CN114277048A

CN114277048A - 一种内含新型冠状病毒ORF1ab基因、E基因和N基因装甲RNA标准物质及其应用

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Publication number: CN114277048A
Application number: CN202210050496.8A
Authority: CN
Inventors: 任彤; 汪琳; 高志强; 蒲静; 赵相鹏; 尹羿; 张伟
Original assignee: China Customs Science And Technology Research Center
Current assignee: China Customs Science And Technology Research Center
Priority date: 2022-01-17
Filing date: 2022-01-17
Publication date: 2022-04-05

Abstract

本发明公开了一种内含新型冠状病毒ORF1ab基因、E基因和N基因装甲RNA标准物质。该标准物质是利用MS2噬菌体装甲RNA技术，将新型冠状病毒ORF1ab基因、E基因和N基因用MS2噬菌体的衣壳蛋白包装而成，本发明制备的标准物质具有稳定、无生物传染性、可真实模拟病毒粒子结构、耐RNase等特性，适用于新冠病毒以ORF1ab基因、E基因和N基因为靶标的核酸检测方法的质量控制，以及检测试剂和实验室能力的评价。

Description

一种内含新型冠状病毒ORF1ab基因、E基因和N基因装甲RNA标准物质及其应用

技术领域

本发明属于疫病检测技术领域，特别涉及一种内含新型冠状病毒ORF1ab基因、E基因和N基因装甲RNA标准物质及其应用。

背景技术

当前，新型冠状病毒肺炎疫情在全球范围内大流行，截止2021年12月7日，全球累计确诊超过2亿7千万人，累计死亡超过532万人，全球每日新增确诊仍保持在60万人左右。因此全球对它高度关注，虽然各国对新冠肺炎防制策略不尽相同，但都把新冠肺炎的快速诊断和及时监测作为首要步骤。核酸检测技术因具有快速、灵敏、特异性强等特点，已成为新冠病毒的主要检测技术，广泛用于临床样品的检测和分子流行病学调查。

新型冠状病毒为RNA病毒，其成熟的病毒体为多形态有囊膜的颗粒，直径75～160nm，基因组为单股正链RNA，冠状病毒拥有已知最大的RNA病毒基因组，其衣壳呈20面立体对称，囊膜表面有约20nm长的棒状或花瓣状刺突，形状似日冕。新冠病毒ORF1ab基因、E基因和N基因是新冠核酸检测的主要靶基因。目前，国内外针对新冠病毒ORF1ab基因、E基因和N基因建立了多种核酸检测方法，其中应用最多是荧光RT-PCR方法，市场上也有多种不同厂家生产的核酸检测试剂盒，这些试剂盒在检测特异性、灵敏度等方面均有不同，直接影响检测结果的一致性和准确性。此外，目前新型冠状病毒核酸检测方法和试剂使用的质控样品多选择质粒DNA和体外转录cRNA制备，裸露核酸又极易被广泛存在的核酸酶降解，且不能实现核酸提取过程的有效监控，难以保证检测结果的准确性。因此，研制一种既稳定又没有传染性可用于新型冠状病毒核酸检测的质控样品和标准物质对于其检测方法和试剂的标准化、规范化使用及临床检测具有重要意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于克服现有质控样品或标准物质的不足，利用MS2噬菌体装甲RNA技术，制备了一种内含新型冠状病毒ORF1ab基因、E基因和N基因装甲RNA标准物质，该标准物质具有稳定、无生物传染性、可真实模拟病毒粒子结构、耐RNase等特性，可用于多种新型冠状病毒核酸检测方法和试剂盒的质量控制。本发明主要是通过以下技术方案解决上述技术问题。

一方面，本发明提供了一种内含新型冠状病毒ORF1ab基因、E基因和N基因装甲RNA标准物质，该装甲RNA标准物质的原核表达载体包括pET32a-ACP-ORF1ab质粒、pET32a-ACP-E质粒和pET32a-ACP-N质粒，将表达载体转入表达菌株中，诱导表达，得到内含新型冠状病毒ORF1ab基因、E基因和N基因装甲RNA病毒样颗粒；

其中原核表达载体pET32a-ACP-ORF1ab质粒、pET32a-ACP-E质粒和pET32a-ACP-N质粒中，所述ACP序列为如序列表SEQ ID NO：4所示的包含MS2噬菌体基因组5'非编码区序列、成熟酶蛋白基因、衣壳蛋白基因、包装位点和复制酶基因部分起始位点的序列，所述ORF1ab基因、E基因和N基因序列如序列表SEQ ID NO：1～3所示。

另一方面，本发明还提供了一种一种内含新型冠状病毒ORF1ab基因、E基因和N基因装甲RNA标准物质的制备方法，包括以下步骤：

1)获得用于新冠病毒核酸检测的ORF1ab基因、E基因和N基因序列；

2)将包含MS2噬菌体基因组5'非编码区序列、成熟酶蛋白基因、衣壳蛋白基因、包装位点和复制酶基因部分起始位点的序列克隆于原核表达载体pET32a中，分别在其下游插入通过步骤1)获得的ORF1ab基因、E基因和N基因的cDNA序列，获得表达载体pET32a-ACP-ORF1ab、pET32a-ACP-E、pET32a-ACP-N；

3)将原核表达载体转入表达菌株中，诱导表达，然后采用超声波裂解，离心，收集上清液，获得表达产物；

4)经Cellufine Sulfate树脂柱纯化、聚乙二醇沉淀和DNase消化，去除残留质粒DNA，得到内含新型冠状病毒ORF1ab基因、E基因和N基因装甲RNA病毒样颗粒；

5)将内含新冠病毒ORF1ab基因、E基因和N基因的装甲RNA病毒样颗粒通过荧光定量RT-PCR方法定值，稀释混合分装，即得。

优选的，步骤4)中，具体过程为：取平衡缓冲液平衡Cellufine sulfate树脂柱，将表达产物上柱结合，用洗涤缓冲液I洗脱，再用洗脱缓冲液II洗脱，收集含装甲RNA病毒颗粒的溶液；然后用固体聚乙二醇进行沉淀，再利用DNase I消化残留的质粒DNA，得到内含新冠病毒ORF1ab基因、E基因和N基因装甲RNA病毒样颗粒，其中，平衡缓冲液为含有0.1M氯化钠的浓度为10mM的磷酸钠缓冲液，pH7.5，洗涤缓冲液I为含0.3M氯化钠的浓度为10mM磷酸钠缓冲液，pH7.5，洗脱缓冲液II为含2M氯化钠的浓度为10mM磷酸钠缓冲液，pH7.5。

优选的，内含新型冠状病毒ORF1ab基因、E基因和N基因装甲RNA标准物质中质粒DNA的残留量为0。

优选的，内含新型冠状病毒ORF1ab基因、E基因和N基因装甲RNA标准物质的浓度为10⁶copies/μL。

再一方面，本发明还提供了一种内含新型冠状病毒ORF1ab基因、E基因和N基因装甲RNA标准物质在制备新冠病毒核酸检测试剂中的应用。

本发明的积极进步效果在于：

1)该装甲RNA内部包含的ORF1ab基因、E基因和N基因片段，覆盖了目前多数新型冠状病毒核酸检测方法和试剂盒检测的区域，如WHO和CDC荐的新型冠状病毒荧光RT-PCR检测方法等。因此该标准物质可用于现有新型冠状病毒核酸检测方法和试剂的质量控制。

2)该装甲RNA标准物质纯度高，无质粒DNA残留，具有良好的质控性能。装甲RNAVLPs的表达产物中会混杂有大量的细菌蛋白、核酸以及质粒DNA，如果不去除将直接影响到质控样品的性能，特别是质粒DNA，未经核酸提取和反转录过程即可检测为阳性，即便只有微量残留，在指数级扩增后也会对结果构成显著影响。研究中，我们试图通过超速离心、病毒沉淀以及DNase消化的方法纯化VLPs，结果发现残留质粒DNA均无法彻底去除。为此，我们进行了多种方法的尝试，包括硅粉吸附、超速离心以及Cellufine Sulfate亲和层析法等试验，结果证实，采用Cellufine Sulfate亲和树脂柱纯化，聚乙二醇沉淀，加入DNase消化后可彻底去除残留质粒DNA。

3)该装甲RNA标准物质内部的ORF1ab基因、E基因和N基因由MS2噬菌体的衣壳蛋白包裹，可耐受RNase降解，相比于体外转录的裸露RNA更加稳定，易于保存。

4)该装甲RNA模拟了天然病毒的结构，可与临床样本一样参与核酸提取和扩增等环节，实现对检测过程的全程质控，确保检测结果的真实可靠。

5)该装甲RNA无生物传染性，易于制备和运输，相比于增殖的病毒粒子，更适合临床推广使用。

6)该装甲RNA标准物质对其内部所含的目的核酸通过荧光定量RT-PCR方法进行了定值，可用于检测样品的定量分析及检测方法和试剂检测极限的评价。

附图说明

图1为新型冠状病毒ORF1ab基因、E基因和N基因RT-PCR扩增结果琼脂糖凝胶电泳图；M:Marker 2000；1:N基因扩增产物,大小为1260bp；2:ORF 1b基因扩增产物，大小为1016bp；3：E基因扩增产物，大小为404bp。

图2为内含新型冠状病毒ORF1ab基因、E基因和N基因装甲RNA实时荧光RT-PCR鉴定结果。

图3为新型冠状病毒荧光RT-PCR检测方法检测10倍系列稀释装甲RNA标准物质的结果。

图4为荧光RT-PCR对新冠病毒装甲RNA标准物质均匀性检测结果。

具体实施方式

一种内含新型冠状病毒ORF1ab基因、E基因和N基因装甲RNA标准物质，该装甲RNA标准物质的原核表达载体包括pET32a-ACP-ORF1ab质粒、pET32a-ACP-E质粒和pET32a-ACP-N质粒，将表达载体转入表达菌株中，诱导表达，得到内含新型冠状病毒ORF1ab基因、E基因和N基因装甲RNA病毒样颗粒；

一种内含新型冠状病毒ORF1ab基因、E基因和N基因装甲RNA标准物质的制备方法，包括如下步骤：

所述ORF1ab基因、E基因和N基因可以通过合成或者RT-PCR扩增获得，该片段覆盖了目前多数新型冠状病毒核酸检测方法和试剂盒检测的区域；

2)将如序列表SEQ ID NO：4所示的包含MS2噬菌体基因组中5’非编码区序列、成熟酶蛋白基因、衣壳蛋白基因、包装位点和复制酶基因部分起始位点的cDNA序列克隆于原核表达载体pET32a中，分别在其下游插入ORF1ab基因、E基因和N基因的cDNA序列，获得表达载体pET32a-ACP-ORF1ab、pET32a-ACP-E、pET32a-ACP-N；

具体的：将pET32a-ACP-ORF1ab、pET32a-ACP-E、pET32a-ACP-N质粒分别转化表达菌株BL21(DE3)，阳性菌落接种到含氨苄霉素(100mg/L)LB液体培养基中，37℃、200r/min培养至OD600为0.6时加入异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)至终浓度1mmol/L，诱导5h，收集菌体采用超声波裂解处理(200W，间隔10s，共超声作用30次)，12 000r/min离心20min，收集上清液，用0.45μm微孔滤膜过滤，得到表达产物；

4)经Cellufine Sulfate树脂柱纯化、聚乙二醇沉淀和DNase消化，去除残留质粒DNA，得到内含新型冠状病毒ORF1ab基因、E基因和N基因装甲RNA病毒样颗粒(VLPs)；

5)将内含新冠病毒ORF1ab基因、E基因和N基因的装甲RNA病毒样颗粒通过荧光定量RT-PCR方法定值，稀释混合分装，即得内含新型冠状病毒ORF1ab基因、E基因和N基因装甲RNA标准物质。

发明人发现装甲RNA VLPs的表达产物中会混杂有大量的细菌蛋白、核酸以及质粒DNA，如果不去除将直接影响到质控样品的性能，特别是质粒DNA，未经核酸提取和反转录过程即可检测为阳性，即便只有微量残留，在指数级扩增后也会对结果构成显著影响。因此，要去除混杂的其他细菌组分和质粒DNA。现有技术中通常使用蔗糖密度梯度离心对表达产物进行纯化，但该方法无法去除DNA，因此，本发明采用了Cellufine Sulfate树脂柱纯化、聚乙二醇沉淀和DNase消化结合的方式，解决了上述技术问题。

具体的：将获得的表达产物用Cellufine sulfate树脂柱纯化，以去除混杂的其他细菌组分和质粒DNA。取10倍柱体积的平衡缓冲液(含有0.1M氯化钠的浓度为10mM的磷酸钠缓冲液，pH7.5)平衡Cellufine sulfate树脂柱，流速3mL/min；将表达上清液上柱结合，上样流速3mL/min，之后利用平衡缓冲液冲洗约10个柱体积；用洗涤缓冲液I(含0.3M氯化钠的浓度为10mM磷酸钠缓冲液，pH7.5)洗脱30个柱体积以上。用洗脱缓冲液II(含2M氯化钠的浓度为10mM磷酸钠缓冲液，pH7.5)洗脱，分管收集作为VLPs溶液。

VLPs溶液中加入固体聚乙二醇(PEG6000)至终浓度为10％(W/V)，室温搅拌使其完全溶解，冰浴4h以上使VLPs形成沉淀，4℃11000r/min离心10min，用适量RNase free dH₂O悬浮沉淀。之后利用DNase I消化溶液中残留的质粒DNA，加入等体积的氯仿CH₃Cl抽提后4℃11000r/min离心10min，回收含VLPs的水相，即为内含新冠病毒ORF1ab基因、E基因和N基因的装甲RNA(AR-IVM)悬浮液。

本发明所述的内含新型冠状病毒ORF1ab基因、E基因和N基因装甲RNA标准物质中没有质粒DNA的残留。

进一步地，将内含新冠病毒ORF1ab基因、E基因和N基因的装甲RNA溶液通过荧光定量RT-PCR方法定值后，稀释分装后作为标准物质使用，内含新型冠状病毒ORF1ab基因、E基因和N基因装甲RNA标准物质的浓度为10⁶copies/μL。

本发明还提供了一种内含新型冠状病毒ORF1ab基因、E基因和N基因装甲RNA标准物质在制备新冠病毒核酸检测试剂中的应用。

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂供应商购买得到。

实施例1内含新型冠状病毒ORF1ab基因、E基因和N基因装甲RNA的获得及鉴定

1、材料

新型冠状病毒SARS-CoV-2由中国医学科学院病原生物研究所提供，海科中心动物检疫研究所保存，表达载体pET-32a由本实验室保存；Trans10、BL21(DE3)感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司。包含MS2噬菌体基因组5’非编码区序列、成熟酶蛋白、衣壳蛋白及其下游的部分基因(ACP)序列的DNA片段由中国检验检疫科学研究院动检所惠赠保存。

2、方法

1)引物设计

根据GenBank公布的SARS-CoV-2基因组序列(登录号为MN908947.3)，选取ORF1ab基因、N基因和E基因主要靶标，利用oligo 6软件设计引物。同时参照WHO和CDC推荐合成SARS-CoV-2 ORF1ab基因、E基因和N基因实时荧光RT-PCR检测用引物和探针。所有引物及探针序列和PCR扩增片段大小见表1。根据GenBank中登录的MS2噬菌体和SARS-CoV-2基因组序列，利用Oligo 6软件设计引物。引物对PF/PR用于MS2噬菌体成熟酶蛋白、衣壳蛋白及其下游的部分基因的扩增，片段为1781bp；引物对NCOV-ORF1abCF/NCOV-ORF1abCR用于扩增SARS-CoV-2的ORF1ab基因的保守区域，片段为1375bp。引物对NCOV-ORF1abPF/NCOV-ORF1abPR用于鉴定检测SARS-CoV-2的ORF1ab基因，扩增片段为1375bp；引物对NCOV-NPF/NCOV-ORF1abPR用于鉴定检测SARS-CoV-2的N基因，扩增片段为419bp；引物对NCOV-NCF/NCOV-NCR用于扩增SARS-CoV-2的N基因，片段为419bp；引物对NCOV-ECF/NCOV-ECR用于扩增SARS-CoV-2的E基因，片段为227bp。引物对NCOV-EPF/NCOV-EPR用于鉴定检测SARS-CoV-2的E基因，扩增片段为227bp。

表1基因克隆和鉴定用引物及探针序列

2)MS2噬菌体基因组片段的合成

包含MS2噬菌体基因组成熟酶蛋白、外壳蛋白及其下游的部分基因序列的DNA片段由中国检验检疫科学研究院动植物检疫所提供，大小约为1700bp。根据MS2噬菌体基因组5’非编码区序列合成完整的上游基因片段，片断大小约为98bp，序列如下：GGTACCCCCTTTCGGGGTCCTGCTCAACTTCCTGTCGAGCTAATGCCATTTTTAATGTCTTTAGCGAGACGCTACCATGGCTATCGCTGTAGGTAGCC。

3)MS2噬菌体ACP基因的融合扩增

包含有MS2噬菌体病毒包装元件基因组成的片段，即含5’非编码区、成熟酶蛋白、外壳蛋白及其下游的部分基因序列，经融合PCR扩增获得。

将MS2噬菌体部分基因组核酸片段和经英骏生物公司合成的MS2噬菌体基因组5’非编码区分别作为模板，利用引物对PF/PFR和PFF/PR分别进行PCR扩增。取扩增产物12μL在1.5％琼脂糖凝胶中120V电泳25min，置紫外凝胶成像系统中观察电泳结果。经琼脂糖凝胶电泳回收目的片段。之后将回收的扩增产物混合作为模板，利用PF/PR引物对进行PCR扩增，扩增体系为：PFU DNA Polymerase 10X Bufferwith MgSO₄，5μL；2.5mM dNTPs，4μL；10μM引物，2μL；PFU DNA Polymerase(2–3U/μL)，1μL；DNA模板，2μL；加ddH₂O至总体积50μL。加完后立即混匀。在PCR仪上按如下条件进行扩增：95℃5min；95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸2min，35个循环后72℃延伸10min，4℃保存。反应结束后用琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物。

4)MS2噬菌体ACP基因片断和质粒pET32a的双酶切

回收ACP扩增产物，之后将其和质粒PET32a分别进行双酶切，体系为目的片断ACP，25μL；10×buffer，8μL；KpnI，4μL；BamHI，4μL；加ddH₂O至总体积80μL。质粒pET32a，20μL；10×Kbuffer，6μL；KpnI，3μL；BamHI，3μL；加ddH₂O至总体积60μL。混匀放置于37℃水浴锅，酶切4h以上。之后胶回收酶切产物胶回收双酶切的ACP片断和pET32a载体。

5)质粒pET32a-ACP的构建

将胶回收的ACP片断和pET32a进行连接，体系为：载体pET32a，2μL；CP片断，8μL；10×T4 DNA连接酶buffer，2μL；T4 DNA连接酶，1μL；加ddH₂O至20μL。充分混合后置于16℃水浴连接过夜。之后转化大肠杆菌感受态细胞(Trans10)，将转化后细菌培养液涂布于含氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养14h，挑取单克隆菌落，混合于10μLLB液体中，混匀后取2μL稀释菌液作模板，进行PCR鉴定，反应体系为：5×GoTaq Buffer(含Mg²⁺)，4μL；dNTP(2.5mmol/μL)，2μL；引物(PF/PR 10pmol/μL)，2μL；GoTaq DNA聚合酶(5U/μL)，1μL；菌液，2μL；加ddH₂O至总体积20μL。反应参数为：95℃3min；扩增条件为：95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸2min，30个循环后72℃延伸10min，4℃保存。反应结束后用琼脂糖凝胶电泳分析筛选出含有阳性重组质粒的单克隆菌。

6)质粒pET32a-ACP的鉴定

将上述PCR鉴定为阳性的单克隆菌落接种于4mL LB培养液中，放入37℃摇床，振荡培养过夜，提取质粒，进行KpnⅠ/BamHⅠ双酶切鉴定，反应体系为，质粒pET32a-ACP，1.5μL；10×K buffer，1μL；KpnⅠ，0.5μL；BamHⅠ，0.5μL；加ddH₂O至10μL。置37℃过夜酶切，之后1.5％琼脂糖凝胶电泳观察酶切结果。

7)内含新冠病毒N基因病毒样颗粒重组表达载体的构建

提取SARS-CoV-2基因组RNA作为模板，一步法RT-PCR扩增其E序列。RT-PCR反应条件为42℃反转录45min；95℃5min；188℃30sec、55℃30sec、72℃30s，35个循环；72℃7min。扩增产物1.0％琼脂糖凝胶电泳，胶回收SARS-CoV-2ORF1ab基因片段。

BamHⅠ/NotⅠ双酶切pET-MS2和SARS-CoV-2 E基因片段，经胶回收后连接，连接产物转化Trans10感受态细胞，将获得的重组克隆进行PCR鉴定，鉴定为阳性的重组载体命名为pET-MS2-CoV-N，由上海生工测序鉴定。

将pET-MS2-CoV-N转化BL21(DE3)感受态细胞，在Amp抗性LB中37℃、200r/min培养至OD600nm值为0.6时，加入IPTG至终浓度1mmol/L，诱导5h，收集菌体采用超声波裂解，12000r/min离心20min，收集上清液，用0.45μm微孔滤膜过滤，得到噬菌体VLPs表达产物。并将其利用Cellufine sulfate病毒纯化树脂柱进行纯化，去除细菌DNA、RNA等杂质，获得高纯度的病毒样颗粒。

VLPs溶液中加入固体聚乙二醇(PEG6000)至终浓度为10％(W/V)，室温搅拌使其完全溶解，冰浴4h以上使VLPs形成沉淀，4℃11000r/min离心10min，用适量RNase free dH₂O悬浮沉淀。之后利用DNase I消化溶液中残留的质粒DNA，加入等体积的氯仿CH₃Cl抽提后4℃11000r/min离心10min，回收水相，即为内含SARS-CoV-2 ORF1ab基因的病毒样颗粒AR-N。

8)内含E基因病毒样颗粒的制备

提取SARS-CoV-2基因组RNA作为模板，一步法RT-PCR扩增其E序列。RT-PCR反应条件为42℃反转录45min；95℃5min；188℃30sec、55℃30sec、72℃30s，35个循环；72℃7min。扩增产物1.0％琼脂糖凝胶电泳，胶回收SARS-CoV-2 E基因片段。

BamHⅠ/NotⅠ双酶切pET-MS2和SARS-CoV-2 ORF1ab基因片段，经胶回收后连接，连接产物转化Trans10感受态细胞，将获得的重组克隆进行PCR鉴定，鉴定为阳性的重组载体命名为pET-MS2-CoV-E，由上海生工测序鉴定。

将pET-MS2-CoV-E转化BL21(DE3)感受态细胞，在Amp抗性LB中37℃、200r/min培养至OD600nm值为0.6时，加入IPTG至终浓度1mmol/L，诱导5h，收集菌体采用超声波裂解，12000r/min离心20min，收集上清液，用0.45μm微孔滤膜过滤，得到噬菌体VLPs表达产物。并将其利用Cellufine sulfate病毒纯化树脂柱进行纯化，去除细菌DNA、RNA等杂质，获得高纯度的病毒样颗粒。

VLPs溶液中加入固体聚乙二醇(PEG6000)至终浓度为10％(W/V)，室温搅拌使其完全溶解，冰浴4h以上使VLPs形成沉淀，4℃11000r/min离心10min，用适量RNase free dH₂O悬浮沉淀。之后利用DNase I消化溶液中残留的质粒DNA，加入等体积的氯仿CH₃Cl抽提后4℃11000r/min离心10min，回收水相，即为内含SARS-CoV-2 E基因的病毒样颗粒AAR-E。

9)病毒样颗粒的鉴定

为验证所制备的病毒样颗粒分别含有SARS-CoV-2 ORF1ab、N、E基因RNA且没有质粒DNA残留，分别取1μL、2μL和4μL病毒样颗粒悬浮液，应用

Mini Kit试剂盒提取RNA，将提取的RNA分作两份：一份进行RT-PCR扩增；另外一份不经反转录，直接进行PCR扩增。扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测结果。同时，提取RNA分作两份进行实时荧光RT-PCR鉴定，一份加入反转录酶，一份不加反转录酶。

10)病毒样颗粒耐核酸酶试验

用去离子水分别将病毒样颗粒悬浮液稀释为强阳和弱阳样品，分两组进行试验，一组加入RNaseA(1μg/mL)37℃放置60min，并以裸露的RNA做对照；另一组不做处理。之后同时提取RNA进行实时荧光RT-PCR检测，采用两样本均数显著性检验t检验进行Ct值统计学分析。

11)病毒样颗粒的电镜观察

将上述初步制备的VLPs表达产物经蔗糖密度梯度离心纯化。首先配制15％、25％、35％、45％蔗糖溶液；之后先在超速离心管中加入5mL初步制备的VLPs，然后在离心管中依次加入15％、25％、35％、45％蔗糖溶液，加的时候是用长针头从底部往上加的。110000g离心2.5h，用长针头将含有明亮条带的部分吸取出来，分别收集到不同的瓶内。之后，用STE缓冲液适量稀释纯化的病毒，然后110000g离心3h去除蔗糖，用少量STE(根据沉淀的量决定加入多少)缓冲液把沉淀悬起，即最后获得了纯化的病毒。取5μL纯化病毒样品经1％的醋酸双氧铀染色5min，自然干燥2h。用JEM2100透射电子显微镜观察病毒样颗粒形态。

3、结果

1)A型新冠病毒ORF1AB基因、E基因和N基因的扩增

选取A型新冠病毒最为保守的M基因片段作为目标区域，以引物对SIVCF/SIVCR扩增，PCR产物电泳可见约758bp的特异性片段，与预期的目的片段大小相符，如图1所示。测序结果表明扩增产物是A型新冠病毒的ORF1AB基因、E基因和N基因，核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1-3所示。

2)装甲RNA病毒样颗粒(VLPs)表达载体的构建

将MS2噬菌体基因组中5’非编码区序列、成熟酶蛋白基因、衣壳蛋白基因、包装位点和复制酶基因部分起始位点的cDNA序列(ACP基因片段)，定向克隆于表达载体pET32a中，提取质粒经Kpn I和BamH I双酶切鉴定阳性质粒，琼脂糖凝胶电泳结果可见约1781bp的目的条带和约5kb的载体条带，与预期大小相符。然后将ORF1AB基因、E基因和N基因定向克隆于表达载体pET32a-ACP中，经限制性酶切消化鉴定，获得阳性表达载体pET-32a-ACP-IVM，测序结果表明ORF1AB基因、E基因和N基因正确克隆到载体上。

3)装甲RNA VLPs的鉴定

将利用Cellufine sulfate亲和层析法纯化和PEG6000沉淀的VLPs加入DNase作用后，分别取1μL、2μL和4μL装甲RNA悬浮液，利用

Mini Kit提取RNA，利用检测引物分别进行直接PCR和RT-PCR。实时荧光RT-PCR检测结果进一步证实，加入反转录酶可出现典型扩增曲线，而不加反转录酶则不会出现扩增曲线(图2所示)。这些结果表明所制备的装甲RNA病毒样颗粒包裹了新冠病毒ORF1ab基因、E基因和N基因RNA片段，且没有质粒DNA的残留，可用于装甲RNA标准物质的制备。

实施例2内含新型冠状病毒ORF1ab基因、E基因和N基因装甲RNA标准物质的制备

1.内含新型冠状病毒ORF1ab基因、E基因和N基因装甲RNA标准物质的定值

将实施例1中获得的装甲RNA病毒样颗粒所含ORF1ab基因、E基因和N基因的拷贝数进行定值，定值方法为分别将扩增获得的新冠病毒的ORF1ab基因、E基因和N基因，克隆于PGEM－Teasy载体中，之后按照Promega公司的Ribo MAXTM Large Scale RNAProductionSystem-T7(Cat#P1300、Lot#125575)试剂盒进行体外转录获得ORF1ab基因、E基因和N基因cRNA，用紫外分光仪测定其260nm和280nm的吸光度值，通过分子量计算出其拷贝数，经10倍系列稀释制成一系列外标品。将实施例1中获得的装甲RNA病毒样颗粒提取RNA后与系列外标品，用WHO规定的新型冠状病毒荧光RT-PCR检测方法同时进行检测。将系列外标品检测获得的Ct值作为定量参数对不同稀释度所含模板拷贝数的对数值做线性回归，绘制标准曲线，并获得标准回归方程，将待测装甲RNA病毒样颗粒测定的Ct值引入标准曲线线性回归方程，计算获得其核酸拷贝数，结果如图3所示。

2.标准物质的稀释、分装和保存

根据上述的定值结果，用PBS将实施例1中获得的装甲RNA病毒样颗粒稀释至10⁶copies/μL并进行等比混合，充分混匀后分装入冻存管中，每支0.5mL，置-80℃保存。

实施例3标准物质的验证

1、均匀性检验

随机抽取标准物质10管，提取RNA，进行实时荧光RT-PCR检测，对获得的Ct值进行统计学分析，结果变异系数分别为2.45％，2.86％，1.56％，均小于5％，表明样品中病毒样颗粒分布是均匀的，结果如图4所示。

2、稳定性检验

将制备的标准样品分别在室温、2-8℃、-20℃和对照(-80℃)保存一定时间，之后提取RNA进行实时荧光RT-PCR检测。检测组与对照组(-80℃)数据作t检验分析表明检测组与对照组差异均无统计学意义(P>0.5),样品内的核酸含量基本保持不变，表明标准样品稳定性很好。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国海关科学技术研究中心

<120> 一种内含新型冠状病毒ORF1ab基因、E基因和N基因装甲RNA标准物质及其应用

<130> P220006DD1SQ

<160> 19

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1018

<212> DNA

<213> （ORF1ab基因序列）

<400> 1

acaagctggt aatgcaacag aagtgcctgc caattcaact gtattatctt tctgtgcttt 60

tgctgtagat gctgctaaag cttacaaaga ttatctagct agtgggggac aaccaatcac 120

taattgtgtt aagatgttgt gtacacacac tggtactggt caggcaataa cagttacacc 180

ggaagccaat atggatcaag aatcctttgg tggtgcatcg tgttgtctgt actgccgttg 240

ccacatagat catccaaatc ctaaaggatt ttgtgactta aaaggtaagt atgtacaaat 300

acctacaact tgtgctaatg accctgtggg ttttacactt aaaaacacag tctgtaccgt 360

ctgcggtatg tggaaaggtt atggctgtag ttgtgatcaa ctccgcgaac ccatgcttca 420

gtcagctgat gcacaatcgt ttttaaacgg gtttgcggtg taagtgcagc ccgtcttaca 480

ccgtgcggca caggcactag tactgatgtc gtatacaggg cttttgacat ctacaatgat 540

aaagtagctg gttttgctaa attcctaaaa actaattgtt gtcgcttcca agaaaaggac 600

gaagatgaca atttaattga ttcttacttt gtagttaaga gacacacttt ctctaactac 660

caacatgaag aaacaattta taatttactt aaggattgtc cagctgttgc taaacatgac 720

ttctttaagt ttagaataga cggtgacatg gtaccacata tatcacgtca acgtcttact 780

aaatacacaa tggcagacct cgtctatgct ttaaggcatt ttgatgaagg taattgtgac 840

acattaaaag aaatacttgt cacatacaat tgttgtgatg atgattattt caataaaaag 900

gactggtatg attttgtaga aaacccagat atattacgcg tatacgccaa cttaggtgaa 960

cgtgtacgcc aagctttgtt aaaaacagta caattctgtg atgccatgcg aaatgctg 1018

<210> 2

<211> 1270

<212> DNA

<213> （N基因序列）

<400> 2

atgaggctgg ttctaaatca cccattcagt acatcgatat cggtaattat acagtttcct 60

gtttaccttt tacaattaat tgccaggaac ctaaattggg tagtcttgta gtgcgttgtt 120

cgttctatga agacttttta gagtatcatg acgttcgtgt tgttttagat ttcatctaaa 180

cgaacaaact aaaatgtctg ataatggacc ccaaaatcag cgaaatgcac cccgcattac 240

gtttggtgga ccctcagatt caactggcag taaccagaat ggagaacgca gtggggcgcg 300

atcaaaacaa cgtcggcccc aaggtttacc caataatact gcgtcttggt tcaccgctct 360

cactcaacat ggcaaggaag accttaaatt ccctcgagga caaggcgttc caattaacac 420

caatagcagt ccagatgacc aaattggcta ctaccgaaga gctaccagac gaattcgtgg 480

tggtgacggt aaaatgaaag atctcagtcc aagatggtat ttctactacc taggaactgg 540

gccagaagct ggacttccct atggtgctaa caaagacggc atcatatggg ttgcaactga 600

gggagccttg aatacaccaa aagatcacat tggcacccgc aatcctgcta acaatgctgc 660

aatcgtgcta caacttcctc aaggaacaac attgccaaaa ggcttctacg cagaagggag 720

cagaggcggc agtcaagcct cttctcgttc ctcatcacgt agtcgcaaca gttcaagaaa 780

ttcaactcca ggcagcagta ggggaacttc tcctgctaga atggctggca atggcggtga 840

tgctgctctt gctttgctgc tgcttgacag attgaaccag cttgagagca aaatgtctgg 900

taaaggccaa caacaacaag gccaaactgt cactaagaaa tctgctgctg aggcttctaa 960

gaagcctcgg caaaaacgta ctgccactaa agcatacaat gtaacacaag ctttcggcag 1020

acgtggtcca gaacaaaccc aaggaaattt tggggaccag gaactaatca gacaaggaac 1080

tgattacaaa cattggccgc aaattgcaca atttgccccc agcgcttcag cgttcttcgg 1140

aatgtcgcgc attggcatgg aagtcacacc ttcgggaacg tggttgacct acacaggtgc 1200

catcaaattg gatgacaaag atccaaattt caaagatcaa gtcattttgc tgaataagca 1260

tattgacgca 1270

<210> 3

<211> 404

<212> DNA

<213> （E基因序列)

<400> 3

acggttcatc cggagttgtt aatccagtaa tggaaccaat ttatgatgaa ccgacgacga 60

ctactagcgt gcctttgtaa gcacaagctg atgagtacga acttatgtac tcattcgttt 120

cggaagagac aggtacgtta atagttaata gcgtacttct ttttcttgct ttcgtggtat 180

tcttgctagt tacactagcc atccttactg cgcttcgatt gtgtgcgtac tgctgcaata 240

ttgttaacgt gagtcttgta aaaccttctt tttacgttta ctctcgtgtt aaaaatctga 300

attcttctag agttcctgat cttctggtct aaacgaacta aatattatat tagtttttct 360

gtttggaact ttaattttag ccatggcaga ttccaacggt acta 404

<210> 4

<211> 1793

<212> DNA

<213> (MS2噬菌体基因组5'非编码区序列、成熟酶蛋白基因、衣壳蛋白基因、包装位点和复制酶基因部分起始位点序列)

<400> 4

ggtaccccct ttcggggtcc tgctcaactt cctgtcgagc taatgccatt tttaatgtct 60

ttagcgagac gctaccatgg ctatcgctgt aggtagccgg aattccattc ctaggaggtt 120

tgacctgtgc gagcttttag tacccttgat agggagaacg agaccttcgt cccctccgtt 180

cgcgtttacg cggacggtga gactgaagat aactcattct ctttaaaata tcgttcgaac 240

tggactcccg gtcgttttaa ctcgactggg gccaaaacga aacagtggca ctacccctct 300

ccgtattcac ggggggcgtt aagtgtcaca tcgatagatc aaggtgccta caagcgaagt 360

gggtcatcgt ggggtcgccc gtacgaggag aaagccggtt tcggcttctc cctcgacgca 420

cgctcctgct acagcctctt ccctgtaagc caaaacttga cttacatcga agtgccgcag 480

aacgttgcga accgggcgtc gaccgaagtc ctgcaaaagg tcacccaggg taattttaac 540

cttggtgttg ctttagcaga ggccaggtcg acagcctcac aactcgcgac gcaaaccatt 600

gcgctcgtga aggcgtacac tgccgctcgt cgcggtaatt ggcgccaggc gctccgctac 660

cttgccctaa acgaagatcg aaagtttcga tcaaaacacg tggccggcag gtggttggag 720

ttgcagttcg gttggttacc actaatgagt gatatccagg gtgcatatga gatgcttacg 780

aaggttcacc ttcaagagtt tcttcctatg agagccgtac gtcaggtcgg tactaacatc 840

aagttagatg gccgcctgtc gtatccagct gcaaacttcc agacaacgtg caacatatcg 900

cgacgtatcg tgatatggtt ttacataaac gatgcacgtt tggcatggtt gtcgtctcta 960

ggtatcttga acccactagg tatagtgtgg gaaaaggtgc ctttctcatt cgttgtcgac 1020

tggctcctac ctgtaggtaa catgctcgag ggccttacgg cccccgtggg atgctcctac 1080

atgtcaggaa cagttactga cgtaataacg ggtgagtcca tcataagcgt tgacgctccc 1140

tacgggtgga ctgtggagag acagggcact gctaaggccc aaatctcagc catgcatcga 1200

ggggtacaat ccgtatggcc aacaactggc gcgtacgtaa agtctccttt ctcgatggtc 1260

cataccttag atgcgttagc attaatcagg caacggctct ctagatagag ccctcaaccg 1320

gagtttgaag catggcttct aactttactc agttcgttct cgtcgacaat ggcggaactg 1380

gcgacgtggc tgtcgcccca agcaacttcg ctaacggggt cgctgaatgg atcagctcta 1440

actcgcgttc acaggcttac aaagtaacct gtagcgttcg tcagagctct gcgcagaatc 1500

gcaaatacac catcaaagtc gaggtgccta aagtggcaac ccagactgtt ggtggtgtag 1560

agcttcctgt agccgcatgg cgttcgtact taaatatgga actaaccatt ccaattttcg 1620

ctacgaattc cgactgcgag cttattgtta aggcaatgca aggtctccta aaagatggaa 1680

acccgattcc ctcagcaatc gcagcaaact ccggcatcta ctaatagacg ccggccattc 1740

aaacatgagg attacccatg tcgaagacaa caaagaagtt caactctgga tcc 1793

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> (人工序列)

<400> 5

agctggatcc ggtaagcaac ag 22

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 6

attgcggccg cgtcgtaaag cgtac 25

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 7

ccctgtgggt tttacactta a 21

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 8

acgattgtgc atcagctga 19

<210> 9

<211> 28

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 9

ccgtctgcgg tatgtggaaa ggttatgg 28

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 10

agctggatcc atgaggctgg ttcta 25

<210> 11

<211> 26

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 11

attgcggccg cacgcagtta tacgcc 26

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 12

cacattggca cccgcaatc 19

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 13

gaggaacgag aagaggcttg 20

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 14

acttcctcaa ggaacaacat tgcca 25

<210> 15

<211> 26

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 15

agctggatcc acggttcata cggagt 26

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 16

attgcggccg catcatggca acctt 25

<210> 17

<211> 26

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 17

acaggtacgt taatagttaa tagcgt 26

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 18

atattgcagc agtacgcaca ca 22

<210> 19

<211> 26

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 19

acactagcca tccttactgc gcttcg 26

Claims

1.一种内含新型冠状病毒ORF1ab基因、E基因和N基因装甲RNA标准物质，其特征在于，该装甲RNA标准物质的原核表达载体包括pET32a-ACP-ORF1ab质粒、pET32a-ACP-E质粒和pET32a-ACP-N质粒，该表达载体通过转入表达菌株中，诱导表达后得到内含新型冠状病毒ORF1ab基因、E基因和N基因装甲RNA病毒样颗粒；

其中原核表达载体pET32a-ACP-ORF1ab质粒、pET32a-ACP-E质粒和pET32a-ACP-N质粒中的ACP序列为序列表SEQ ID NO：4所示的包含MS2噬菌体基因组5'非编码区序列、成熟酶蛋白基因、衣壳蛋白基因、包装位点和复制酶基因部分起始位点的序列，所述ORF1ab基因、E基因和N基因序列对应序列表SEQ ID NO：1～3所示。

2.一种内含新型冠状病毒ORF1ab基因、E基因和N基因装甲RNA标准物质的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的内含新型冠状病毒ORF1ab基因、E基因和N基因装甲RNA标准物质的制备方法，其特征在于，步骤4)中，具体过程为：取平衡缓冲液平衡Cellufine sulfate树脂柱，将表达产物上柱结合，用洗涤缓冲液I洗脱，再用洗脱缓冲液II洗脱，收集含装甲RNA病毒颗粒的溶液；然后用固体聚乙二醇进行沉淀，再利用DNase I消化残留的质粒DNA，得到内含新冠病毒ORF1ab基因、E基因和N基因装甲RNA病毒样颗粒，其中，平衡缓冲液为含有0.1M氯化钠的浓度为10mM的磷酸钠缓冲液，pH7.5，洗涤缓冲液I为含0.3M氯化钠的浓度为10mM磷酸钠缓冲液，pH7.5，洗脱缓冲液II为含2M氯化钠的浓度为10mM磷酸钠缓冲液，pH7.5。

4.根据权利要求2或3所述的内含新型冠状病毒ORF1ab基因、E基因和N基因装甲RNA标准物质的制备方法，其特征在于，内含新型冠状病毒ORF1ab基因、E基因和N基因装甲RNA标准物质中质粒DNA的残留量为0。

5.根据权利要求4所述的内含新型冠状病毒ORF1ab基因、E基因和N基因装甲RNA标准物质的制备方法，其特征在于，内含新型冠状病毒ORF1ab基因、E基因和N基因装甲RNA标准物质的浓度为10⁶copies/μL。

6.权利要求1所述的内含新型冠状病毒ORF1ab基因、E基因和N基因装甲RNA标准物质在制备新冠病毒核酸检测试剂中的应用。