열을 갖는 인접 뉴클레오티드의 영역을 갖는 프라이머를 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 한 쌍의 표적 유전자-특이적 프라이머를 포함하는 조성물이 제공된다. 용어 "표적 유전자-특이적 프라이머 쌍"은 표적 유전자의 정의된 영역을 증폭시키기에 적합한 프라이머 쌍을 포함한다. 표적 유전자-특이적 프라이머 쌍은 전형적으로 표적 유전자의 영역의 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 제1 프라이머 및 표적 유전자의 영역에 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 상보적인 서열을 포함하는 제2 프라이머를 포함한다. 프라이머 쌍은 전형적으로 50 내지 1500개의 뉴클레오티드 길이, 50 내지 1000개의 뉴클레오티드 길이, 50 내지 750개의 뉴클레오티드 길이, 50 내지 500개의 뉴클레오티드 길이, 50 내지 400개의 뉴클레오티드 길이, 50 내지 300개의 뉴클레오티드 길이, 50 내지 200개의 뉴클레오티드 길이, 50 내지 150개의 뉴클레오티드 길이, 100 내지 300개의 뉴클레오티드 길이, 100 내지 200개의 뉴클레오티드 길이, 또는 100 내지 150개의 뉴클레오티드 길이인 표적 유전자의 영역을 증폭시키기에 적합하다. 비제한적인 예시적인 프라이머 및 프라이머 쌍은 표 A에 나타낸다.
일부 실시양태에서, 조성물은 적어도 한 쌍의 표적 유전자-특이적 프라이머를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 내인성 대조군 (예컨대 SAC)을 증폭시키기 위한 표적 유전자-특이적 프라이머 쌍 및/또는 외인성 대조군 (예컨대 SPC)을 증폭시키기 위한 한 쌍의 표적 유전자-특이적 프라이머를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 조성물은 적어도 하나의 표적 유전자-특이적 프로브를 포함한다. 용어 "표적 유전자-특이적 프로브" 및 "표적 RNA-특이적 프로브"는 상호교환적으로 사용되며, (i) 표적 유전자의 영역과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일하거나, 또는 (ii) 표적 유전자에서 발견되는 인접 뉴클레오티드의 영역의 서열에 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 상보적인 서열을 갖는 인접 뉴클레오티드의 영역을 갖는 프로브를 포함한다. 비제한적인 예시적인 표적-특이적 프로브는 표 A 및 B에 나타낸다.
일부 실시양태에서, 조성물 (하나 이상의 표적 유전자-특이적 프라이머 쌍을 포함하는 상기 기재된 조성물 포함)은 표적 유전자를 검출하기 위한 하나 이상의 프로브를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 내인성 대조군 (예컨대 SAC)을 검출하기 위한 프로브 및/또는 외인성 대조군 (예컨대 SPC)을 검출하기 위한 프로브를 포함한다.
일부 실시양태에서, 조성물은 수성 조성물이다. 일부 실시양태에서, 수성 조성물은 하기 논의된 바와 같은 완충 구성성분, 예컨대 포스페이트, tris, HEPES 등, 및/또는 추가 구성성분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 건조, 예를 들어 동결건조되고, 유체의 첨가에 의한 재구성에 적합하다. 건조 조성물은 하나 이상의 완충 구성성분 및/또는 추가 구성성분을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 조성물은 하나 이상의 추가 구성성분을 추가로 포함한다. 추가 구성성분은 염, 예컨대 NaCl, KCl 및 MgCl2; 열안정성 폴리머라제, 예컨대 Taq를 포함하는 폴리머라제; dNTP; 역전사효소, 예컨대 MMLV 역전사효소; Rnase 억제제; 소 혈청 알부민 (BSA) 등; 환원제, 예컨대 β-메르캅토에탄올; EDTA 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 조성물의 의도된 용도에 따라 적합한 조성물 구성성분을 선택할 수 있다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 표적 유전자를 검출하기 위한 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 역전사효소 반응을 위한 프라이머로서 사용된다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 증폭을 위한 프라이머로서 사용된다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 PCR을 위한 프라이머로서 사용된다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 표적 유전자를 검출하기 위한 프로브로서 사용된다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 검출가능하게 표지된다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 FRET 프로브이다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 태크맨® 프로브, 분자 비콘, 또는 스콜피온 프로브이다.
일부 실시양태에서, 조성물은 표적 유전자, 예컨대 플루 A 폴리머라제 산성 (PA) 유전자, 플루 A 폴리머라제 염기성 2 (PB2) 유전자, 플루 A 매트릭스 단백질 (MP) 유전자, 플루 B 매트릭스 단백질 (MP) 유전자, 플루 B 비구조적 단백질 (NS) 유전자, 조류 인플루엔자 매트릭스 단백질 (MP) 유전자, RSV A 게놈, RSV B 게놈, SARS-CoV-2 E 유전자, 및/또는 SARS-CoV-2 N2 유전자, 및/또는 SARS CoV-2 RdRP 유전자의 영역과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한, 또는 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 상보적인 서열을 갖는 적어도 하나의 FRET 프로브를 포함한다. 일부 실시양태에서, FRET 프로브는 PCR 반응 동안 프로브가 소화될 때 특이적 표적 유전자와 연관된 고유한 형광 방출을 생성하도록 공여자/수용자 쌍으로 표지된다. 일부 실시양태에서, 조성물이 다중 FRET 프로브를 포함하는 경우, 각 프로브는 PCR 반응 동안 프로브가 소화될 때 각각의 하나가 특이적 프로브 서열 및/또는 표적 유전자와 연관된 고유한 형광 방출을 생성하도록 상이한 공여자/수용자 쌍으로 표지된다. 일부 실시양태에서, FRET 프로브의 서열은 표적 유전자의 표적 영역에 상보적이다. 다른 실시양태에서, FRET 프로브는 표적 유전자의 가장 잘 정렬된 표적 영역의 서열과 비교할 때 하나 이상의 염기 미스매치를 포함하는 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 조성물은 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 뉴클레오티드로 이루어진 FRET 프로브를 포함하고, 여기서 서열의 적어도 일부는 표적 유전자, 예컨대 플루 A 폴리머라제 산성 (PA) 유전자, 플루 A 폴리머라제 염기성 2 (PB2) 유전자, 플루 A 매트릭스 단백질 (MP) 유전자, 플루 B 매트릭스 단백질 (MP) 유전자, 플루 B 비구조적 단백질 (NS) 유전자, 조류 인플루엔자 매트릭스 단백질 (MP) 유전자, RSV A 게놈, RSV B 게놈, SARS-CoV-2 E 유전자, 및/또는 SARS-CoV-2 N2 유전자, 및/또는 SARS CoV-2 RdRP 유전자의 영역과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일하거나, 또는 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 상보적이다. 일부 실시양태에서, FRET 프로브의 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 뉴클레오티드는 표적 유전자, 예컨대 플루 A 폴리머라제 산성 (PA) 유전자, 플루 A 폴리머라제 염기성 2 (PB2) 유전자, 플루 A 매트릭스 단백질 (MP) 유전자, 플루 B 매트릭스 단백질 (MP) 유전자, 플루 B 비구조적 단백질 (NS) 유전자, 조류 인플루엔자 매트릭스 단백질 (MP) 유전자, RSV A 게놈, RSV B 게놈, SARS-CoV-2 E 유전자, 및/또는 SARS-CoV-2 N2 유전자, 및/또는 SARS CoV-2 RdRP 유전자에 동일하게 존재하거나, 또는 이의 영역에 상보적이다. 일부 실시양태에서, FRET 프로브는 표적 유전자의 서열 또는 상보체와 비교할 때 1, 2 또는 3개의 염기 미스매치를 갖는 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서, 키트는 상기 논의된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 상기 논의된 적어도 하나의 프라이머 및/또는 프로브를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 적어도 하나의 폴리머라제, 예컨대 열안정성 폴리머라제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 dNTP를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 실시간 RT-PCR 방법에서 사용하기 위한 키트는 하나 이상의 표적 유전자-특이적 FRET 프로브 및/또는 표적 RNA의 역전사를 위한 하나 이상의 프라이머 및/또는 표적 유전자 또는 그로부터 역전사된 cDNA의 증폭을 위한 하나 이상의 프라이머를 포함한다.
일부 실시양태에서, 프라이머 및/또는 프로브 중 하나 이상은 "선형"이다. "선형" 프라이머는 단일 가닥 분자인 폴리뉴클레오티드를 지칭하며, 전형적으로 프라이머가 내부 이중체를 형성하도록 동일한 폴리뉴클레오티드 내의 또 다른 영역에 상보적인, 예를 들어 적어도 3, 4 또는 5개의 인접 뉴클레오티드의 짧은 영역을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 역전사에서 사용하기 위한 프라이머는 표적 유전자의 5'-말단에서 적어도 4개, 예컨대 적어도 5개, 예컨대 적어도 6개, 예컨대 적어도 7개 또는 그 이상의 인접 뉴클레오티드의 영역에 상보적인 서열을 갖는 3'-말단에서 적어도 4개, 예컨대 적어도 5개, 예컨대 적어도 6개, 예컨대 적어도 7개 또는 그 이상의 인접 뉴클레오티드의 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 키트는 표적 유전자 또는 그로부터 역전사된 cDNA의 증폭을 위한 한 쌍 이상의 선형 프라이머 ("정방향 프라이머" 및 "역방향 프라이머")를 포함한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 제1 프라이머는 표적 유전자의 제1 위치에서 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드의 영역의 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일한 서열을 갖는 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드의 영역을 포함한다. 또한, 일부 실시양태에서, 제2 프라이머는 2개의 프라이머를 사용하는 PCR 반응이 표적 유전자의 제1 위치로부터 표적 유전자의 제2 위치까지 앰플리콘 연장을 초래하도록, 표적 유전자의 제2 위치에서 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드의 영역의 서열에 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 상보적인 서열을 갖는 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개 또는 적어도 25개의 인접 뉴클레오티드의 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 키트는 적어도 2개, 적어도 3개 또는 적어도 4개의 프라이머 세트를 포함하며, 이들 각각은 상이한 표적 유전자 또는 그로부터 역전사된 cDNA의 증폭을 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 키트는 대조군 RNA, 예컨대 내인성 대조군 및/또는 외인성 대조군을 증폭시키기 위한 적어도 하나의 프라이머 세트를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물에서 사용하기 위한 프로브 및/또는 프라이머는 데옥시리보뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물에서 사용하기 위한 프로브 및/또는 프라이머는 데옥시리보뉴클레오티드 및 하나 이상의 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 LNA 유사체 또는 상기 기재된 다른 이중체-안정화 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물에서 사용하기 위한 프로브 및/또는 프라이머는 모든 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로브 및/또는 프라이머는 상보성 영역에 하나 이상의 이중체-안정화 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 LNA 유사체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 실시간 RT-PCR 방법에서 사용하기 위한 키트는 역전사 및 증폭 반응에서 사용하기 위한 시약을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 효소, 예컨대 역전사효소 또는 열안정성 DNA 폴리머라제, 예컨대 Taq 폴리머라제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 역전사 및/또는 증폭에서 사용하기 위한 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트 (dNTP)를 추가로 포함한다. 추가 실시양태에서, 키트는 프로브 및 프라이머의 특이적 혼성화를 위해 최적화된 완충액을 포함한다.
키트는 일반적으로 하나 이상의 별도의 조성물로서 또는 임의로 시약의 호환성이 허용되는 부가혼합물로서 시약을 보유하는 하나 이상의 컨테이너를 갖는 패키지를 포함한다. 키트는 또한 사용자 관점으로부터 바람직할 수 있는 다른 물질(들), 예컨대 완충제(들), 희석제(들), 표준(들), 및/또는 샘플 프로세싱, 세척, 또는 검정의 임의의 다른 단계 수행에 유용한 임의의 다른 물질을 포함할 수 있다.
키트는 바람직하게는 본원에 기재된 하나 이상의 방법을 수행하기 위한 지시사항을 포함한다. 키트에 포함된 지시사항은 포장재에 부착될 수 있거나 패키지 삽입물로서 포함될 수 있다. 지시사항은 전형적으로 서면 또는 인쇄된 자료이지만, 이는 상기에 제한되지는 않는다. 이러한 지시사항을 저장하고 이를 최종 사용자에게 통신할 수 있는 임의의 매체가 본 발명에 의해 고려된다. 이러한 매체는 전자 저장 매체 (예를 들어, 자기 디스크, 테이프, 카트리지, 칩), 광학 매체 (예를 들어, CD ROM) 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "지시사항"은 지시사항을 제공하는 인터넷 사이트의 주소를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 키트는 하나 이상의 진엑스퍼트® 카트리지(들)에 제공된 상기 기재된 시약을 포함할 수 있다. 이들 카트리지는 추출, 증폭 및 검출이 이러한 독립적 "카트리지 내의 실험실" 내에서 수행되는 것을 허용한다. (예를 들어, 미국 특허 5,958,349, 6,403,037, 6,440,725, 6,783,736, 및 6,818,185 참조; 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.) 게놈 카피 수 수준을 측정하고 병원체를 검출하기 위한 시약은 키트 내의 별도의 카트리지에 제공될 수 있거나, 이들 시약 (멀티플렉스 검출에 적합)은 단일 카트리지에 제공될 수 있다.
본원에 기재된 임의의 키트는 일부 실시양태에서 비강 흡인물/세척액 샘플을 위한 리셉터클 및/또는 비인두 스왑 샘플을 수집하기 위한 스왑을 포함할 수 있다.
하기 실시예는 단지 예시를 위한 것이며, 어떠한 방식으로든 제한하려는 의도가 아니다.
6. 실시예
6.1. 실시예 1: SARS-CoV-2/플루/RSV 검정의 설계
인플루엔자 및 RSV를 검출하기 위한 프라이머 및 프로브의 설계에 적합한 유전자 단편은 먼저 유럽 분자 생물학 실험실 (EMBL)-유럽 생물정보학 연구소 (EBI) 서열 정렬 소프트웨어, ClustalW를 사용하여 RNA 세그먼트의 서열 정렬을 생성함으로써 식별되었다. ClustalW는 선택된 서열에 대한 최상의 매치를 계산하고 동일성, 유사성 및 차이점을 비교할 수 있도록 이를 정렬하는, 핵산 또는 단백질에 대한 범용 다중 서열 정렬 프로그램이다. 각 잠재적 표적에 대해, 표적을 구별하는 100-200 nt 길이의 서열 영역을 선택하였다. 영역을 또한 다형성 염기 치환의 빈도에 기초하여 선택하였으며; 고도로 보존된 영역을 선택하였다. 가음성 결과를 경감시키기 위해 중복 다중-표적 설계를 사용하였다.
선택된 영역에서 RNA 단편의 증폭을 위한 프라이머 및 프로브의 설계를 DNA 소프트웨어, 인크.(DNA Software, Inc.)의 Visual OMP (올리고뉴클레오티드 모델링 플랫폼)를 사용하여 수행하였다. Visual OMP는 DNA, RNA, PNA 및 이노신에 대한 독점 최근접-이웃 및 다중-상태 열역학 파라미터 뿐만 아니라 모든 공개 도메인 열역학 파라미터를 혼입함으로써 단일-가닥 핵산의 폴딩 및 혼성화를 인실리코 모델링한다. 이는 복잡한 검정, 예컨대 마이크로어레이, 마이크로플루이딕스 애플리케이션 및 멀티플렉스 PCR을 위한 프라이머 및 프로브의 효과적인 설계를 가능하게 한다. 인실리코 실험은 명시된 조건에서 표적 (최적 및 차선), 프라이머 (최적 및 차선), 동종이량체, 및 표적 및 프라이머 이종이량체에 대한 2차 구조를 시뮬레이션한다. 용융 온도 (Tm), 자유 에너지 (ΔG), 결합 퍼센트, 및 모든 종에 대한 농도에 대한 값을 계산한다. 또한, Visual OMP는 단일 또는 멀티플렉스 반응에서 표적(들)과 프라이머 및 프로브 사이의 결합 효율을 예측한다.
이 소프트웨어 도구를 사용하여, 올리고뉴클레오티드 및 상이한 플루 표적 사이의 예측된 상호작용을 열역학적으로 평가하고, 원치않는 상호작용을 최소화하였다.
그 후, 선택된 프라이머 및 프로브를 BLAST 검색에 적용하였다. 예상된 전장 앰플리콘 서열을 나타내는 올리고를 단독으로 및 조합으로 문의하였다.
표 A에 나타낸 바와 같은 플루 A PB2 및 PA 표적 유전자, 플루 A 1 매트릭스 단백질 (MP) 유전자, 플루 A 2 (조류 단리물) MP 유전자, 플루 B MP 유전자, 플루 B NS 유전자, 및 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV) A 및 B를 검출하기 위해 상기 기재된 바와 같이 프라이머 및 프로브를 설계하였다.
SARS-CoV-2를 검출하기 위한 프라이머 및 프로브를 설계하고, 패널에 첨가하였다. 대략 80개의 프라이머/프로브 조합을 심플렉스, 이중체로, 및 표 A에 나타낸 바와 같은 플루/RSV 프라이머/프로브의 존재 하에 스크리닝하였다. 예시적인 SARS-CoV-2 프라이머 및 프로브는 표 A에 나타낸다.
SARS-CoV-2를 검출하기 위한 표적으로서 SARS-CoV-2 Orf1ab 유전자를 평가하였다. 또한, SARS-CoV-2를 검출하기 위한 표적으로서 RDRP 유전자를 평가하였다.
SARS-CoV-2/플루/RSV 멀티플렉스 검정의 예시적인 프라이머 및 프로브 조성은 표 B에 나타낸다.
표 B: 프라이머 및 프로브 농도
Figure pct00004
표 B에 제시된 바와 같이, SARS-CoV-2 E 프로브 및 SARS-Cov-2 N2 프로브 각각은 300-400nM 농도에서 PCR 반응에서 신호 대 노이즈 비율을 최적화하는 것으로 나타났다. SARS-CoV-2 E 프로브 및 SARS-CoV-2 N2 프로브에 대한 농도는 또한 각 검출 프로브에 대해 대략 600 nM/비드일 수 있다.
6.2. 실시예 2: SARS-CoV-2/플루/RSV 검정의 성능
표 C는 SARS-CoV-2 마커만을 검출하는 검정 및 플루/RSV 마커만을 검출하는 검정과 비교하여 SARS-CoV-2/플루/RSV 멀티플렉스 검정의 성능을 보여준다. 표 C의 데이터는 4-플렉스 검정에서 각 마커에 대해 1x LOD에서 정량화된 참조 물질을 사용한 10개 테스트의 평균 Ct 값을 보여준다. 대조군을 엑스퍼트(XPERT)® 엑스프레스 SARS-CoV-2 검정 및 엑스퍼트® 엑스프레스 플루 RSV 검정에서 병렬로 실행하였다.
표 C: SARS-CoV-2/플루/RSV 검정의 성능
Figure pct00005
6.3. 실시예 3: SARS-CoV-2/플루/RSV 검정의 임상 성능
6.3.1. 임상 평가
바이러스 수송 배지에 보관된 임상 비인두 (NP) 스왑 표본을 사용하여 SARS-CoV-2/플루/RSV 멀티플렉스 검정의 성능을 평가하였다. 보관된 표본을 날짜 및 이전에 공지된 분석물질 결과에 의해 연속적으로 선택하였다. 총 240개의 NP 스왑 표본을 SARS-CoV-2 테스트 및 FDA-승인 엑스퍼트® 엑스프레스 플루/RSV 테스트와 나란히 SARS-CoV-2/플루/RSV 멀티플렉스 검정으로 무작위 및 맹검 방식으로 테스트하였다.
SARS-CoV-2 표적에 대한 SARS-CoV-2 테스트 결과 및 플루 A, 플루 B 및 RSV 표적에 대한 엑스퍼트® 엑스프레스 플루/RSV 결과와 SARS-CoV-2/플루/RSV 멀티플렉스 검정의 결과를 각각 비교함으로써 양성 일치 퍼센트 (PPA) 및 음성 일치 퍼센트 (NPA)를 결정하였다.
SARS-CoV-2/플루/RSV 멀티플렉스 검정은 SARS-CoV-2의 경우 각각 97.9% 및 100.0%의 PPA 및 NPA; 플루 A의 경우 각각 100.0% 및 100.0%; 플루 B의 경우 각각 100.0% 및 99.0%; RSV의 경우 각각 100.0% 및 100.0%를 나타내었다 (표 D).
표 D: SARS-CoV-2/플루/RSV 멀티플렉스 검정 성능 결과
Figure pct00006
6.3.2. 분석 민감도 (검출 한계)
SARS-CoV-2/플루/RSV 멀티플렉스 검정의 분석 민감도를 임상 및 실험실 표준 연구소 (CLSI) 문서 EP17-A2의 지침에 따라 풀링된 음성 임상 NP 스왑 매트릭스로 6개의 호흡기 바이러스 (NATtrol SARS-CoV-2, 플루 A H1, 플루 H3, 플루 B, RSV A 및 RSV B)의 제한 희석 및 1개의 시약 로트로 평가하였다. 프로빗 회귀 분석에 의해 결정된 바와 같은 추정 LoD 값을 SARS-CoV-2/플루/RSV 멀티플렉스 검정 시약의 2개 로트를 사용하여 입증하였다. 테스트된 바이러스에 대한 입증된 LoD 값은 표 E에 요약되어 있다.
표 E: SARS-CoV-2/플루/RSV 멀티플렉스 검정 검출 한계
Figure pct00007
6.3.3. 분석적 반응성 (포괄성)
2개의 표적, E 및 N2에 대한 GISAID 유전자 데이터베이스에서 이용가능한 48,461개의 SARS-CoV-2 서열과 관련하여 검정 앰플리콘의 인실리코 분석을 사용하여 SARS-CoV-2/플루/RSV 멀티플렉스 검정의 포괄성을 평가하였다. RdRP 표적에 대해 유사한 분석을 수행하였다.
E 표적의 분석을 위해, 모호한 뉴클레오티드로 인해 113개의 서열이 배제되었으며, 이는 총 48,348개의 서열로 감소시켰다. 48,348개의 GISAID 서열 중, 48,108개 (99.5%)는 SARS-CoV-2/플루/RSV 멀티플렉스 검정에서 생성된 SARS-CoV-2 E 표적 앰플리콘과 정확히 매치하였다. 223개의 서열에 대해 단일 뉴클레오티드 미스매치가 관찰되었고, 17개의 서열에 대해 2개의 미스매치가 관찰되었다. 2개의 미스매치를 갖는 17개의 서열 중, 2개의 서열은 정방향 프라이머 영역에 2개의 미스매치를 함유하였고, 3개의 서열은 역방향 프라이머에 'GA" 디뉴클레오티드를 갖고, 12개의 서열은 검정에 사용된 올리고뉴클레오티드 사이에 있는 'AA' 디뉴클레오티드를 함유하였다. 이들 미스매치 중 어느 것도 검정의 성능에 영향을 미치지 않을 것으로 예상된다.
N2 표적의 분석을 위해, 모호한 뉴클레오티드로 인해 129개의 서열이 배제되었으며, 이는 평가에서 사용된 총 서열을 48,332개의 서열로 감소시켰다. 48,332개의 GISAID 서열 중, 47,962개 (99.2%)는 SARS-CoV-2/플루/RSV 멀티플렉스 검정에서 생성된 SARS-CoV-2 N2 표적 앰플리콘과 정확히 매치하였다. 369개의 서열에 대해 단일 뉴클레오티드 미스매치가 관찰되었고, 하나의 서열에 대해 3개의 미스매치가 관찰되었다. 3개의 변이체 위치를 갖는 하나의 서열의 경우, 미스매칭된 뉴클레오티드 중 2개가 프로브 영역에 있고, 프로브 결합에 영향을 미칠 수 있다. 다른 미스매치 중 어느 것도 검정 성능에 부정적인 영향을 미치지 않을 것으로 예상된다.
플루 및 RSV 바이러스에 대한 SARS-CoV-2/플루/RSV 멀티플렉스 검정의 포괄성은 엑스퍼트® 엑스프레스 플루/RSV 테스트의 분석적 반응성 평가에 대해 보고된 것과 같다. 공공 데이터베이스에서 RSV 서열의 인실리코 분석은 특히 RSV A에 대한 일부 프라이머 및 프로브 설계에 기초하여 검출되지 않을 수 있는 NCBI 데이터베이스에 일부 기탁된 서열을 나타내었다. RSV에 대해 본원에 개시된 프라이머 및 프로브는 RSV A의 개선된 커버리지를 제공한다.
분석 LoD 근처 수준에서 인플루엔자 A H1N1 (계절성 pre-2009), 인플루엔자 A H1N1 (팬데믹 2009), 인플루엔자 A H3N2 (계절성), 조류 인플루엔자 A (H5N1, H5N2, H6N2, H7N2, H7N3, H2N2, H7N9 및 H9N2), 인플루엔자 B (빅토리아 및 야마가타 계통 둘 모두로부터의 균주를 나타냄), 및 호흡기 세포융합 바이러스 서브그룹 A 및 B (RSV A 및 RSV B)의 다중 균주에 대한 엑스퍼트® 엑스프레스 플루/RSV 테스트를 평가하였다. 48개의 인플루엔자 바이러스 (35개의 인플루엔자 A 및 13개의 인플루엔자 B) 및 5개의 RSV 균주로 구성된 총 53개의 균주를 이 연구에서 엑스퍼트® 엑스프레스 플루/RSV 테스트로 테스트하였다. 각 균주에 대해 3개의 복제물을 테스트하였다. 0.1 TCID50/mL에서 3개의 복제물 중 2개에서 양성으로 테스트된 1개의 플루 A H1N1 균주 (A/뉴저지/8/76)를 제외하고, 모든 플루 및 RSV 균주는 모든 3개 복제물에서 양성으로 테스트되었다. 결과는 표 F에 나타낸다. 인실리코 분석으로부터 예측된 교차 반응성은 추가 pH1N1 균주에 대해 100% 서열 상동성을 나타내었다.
표 F: 엑스퍼트® 엑스프레스 플루/RSV 테스트의 분석적 반응성 (포괄성)
Figure pct00008
Figure pct00009
a. 시뮬레이션된 배경 매트릭스에서 정제된 바이러스 RNA는 생물안전성 규정으로 인해 조류 인플루엔자 A 바이러스에 사용되었다.
b. 바이러스 역가가 없는 불활성화된 조류 인플루엔자 A (H7N9) 바이러스는 시뮬레이션된 배경 매트릭스에서 100,000배 희석되었고, 생물안전성 규정으로 인해 테스트되었다.
c. 공지된 빅토리아 계통.
d. 공지된 야마가타 계통.
6.3.4. 분석 특이성 (독점성)
SARS-CoV-2/플루/RSV 멀티플렉스 검정에서 프라이머 및 프로브를 GISAID 데이터베이스로부터 다운로드한 서열에 개별적으로 매핑함으로써 표 G에 나열된 모든 유기체와의 가능한 교차-반응에 대한 인실리코 분석을 수행하였다. E 프라이머 및 프로브는 SARS-CoV-2에 특이적이지 않으며, 인간 및 박쥐 SARS-코로나바이러스를 검출할 것이다. 인실리코 분석에 기초하여 표 G에 나열된 다른 유기체와의 잠재적인 의도하지 않은 교차 반응성은 예상되지 않는다.
표 G: SARS-CoV-2/플루/RSV 멀티플렉스 검정 분석 특이성 미생물
Figure pct00010
플루 A, 플루 B 및 RSV 바이러스에 대한 SARS-CoV-2/플루/RSV 멀티플렉스 검정의 분석 특이성은 엑스퍼트® 엑스프레스 플루/RSV 테스트의 분석 독점성 평가에 대해 보고된 것과 같다. 일반적인 호흡기 병원체 또는 비인두에서 잠재적으로 접할 수 있는 병원체를 나타내는 16개의 바이러스, 26개의 박테리아 및 2개의 효모 균주로 이루어진 44개의 배양물 패널을 테스트함으로써 엑스퍼트® 엑스프레스 플루/RSV 테스트의 분석 특이성을 평가하였다. 1 x 105 CFU/mL (클라미디아 뉴모니아에)에서 테스트된 하나의 균주를 제외하고 각 박테리아 및 효모 균주의 3개 복제물을 ≥ 1 x 106 CFU/mL의 농도에서 테스트하였다. ≥ 1 x 105 TCID50/mL의 농도에서 각 바이러스의 3개 복제물을 테스트하였다. 분석 특이성은 100%였다. 결과는 표 H에 나타낸다.
표 H: 엑스퍼트® 엑스프레스 플루/RSV 테스트의 분석 특이성
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
6.3.5. 경쟁적 간섭
시뮬레이션된 배경 매트릭스에서 더 높은 농도의 상이한 표적 균주의 존재 하에 LoD 근처에서 개별 SARS-CoV-2, 플루 A, 플루 B 또는 RSV 균주를 테스트함으로써 공동-감염에 의해 야기된 SARS-CoV-2/플루/RSV 멀티플렉스 검정의 경쟁적 간섭을 평가하였다. LoD에서의 농도는 SARS-CoV-2의 경우 131 카피/mL였고, 플루 및 RSV 균주의 경우 0.04 TCID50/mL 내지 0.43 TCID50/mL의 범위였으며; 경쟁적 균주를 104 역가 단위 (카피/mL, TCID50/mL, CEID50/mL 또는 PFU/mL)에서 평가하였다. SARS-CoV-2 (불활성화된 USA-WA1/2020), 플루 A H3 (H3/빅토리아/361/2011), 플루 B (B/Mass/02/2012), RSV A (RSV-A/2/호주/61) 및 RSV B (RSV-B/Wash/18537/62)의 균주를 사용하여 분석적 경쟁적 간섭을 평가하였다. 20개의 복제물을 각 표적 균주 및 각 경쟁적 균주 조합에 대해 테스트하였다. LoD에서 20개의 복제물 샘플에서 정규 이항 분포는 N=20, p=0.95 (X~Bin(20,0.95))인 이항 분포에 기초하여 17 내지 20개의 양성 결과이다. 따라서, 16개 이하의 양성이 있는 20개 세트는 드물고, 높은 수준의 경쟁 분석물질로 인한 경쟁적 억제 효과를 나타낸다.
131 카피/mL의 SARS-CoV-2에서, 1 x 104 CEID50/mL의 플루 A/빅토리아/361/2011의 존재 하에 경쟁적 억제 효과가 관찰되었다. 더 낮은 농도의 플루 A/빅토리아/361/2011 (1 x 103 CEID50/mL)에서 경쟁적 억제 효과가 관찰되지 않았다.
131 카피/mL의 SARS-CoV-2에서, 1 x 104, 1 x 103 및 1 x 102 TCID50/mL의 플루 B/Mass/2/2012의 존재 하에 경쟁적 억제 효과가 관찰되었다. 더 낮은 농도의 플루 B/Mass/2/2012 (1 x 101 TCID50/mL)에서 경쟁적 억제 효과가 관찰되지 않았다.
SARS-CoV-2가 1310 카피/mL (10x LoD)로 증가한 경우, 1 x 104 TCID50/mL의 플루 B/Mass/2/2012에서 경쟁적 억제 효과가 더 이상 관찰되지 않았다.
1 x 104 PFU/mL의 RSV A/2/호주/61 또는 1 x 104 TCID50/mL의 RSV B/Wash/18537/62의 존재 하에 131 카피/mL의 SARS-CoV-2에서, 경쟁적 억제 효과가 관찰되지 않았다.
1 x 104 카피/mL SARS-CoV-2 바이러스의 존재 하에 0.087 TCID50/mL의 플루 A/빅토리아/361/2011에서, 경쟁적 억제 효과가 관찰되지 않았다.
0.04 TCID50/mL의 플루 B/Mass/2/2012에서, 1 x 104 CEID50/mL의 플루 A/빅토리아/361/2011의 존재 하에 경쟁적 억제 효과가 관찰되었다. 더 낮은 농도의 플루 A/빅토리아/361/2011 (1 x 103 CEID50/mL)에서 경쟁적 억제 효과가 관찰되지 않았다.
1 x 104 카피/mL SARS-CoV-2 바이러스의 존재 하에 0.04 TCID50/mL의 플루 B/Mass/2/2012에서, 경쟁적 억제 효과가 관찰되지 않았다.
0.43 TCID50/mL의 RSV A/2/호주/61에서, 1 x 104 CEID50/mL의 플루 A/빅토리아/361/2011의 존재 하에 경쟁적 억제 효과가 관찰되었다. 더 낮은 농도의 플루 A/빅토리아/361/2011 (1 x 103 CEID50/mL)에서 경쟁적 억제 효과가 관찰되지 않았다.
0.43 TCID50/mL의 RSV A/2/호주/61에서 1 x 104 카피/mL SARS-CoV-2 바이러스의 존재 하에, 이 조건에 대해 경쟁적 억제 효과가 관찰되지 않았다.
0.13 TCID50/mL의 RSV-B/Wash/18537/62에서, 1 x 104 CEID50/mL의 플루 A/빅토리아/361/2011의 존재 하에 경쟁적 억제 효과가 관찰되었다. 더 낮은 농도의 플루 A/빅토리아/361/2011 (1 x 103 CEID50/mL)에서 경쟁적 억제 효과가 관찰되지 않았다.
0.13 TCID50/mL의 RSV-B/Wash/18537/62에서, 1 x 104 TCID50/mL의 플루 B/Mass/2/2012의 존재 하에 경쟁적 억제 효과가 관찰되었다. 더 낮은 농도의 플루 B/Mass/2/2012 (1 x 101 TCID50/mL)에서 경쟁적 억제 효과가 관찰되지 않았다.
RSV-B/Wash/18537/62가 1.3 TCID50/mL (~10x LoD)로 증가한 경우, 1 x 104 TCID50/mL의 플루 B/Mass/2/2012에서 경쟁적 억제 효과가 더 이상 관찰되지 않았다.
0.13 TCID50/mL의 RSV-B/Wash/18537/62에서 1 x 104 카피/mL SARS-CoV-2 바이러스의 존재 하에, 이 조건에 대해 경쟁적 억제 효과가 관찰되지 않았다.
6.3.6. 잠재적 간섭 물질
비인두에 존재할 수 있고 (또는 표본 수집 및 취급 동안 도입될 수 있고) SARS-CoV-2, 플루 A, 플루 B 및 RSV의 정확한 검출을 간섭할 수 있는 잠재적 간섭 물질을 SARS-CoV-2/플루/RSV 멀티플렉스 검정에 대한 선택 직접 테스트로 평가하고, 엑스퍼트® 엑스프레스 플루/RSV 테스트의 간섭 평가로부터 외삽하였다.
비강 통로 및 비인두에서 잠재적 간섭 물질은 혈액, 비강 분비물 또는 점액, 및 충혈, 비강 건조, 자극 또는 천식 및 알레르기 증상을 완화하기 위해 사용되는 비강 및 인후 약제, 뿐만 아니라 항생제 및 항바이러스제를 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 샘플 프로세싱 대조군 (SPC)의 성능에 대한 효과를 결정하기 위해 각 물질의 존재 하에 음성 샘플 (N = 8)을 테스트하였다. 각 균주에 대해 결정된 3x 분석 LoD에서 스파이킹된 바이러스로 물질당 양성 샘플 (N = 8)을 테스트하였다. SARS-CoV-2/플루/RSV 멀티플렉스 검정으로 테스트된 양성 샘플은 1개의 SARS-CoV-2, 2개의 인플루엔자 A, 1개의 인플루엔자 B 및 2개의 RSV (RSV A 및 RSV B) 균주를 포함한 반면, 엑스퍼트® 엑스프레스 플루/RSV로 테스트된 것들은 6개의 인플루엔자 (4개의 인플루엔자 A 및 2개의 인플루엔자 B) 및 4개의 RSV (2개의 RSV A 및 2개의 RSV B)로 이루어졌다. 모든 결과를 양성 및 음성 시뮬레이션된 비강 매트릭스 대조군과 비교하였다. 시뮬레이션된 비강 매트릭스는 2.5% (w/v) 돼지 뮤신, 15% 글리세롤을 갖는 1x PBS 용액에 제형화된 0.85% 염화나트륨 (NaCl) 중 1% (v/v) 인간 전혈로 이루어졌으며, 그 후 범용 수송 배지 (UTM)에서 2.5% v/v의 농도로 희석하였다. 평가된 물질은 표시된 활성 성분 및 테스트된 최종 농도와 함께 표 I에 나열되어 있다. 물질 중 어느 것도 이 연구에서 테스트된 농도에서 검정 성능의 간섭을 유발하지 않았다. 모든 양성 및 음성 복제물은 SARS-CoV-2/플루/RSV 멀티플렉스 검정 및/또는 엑스퍼트® 엑스프레스 플루/RSV 테스트에 의해 정확하게 식별되었다.
표 I: SARS-CoV-2/플루/RSV 멀티플렉스 검정에서 잠재적 간섭 물질
Figure pct00014
a. SARS-CoV-2/플루/RSV 멀티플렉스 검정으로 직접적으로 평가된 물질/활성 성분 및 농도.
b. 2.5%의 농도에서 관찰된 엑스퍼트® 엑스프레스 플루/RSV 성능에 대한 간섭 없음
본 출원에 인용된 모든 간행물, 특허, 특허 출원 및 기타 문서는 각각의 개별 간행물, 특허, 특허 출원 또는 기타 문서가 개별적으로 모든 목적을 위해 참조로 포함되는 것으로 표시된 것과 동일한 정도로 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
다양한 특정 실시양태가 예시되고 설명되었지만, 본 발명(들)의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 변경이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다.
특정 서열의 표
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
SEQUENCE LISTING <110> CEPHEID <120> METHODS OF DETECTING SARS-COV-2, INFLUENZA, AND RSV <130> 01148-0016-00PCT <150> US 63/044,902 <151> 2020-06-26 <150> US 63/074,809 <151> 2020-09-04 <160> 81 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 3151 <212> DNA <213> Influenza A virus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3151) <223> Flu A 1 polymerase basic 2 (PB2) gene (KC471406.1 for Influenza A virus A/Swine/Korea/ CY02-09/2012 (H3N2) segment 1) <400> 1 atggagagaa taaaagaact aagagatcta atgtcgcagt ctcgcactcg cgagatactc 60 actaagacca ctgtggacca tatggccata atcaaaaagt acacgtcagg aaggcaggag 120 aagaaccccg cactcagaat gaaatggatg atggcaatga aatacccaat tacagcagac 180 aggagaataa tggacatgat tccagagagg aatgaacaag gacaaaccct ctggagcaaa 240 acaaccgatg ctggatcgga ccgtgtgatg gtatcacccc tggccgtaac atggtggaat 300 aggaatggcc caacaacaag cacagttcac taccctaagg tatacaaaac ttatttcgaa 360 aaagtcgaaa ggttaaaaca tggtaccttt ggccctgtcc acttcagaaa tcaagttaaa 420 ataagaagga gggttgacac aaaccccggt catgcagatc tcagtgccaa 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tcatgcagat ctcagtgcca aggaggcaca ggatgtgatc atggaagttg ttttcccaaa 1380 cgaagtgggg gcaagaatac tgacatcaga gtcacagctg acaataacaa aagaaaagaa 1440 agaagagctc caggattgta aaattgctcc cttgatggtg gcatacatgc tagaaagaga 1500 attggttcgt aagacgaggt ttcttccggt ggctggtgga acaagcagtg tttatattga 1560 agtgctgcac ttaactcagg gaacatgttg ggaacaaatg tacactccag gaggagaagt 1620 gagaaatgat gatgttgacc aaagtttgat tatcgccgct agaaacatag taagaagagc 1680 agcagtgtca gcagacccat tagcatctct cttggaaatg tgccacagca cacaaattgg 1740 aggaataagg atgatggaca tccttagaca gaacccaacg gaggaacaag ccgtagacat 1800 atgcaaggca gcaatggggc tgaggattag ctcctctttc agctttggtg ggttcacctt 1860 caaaaggaca agcggatcat ctgttaagaa agaagaagaa gtgctcacgg gcaacctcca 1920 aacactgaaa ataagagtac atgaaggata tgaggaattc acaatggtcg ggagaagagc 1980 aacagctatt ctcagaaaag caaccaggag attgatccag ttaatagtaa gtggaagaga 2040 cgatcaatca attgctgagg caataattgt ggccatggta ttttcacaag aggattgcat 2100 gatcaaagca gttaggggcg atctgaactt tgtcaatagg gcaaaccagc gactgaatcc 2160 catgcaccaa ctcttgaggc atttccaaaa ggatgcaaaa gtgcttttcc agaactgggg 2220 gattgaaccc atcgacagtg taatgggaat gatcggaata ttgcctgata tgaccccaag 2280 cacggaaatg tcactgagag gtataagagt cagcaaaatg ggagtagatg aatattccag 2340 tacggagaga gtggtagtga gcattgaccg atttttgaga gttcgggatc aacgagggaa 2400 cgtactattg tcccccgaag aggtcagcga gacacaggga actgagaaat tgaccataac 2460 ttattcgtca tcaatgatgt gggagatcaa tggtcctgag tcagtgctgg tcaacactta 2520 tcaatggatc ataaggaact gggaaagctt gaaaattcaa tggtcacagg atcccacgat 2580 gttatacaac aaaatggaat ttgaaccatt ccagtctctt gtccctaagg caaccagaag 2640 tcgttacagt ggattcgtga ggacactgtt ccagcaaatg cgggatgtgc ttggaacatt 2700 tgatactgtc caaataataa agcttctccc ctttgctgca gctccaccgg aacagagtag 2760 gatgcagttc tcctcgctga ctgtgaatgt aagaggatca gggctgagga tactggtaag 2820 aggcaattct ccagtgttca attacaataa agcaaccaaa aggcttacaa ttcttggaaa 2880 agatgcaggt gcattgactg aagatccaga tgaaggcaca gctggagtgg agtctgctgt 2940 cctgagggga ttcctcattt tgggtaaaga agacaagaga tatggcccag cattaagcat 3000 caatgaactg agcaatcttg caaaaggaga gaaggctaat gtgctaattg ggcaaggaga 3060 cgtggtgttg gtaatgaaac ggaaacggga ctctagcata cttactgaca gccagacagc 3120 gaccaaaagg attcggatgg ccatcaatta g 3151 <210> 2 <211> 2587 <212> DNA <213> Influenza A virus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2587) <223> Flu A 1 polymerase acidic (PA) gene (consensus sequence, KC471368.1 Influenza A virus A/Swine/Korea/ CY01-04/2012 (H1N1) segment 3) <400> 2 atggaagact ttgtgcgaca atgcttcaat ccgatgatcg tcgagcttgc ggaaaaggca 60 atgaaagaat atggggaaga tccgaaaatc gaaactaaca agtttgctgc aatatgcaca 120 catttggaag tttgtttcat gtattcggat ttccatttca tcgacgaacg gggtgaatca 180 ataattgtag aatctggtga cccgaatgca ctattgaagc accgatttga gataattgaa 240 ggaagagacc gaatcatggc ctggacagtg gtgaacagta tatgtaacac aacaggggta 300 gagaagccta aatttcttcc tgatttgtat gattacaaag aaaaccggtt cattgaaatt 360 ggagtaacac ggagggaagt ccacatatat tacctagaga aagccaacaa aataaaatct 420 gagaagacac acattcatgg aagactttgt gcgacaatgc ttcaatccga tgatcgtcga 480 gcttgcggaa aaggcaatga aagaatatgg ggaagatccg aaaatcgaaa ctaacaagtt 540 tgctgcaata tgcacacatt tggaagtttg tttcatgtat tcggatttcc atttcatcga 600 cgaacggggt gaatcaataa ttgtagaatc tggtgacccg aatgcactat tgaagcaccg 660 atttgagata attgaaggaa gagaccgaat catggcctgg acagtggtga acagtatatg 720 taacacaaca ggggtagaga agcctaaatt tcttcctgat ttgtatgatt acaaagaaaa 780 ccggttcatt gaaattggag taacacggag ggaagtccac atatattacc tagagaaagc 840 caacaaaata aaatctgaga agacacacat tcacatcttt tcattcactg gagaggagat 900 ggccaccaaa gcagactaca cccttgacga agagagcagg gcaagaatca aaactaggct 960 tttcactata agacaagaaa tggccagtag gagtctatgg gattcctttc gtcaatccga 1020 aagaggcgaa gagacaattg aagaaaaatt tgagattaca ggaactatgc gcaagcttgc 1080 cgaccaaagt ctcccaccga acttctccag ccttgaaaac tttagagcct atgtagatgg 1140 attcgagccg aacggctgca ttgagggcaa gctttcccaa atgtcaaagg aagtgaacgc 1200 caaaattgaa ccattcttga ggacgacacc acgccccctc agattgcctg atgggcctct 1260 ttgccatcag cggtcaaagt tcctgctgat ggatgctctg aaattaagta ttgaagaccc 1320 gagtcacgag ggagagggaa taccactata tgatgcaatc aaatgcatga agacattctt 1380 tggctggaaa gagcctaaca tagtcaaacc acataagaaa ggcataaatc ccaattacct 1440 tatggcttgg aagcaggtgc taacagagct acaggacatt gaaaatgaag agaagatccc 1500 aaggacaaag aacatgaaga gaacaagcca attgaagtgg gcactcggtg aaaatatggc 1560 accagaaaaa gtagactttg atgactgcaa agatgttgga gaccttaaac agtatgacag 1620 tgatgagcca gagcccagat ctctagcaag ctgggtccaa aatgaattca ataaggcatg 1680 tgaattgact gattcaagct ggatagaact tgatgaaata ggagaagatg ttgccccgat 1740 tgaacatatc gcaagcatga ggaggaacta ttttacagca gaagtgtccc actgcagggc 1800 tactgaatac ataatgaagg gagtgtacat aaatacggcc ttgctcaatg catcctgtgc 1860 agccatggat gactttcagc tgatcccaat gataagcaaa tgtaggacca aagaaggaag 1920 acggaaaaca aacctgtatg ggttcattat aaaaggaagg tctcatttga gaaatgatac 1980 tgatgtggtg aactttgtaa gtatggagtt ctcactcact gacccgagac tggagccaca 2040 caaatgggaa aaatactgtg ttcttgaaat aggagacatg ctcttgagga ctgcgatagg 2100 ccaagtgtcg aggcccatgt tcctatatgt gagaaccaat ggaacctcca agatcaagat 2160 gaaatggggc atggaaatga ggcgctgcct tcttcagtcc cttcagcaga ttgagagcat 2220 gattgaggcc gagtcttctg tcaaagagaa agacatgacc aaggaattct ttgaaaacaa 2280 atcagaaaca tggccaatcg gagagtcacc cagaggagtg gaggaaggct ctattgggaa 2340 agtgtgcagg accttactgg caaaatctgt gttcaacagt ctatatgcgt ctccacaact 2400 tgaggggttt tcggctgaat cgagaaaatt gcttctcatt gttcaggcac ttagggacaa 2460 cctggaacct ggaaccttcg atcttggggg gctatatgaa gcaatcgagg agtgcctgat 2520 taatgatccc tgggttttgc ttaatgcatc ttggttcaac tccttcctca cacatgcact 2580 gaagtag 2587 <210> 3 <211> 982 <212> DNA <213> Influenza A virus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(982) <223> Flu A 1 matrix protein (MP) gene (consensus sequence KC951136.1 of segment 7 from A/Swine/ Pennsylvania/ A01432652/2013 (H3N2)) <400> 3 atgagtcttc taaccgaggt cgaaacgtac gttctttcta tcataccgtc aggccccctc 60 aaagccgaga tcgcgcagag actggaaagt gtctttgcag gaaagaacac agatcttgag 120 gctctcatgg aatggctaaa gacaagacca atcttgtcac ctttgactaa gggaatttta 180 ggatttgtgt tcacgctcac cgtgcccagt gagcgaggac tgcagcgtag acgctttgtc 240 caaaatgccc taaatgggaa tggggaccca aacaacatgg atagagcagt taaactatac 300 aagaagctca aaagagaaat aacgttccat ggggccaagg aggtgtcact aagctattca 360 actggtgcac ttgccagttg catgggcctc atatacaaca ggatgggaac agtgaccaca 420 gaagctgctt ttggtctagt gtgtgccact tgtgaacaga ttgctgattc acagcatcgg 480 tctcacagac agatggctac taccaccaat ccactaatca ggcatgagaa cagaatggtg 540 ctggctagca ctacggcaaa ggctatggaa cagatggctg gatcgagtga acaggcagcg 600 gaggccatgg aggttgctaa tcagactagg cagatggtac atgcaatgag aactattggg 660 actcatccta gctccagtac tggtctgaaa gatgaccttc ttgaaaattt gcaggcctac 720 cagaagcgaa tgggagtgca gatgcagcga ttcaagtgat cctctcgcca ttgcagcaaa 780 tatcattggg atcttgcacc tgatattgtg gattactgat cgtctttttt tcaaatgtat 840 ttatcgtcgc tttaaatacg gtttgaaaag agggccttct acagaaggag tgcctgagtc 900 catgagggaa gaatatcaac aggaacagca gagtgctgtg gatgttgacg atggtcattt 960 tgtcaacata gagctagagt aa 982 <210> 4 <211> 931 <212> DNA <213> Influenza A virus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(931) <223> Flu A 2 1 matrix protein (MP) gene (consensus sequence, KF018056.1 Influenza A virus A/Taiwan/ T02081/2013 (H7N9) segment 7) <400> 4 cgtacgttct atctatcatt ccatcaggcc ccctcaaagc cgagatcgcg cagagacttg 60 aggatgtttt tgcagggaag aacgcagatc tcgaggctct catggagtgg ataaagacaa 120 gaccaatcct gtcacctctg actaagggga ttttagggtt tgtgttcacg ctcaccgtgc 180 ccagtgagcg aggactgcag cgtagacggt ttgtccaaaa cgccctaaat gggaatggag 240 acccaaacaa catggacaag gcagttaaat tatacaagaa actgaagagg gaaatgacat 300 tccatggagc aaaggaagtt gcactcagtt actcaactgg tgcgcttgcc agctgcatgg 360 gtctcatata caacaggatg gggacagtaa ctgcagaagg ggctcttgga ttggtatgtg 420 ccacttgtga gcagattgct gacgcacaac atcggtccca caggcagatg gcaactacta 480 ccaacccact aattaggcat gagaatagaa tggtactagc cagtactacg gctaaggcta 540 tggagcagat ggctggatca agtgaacagg cagcggaagc catggaagtt gcaagccagg 600 ctaggcaaat ggtgcaggct atgagaacag tcgggactca ccctaactcc agtacaggtc 660 taaaggatga tcttattgaa aatttgcagg cttaccagaa ccggatggga gtgcaactgc 720 agcggttcaa gtgatcctct cgttgttgca gctaacatta ttgggatatt gcacttgata 780 ttgtggattc ttgatcgtct tttcttcaaa tgcatttatc gtcgctttaa atacggtttg 840 aaaagagggc cttctacgga aggaatgcct gagtctatga gggaagaata tcggcaggaa 900 cagcagaatg ctgtggatgt tgacgatggt c 931 <210> 5 <211> 1683 <212> DNA <213> Influenza A virus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1683) <223> Flu A 3 haemagglutinin (HA) gene (consensus sequence, KC896763.1 Influenza A virus A/Nanjing/ 2913/2013 (H7N9) segment 4) <400> 5 atgaacactc aaatcctggt attcgctctg attgcgatca ttccaacaaa tgcagacaaa 60 atctgcctcg gacatcatgc cgtgtcaaac ggaaccaaag taaacacatt aactgaaaga 120 ggagtggaag tcgtcaatgc aactgaaaca gtggaacgaa caaacatccc caggatctgc 180 tcaaaaggga aaatgacagt tgacctcggt caatgtggac tcctggggac aatcactgga 240 ccacctcaat gtgaccaatt cctagaattt tcagccgatt taattattga gaggcgagaa 300 ggaagtgatg tctgttatcc tgggaaattc gtgaatgagg aagctctgag gcaaatactc 360 agagaatcag gcggaattga caaggaagca atgggattca catacagtgg aataagaact 420 aatggagcaa ccagtgcatg taggagatca ggatcttcat tctatgcaga aatgaaatgg 480 ctcctgtcaa acacagataa tgctgcattc ccgcagatga ctaagtcata taaaaataca 540 agaaaaagcc cagctctaat agtatggggg atccatcatt ccgtatcaac tgcagagcaa 600 accaagctat atgggagtgg aaacaaactg gtgacagttg ggagttctaa ttatcaacaa 660 tcttttgtac cgagtccagg agcgagacca caagttaatg gtctatctgg aagaattgac 720 tttcattggc taatgctaaa tcccaatgat acagtcactt tcagtttcaa tggggctttc 780 atagctccag accgtgcaag cttcctgaga ggaaaatcta tgggaatcca gagtggagta 840 caggttgatg ccaattgtga aggggactgc tatcatagtg gagggacaat aataagtaac 900 ttgccatttc agaacataga tagcagggca gttggaaaat gtccgagata tgttaagcaa 960 aggagtctgc tgctagcaac agggatgaag aatgttcctg agattccaaa gggaagaggc 1020 ctatttggtg ctatagcggg tttcattgaa aatggatggg aaggcctaat tgatggttgg 1080 tatggtttca gacaccagaa tgcacaggga gagggaactg ctgcagatta caaaagcact 1140 caatcggcaa ttgatcaaat aacaggaaaa ttaaaccggc ttatagaaaa aaccaaccaa 1200 caatttgagt tgatagacaa tgaattcaat gaggtagaga agcaaatcgg taatgtgata 1260 aattggacca gagattctat aacagaagtg tggtcataca atgctgaact cttggtagca 1320 atggagaacc agcatacaat tgatctggct gattcagaaa tggacaaact gtacgaacga 1380 gtgaaaagac agctgagaga gaatgctgaa gaagatggca ctggttgctt tgaaatattt 1440 cacaagtgtg atgatgactg tatggccagt attagaaata acacctatga tcacagcaaa 1500 tacagggaag aggcaatgca aaatagaata cagattgacc cagtcaaact aagcagcggc 1560 tacaaagatg tgatactttg gtttagcttc ggggcatcat gtttcatact tctagccatt 1620 gtaatgggcc ttgtcttcat atgtgtaaag aatggaaaca tgcggtgcac tatttgtata 1680 taa 1683 <210> 6 <211> 1139 <212> DNA <213> Influenza B virus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1139) <223> Flu B matrix protein (MP) gene (consensus sequence, KC814126.1 Influenza B virus B/Utah/03/2011 segment 7 <400> 6 atgtcgctgt ttggagacac aattgcctac ctgctttcat tgacagagga tggagaaggc 60 aaagcagaac tagcagaaaa attacactgt tggtttggtg ggaaagaatt tgacctagac 120 tctgccttgg aatggataaa aaacaaaaga tgcttaactg atatacaaaa agcactaatt 180 ggtgcctcta tatgcttttt aaaacccaaa gaccaggaaa gaaaaagaag attcatcaca 240 gagcccttat caggaatggg aacaacagca acaaaaaaga aaggcctgat tctggctgag 300 agaaaaatga gaagatgtgt gagctttcat gaagcatttg aaatagcaga aggccatgaa 360 agctcagcgc tactatactg tctcatggtc atgtacctga atcctggaaa ttattcaatg 420 caagtaaaac taggaacgct ctgtgcttta tgcgagaaac aagcatcaca ttcacacagg 480 gctcatagca gagcagcgag atcttcagtg cctggagtga gacgagaaat gcagatggtc 540 tcagctatga acacagcaaa aacaatgaat ggaatgggaa aaggagaaga cgtccaaaag 600 ctggcagaag agttgcaaag caacattgga gtgctgagat ctcttggagc aagccaaaag 660 aatggggaag ggattgcaaa ggatgtaatg gaagtgctaa agcagagctc catgggaaat 720 tcagctcttg tgaagaaata tctataatgc tcgaaccatt tcagattctt acaatttgtt 780 cttttatctt atcagctctc catttcatgg cttggacaat agggcatttg aatcaaataa 840 aaagaggaat aaacatgaaa atacgaataa aaggtccaaa caaagagaca ataaacagag 900 aggtatcaat tttgagacac agttaccaaa aagaaatcca ggccaaagaa acaatgaagg 960 aagtactctc tgacaacatg gaggtattga atgaccacat aataattgag gggctttctg 1020 ccgaagagat aataaaaatg ggtgaaacag ttttggagat agaagaattg cattaaattc 1080 aattttacta tatttcttac tatgcattta agcaaattgt aatcaatgtc agcaaataa 1139 <210> 7 <211> 1054 <212> DNA <213> Influenza B virus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1054) <223> Flu B nonstructural (NS) gene (consensus sequence KC892145.1 Influenza B virus B/California/03/ 2012 segment 8 <400> 7 atggcgaaca acaacatgac cacaacacaa attgaggtgg gtccgggagc aaccaatgcc 60 accataaact ttgaagcagg aattctggag tgctatgaaa ggctttcatg gcaaagagcc 120 cttgactacc ccggtcaaga ccgcctaaac agactaaaga gaaaattaga gtcaagaata 180 aagactcaca acaaaagtga gcctgaaagt aaaaggatgt cccttgaaga gagaaaagca 240 attggagtaa aaatgatgaa agtactccta tttatgaatc cgtctgctgg aattgaaggg 300 tttgagccat actgtatgaa cagttcctca aatagcaact gtacgaaata caattggacc 360 gattaccctt caacaccaga gaggtgcctt gatgacatag aggaagaacc agaggatgtt 420 gatggcccaa ctgaaatagt attaagggac atgaacaaca aagatgcaag gcaaaagata 480 aaggaggaag taaacactca gaaagaaggg aagttccgtt tgacaataaa aagggatatg 540 cgtaatgtat tgtccttgag agtgttggta aatggaacat tcctcaaaca ccccaatgga 600 tacaagtcct tatcaactct gcatagattg aatgcatatg accagagtgg aaggcttgtt 660 gctaaacttg ttgccactga tgatcttaca gtggaggatg aagaagatgg ccatcggatc 720 ctcaactcac tcttcgagcg tcttaatgaa ggacattcaa agccaattcg agcagctgaa 780 actgcggtgg gagtcttatc ccaatttggt caagagcacc gattatcacc agaagaggga 840 gacaattaga ctggtcacgg aagaacttta tcttttaagt aaaagaattg atgataacat 900 actattccac aaaacagtga tagctaacag ctccataata gctgacatgg ttgtatcatt 960 atcattatta gaaacattgt atgaaatgaa ggatgtggtt gaagtgtaca gcaggcagtg 1020 cttgtgaatt taaaataaaa atcctgttac tact 1054 <210> 8 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Flu A 1 PB2 amplicon <400> 8 aaacgggact ctagcatact tactgacagc cagacagcga ccaaaaggat tcggatggcc 60 atcaatta 68 <210> 9 <211> 88 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Flu A 1 PA amplicon <400> 9 atcttggggg gctatatgaa gcaatcgagg agtgcctgat taatgatccc tgggttttgc 60 ttaatgcatc ttggttcaac tccttcct 88 <210> 10 <211> 145 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Flu A 1 MP amplicon <400> 10 ttctaaccga ggtcgaaacg tacgttcttt ctatcatacc gtcaggcccc ctcaaagccg 60 agatcgcgca gagactggaa agtgtctttg caggaaagaa cacagatctt gaggctctca 120 tggaatggct aaagacaaga ccaat 145 <210> 11 <211> 91 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Flu A 2 MP amplicon <400> 11 caagaccaat cctgtcacct ctgactaagg ggattttagg gtttgtgttc acgctcaccg 60 tgcccagtga gcgaggactg cagcgtagac g 91 <210> 12 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Flu A 3 HA amplicon <400> 12 gaaatgaaat ggctcctgtc aaacacagat aatgctgcat tcccgcagat gactaagtca 60 tataaaaata caagaaaaag c 81 <210> 13 <211> 107 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Flu B MP amplicon <400> 13 tttggagaca caattgccta cctgctttca ttgacagagg atggagaagg caaagcagaa 60 ctagcagaaa aattacactg ttggtttggt gggaaagaat ttgacct 107 <210> 14 <211> 112 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Flu B NS amplicon <400> 14 gatggccatc ggatcctcaa ctcactcttc gagcgtctta atgaaggaca ttcaaagcca 60 attcgagcag ctgaaactgc ggtgggagtc ttatcccaat ttggtcaaga gc 112 <210> 15 <211> 121 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: RSV A amplicon <400> 15 tacactcaac aaagatcaac ttctgtcatc cagcaaatac accatccaac ggagcacagg 60 agatagtatt gatactccta attatgatgt gcagaaacac atcaacaagt tatgtggcat 120 g 121 <210> 16 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: RSV B amplicon <400> 16 cattaaataa ggatcagctg ctgtcatcca gcaaatacac tattcaacgt agtacaggag 60 ataatattga cactcccaat tatgatgtgc aaaaacacct aaacaaacta tgtggtatgc 120 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Flu A PB2 Fwd <400> 17 aaacgggact ctagcatact 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Flu A PB2 Rev <400> 18 taattgatgg ccatccgaat 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Flu A PB2 FAM_Q38 <400> 19 agccagacag cgaccaaaag 20 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Flu A PA Fwd <400> 20 atcttggggg gctatatgaa gcaat 25 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Flu A PA Rev <400> 21 aggaaggagt tgaaccaaga 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Flu A PA FAM_Q38 <400> 22 aatgatccct gggttttgct 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Flu A MP fwd <400> 23 ttctaaccga ggtcgaaacg 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Flu A MP Rev <400> 24 attggtcttg tctttagcca 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Flu A MP FAM_Q38 <400> 25 tcaggccccc tcaaagccga 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Avian MP Fwd <400> 26 caagaccaat cctgtcacct 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Avian MP Rev <400> 27 cgtctacgct gcagtcctcg 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Avian MP CF5_Q38 <400> 28 acgctcaccg tgcccagtga 20 <210> 29 <400> 29 000 <210> 30 <400> 30 000 <210> 31 <400> 31 000 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Flu B MP Fwd <400> 32 ttggagacac gattgcctac 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Flu B MP Rev <400> 33 aggtcaaatt ctttcccacc 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Flu B MP CF3_Q38 <400> 34 atggagaagg caaagcagaa 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Flu B NS Fwd <400> 35 gatggccatc ggatcctcaa 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Flu B NS Rev <400> 36 gctcttgacc aaattgggat 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Flu B NS CF3_Q38 <400> 37 aaagccaatt cgagcagctg 20 <210> 38 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: RSV A Fwd <400> 38 tacactcaac aaagatcaac ttctgtc 27 <210> 39 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: RSV A Rev <400> 39 catgccacat aacttattga tgtgt 25 <210> 40 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: RSV A CF4_Q38 <400> 40 caccatccaa cggagcacag gaga 24 <210> 41 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: RSV B Fwd <400> 41 cattaaataa ggatcagctg ctgtc 25 <210> 42 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: RSV B Rev <400> 42 gcataccaca tagtttgttt aggtgtt 27 <210> 43 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: RSV B CF4_Q38 <400> 43 taatattgat actcccaatt atgatgtgc 29 <210> 44 <211> 228 <212> DNA <213> Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(228) <223> SARS-CoV-2 E gene 26249 26476 nt of MT276598 <400> 44 atgtactcat tcgtttcgga agagacaggt acgttaatag ttaatagcgt acttcttttt 60 cttgctttcg tggtattctt gctagttaca ctagccatcc ttactgcgct tcgattgtgt 120 gcgtactgct gcaatattgt taacgtgagt cttgtaaaac cttcttttta cgtttactct 180 cgtgttaaaa atctgaattc ttctagagtt cctgatcttc tggtctaa 228 <210> 45 <211> 1250 <212> DNA <213> Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1250) <223> SARS-CoV-2 N2 gene 28278 29537 nt of MT276598 <400> 45 aactaaaatg tctgataatg gaccccaaaa tcagcgaaat gcaccccgca ttacgtttgg 60 tggaccctca gattcaactg gcagtaacca gaatggagaa cgcagtgggg cgcgatcaaa 120 acaacgtcgg ccccaaggtt tacccaataa tactgcgtct tggttcaccg ctctcactca 180 acatggcaag gaagacctta aattccctcg aggacaaggc gttccaatta acaccaatag 240 cagtccagat gaccaaattg gctactaccg aagagctacc agacgaattc gtggtggtga 300 cggtaaaatg aaagatctca gtccaagatg gtatttctac tacctaggaa ctgggccaga 360 agctggactt ccctatggtg ctaacaaaga cggcatcata tgggttgcaa ctgagggagc 420 cttgaataca ccaaaagatc acattggcac ccgcaatcct gctaacaatg ctgcaatcgt 480 gctacaactt cctcaaggaa caacattgcc aaaaggcttc tacgcagaag ggagcagagg 540 cggcagtcaa gcctcttctc gttcctcatc acgtagtcgc aacagttcaa gaaattcaac 600 tccaggcagc agtaaacgaa cttctcctgc tagaatggct ggcaatggcg gtgatgctgc 660 tcttgctttg ctgctgcttg acagattgaa ccagcttgag agcaaaatgt ctggtaaagg 720 ccaacaacaa caaggccaaa ctgtcactaa gaaatctgct gctgaggctt ctaagaagcc 780 tcggcaaaaa cgtactgcca ctaaagcata caatgtaaca caagctttcg gcagacgtgg 840 tccagaacaa acccaaggaa attttgggga ccaggaacta atcagacaag gaactgatta 900 caaacattgg ccgcaaattg cacaatttgc ccccagcgct tcagcgttct tcggaatgtc 960 gcgcattggc atggaagtca caccttcggg aacgtggttg acctacacag gtgccatcaa 1020 attggatgac aaagatccaa atttcaaaga tcaagtcatt ttgctgaata agcatattga 1080 cgcatacaaa acattcccac caacagagcc taaaaaggac aaaaagaaga aggctgatga 1140 aactcaagcc ttaccgcaga gacagaagaa acagcaaact gtgactcttc ttcctgctgc 1200 agatttggat gatttctcca aacaattgca acaatccatg agcagtgctg 1250 <210> 46 <211> 93 <212> DNA <213> Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(93) <223> SARS-CoV-2 E amplicon <400> 46 tcggaagaga caggtacgtt aatagttaat agcgtacttc tttttcttgc tttcgtggta 60 ttcttgctag ttacactagc catccttact gcg 93 <210> 47 <211> 67 <212> DNA <213> Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(67) <223> SARS-CoV-2 N2 amplicon <400> 47 ttacaaacat tggccgcaaa ttgcacaatt tgcccccagc gcttcagcgt tcttcggaat 60 gtcgcgc 67 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: CEP-COV2-E-FWD1 <400> 48 tcggaagaga caggtacgtt 20 <210> 49 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: CEP-COV2-E-REV1 <400> 49 cgcagtaagg atggctagt 19 <210> 50 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: CEP-COV2-E-PRCF1-3 <400> 50 tgctttcgtg gtattcttgc t 21 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: CEP-19NCOV-N2-FWD2 <400> 51 ttacaaacat tggccgcaaa 20 <210> 52 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: COV N2 Rev/CEP-19NCOV-N2-REV2 <400> 52 gcgcgacatt ccgaagaac 19 <210> 53 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: CEP-19NCOV-N2-PRCF1-3 <400> 53 acaatttgcc cccagcgctt cag 23 <210> 54 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: COV2-E-W-F1 <400> 54 acaggtacgt taatagttaa tagcgt 26 <210> 55 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: COV2-E-W-R1 <400> 55 atattgcagc agtacgcaca ca 22 <210> 56 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: COV2-E-W-P2 <400> 56 acactagcca tccttactgc gcttcg 26 <210> 57 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: COV2-N2-C-F1 <400> 57 ttacaaacat tggccgcaaa 20 <210> 58 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: COV2-N2-C-R1 <400> 58 gcgcgacatt ccgaagaa 18 <210> 59 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: COV2-N2-C-P1 <400> 59 acaatttgcc cccagcgctt cag 23 <210> 60 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: W-19NCOV-FWD1 <400> 60 gtgaratggt catgtgtggc gg 22 <210> 61 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: COV2 RDRP Rev/ RDRP-W-R2 <400> 61 caaatgttaa aaacactatt agcataag 28 <210> 62 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: RDRP-W-P2_Q13 <400> 62 caggtggaac ctcatcagga gatgc 25 <210> 63 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: CEP-19NCOV-ORF1AB-FWD11 <400> 63 gacaaatgct ggtgattac 19 <210> 64 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: CEP-COV-ORF1AB-REV <400> 64 ctttgagcgt ttctgctgca aa 22 <210> 65 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: CEP-COV-ORF1AB-PRCF1-3 <400> 65 ctaacacctg tactgaaaga ctcaagc 27 <210> 66 <211> 115 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: SARS-CoV-2 E Alt amplicon (COV2-E-W) <400> 66 agacaggtac gttaatagtt aatagcgtac ttctttttct tgctttcgtg gtattcttgc 60 tagttacact agccatcctt actgcgcttc gattgtgtgc gtactgctgc aatat 115 <210> 67 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: RSV A V2 Fwd <400> 67 tacactcaac aaagatcaac ttctatc 27 <210> 68 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: RSV A V2a Rev <400> 68 catgccacat aacttattaa tgtgt 25 <210> 69 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: RSV A V2b Rev <400> 69 catgccacat agcttattga tgtgt 25 <210> 70 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: COV E V2 Fwd <400> 70 gctttcgtgg tattcttgct 20 <210> 71 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: COV E V2 Rev <400> 71 gcagtacgca cacaatcg 18 <210> 72 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: COV E V2 P <400> 72 cactagccat ccttactgcg c 21 <210> 73 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: COV N2 V2 Fwd <400> 73 aaaaaattac aaacattggc cgcaaa 26 <210> 74 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: COV N2 V2 P1 <400> 74 cacaatttgc ccccagcgct tcag 24 <210> 75 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: COV N2 V2 P2 <400> 75 cacaatttgc cccuagcgct tcag 24 <210> 76 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: COV2 RDRP V2 Fwd <400> 76 cacttgttct tgctcgcaaa 20 <210> 77 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: COV2 RDRP V2 P <400> 77 caacgtgttg tagcttgtca c 21 <210> 78 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: COV2 RDRP V2 Rev2 <400> 78 ctcattagct aatctataga aacgg 25 <210> 79 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: SARS-CoV-2 E Alt amplicon <400> 79 gctttcgtgg tattcttgct agttacacta gccatcctta ctgcgcttcg attgtgtgcg 60 tactgc 66 <210> 80 <211> 187 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: RDRP amplicon 1 <400> 80 caaatgttaa aaacactatt agcataagca gttgtggcat ctcctgatga ggttccacct 60 ggtttaacat atagtgaacc gccacacatg accatttcac tcaatacttg agcacactca 120 ttagctaatc tatagaaacg gtgtgacaag ctacaacacg ttgtatgttt gcgagcaaga 180 acaagtg 187 <210> 81 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: RDRP amplicon 2 <400> 81 ctcattagct aatctataga aacggtgtga caagctacaa cacgttgtat gtttgcgagc 60 aagaacaagt g 71

Claims (50)

  1. 하기를 포함하는, 대상체로부터의 생물학적 샘플에서 인플루엔자 A, 인플루엔자 B, RSV 및 SARS-CoV-2의 존재 또는 부재를 검출하는 방법:
    a) 인플루엔자 A 유전자, 인플루엔자 B 유전자, RSV 유전자 및 SARS-CoV-2 유전자를 검출하는 프라이머 세트와 대상체로부터의 생물학적 샘플을 접촉시키는 단계;
    b) 하나 이상의 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 수행하는 단계; 및
    c) PCR에 의해 생산된 앰플리콘을 검출하는 단계.
  2. 하기를 포함하는, 대상체로부터의 샘플에서 인플루엔자 A 또는 인플루엔자 B, RSV 및 SARS-CoV-2로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함하는, 대상체가 인플루엔자, RSV 및/또는 COVID-19를 갖는지 여부를 결정하는 방법:
    a) 인플루엔자 A 유전자, 인플루엔자 B 유전자, RSV 유전자 및 SARS-CoV-2 유전자를 검출하는 프라이머 세트와 대상체로부터의 생물학적 샘플을 접촉시키는 단계;
    b) 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 수행하는 단계; 및
    c) PCR에 의해 생산된 앰플리콘을 검출하는 단계.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    a) 인플루엔자 A의 존재 또는 부재를 검출하는 프라이머 세트가 하기 중 적어도 하나를 포함하고:
    i) 하기로부터 선택된 인플루엔자 A PB2를 검출하는 프라이머 세트:
    1) 인플루엔자 PB2 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머;
    2) 서열식별번호: 1의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 1의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
    3) 서열식별번호: 17의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 18의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머;
    ii) 하기로부터 선택된 인플루엔자 A PA를 검출하는 프라이머 세트:
    1) 인플루엔자 PA 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머;
    2) 서열식별번호: 2의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 2의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
    3) 서열식별번호: 20의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 21의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머;
    iii) 하기로부터 선택된 인플루엔자 A MP를 검출하는 프라이머 세트:
    1) 인플루엔자 A MP 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머;
    2) 서열식별번호: 3의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 3의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
    3) 서열식별번호: 23의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 24의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머;
    iv) 하기로부터 선택된 조류 인플루엔자 MP를 검출하는 프라이머 세트:
    1) 조류 인플루엔자 MP 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머;
    2) 서열식별번호: 4의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 4의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
    3) 서열식별번호: 26의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 27의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머;
    b) 인플루엔자 B의 존재 또는 부재를 검출하는 프라이머 세트가 하기 중 적어도 하나를 포함하고:
    i) 하기로부터 선택된 인플루엔자 B MP를 검출하는 프라이머 세트:
    1) 인플루엔자 B MP 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머;
    2) 서열식별번호: 6의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 6의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
    3) 서열식별번호: 32의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 33의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머;
    ii) 하기로부터 선택된 인플루엔자 B NS를 검출하는 프라이머 세트:
    1) 인플루엔자 B NS 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머;
    2) 서열식별번호: 7의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 7의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
    3) 서열식별번호: 35의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 36의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머;
    c) RSV의 존재 또는 부재를 검출하는 프라이머 세트가 하기 중 적어도 하나를 포함하고:
    i) 하기로부터 선택된 RSV A를 검출하는 프라이머 세트:
    1) RSV A 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머; 및
    2) 서열식별번호: 38의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 39의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
    ii) 하기로부터 선택된 RSV B를 검출하는 프라이머 세트:
    1) RSV B 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머; 및
    2) 서열식별번호: 41의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 42의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머;
    d) SARS-CoV-2의 존재 또는 부재를 검출하는 프라이머 세트가 하기 중 적어도 하나를 포함하는 것인 방법:
    i) 하기로부터 선택된 SARS-CoV-2 E를 검출하는 프라이머 세트:
    1) SARS-CoV-2 E 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머;
    2) 서열식별번호: 44의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 44의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
    3) 서열식별번호: 48의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 49의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
    ii) 하기로부터 선택된 SARS-CoV-2 N2를 검출하는 프라이머 세트:
    1) SARS-CoV-2 N2 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머;
    2) 서열식별번호: 45의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 45의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
    3) 서열식별번호: 51의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 52의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    a) 인플루엔자 A의 존재 또는 부재를 검출하는 프라이머 세트가 하기 중 적어도 하나를 포함하고:
    i) 하기로부터 선택된 인플루엔자 A PB2를 검출하는 프라이머 세트:
    1) 인플루엔자 PB2 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머;
    2) 서열식별번호: 1의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 1의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
    3) 서열식별번호: 17의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 18의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머;
    ii) 하기로부터 선택된 인플루엔자 A PA를 검출하는 프라이머 세트:
    1) 인플루엔자 PA 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머;
    2) 서열식별번호: 2의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 2의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
    3) 서열식별번호: 20의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 21의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머;
    iii) 하기로부터 선택된 인플루엔자 A MP를 검출하는 프라이머 세트:
    1) 인플루엔자 A MP 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머;
    2) 서열식별번호: 3의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 3의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
    3) 서열식별번호: 23의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 24의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머;
    iv) 하기로부터 선택된 조류 인플루엔자 MP를 검출하는 프라이머 세트:
    1) 조류 인플루엔자 MP 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머;
    2) 서열식별번호: 4의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 4의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
    3) 서열식별번호: 26의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 27의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머;
    b) 인플루엔자 B의 존재 또는 부재를 검출하는 프라이머 세트가 하기 중 적어도 하나를 포함하고:
    i) 하기로부터 선택된 인플루엔자 B MP를 검출하는 프라이머 세트:
    1) 인플루엔자 B MP 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머;
    2) 서열식별번호: 6의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 6의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
    3) 서열식별번호: 32의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 33의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머;
    ii) 하기로부터 선택된 인플루엔자 B NS를 검출하는 프라이머 세트:
    1) 인플루엔자 B NS 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머;
    2) 서열식별번호: 7의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 7의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
    3) 서열식별번호: 35의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 36의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머;
    c) RSV의 존재 또는 부재를 검출하는 프라이머 세트가 하기 중 적어도 하나를 포함하고:
    i) 하기로부터 선택된 RSV A를 검출하는 프라이머 세트:
    1) RSV A 유전자의 서열을 검출하기 위한 적어도 하나의 정방향 및 적어도 하나의 역방향 프라이머; 및
    2) 서열식별번호: 38 및/또는 서열식별번호: 67의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 적어도 하나의 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 39, 서열식별번호: 68 및/또는 서열식별번호: 69의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 적어도 하나의 역방향 프라이머; 및
    ii) 하기로부터 선택된 RSV B를 검출하는 프라이머 세트:
    1) RSV B 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머; 및
    2) 서열식별번호: 41의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 42의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머;
    d) SARS-CoV-2의 존재 또는 부재를 검출하는 프라이머 세트가 하기 중 적어도 하나를 포함하는 것인 방법:
    i) 하기로부터 선택된 SARS-CoV-2 E를 검출하는 프라이머 세트:
    1) SARS-CoV-2 E 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머;
    2) 서열식별번호: 44의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 44의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 역방향 프라이머;
    3) 서열식별번호: 70의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 71의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
    4) 서열식별번호: 48의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 49의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머;
    ii) 하기로부터 선택된 SARS-CoV-2 N2를 검출하는 프라이머 세트:
    1) SARS-CoV-2 N2 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머;
    2) 서열식별번호: 45의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 45의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
    3) 서열식별번호: 73 또는 서열식별번호: 51의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 52의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머;
    iii) 하기로부터 선택된 SARS-CoV-2 RdRP를 검출하는 프라이머 세트:
    1) SARS-CoV-2 RdRP 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 적어도 하나의 역방향 프라이머;
    2) 서열식별번호: 76의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 61 및/또는 서열식별번호: 78의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 적어도 하나의 역방향 프라이머.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    a) 인플루엔자 A의 존재 또는 부재를 검출하는 프라이머 세트가 하기 중 적어도 하나를 포함하고:
    i) 서열식별번호: 17의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 18의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머를 포함하는 인플루엔자 A PB2를 검출하는 프라이머 세트;
    ii) 서열식별번호: 20의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 21의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머를 포함하는 인플루엔자 A PA를 검출하는 프라이머 세트;
    iii) 서열식별번호: 23의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 24의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머를 포함하는 인플루엔자 A MP를 검출하는 프라이머 세트; 및
    iv) 서열식별번호: 26의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 27의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머를 포함하는 조류 인플루엔자 MP를 검출하는 프라이머 세트;
    b) 인플루엔자 B의 존재 또는 부재를 검출하는 프라이머 세트가 하기 중 적어도 하나를 포함하고:
    i) 서열식별번호: 32의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 33의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머를 포함하는 인플루엔자 B MP를 검출하는 프라이머 세트; 및
    ii) 서열식별번호: 35의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 36의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머를 포함하는 인플루엔자 B NS를 검출하는 프라이머 세트;
    c) RSV의 존재 또는 부재를 검출하는 프라이머 세트가 하기 중 적어도 하나를 포함하고:
    i) 서열식별번호: 38 및/또는 서열식별번호: 67의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 적어도 하나의 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 39, 서열식별번호: 68 및/또는 서열식별번호: 69의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 적어도 하나의 역방향 프라이머를 포함하는 RSV A를 검출하는 프라이머 세트; 및
    ii) 서열식별번호: 41의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 42의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머를 포함하는 RSV B를 검출하는 프라이머 세트;
    d) SARS-CoV-2의 존재 또는 부재를 검출하는 프라이머 세트가 하기 중 적어도 하나를 포함하는 것인 방법:
    i) 서열식별번호: 70의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 71의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머를 포함하는 SARS-CoV-2 E를 검출하는 프라이머 세트;
    ii) 서열식별번호: 73의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 52의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머를 포함하는 SARS-CoV-2 N2를 검출하는 프라이머 세트; 및
    iii) 서열식별번호: 76의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 61 및/또는 서열식별번호: 78의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 적어도 하나의 역방향 프라이머를 포함하는 SARS-CoV-2 RdRP를 검출하는 프라이머 세트.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 인플루엔자 A PA 앰플리콘이 서열식별번호: 9와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하고/거나;
    b) 인플루엔자 A PB2 앰플리콘이 서열식별번호: 8과 적어도 85% 동일한 서열을 포함하고/거나;
    c) 인플루엔자 A MP 앰플리콘이 서열식별번호: 10과 적어도 85% 동일한 서열을 포함하고/거나;
    d) 조류 인플루엔자 MP 앰플리콘이 서열식별번호: 11과 적어도 85% 동일한 서열을 포함하고/거나;
    e) 인플루엔자 B MP 앰플리콘이 서열식별번호: 13과 적어도 85% 동일한 서열을 포함하고/거나;
    f) 인플루엔자 B NS 앰플리콘이 서열식별번호: 14와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하고/거나;
    g) RSV A 앰플리콘이 서열식별번호: 15와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하고/거나;
    h) RSV B 앰플리콘이 서열식별번호: 16과 적어도 85% 동일한 서열을 포함하고/거나;
    i) SARS-CoV-2 E 앰플리콘이 서열식별번호: 46 또는 서열식별번호: 79와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하고/거나;
    j) SARS-CoV-2 N2 앰플리콘이 서열식별번호: 47과 적어도 85% 동일한 서열을 포함하고/거나; 및/또는
    k) SARS-CoV-2 RdRP 앰플리콘이 서열식별번호: 80 및/또는 서열식별번호: 81과 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 인플루엔자 A PA 프로브, 인플루엔자 A PB2 프로브, 인플루엔자 A MP 프로브, 조류 인플루엔자 MP 프로브, 인플루엔자 B MP 프로브, 인플루엔자 B NS 프로브, RSV A 프로브, RSV B 프로브, SARS-CoV-2 E 프로브, SARS-CoV-2 N2 프로브 및 SARS-CoV-2 RdRP 프로브로부터 선택된 적어도 하나의 프로브와 앰플리콘을 접촉시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    a) 인플루엔자 A PA 프로브가 서열식별번호: 22의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함하고/거나;
    b) 인플루엔자 A PB2 프로브가 서열식별번호: 19의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함하고/거나;
    c) 인플루엔자 A MP 프로브가 서열식별번호: 25의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함하고/거나;
    d) 조류 인플루엔자 MP 프로브가 서열식별번호: 28의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함하고/거나;
    e) 인플루엔자 B MP 프로브가 서열식별번호: 34의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함하고/거나;
    f) 인플루엔자 B NS 프로브가 서열식별번호: 37의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함하고/거나;
    g) RSV A 프로브가 서열식별번호: 40의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함하고/거나;
    h) RSV B 프로브가 서열식별번호: 43의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함하고/거나;
    i) SARS-CoV-2 E 프로브가 서열식별번호: 72, 서열식별번호: 50 또는 서열식별번호: 56의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함하고/거나;
    j) SARS-CoV-2 N2 프로브가 서열식별번호: 74, 서열식별번호: 75 및/또는 서열식별번호: 53의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함하고/거나; 및/또는
    k) SARS-CoV-2 RdRP 프로브가 서열식별번호: 77의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함하는 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 대조군을 검출하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 외인성 대조군이 샘플 프로세싱 대조군인 방법.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 외인성 대조군이 박테리오파지 보호 코트에 패키징된 RNA 대조군인 방법.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 대조군을 검출하기 위한 대조군 프라이머 쌍과 샘플로부터의 핵산을 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
  13. 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 대조군 앰플리콘을 형성하는 것 및 외인성 대조군 앰플리콘과 선택적으로 혼성화할 수 있는 대조군 프로브와 외인성 대조군 앰플리콘을 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
  14. 제7항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 각 프로브가 검출가능한 표지를 포함하는 것인 방법.
  15. 제7항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 각 프로브가 형광 염료 및 켄쳐 분자를 포함하는 것인 방법.
  16. 제7항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상이한 표적 분자를 검출하기 위한 프로브가 검출가능하게 상이한 검출가능한 표지를 포함하는 것인 방법.
  17. 제7항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상이한 표적 분자를 검출하기 위한 프로브가 검출가능하게 상이하지 않은 검출가능한 표지를 포함하는 것인 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, PCR이 정량적 PCR인 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, PCR 반응이 초기 변성 단계로부터 최종 연장 단계까지 2시간 미만이 소요되는 것인 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, PCR 반응이 초기 변성 단계로부터 최종 연장 단계까지 1시간 미만이 소요되는 것인 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인플루엔자, RSV 및/또는 COVID-19의 하나 이상의 증상을 갖는 것인 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 발열, 오한, 기침, 숨가쁨 또는 호흡 곤란, 인후통, 콧물, 비충혈, 근육통 또는 몸살, 두통, 피로, 새로운 미각 또는 후각 상실, 오심 또는 구토, 및 설사로부터 선택된 하나 이상의 증상을 갖는 것인 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 비인두 스왑 샘플, 구인두 샘플, 비강 흡인물 샘플, 비강 또는 중비갑개 스왑, 비강 흡인물 샘플, 비강 세척액 샘플, 인후 스왑 샘플, 기관지폐포 세정액 샘플, 기관지 흡인물 샘플, 기관지 세척액 샘플, 기관내 흡인물, 기관내 세척액 샘플, 기관 흡인물, 비강 분비물 샘플, 점액 샘플, 가래 샘플, 폐 조직 샘플, 소변 샘플, 타액 샘플 및 대변 샘플로부터 선택되는 것인 방법.
  24. 인플루엔자 A 유전자, 인플루엔자 B 유전자, RSV 유전자 및 SARS-CoV-2 유전자의 존재를 검출하는 프라이머 세트를 포함하는 조성물로서,
    a) 여기서 인플루엔자 A의 존재를 검출하는 프라이머 세트는 하기 중 적어도 하나를 포함하고:
    i) 하기로부터 선택된 인플루엔자 A PB2를 검출하는 프라이머 세트:
    1) 인플루엔자 PB2 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머;
    2) 서열식별번호: 1의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 1의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
    3) 서열식별번호: 17의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 18의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머;
    ii) 하기로부터 선택된 인플루엔자 A PA를 검출하는 프라이머 세트:
    1) 인플루엔자 PA 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머;
    2) 서열식별번호: 2의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 2의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
    3) 서열식별번호: 20의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 21의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머;
    iii) 하기로부터 선택된 인플루엔자 A MP를 검출하는 프라이머 세트:
    1) 인플루엔자 A MP 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머;
    2) 서열식별번호: 3의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 3의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
    3) 서열식별번호: 23의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 24의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머;
    iv) 하기로부터 선택된 조류 인플루엔자 MP를 검출하는 프라이머 세트:
    1) 조류 인플루엔자 MP 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머;
    2) 서열식별번호: 4의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 4의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
    3) 서열식별번호: 26의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 27의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머;
    b) 여기서 인플루엔자 B의 존재를 검출하는 프라이머 세트는 하기 중 적어도 하나를 포함하고:
    i) 하기로부터 선택된 인플루엔자 B MP를 검출하는 프라이머 세트:
    1) 인플루엔자 B MP 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머;
    2) 서열식별번호: 6의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 6의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
    3) 서열식별번호: 32의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 33의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머;
    ii) 하기로부터 선택된 인플루엔자 B NS를 검출하는 프라이머 세트:
    1) 인플루엔자 B NS 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머;
    2) 서열식별번호: 7의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 7의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
    3) 서열식별번호: 35의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 36의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머;
    c) 여기서 RSV의 존재를 검출하는 프라이머 세트는 하기 중 적어도 하나를 포함하고:
    i) 하기로부터 선택된 RSV A를 검출하는 프라이머 세트:
    1) RSV A 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머; 및
    2) 서열식별번호: 38의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 39의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
    ii) 하기로부터 선택된 RSV B를 검출하는 프라이머 세트:
    1) RSV B 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머; 및
    2) 서열식별번호: 41의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 42의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머;
    d) 여기서 SARS-CoV-2의 존재를 검출하는 프라이머 세트는 하기 중 적어도 하나를 포함하는 것인 조성물:
    i) 하기로부터 선택된 SARS-CoV-2 E를 검출하는 프라이머 세트:
    1) SARS-CoV-2 E 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머;
    2) 서열식별번호: 44의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 44의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
    3) 서열식별번호: 48의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 49의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
    ii) 하기로부터 선택된 SARS-CoV-2 N2를 검출하는 프라이머 세트:
    1) SARS-CoV-2 N2 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머;
    2) 서열식별번호: 45의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 45의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
    3) 서열식별번호: 51의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 52의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머.
  25. 인플루엔자 A 유전자, 인플루엔자 B 유전자, RSV 유전자 및 SARS-CoV-2 유전자의 존재를 검출하는 프라이머 세트를 포함하는 조성물로서,
    a) 여기서 인플루엔자 A의 존재 또는 부재를 검출하는 프라이머 세트는 하기 중 적어도 하나를 포함하고:
    i) 하기로부터 선택된 인플루엔자 A PB2를 검출하는 프라이머 세트:
    1) 인플루엔자 PB2 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머;
    2) 서열식별번호: 1의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 1의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
    3) 서열식별번호: 17의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 18의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머;
    ii) 하기로부터 선택된 인플루엔자 A PA를 검출하는 프라이머 세트:
    1) 인플루엔자 PA 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머;
    2) 서열식별번호: 2의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 2의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
    3) 서열식별번호: 20의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 21의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머;
    iii) 하기로부터 선택된 인플루엔자 A MP를 검출하는 프라이머 세트:
    1) 인플루엔자 A MP 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머;
    2) 서열식별번호: 3의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 3의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
    3) 서열식별번호: 23의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 24의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머;
    iv) 하기로부터 선택된 조류 인플루엔자 MP를 검출하는 프라이머 세트:
    1) 조류 인플루엔자 MP 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머;
    2) 서열식별번호: 4의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 4의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
    3) 서열식별번호: 26의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 27의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머;
    b) 여기서 인플루엔자 B의 존재 또는 부재를 검출하는 프라이머 세트는 하기 중 적어도 하나를 포함하고:
    i) 하기로부터 선택된 인플루엔자 B MP를 검출하는 프라이머 세트:
    1) 인플루엔자 B MP 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머;
    2) 서열식별번호: 6의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 6의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
    3) 서열식별번호: 32의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 33의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머;
    ii) 하기로부터 선택된 인플루엔자 B NS를 검출하는 프라이머 세트:
    1) 인플루엔자 B NS 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머;
    2) 서열식별번호: 7의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 7의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
    3) 서열식별번호: 35의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 36의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머;
    c) 여기서 RSV의 존재 또는 부재를 검출하는 프라이머 세트는 하기 중 적어도 하나를 포함하고:
    i) 하기로부터 선택된 RSV A를 검출하는 프라이머 세트:
    1) RSV A 유전자의 서열을 검출하기 위한 적어도 하나의 정방향 및 적어도 하나의 역방향 프라이머; 및
    2) 서열식별번호: 38 및/또는 서열식별번호: 67의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 적어도 하나의 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 39, 서열식별번호: 68 및/또는 서열식별번호: 69의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 적어도 하나의 역방향 프라이머; 및
    ii) 하기로부터 선택된 RSV B를 검출하는 프라이머 세트:
    1) RSV B 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머; 및
    2) 서열식별번호: 41의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 42의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머;
    d) 여기서 SARS-CoV-2의 존재 또는 부재를 검출하는 프라이머 세트는 하기 중 적어도 하나를 포함하는 것인 조성물:
    i) 하기로부터 선택된 SARS-CoV-2 E를 검출하는 프라이머 세트:
    1) SARS-CoV-2 E 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머;
    2) 서열식별번호: 44의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 44의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 역방향 프라이머;
    3) 서열식별번호: 70의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 71의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
    4) 서열식별번호: 48의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 49의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머;
    ii) 하기로부터 선택된 SARS-CoV-2 N2를 검출하는 프라이머 세트:
    1) SARS-CoV-2 N2 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머;
    2) 서열식별번호: 45의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 45의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
    3) 서열식별번호: 73 또는 서열식별번호: 51의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 52의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머
    iii) 하기로부터 선택된 SARS-CoV-2 RdRP를 검출하는 프라이머 세트:
    1) SARS-CoV-2 RdRP 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 적어도 하나의 역방향 프라이머;
    2) 서열식별번호: 76의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 61 및/또는 서열식별번호: 78의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 적어도 하나의 역방향 프라이머.
  26. 인플루엔자 A 유전자, 인플루엔자 B 유전자, RSV 유전자 및 SARS-CoV-2 유전자의 존재를 검출하는 프라이머 세트를 포함하는 조성물로서,
    a) 여기서 인플루엔자 A의 존재 또는 부재를 검출하는 프라이머 세트는 하기 중 적어도 하나를 포함하고:
    i) 서열식별번호: 17의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 18의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머를 포함하는 인플루엔자 A PB2를 검출하는 프라이머 세트;
    ii) 서열식별번호: 20의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 21의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머를 포함하는 인플루엔자 A PA를 검출하는 프라이머 세트;
    iii) 서열식별번호: 23의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 24의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머를 포함하는 인플루엔자 A MP를 검출하는 프라이머 세트; 및
    iv) 서열식별번호: 26의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 27의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머를 포함하는 조류 인플루엔자 MP를 검출하는 프라이머 세트;
    b) 여기서 인플루엔자 B의 존재 또는 부재를 검출하는 프라이머 세트는 하기 중 적어도 하나를 포함하고:
    i) 서열식별번호: 32의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 33의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머를 포함하는 인플루엔자 B MP를 검출하는 프라이머 세트; 및
    ii) 서열식별번호: 35의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 36의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머를 포함하는 인플루엔자 B NS를 검출하는 프라이머 세트;
    c) 여기서 RSV의 존재 또는 부재를 검출하는 프라이머 세트는 하기 중 적어도 하나를 포함하고:
    i) 서열식별번호: 38 및/또는 서열식별번호: 67의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 적어도 하나의 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 39, 서열식별번호: 68 및/또는 서열식별번호: 69의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 적어도 하나의 역방향 프라이머를 포함하는 RSV A를 검출하는 프라이머 세트; 및
    ii) 서열식별번호: 41의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 42의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머를 포함하는 RSV B를 검출하는 프라이머 세트;
    d) 여기서 SARS-CoV-2의 존재 또는 부재를 검출하는 프라이머 세트는 하기 중 적어도 하나를 포함하는 것인 조성물:
    i) 서열식별번호: 70의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 71의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머를 포함하는 SARS-CoV-2 E를 검출하는 프라이머 세트;
    ii) 서열식별번호: 73의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 52의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머를 포함하는 SARS-CoV-2 N2를 검출하는 프라이머 세트; 및
    iii) 서열식별번호: 76의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 61 및/또는 서열식별번호: 78의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 적어도 하나의 역방향 프라이머를 포함하는 SARS-CoV-2 RdRP를 검출하는 프라이머 세트.
  27. 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 대조군을 검출하기 위한 프라이머 쌍을 추가로 포함하는 조성물.
  28. 제27항에 있어서, 외인성 대조군이 샘플 프로세싱 대조군인 조성물.
  29. 제24항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 대조군이 박테리오파지 보호 코트에 패키징된 RNA 대조군인 방법.
  30. 제24항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 인플루엔자 A PA 프로브, 인플루엔자 A PB2 프로브, 인플루엔자 A MP 프로브, 조류 인플루엔자 MP 프로브, 인플루엔자 B MP 프로브, 인플루엔자 B NS 프로브, RSV A 프로브, RSV B 프로브, SARS-CoV-2 E 프로브, SARS-CoV-2 N2 프로브 및 SARS-CoV-2 RdRP 프로브로부터 선택된 적어도 하나의 프로브를 추가로 포함하는 조성물.
  31. 제30항에 있어서,
    a) 인플루엔자 A PA 프로브가 서열식별번호: 22의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함하고/거나;
    b) 인플루엔자 A PB2 프로브가 서열식별번호: 19의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함하고/거나;
    c) 인플루엔자 A MP 프로브가 서열식별번호: 25의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함하고/거나;
    d) 조류 인플루엔자 MP 프로브가 서열식별번호: 28의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함하고/거나;
    e) 인플루엔자 B MP 프로브가 서열식별번호: 34의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함하고/거나;
    f) 인플루엔자 B NS 프로브가 서열식별번호: 37의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함하고/거나;
    g) RSV A 프로브가 서열식별번호: 40의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함하고/거나;
    h) RSV B 프로브가 서열식별번호: 43의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함하고/거나;
    i) SARS-CoV-2 E 프로브가 서열식별번호: 72, 서열식별번호: 50 또는 서열식별번호: 56의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함하고/거나;
    j) SARS-CoV-2 N2 프로브가 서열식별번호: 74, 서열식별번호: 75 및/또는 서열식별번호: 53의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함하고/거나; 및/또는
    k) SARS-CoV-2 RdRP 프로브가 서열식별번호: 77의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함하는 것인 조성물.
  32. 제24항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 대조군을 검출하기 위한 프로브를 추가로 포함하는 조성물.
  33. 제24항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 각 프로브가 검출가능한 표지를 포함하는 것인 조성물.
  34. 제33항에 있어서, 각 프로브가 형광 염료 및 켄쳐 분자를 포함하는 것인 조성물.
  35. 제24항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 동결건조된 프라이머 세트를 포함하는 조성물.
  36. 제24항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 용액 중의 프라이머 세트를 포함하는 조성물.
  37. 제24항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 인플루엔자, RSV 및/또는 COVID-19의 존재 또는 부재에 대해 테스트되는 대상체로부터의 샘플로부터의 핵산을 포함하는 조성물.
  38. 제37항에 있어서, 샘플이 비인두 스왑 샘플, 구인두 샘플, 비강 흡인물 샘플, 비강 또는 중비갑개 스왑, 비강 흡인물 샘플, 비강 세척액 샘플, 인후 스왑 샘플, 기관지폐포 세정액 샘플, 기관지 흡인물 샘플, 기관지 세척액 샘플, 기관내 흡인물, 기관내 세척액 샘플, 기관 흡인물, 비강 분비물 샘플, 점액 샘플, 가래 샘플, 폐 조직 샘플, 소변 샘플, 타액 샘플 및 대변 샘플로부터 선택되는 것인 조성물.
  39. 제24항 내지 제38항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 키트.
  40. 제39항에 있어서, 외인성 대조군을 추가로 포함하는 키트.
  41. 제40항에 있어서, 외인성 대조군이 박테리오파지 보호 코트에 패키징된 RNA 대조군인 키트.
  42. 제39항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, dNTP 및/또는 열안정성 폴리머라제를 포함하는 키트.
  43. 제39항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 역전사효소를 포함하는 키트.
  44. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 멀티플렉스 반응에서 적어도 하나의 인플루엔자 A 유전자, 적어도 하나의 인플루엔자 B 유전자, 적어도 하나의 RSV 유전자, 적어도 하나의 SARS-CoV-2 유전자, 및 외인성 대조군의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함하는 방법.
  45. 제44항에 있어서, 반응의 사이클 역치 (Ct)가 40 사이클 미만인 방법.
  46. 하기를 포함하는, 대상체로부터의 생물학적 샘플에서 SARS-CoV-2의 존재 또는 부재를 검출하고/거나 대상체가 COVID-19를 갖는지 여부를 결정하는 방법으로서:
    a) SARS-CoV-2 E 및/또는 N2 유전자를 검출하는 프라이머 세트와 대상체로부터의 생물학적 샘플을 접촉시키는 단계;
    b) 하나 이상의 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 수행하는 단계; 및
    c) PCR에 의해 생산된 앰플리콘을 검출하는 단계;
    여기서 SARS-CoV-2 E 및/또는 N2 유전자의 존재 또는 부재를 검출하는 프라이머 세트는 하기 중 적어도 하나를 포함하는 것인 방법:
    a) 하기로부터 선택된 SARS-CoV-2 E를 검출하는 프라이머 세트:
    i) SARS-CoV-2 E 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머;
    ii) 서열식별번호: 44의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 44의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
    iii) 서열식별번호: 48의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 49의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
    b) 하기로부터 선택된 SARS-CoV-2 N2를 검출하는 프라이머 세트:
    i) SARS-CoV-2 N2 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머;
    ii) 서열식별번호: 45의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 45의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
    iii) 서열식별번호: 51의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 52의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머.
  47. 하기를 포함하는, 대상체로부터의 생물학적 샘플에서 SARS-CoV-2의 존재 또는 부재를 검출하고/거나 대상체가 COVID-19를 갖는지 여부를 결정하는 방법으로서:
    a) SARS-CoV-2 E, SARS-CoV-2 N2 유전자 및/또는 SARS-CoV-2 RdRP 유전자를 검출하는 프라이머 세트와 대상체로부터의 생물학적 샘플을 접촉시키는 단계;
    b) 하나 이상의 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 수행하는 단계; 및
    c) PCR에 의해 생산된 앰플리콘을 검출하는 단계;
    여기서 SARS-CoV-2 E, SARS-CoV-2 N2 유전자 및/또는 SARS-CoV-2 RdRP 유전자의 존재 또는 부재를 검출하는 프라이머 세트는 하기 중 적어도 하나를 포함하는 것인 방법:
    a) 하기로부터 선택된 SARS-CoV-2 E를 검출하는 프라이머 세트:
    i) SARS-CoV-2 E 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머;
    ii) 서열식별번호: 44의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 44의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
    iii) 서열식별번호: 70의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 71의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
    iv) 서열식별번호: 48의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 49의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머;
    b) 하기로부터 선택된 SARS-CoV-2 N2를 검출하는 프라이머 세트:
    i) SARS-CoV-2 N2 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머;
    ii) 서열식별번호: 45의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 45의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드에 적어도 85% 상보적인 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
    iii) 서열식별번호: 73 또는 서열식별번호: 51의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 52의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머; 및
    c) 하기로부터 선택된 SARS-CoV-2 RdRP를 검출하는 프라이머 세트:
    i) SARS-CoV-2 RdRP 유전자의 서열을 검출하기 위한 정방향 및 적어도 하나의 역방향 프라이머;
    ii) 서열식별번호: 76의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 61 및/또는 서열식별번호: 78의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 적어도 하나의 역방향 프라이머.
  48. 제47항에 있어서,
    a) SARS-CoV-2 E를 검출하는 프라이머 세트가 서열식별번호: 70의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 71의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머를 포함하고;
    b) SARS-CoV-2 N2를 검출하는 프라이머 세트가 서열식별번호: 73의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 52의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 역방향 프라이머를 포함하고;
    c) SARS-CoV-2 RdRP를 검출하는 프라이머 세트가 서열식별번호: 76의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열식별번호: 61 및/또는 서열식별번호: 78의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 적어도 하나의 역방향 프라이머를 포함하는 것인 방법.
  49. 제47항 또는 제48항에 있어서,
    a) SARS-CoV-2 E 앰플리콘이 서열식별번호: 79와 적어도 85% 동일한 서열을 포함하고/거나;
    b) SARS-CoV-2 N2 앰플리콘이 서열식별번호: 47과 적어도 85% 동일한 서열을 포함하고/거나; 및/또는
    c) SARS-CoV-2 RdRP 앰플리콘이 서열식별번호: 80 및/또는 서열식별번호: 81과 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 것인 방법.
  50. 제47항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 SARS-CoV-2 E 프로브, SARS-CoV-2 N2 프로브 및 SARS-CoV-2 RdRP 프로브로부터 선택된 적어도 하나의 프로브와 앰플리콘을 접촉시키는 것을 추가로 포함하고, 여기서
    a) SARS-CoV-2 E 프로브가 서열식별번호: 72의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함하고;
    b) SARS-CoV-2 N2 프로브가 서열식별번호: 74 및/또는 서열식별번호: 75의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함하고;
    c) SARS-CoV-2 RdRP 프로브가 서열식별번호: 77의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드와 적어도 85% 동일한 또는 상보적인 서열을 포함하는 것인 방법.
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