CN112359022A - 检测用新型冠状病毒核酸假病毒标准物质及其制备方法 - Google Patents

Abstract

一种新型冠状病毒(2019‑nCoV，或称SARS‑CoV‑2)核酸检测用假病毒标准物质及其制备方法。将新型冠状病毒核酸整合至慢病毒表达质粒载体中，然后将构建的慢病毒表达质粒与包装质粒共同转染至细胞中，经细胞表达后得到大量包装了新冠病毒RNA的假病毒颗粒。通过DNase I消化和蔗糖密度梯度超速离心去除质粒DNA后，冷冻干燥获得假病毒颗粒冻干物。本发明既有包装了病毒的部分RNA序列，又有包装了全部序列的假病毒标准物质，能完全模拟病毒RNA提取和核酸检测全过程，可用于新冠病毒核酸定性和定量检测方法的验证评价以及实验室质量控制。得到的标准物质具有纯度高、安全性好和量值准确等特性，并且稳定性好，可以常温条件运输，为标准物质的量值溯源传递提供了保障。

Description

检测用新型冠状病毒核酸假病毒标准物质及其制备方法

技术领域：

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种检测用新型冠状病毒核酸假病毒标准物质及其制备方法。

背景技术：

目前，新型冠状病毒(2019-nCoV，亦称为SARS-CoV-2)感染在全球范围内大流行，急需对大量的人群感染新型冠状病毒情况进行持续的检测。

聚合酶链反应(PCR)被认为是新型冠状病毒肺炎病人确诊的“金标准”，而目前新型冠状病毒PCR检测试剂质量参差不齐，对新型冠状病毒的检测造成较大影响，急需解决。

为了能够对各厂家生产的检测PCR试剂进行标准化的质量控制，中国计量科学研究院于2020年2月紧急研制了2种不同浓度的新冠病毒核酸标准物质(GBW(E)0910890～90)和 2种不同浓度的新冠病毒核酸基因组标准物质(GBW(E)0910898～99)。

然而，上述新冠病毒核酸标准物质是RNA转录子和RNA基因组形式，有以下缺点：

1)稳定性不好

现有新冠病毒核酸标准物质是裸露RNA状态的标准物质，很容易被环境中RNA酶降解，导致检测误差；

2)无法模拟新冠病毒核酸提取过程

新冠病毒核酸检测时需要先从咽拭子、痰液等样本中提取病毒核酸，然后进行PCR扩增来检测。而裸露RNA标准无法代替真实病毒检测过程，比如核酸提取效率只有70％，而直接用裸露RNA进行检测是无法来评价提取效率的。

3)标准物质贮存要求严苛

因为是裸露的RNA，必须贮存在-70℃以下，对于基层单位使用很不方便。

因此，如果能够构建一种新型冠状病毒的假病毒标准物质，就能够模拟病毒从RNA提取至核酸扩增检测步骤全过程，可以解决以上问题。而且，新型冠状病毒假病毒标准物质的建立将填补国内在新冠病毒检测领域的假病毒标准物质的空白，为我国新冠病毒核酸检测全流程的量值溯源传递发挥重要作用。

发明内容：

(一)要解决的技术问题

本发明的目的是提供一种新型冠状病毒(2019-nCoV，或称SARS-CoV-2)假病毒标准物质及其制备方法。

(二)技术方案

本发明制备了一种新型冠状病毒核酸检测用假病毒标准物质，该标准物质中，包括蛋白包裹RNA的假病毒颗粒，所述RNA选自以下：

SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3中任选1～3个核苷酸片段；或SEQ ID NO.4所示序列的核酸。

所述RNA包括了2019-nCoV(或SARS-CoV-2)全部基因序列和几个RNA片段(可能包括ORF1a/b、N、E等基因序列片段)。

本发明得到的假病毒标准物质，由以下组分组成：

1)蛋白包裹前述RNA的假病毒颗粒和病毒保护剂制成的假病毒冻干物；

2)用于假病毒冻干物复溶的无RNA酶水溶液。

所述被蛋白包裹，是新型冠状病毒RNA颗粒被慢病毒外壳蛋白包裹。

所述慢病毒的表达载体选自pCDH、pLentilox 3.7、pLKO.1、pBoBi、pLV、pLVX或pWPXL。

制成所述病毒保护剂的原料组成为：糖0～2重量份，牛血清白蛋白0～1重量份；

病毒保护剂优选的原料组成为：海藻糖5～10重量份，牛血清白蛋白1～5重量份，蔗糖1～3重量份；

将所述冻干物用无RNA酶水复溶后，其RNA浓度为1×10¹～1×10⁶copies/μL。

所述冻干物优选为饼状或球状；

一种新型冠状病毒(2019-nCoV，或称SARS-CoV-2)假病毒标准物质的制备方法，具体步骤如下：

1、通过PCR扩增，克隆2019-nCoV(或SARS-CoV-2)的基因片段或全基因组序列(选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4任一所示序列的核苷酸)；

2、利用同源重组的方法，将克隆到的基因连接到慢病毒表达载体，获得重组表达质粒。优选的，所述慢病毒表达载体选自pCDH、pLentilox 3.7、pLKO.1、pBoBi、pLV、pLVX或pWPXL。

3、分别将步骤2获得的重组表达质粒，以及假病毒包装质粒和假病毒包膜质粒转化到大肠杆菌中，进行扩增并分别提取相应的质粒；

优选的，所述假病毒包装质粒选自pCMV-dR8.91、psPAX2、pMDLg/pRRE、pLP1或pNL4-3；

优选的，所使用的假病毒包膜质粒为pMD2.G、pCMV-VSV-G、pLP VSV-G或pVSV-G。

优选的，所述大肠杆菌为Stable3。

4、将步骤3获得的重组表达质粒、假病毒包装质粒和包膜质粒共同转染至细胞后进行假病毒颗粒的包装，得到分泌在上清中包装了SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4所示序列RNA的假病毒颗粒的粗产物；

优选的，所述步骤4中所转染的细胞为HEK293T细胞。

优选的，所述步骤3中将假病毒表达载体质粒与假病毒的包装质粒和包膜质粒共同转染进HEK293T细胞的具体步骤为：

1)取HEK293T细胞接种到6孔板中，每孔接种细胞5×10⁵个，培养基为2mL含10％FBS的 DMEM完全培养基；

2)取150μL无血清MEM培养基，加入0.1～10μg的pCDH-CMV-MCS-EF1-puro-2019-nCoV (或pCDH-CMV-MCS-EF1-puro-SARS-CoV-2)、0.1～10μg的pCMV-dR8.91以及0.1～10μg的 pMD2.G，轻轻混匀后静置5min；

3)取150μL无血清MEM培养基，加入1～15μL转染试剂Exfect2000,轻轻混匀后静置5min；

4)将步骤3的混合液加到步骤4的液体中，轻轻混匀后静置10min；

5)从培养HEK293T细胞的6孔板的孔中吸去1mL培养基(剩余1mL)，将步骤4)中的混合液缓慢均匀地滴加到培养的细胞中，轻轻混匀后将细胞放回37℃细胞培养箱中培养；

6)6～18h后，吸去全部进行质粒转染的培养基，加入2mL DMEM完全培养基，置于37℃细胞培养箱中培养；

7)培养48～72h后收集细胞上清。

粗产物的纯化和后处理方法如下：

1)将假病毒颗粒的粗产物进行DNase I消化；

2)进行蔗糖密度梯度超速离心，收集假病毒颗粒，重悬于PBS中；

3)将假病毒颗粒的PBS溶液制备成所需浓度的假病毒溶液，加入冻干保护剂后进行冻干，得到假病毒冻干物。

优选的，所述DNase I消化的具体操作步骤为：向上一步获得的假病毒颗粒粗产物加入 DNase I，使DNase I浓度达到3～30U/mL，37℃孵育约6～24h。

优选的，超速离心的转速为70,000～200,000×g，离心2～3h，收集假病毒，用PBS溶解，分装冻存。

经上述纯化得到的假病毒颗粒不含有任何DNA。

本发明提供的新型冠状病毒(2019-nCoV，或称SARS-CoV-2)假病毒标准物质的定值方法，为数字PCR法，具体操作如下：用0.2mL无RNA酶水对标准物质进行复水溶解，充分混匀后提取RNA，采用一步法逆转录数字PCR对新型冠状病毒(2019-nCoV)RNA进行定量检测，实验结果以拷贝数浓度(copies/μL)表示，定值结果表示为：标准值±扩展不确定度。

本发明提供的假病毒标准物质的用途：

1、新冠病毒核酸定性和定量检测方法的验证评价以及实验室质量控制。

2、新冠病毒核酸检测试剂研制和质量评价。

3、新冠病毒预防治疗疫苗和药物制备。

(三)有益效果

1、既有包装了病毒的部分RNA序列，又有包装了全部序列的假病毒标准物质

获得包装了2019-nCoV(或SARS-CoV-2)部分RNA序列或全部序列的新型冠状病毒核酸检测用假病毒标准物质，能真实模拟新型冠状病毒检测从样本中的RNA提取到核酸检测的全过程。

2、安全性良好

蛋白外壳包裹RNA的假病毒模拟了新型冠状病毒形态，但不具有致病性。

3、纯度高

通过纯化工艺得到的新型冠状病毒(2019-nCoV或SARS-CoV-2)假病毒标准物质，具有很高纯度，不含有任何DNA(详见实施例7)。

DNA主要是指载体DNA，因载体DNA中包含了新冠病毒检测核酸片段，在PCR检测病毒核酸过程中，可能检测到的既有新冠假病毒RNA，也有载体DNA中新冠病毒DNA片段，因此载体DNA干扰新冠假病毒中RNA检测结果的准确性。

4、稳定性好，可以常温条件运输，为标准物质的量值溯源传递提供了保障

由于新型冠状病毒RNA被包裹在蛋白中，防止了RNA分子在环境中的直接暴露而导致降解。

经测定，冻干物成品在常温乃至45℃下具有很好的稳定性(详见实施例8)，无需低温运输，大大节约了运输成本。在-20℃下可长期储存。为标准物质的量值溯源传递提供了保障。而现有技术所研制的新冠病毒核酸标准物质是裸露RNA状态的标准物质，很容易被环境中RNA酶降解，因此，标准物质必须贮存在-70℃以下。

5、量值准确

采用数字PCR方法进行定值，可确保新冠假病毒标准物质量值准确

附图说明

图1为本发明实施例1中新型冠状假病毒基因序列1(ORF1ab基因)、基因序列2(E基因)和基因序列3(N基因)PCR扩增图

图2为本发明实施例1中慢病毒重组表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-puro-2019-nCoV(或 SARS-CoV-2)、pMD2.G和pCMV-dR8.91电泳结果图

图3本发明实施例6中新型冠状病毒假病毒颗粒的电镜图

图4为本发明实施例6中逆转录数字PCR(RT-dPCR)检测图，A为2019-nCoV-ORF1ab基因，B为2019-nCoV-E基因，C为2019-nCoV-N基因；

图5为本发明实施例8中新型冠状病毒假病毒冻干粉稳定性监测结果

序列信息

Seq No.1：包装的新型冠状病毒基因序列1(ORF1ab-1基因)(基因组坐标：13201-15600， GenBank No.NC_045512)cDNA序列(2400bp)：

Seq No.2：包装的新型冠状病毒基因序列2(E基因)(基因组坐标：26245-26472，GenBank No.NC_045512)的cDNA序列(228bp)：

Seq No.3：包装的新型冠状病毒基因序列3(N基因)(基因组坐标：28274-29533，GenBank No.NC_045512)的cDNA序列(1260bp)：

Seq No.4：包装的新型冠状病毒基因组cDNA全长序列。

具体实施方式

下面结合具体实例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。

本发明的以下实施例不应解释为限制本发明的范围。对本发明公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所有这些改进，均应落入本发明的精神和范围之内。非特殊说明，本发明实施例采用的试剂均为市售商品，本发明实施例采用的数据库均为公开的在线数据库。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，通常按照常规条件中的条件，或者按照制造厂商的建议条件。

本发明的新型冠状病毒(2019-nCoV或SARS-CoV-2)核酸检测用假病毒标准物质，是将2019-nCoV(或SARS-CoV-2)RNA包装在假病毒颗粒中。

一般的，通过序列组合得到的2019-nCoV(或SARS-CoV-2)的序列，通过慢载体包装后得到的包装了2019-nCoV(或SARS-CoV-2)RNA的假病毒颗粒，都是基于类似的原理得到相应的标准物质，因此，由上述方法得到的包装了病毒2019-nCoV(或SARS-CoV-2)RNA的假病毒颗粒具有类似的功能和应用，也包括在本发明的范围内。

以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量标书，表明在不改动基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。因此，用“大约”、“左右”等语言所修正的数值不限于该准确数值本身。在某些情况下，近似性语言可能与测量仪器的精度有关。

实施例1新型冠状假病毒制备方案一

本实施例中，慢病毒颗粒包装基因序列1(ORF1ab-1基因)、基因序列2(E基因)和基因序列3(N基因)片段RNA采用如下方法制得：

1.1从2019-nCoV(或SARS-CoV-2)基因组cDNA中通过PCR克隆基因序列1(ORF1ab-1基因)、基因序列2(E基因)和基因序列3(N基因)片段(图1)以及对 pCDH-CMV-MCS-EF1-puro载体质粒进行线性化，引物如下(表1)：

表1基因序列1、基因序列2和基因序列3的引物序列

1.2通过引物的设计使2019-nCoV(或SARS-CoV-2)的基因序列1、基因序列2和基因序列3 各个片段以及线性化的载体质粒依次在两端具有20bp的重复序列，以便后续进行同源重组连接；

1.3对克隆的基因片段以及线性化载体质粒进行琼脂糖凝胶回收纯化；

1.4通过融合PCR的方法将2019-nCoV(或SARS-CoV-2)的基因序列1、基因序列2和基因序列3各片段连接为一个片段；

1.5取PCR管，以摩尔比1:1的比例加入2019-nCoV(或SARS-CoV-2)的基因序列1、基因序列2和基因序列3片段以及线性化载体质粒，加入2μL的同源重组酶，2μL的2×反应buffer，用超纯水补足20μL后于PCR仪中37℃反应30min；

1.6将同源重组反应后的混合液加入到stable3菌株感受态中进行转化；

1.7于氨苄青霉素抗性的细菌培养平板上筛选单克隆；

1.8于含有氨苄青霉素抗性的LB培养基中扩大培养单克隆，扩增pCDH-CMV-MCS-EF1- puro-2019-nCoV(或SARS-CoV-2)质粒；

1.9单克隆进行质粒提取后在琼脂糖凝胶电泳上验证pCDH-CMV-MCS-EF1-puro-2019-nCoV (或SARS-CoV-2)构建成功(图2)。并将克隆送测序公司进行测序验证，得到慢病毒表达载体质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-puro-2019-nCoV(或SARS-CoV-2)。

1.10取HEK293T接种到6孔板中，每孔接种细胞5×10⁵个，每孔培养基为2ml含10％FBS的 DMEM完全培养基；

1.11培养细胞汇合度达到70％左右；

1.12取150μL无血清MEM培养基，加入质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-puro-2019-nCoV(或SARS-CoV-2)0.15μg、pCMV-dR8.91 0.15μg以及pMD2.G 0.15μg，轻轻混匀后静置5min；

1.13取150μL无血清MEM培养基，加入8μL转染试剂Exfect2000,轻轻混匀后静置5min；

1.14将步骤1.12的混合液加到步骤1.13的液体中，轻轻混匀后静置10min；

1.15从培养HEK293T细胞的6孔板每孔细胞中吸去1mL培养基(剩余1mL)，将步骤1.14中的混合液缓慢均匀地滴加到培养的细胞中，轻轻混匀后将细胞放回37℃细胞培养箱中培养；

1.16培养12h后，吸去所有孔的培养基，加入2mL含10％FBS的DMEM完全培养基，置于37℃细胞培养箱中培养；

1.17培养72h后收集所有孔的细胞上清，即为假病毒颗粒粗产物。

实施例2新型冠状假病毒制备方案二

本实施例中，慢病毒颗粒包装基因序列1(ORF1ab-1基因)和基因序列3(N基因)片段RNA采用如下方法制得：

2.1从2019-nCoV(或SARS-CoV-2)基因组cDNA中通过PCR克隆基因序列1(ORF1ab-1基因)和基因序列2(N基因)片段以及对pLVX载体质粒进行线性化，引物见表1：

2.2通过引物的设计使2019-nCoV(或SARS-CoV-2)的基因序列1和基因序列3各个片段以及线性化的载体质粒依次在两端具有20bp的重复序列，以便后续进行同源重组连接；

2.3对克隆的基因片段以及线性化载体质粒进行琼脂糖凝胶回收纯化；

2.4通过融合PCR的方法将2019-nCoV(或SARS-CoV-2)的基因序列1和基因序列3各片段连接为一个片段；

2.5取PCR管，以摩尔比1:1的比例加入2019-nCoV(或SARS-CoV-2)的基因序列1和基因序列3片段以及线性化载体质粒，加入2μL的同源重组酶，2μL的2×反应buffer，用超纯水补足 20μL后于PCR仪中37℃反应30min；

2.6将同源重组反应后的混合液加入到DH5α菌株感受态中进行转化；

2.7于卡那霉素抗性的细菌培养平板上筛选单克隆；

2.8于含有卡那霉素抗性的LB培养基中扩大培养单克隆，扩增pLVX-2019-nCoV(或SARS-CoV-2)质粒；

2.9单克隆进行质粒提取后在琼脂糖凝胶电泳上验证pLVX-2019-nCoV(或SARS-CoV-2)构建成功。并将克隆送测序公司进行测序验证，得到慢病毒表达载体质粒pLVX-2019-nCoV(或 SARS-CoV-2)。

2.10取HEK293T接种到6孔板中，每孔接种细胞5×10⁵个，每孔培养基为2ml含10％FBS的 DMEM完全培养基；

2.11培养细胞汇合度达到70％左右；

2.12配制转染试剂2.5M CaCl2溶液10倍稀释后取2mL，加入质粒pLVX-2019-nCoV(或 SARS-CoV-2)0.23μg、pLP1 0.23μg以及pLP VSV-G 0.23μg，轻轻混匀；

2.13将混匀有DNA的CaCl2溶液放置于Votex上，边涡旋边加入等体积的2×HBSbuffer(2mL)，Votex混匀5s后加入培养基中，轻轻摇晃混匀后显微镜下观察，晶体呈分散的颗粒状为最佳；

2.14转染12h后弃掉培养基，加入10mL新鲜培养基；

2.15培养48h后收集所有孔的细胞上清，即为假病毒颗粒粗产物。

实施例3新型冠状假病毒制备方案三

本实施例中，慢病毒颗粒包装基因序列3(N基因)片段RNA采用如下方法制得：

3.1从2019-nCoV(或SARS-CoV-2)基因组cDNA中通过PCR克隆基因序列3(N基因)片段以及对pBoBi载体质粒进行线性化，引物序列见表1：

3.2通过引物的设计使2019-nCoV(或SARS-CoV-2)的基因序列1、基因序列2和基因序列3 各个片段以及线性化的载体质粒依次在两端具有20bp的重复序列，以便后续进行同源重组连接；

3.3对克隆的基因片段以及线性化载体质粒进行琼脂糖凝胶回收纯化；

3.4通过融合PCR的方法将2019-nCoV(或SARS-CoV-2)的基因序列3各片段连接为一个片段；

3.5取PCR管，以摩尔比1:1的比例加入2019-nCoV(或SARS-CoV-2)的基因序列3片段以及线性化载体质粒，加入2μL的同源重组酶，2μL的2×反应buffer，用超纯水补足20μL后于PCR 仪中37℃反应30min；

3.6将同源重组反应后的混合液加入到DH5α菌株感受态中进行转化；

3.7于卡那霉素抗性的细菌培养平板上筛选单克隆；

3.8于含有卡那霉素抗性的LB培养基中扩大培养单克隆，扩增pBoBi-2019-nCoV(或 SARS-CoV-2)质粒；

3.9单克隆进行质粒提取后在琼脂糖凝胶电泳上验证pBoBi-2019-nCoV(或SARS-CoV-2)构建成功。并将克隆送测序公司进行测序验证，得到慢病毒表达载体质粒pBoBi-2019-nCoV(或 SARS-CoV-2)。

3.10取HEK293T接种到6孔板中，每孔接种细胞5×10⁵个，每孔培养基为2ml含10％FBS的 DMEM完全培养基；

3.11培养细胞汇合度达到70％左右；

3.12配制转染试剂2.5M CaCl2溶液10倍稀释后取2mL，加入质粒pBoBi-2019-nCoV(或 SARS-CoV-2)1.2μg、pMDLg/pRRE 1.2μg以及pCMV-VSV-G 1.2μg，轻轻混匀；

3.13将混匀有DNA的CaCl2溶液放置于Votex上，边涡旋边加入等体积的2×HBSbuffer(2mL)，Votex混匀5s后加入培养基中，轻轻摇晃混匀后显微镜下观察，晶体呈分散的颗粒状为最佳；

3.14转染12h后弃掉培养基，加入10mL新鲜培养基；

3.15培养48h后收集所有孔的细胞上清，即为假病毒颗粒粗产物。

实施例4新型冠状假病毒制备方案四

本实施例中，慢病毒颗粒包装新冠病毒基因组RNA全长采用如下方法制得：

4.1从2019-nCoV(或SARS-CoV-2)基因组cDNA中通过PCR克隆各个片段并拼接获得基因全长序列以及对pLentilox 3.7载体质粒进行线性化。

4.2对克隆的基因片段以及线性化载体质粒进行琼脂糖凝胶回收纯化；

4.3通过融合PCR的方法将2019-nCoV(或SARS-CoV-2)的基因序列1、基因序列2和基因序列3各片段连接为一个片段；

4.5取PCR管，以摩尔比1:1的比例加入2019-nCoV(或SARS-CoV-2)的基因全长序列以及线性化载体质粒，加入2μL的同源重组酶，2μL的2×反应buffer，用超纯水补足20μL后于PCR仪中37℃反应30min；

4.6将同源重组反应后的混合液加入到stable3菌株感受态中进行转化；

4.7于氨苄青霉素抗性的细菌培养平板上筛选单克隆；

4.8于含有氨苄青霉素抗性的LB培养基中扩大培养单克隆，扩增pLentilox 3.7-2019-nCoV(或 SARS-CoV-2)质粒；

4.9单克隆进行质粒提取后在琼脂糖凝胶电泳上验证pLentilox 3.7-2019-nCoV(或 SARS-CoV-2)构建成功。并将克隆送测序公司进行测序验证，得到慢病毒表达载体质粒pLentilox 3.7-2019-nCoV(或SARS-CoV-2)。

4.10取HEK293T接种到6孔板中，每孔接种细胞5×10⁵个，每孔培养基为2ml含10％FBS的 DMEM完全培养基；

4.11培养细胞汇合度达到70％左右；

4.12取150μL无血清MEM培养基，加入质粒pLentilox 3.7-2019-nCoV(或SARS-CoV-2)5.0μg、 psPAX2 2.0μg以及pVSV-G 2.0μg，轻轻混匀后静置5min；

4.13取150μL无血清MEM培养基，加入8μL转染试剂Exfect2000,轻轻混匀后静置5min；

4.14将步骤4.12的混合液加到步骤4.13的液体中，轻轻混匀后静置10min；

4.15从培养HEK293T细胞的6孔板每孔细胞中吸去1mL培养基(剩余1mL)，将步骤4.14中的混合液缓慢均匀地滴加到培养的细胞中，轻轻混匀后将细胞放回37℃细胞培养箱中培养；

4.16培养12h后，吸去所有孔的培养基，加入2mL含10％FBS的DMEM完全培养基，置于37℃细胞培养箱中培养；

4.17培养72h后收集所有孔的细胞上清，即为假病毒颗粒粗产物。

实施例5：包装了2019-nCoV(或SARS-CoV-2)的ORF1ab、E和N基因RNA的新型冠状病毒假病毒颗粒富集纯化

5.1将转染48～72h后的细胞上清液收集合并，3000rpm离心10min后使用0.45μm无菌滤膜过滤去除细胞碎片。

5.2向过滤后的细胞上清液中加入终浓度10U/mL的DNase I消化6h，期间多次颠倒混匀；

5.3制备蔗糖梯度，用长针头从底部依次加入60％、45％、35％和25％的蔗糖。

5.4对上一步得到的假病毒颗粒产物进行蔗糖密度超速离心，100,000×g，离心3h，收集假病毒，最后用10mL PBS溶解，完成假病毒颗粒的富集纯化。

实施例6：新型冠状病毒假病毒颗粒的验证

6.1假病毒颗粒制样后进行透射电镜TEM的观察

具体过程如下：

6.1.1将铜网置于20μL的包装了2019-nCoV(或SARS-CoV-2)RNA的新型冠状病毒假病毒颗粒的微滴内；

6.1.2吸附10min后，取出铜网并用20μL的2％的磷钨酸(phosphotungstic acidPTA pH 6.8) 进行负染固定样品30s；

6.1.3将铜网取出，置于滤纸片上晾干过夜后进行透射电镜观察。结果如图3所示。

6.2用数字PCR验证包装了2019-nCoV(或SARS-CoV-2)的ORF1ab、E和N基因RNA的新型冠状病毒假病毒颗粒

6.2.1取20μL浓缩后的假病毒颗粒加180μL无菌水补齐至140μL，进行假病毒颗粒的RNA提取 (提取步骤参考试剂盒说明书QIAamp viral RNA minikit)；

6.2.2提取RNA后，利用合成的2019-nCoV(或SARS-CoV-2)的引物和探针进行数字PCR验证。数字PCR检测引物和探针序列见表2：

表2数字PCR验证基因序列1、基因序列2和基因序列3的引物和探针序列

6.2.3数字PCR体系为(20μL体系)：

表3新型冠状病毒逆转录数字PCR(RT-dPCR)反应体系配制

6.2.4数字PCR扩增程序为：45℃，10min；95℃，5min；再按95℃，15s，58℃，30s循环40 次；荧光检测在58℃；

6.2.5数字PCR验证新型冠状病毒假病毒颗粒包装了基因序列1(ORF1ab基因)、基因序列2 (E基因)和基因序列3(N基因)RNA(图4)。

实施例7新型冠状病毒假病毒纯度验证

包装了2019-nCoV(或SARS-CoV-2)的RNA的新型冠状病毒假病毒颗粒的纯度主要通过数字PCR扩增验证是否有表达载体质粒存在，具体过程如下：

7.1取20μL浓缩后的假病毒颗粒，利用合成的2019-nCoV(或SARS-CoV-2)的引物和探针进行数字PCR验证，引物探针序列见实施例6的6.2.2的表2：

7.2数字PCR检测表达载体质粒的体系为(20μL体系)：

表4新型冠状病毒数字PCR(RT-PCR)反应体系配制

7.3数字PCR扩增程序为：95℃，5min；再按95℃，15s，58℃，30s循环40次；荧光检测在 58℃；

7.4数字PCR验证新型冠状病毒假病毒颗粒中没有pCDH-CMV-MCS-EF1-puro-2019-nCoV (或SARS-CoV-2)、pBoBi-2019-nCoV(或SARS-CoV-2)、pLV-2019-nCoV(或SARS-CoV-2)、 pLentilox 3.7-2019-nCoV(或SARS-CoV-2)、pLKO.1-2019-nCoV(或SARS-CoV-2)、pLVX、 pWPXL-2019-nCoV(或SARS-CoV-2)、FUGW-2019-nCoV(或SARS-CoV-2)等表达载体质粒存在。

实施例8新型冠状病毒假病毒标准物质的稳定性评价 (以包装了基因序列3(N基因)RNA新型冠状假病毒为例)

8.1新型冠状病毒假病毒标准物质稳定性时间点和温度点设置

稳定性按照0天、3天、5天、7天、14天共7个时间点储存在-80℃、-20℃、4℃、20℃、37℃、45℃、60℃等7种不同温度，每个时间点和温度点抽取3个单元，采用数字PCR定量测量基因拷贝数，每个单元3次重复，用t检验进行短期稳定性评估。

8.2新型冠状病毒假病毒标准物质稳定性评估结果

在设置时间点取出不同温度储存的新型冠状假病毒，提取RNA后，采用RT-dPCR测试假病毒在不同温度下的稳定性。从图5可以看出，从-80℃-45℃的温度条件下，14天内RT-dPCR 的copies/μL变化不明显，因此包装了新型冠状病毒基因序列3(N基因)RNA的加病毒在45℃以下均有很好的稳定性。

Seq No.1：包装的新型冠状病毒基因序列1(ORF1ab-1基因)(基因组坐标：13201-15600， GenBank No.NC_045512)cDNA序列(2400bp)：

Seq No.2：包装的新型冠状病毒基因序列2(E基因)(基因组坐标：26245-26472，GenBank No.NC_045512)的cDNA序列(228bp)：

Seq No.3：包装的新型冠状病毒基因序列3(N基因)(基因组坐标：28274-29533，GenBank No.NC_045512)的cDNA序列(1260bp)：

Seq No.4：包装的新型冠状病毒基因组cDNA全长序列。

序列表

<110> 中国计量科学研究院

<120> 检测用新型冠状病毒核酸假病毒标准物质及其制备方法

<160> 4

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 2900

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

1 ggaagccaat atggatcaag aatcctttgg tggtgcatcg tgttgtctgt actgccgttg

61 ccacatagat catccaaatc ctaaaggatt ttgtgactta aaaggtaagt atgtacaaat

121 acctacaact tgtgctaatg accctgtggg ttttacactt aaaaacacag tctgtaccgt

181 ctgcggtatg tggaaaggtt atggctgtag ttgtgatcaa ctccgcgaac ccatgcttca

241 gtcagctgat gcacaatcgt ttttaaacgg gtttgcggtg taagtgcagc ccgtcttaca

301 ccgtgcggca caggcactag tactgatgtc gtatacaggg cttttgacat ctacaatgat

361 aaagtagctg gttttgctaa attcctaaaa actaattgtt gtcgcttcca agaaaaggac

421 gaagatgaca atttaattga ttcttacttt gtagttaaga gacacacttt ctctaactac

481 caacatgaag aaacaattta taatttactt aaggattgtc cagctgttgc taaacatgac

541 ttctttaagt ttagaataga cggtgacatg gtaccacata tatcacgtca acgtcttact

601 aaatacacaa tggcagacct cgtctatgct ttaaggcatt ttgatgaagg taattgtgac

661 acattaaaag aaatacttgt cacatacaat tgttgtgatg atgattattt caataaaaag

721 gactggtatg attttgtaga aaacccagat atattacgcg tatacgccaa cttaggtgaa

781 cgtgtacgcc aagctttgtt aaaaacagta caattctgtg atgccatgcg aaatgctggt

841 attgttggtg tactgacatt agataatcaa gatctcaatg gtaactggta tgatttcggt

901 gatttcatac aaaccacgcc aggtagtgga gttcctgttg tagattctta ttattcattg

961 ttaatgccta tattaacctt gaccagggct ttaactgcag agtcacatgt tgacactgac

1021 ttaacaaagc cttacattaa gtgggatttg ttaaaatatg acttcacgga agagaggtta

1081 aaactctttg accgttattt taaatattgg gatcagacat accacccaaa ttgtgttaac

1141 tgtttggatg acagatgcat tctgcattgt gcaaacttta atgttttatt ctctacagtg

1201 ttcccaccta caagttttgg accactagtg agaaaaatat ttgttgatgg tgttccattt

1261 gtagtttcaa ctggatacca cttcagagag ctaggtgttg tacataatca ggatgtaaac

1321 ttacatagct ctagacttag ttttaaggaa ttacttgtgt atgctgctga ccctgctatg

1381 cacgctgctt ctggtaatct attactagat aaacgcacta cgtgcttttc agtagctgca

1441 cttactaaca atgttgcttt tcaaactgtc aaacccggta attttaacaa agacttctat

1501 gactttgctg tgtctaaggg tttctttaag gaaggaagtt ctgttgaatt aaaacacttc

1561 ttctttgctc aggatggtaa tgctgctatc agcgattatg actactatcg ttataatcta

1621 ccaacaatgt gtgatatcag acaactacta tttgtagttg aagttgttga taagtacttt

1681 gattgttacg atggtggctg tattaatgct aaccaagtca tcgtcaacaa cctagacaaa

1741 tcagctggtt ttccatttaa taaatggggt aaggctagac tttattatga ttcaatgagt

1801 tatgaggatc aagatgcact tttcgcatat acaaaacgta atgtcatccc tactataact

1861 caaatgaatc ttaagtatgc cattagtgca aagaatagag ctcgcaccgt agctggtgtc

1921 tctatctgta gtactatgac caatagacag tttcatcaaa aattattgaa atcaatagcc

1981 gccactagag gagctactgt agtaattgga acaagcaaat tctatggtgg ttggcacaac

2041 atgttaaaaa ctgtttatag tgatgtagaa aaccctcacc ttatgggttg ggattatcct

2101 aaatgtgata gagccatgcc taacatgctt agaattatgg cctcacttgt tcttgctcgc

2161 aaacatacaa cgtgttgtag cttgtcacac cgtttctata gattagctaa tgagtgtgct

2221 caagtattga gtgaaatggt catgtgtggc ggttcactat atgttaaacc aggtggaacc

2281 tcatcaggag atgccacaac tgcttatgct aatagtgttt ttaacatttg tcaagctgtc

2341 acggccaatg ttaatgcact tttatctact gatggtaaca aaattgccga taagtatgtc

2401 caaaggactt ccttggaatg tagtgcgtat aaagattgta caaatgttaa gtgacacact

2461 taaaaatctc tctgacagag tcgtatttgt cttatgggca catggctttg agttgacatc

2521 tatgaagtat tttgtgaaaa taggacctga gcgcacctgt tgtctatgtg atagacgtgc

2581 cacatgcttt tccactgctt cagacactta tgcctgttgg catcattcta ttggatttga

2641 ttacgtctat aatccgttta tgattgatgt tcaacaatgg ggttttacag gtaacctaca

2701 aagcaaccat gatctgtatt gtcaagtcca tggtaatgca catgtagcta gttgtgatgc

2761 aatcatgact aggtgtctag ctgtccacga gtgctttgtt aagcgtgttg actggactat

2821 tgaatatcct ataattggtg atgaactgaa gattaatgcg gcttgtagaa aggttcaaca

2881 catggttgtt aaagctgcat

<210> 2

<211> 228

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

1 atgtactcat tcgtttcgga agagacaggt acgttaatag ttaatagcgt acttcttttt

61 cttgctttcg tggtattctt gctagttaca ctagccatcc ttactgcgct tcgattgtgt

121 gcgtactgct gcaatattgt taacgtgagt cttgtaaaac cttcttttta cgtttactct

181 cgtgttaaaa atctgaattc ttctagagtt cctgatcttc tggtctaa

<210> 3

<211> 1260

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

1 atgtctgata atggacccca aaatcagcga aatgcacccc gcattacgtt tggtggaccc

61 tcagattcaa ctggcagtaa ccagaatgga gaacgcagtg gggcgcgatc aaaacaacgt

121 cggccccaag gtttacccaa taatactgcg tcttggttca ccgctctcac tcaacatggc

181 aaggaagacc ttaaattccc tcgaggacaa ggcgttccaa ttaacaccaa tagcagtcca

241 gatgaccaaa ttggctacta ccgaagagct accagacgaa ttcgtggtgg tgacggtaaa

301 atgaaagatc tcagtccaag atggtatttc tactacctag gaactgggcc agaagctgga

361 cttccctatg gtgctaacaa agacggcatc atatgggttg caactgaggg agccttgaat

421 acaccaaaag atcacattgg cacccgcaat cctgctaaca atgctgcaat cgtgctacaa

481 cttcctcaag gaacaacatt gccaaaaggc ttctacgcag aagggagcag aggcggcagt

541 caagcctctt ctcgttcctc atcacgtagt cgcaacagtt caagaaattc aactccaggc

601 agcagtaggg gaacttctcc tgctagaatg gctggcaatg gcggtgatgc tgctcttgct

661 ttgctgc tgcttgacag attgaaccag cttgagagca aaatgtctggtaa aggccaacaa

721 caacaaggcc aaactgtcac taagaaatct gctgctgagg cttctaagaa gcctcggcaa

781 aaacgta ctgccactaa agcatacaat gtaacacaag ctttcggcagacg tggtccagaa

841 caaacccaag gaaattttgg ggaccaggaa ctaatcagac aaggaactga ttacaaacat

901 tggccgcaaa ttgcacaatt tgcccccagc gcttcagcgt tcttcggaat gtcgcgcatt

961 ggcatggaag tcacaccttc gggaacgtgg ttgacctaca caggtgccat caaattggat

1021 gacaaagatc caaatttcaa agatcaagtc attttgctga ataagcatat tgacgcatac

1081 aaaacattcc caccaacaga gcctaaaaag gacaaaaaga agaaggctga tgaaactcaa

1141 gccttaccgc agagacagaa gaaacagcaa actgtgactc ttcttcctgc tgcagatttg

1201 gatgatttct ccaaacaatt gcaacaatcc atgagcagtg ctgactcaac tcaggcctaa

<210> 4

<211> 29903

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

1 attaaaggtt tataccttcc caggtaacaa accaaccaac tttcgatctc ttgtagatct

61 gttctctaaa cgaactttaa aatctgtgtg gctgtcactc ggctgcatgc ttagtgcact

121 cacgcagtat aattaataac taattactgt cgttgacagg acacgagtaa ctcgtctatc

181 ttctgcaggc tgcttacggt ttcgtccgtg ttgcagccga tcatcagcac atctaggttt

241 cgtccgggtg tgaccgaaag gtaagatgga gagccttgtc cctggtttca acgagaaaac

301 acacgtccaa ctcagtttgc ctgttttaca ggttcgcgac gtgctcgtac gtggctttgg

361 agactccgtg gaggaggtct tatcagaggc acgtcaacat cttaaagatg gcacttgtgg

421 cttagtagaa gttgaaaaag gcgttttgcc tcaacttgaa cagccctatg tgttcatcaa

481 acgttcggat gctcgaactg cacctcatgg tcatgttatg gttgagctgg tagcagaact

541 cgaaggcatt cagtacggtc gtagtggtga gacacttggt gtccttgtcc ctcatgtggg

601 cgaaatacca gtggcttacc gcaaggttct tcttcgtaag aacggtaata aaggagctgg

661 tggccatagt tacggcgccg atctaaagtc atttgactta ggcgacgagc ttggcactga

721 tccttatgaa gattttcaag aaaactggaa cactaaacat agcagtggtg ttacccgtga

781 actcatgcgt gagcttaacg gaggggcata cactcgctat gtcgataaca acttctgtgg

841 ccctgatggc taccctcttg agtgcattaa agaccttcta gcacgtgctg gtaaagcttc

901 atgcactttg tccgaacaac tggactttat tgacactaag aggggtgtat actgctgccg

961 tgaacatgag catgaaattg cttggtacac ggaacgttct gaaaagagct atgaattgca

1021 gacacctttt gaaattaaat tggcaaagaa atttgacacc ttcaatgggg aatgtccaaa

1081 ttttgtattt cccttaaatt ccataatcaa gactattcaa ccaagggttg aaaagaaaaa

1141 gcttgatggc tttatgggta gaattcgatc tgtctatcca gttgcgtcac caaatgaatg

1201 caaccaaatg tgcctttcaa ctctcatgaa gtgtgatcat tgtggtgaaa cttcatggca

1261 gacgggcgat tttgttaaag ccacttgcga attttgtggc actgagaatt tgactaaaga

1321 aggtgccact acttgtggtt acttacccca aaatgctgtt gttaaaattt attgtccagc

1381 atgtcacaat tcagaagtag gacctgagca tagtcttgcc gaataccata atgaatctgg

1441 cttgaaaacc attcttcgta agggtggtcg cactattgcc tttggaggct gtgtgttctc

1501 ttatgttggt tgccataaca agtgtgccta ttgggttcca cgtgctagcg ctaacatagg

1561 ttgtaaccat acaggtgttg ttggagaagg ttccgaaggt cttaatgaca accttcttga

1621 aatactccaa aaagagaaag tcaacatcaa tattgttggt gactttaaac ttaatgaaga

1681 gatcgccatt attttggcat ctttttctgc ttccacaagt gcttttgtgg aaactgtgaa

1741 aggtttggat tataaagcat tcaaacaaat tgttgaatcc tgtggtaatt ttaaagttac

1801 aaaaggaaaa gctaaaaaag gtgcctggaa tattggtgaa cagaaatcaa tactgagtcc

1861 tctttatgca tttgcatcag aggctgctcg tgttgtacga tcaattttct cccgcactct

1921 tgaaactgct caaaattctg tgcgtgtttt acagaaggcc gctataacaa tactagatgg

1981 aatttcacag tattcactga gactcattga tgctatgatg ttcacatctg atttggctac

2041 taacaatcta gttgtaatgg cctacattac aggtggtgtt gttcagttga cttcgcagtg

2101 gctaactaac atctttggca ctgtttatga aaaactcaaa cccgtccttg attggcttga

2161 agagaagttt aaggaaggtg tagagtttct tagagacggt tgggaaattg ttaaatttat

2221 ctcaacctgt gcttgtgaaa ttgtcggtgg acaaattgtc acctgtgcaa aggaaattaa

2281 ggagagtgtt cagacattct ttaagcttgt aaataaattt ttggctttgt gtgctgactc

2341 tatcattatt ggtggagcta aacttaaagc cttgaattta ggtgaaacat ttgtcacgca

2401 ctcaaaggga ttgtacagaa agtgtgttaa atccagagaa gaaactggcc tactcatgcc

2461 tctaaaagcc ccaaaagaaa ttatcttctt agagggagaa acacttccca cagaagtgtt

2521 aacagaggaa gttgtcttga aaactggtga tttacaacca ttagaacaac ctactagtga

2581 agctgttgaa gctccattgg ttggtacacc agtttgtatt aacgggctta tgttgctcga

2641 aatcaaagac acagaaaagt actgtgccct tgcacctaat atgatggtaa caaacaatac

2701 cttcacactc aaaggcggtg caccaacaaa ggttactttt ggtgatgaca ctgtgataga

2761 agtgcaaggt tacaagagtg tgaatatcac ttttgaactt gatgaaagga ttgataaagt

2821 acttaatgag aagtgctctg cctatacagt tgaactcggt acagaagtaa atgagttcgc

2881 ctgtgttgtg gcagatgctg tcataaaaac tttgcaacca gtatctgaat tacttacacc

2941 actgggcatt gatttagatg agtggagtat ggctacatac tacttatttg atgagtctgg

3001 tgagtttaaa ttggcttcac atatgtattg ttctttctac cctccagatg aggatgaaga

3061 agaaggtgat tgtgaagaag aagagtttga gccatcaact caatatgagt atggtactga

3121 agatgattac caaggtaaac ctttggaatt tggtgccact tctgctgctc ttcaacctga

3181 agaagagcaa gaagaagatt ggttagatga tgatagtcaa caaactgttg gtcaacaaga

3241 cggcagtgag gacaatcaga caactactat tcaaacaatt gttgaggttc aacctcaatt

3301 agagatggaa cttacaccag ttgttcagac tattgaagtg aatagtttta gtggttattt

3361 aaaacttact gacaatgtat acattaaaaa tgcagacatt gtggaagaag ctaaaaaggt

3421 aaaaccaaca gtggttgtta atgcagccaa tgtttacctt aaacatggag gaggtgttgc

3481 aggagcctta aataaggcta ctaacaatgc catgcaagtt gaatctgatg attacatagc

3541 tactaatgga ccacttaaag tgggtggtag ttgtgtttta agcggacaca atcttgctaa

3601 acactgtctt catgttgtcg gcccaaatgt taacaaaggt gaagacattc aacttcttaa

3661 gagtgcttat gaaaatttta atcagcacga agttctactt gcaccattat tatcagctgg

3721 tatttttggt gctgacccta tacattcttt aagagtttgt gtagatactg ttcgcacaaa

3781 tgtctactta gctgtctttg ataaaaatct ctatgacaaa cttgtttcaa gctttttgga

3841 aatgaagagt gaaaagcaag ttgaacaaaa gatcgctgag attcctaaag aggaagttaa

3901 gccatttata actgaaagta aaccttcagt tgaacagaga aaacaagatg ataagaaaat

3961 caaagcttgt gttgaagaag ttacaacaac tctggaagaa actaagttcc tcacagaaaa

4021 cttgttactt tatattgaca ttaatggcaa tcttcatcca gattctgcca ctcttgttag

4081 tgacattgac atcactttct taaagaaaga tgctccatat atagtgggtg atgttgttca

4141 agagggtgtt ttaactgctg tggttatacc tactaaaaag gctggtggca ctactgaaat

4201 gctagcgaaa gctttgagaa aagtgccaac agacaattat ataaccactt acccgggtca

4261 gggtttaaat ggttacactg tagaggaggc aaagacagtg cttaaaaagt gtaaaagtgc

4321 cttttacatt ctaccatcta ttatctctaa tgagaagcaa gaaattcttg gaactgtttc

4381 ttggaatttg cgagaaatgc ttgcacatgc agaagaaaca cgcaaattaa tgcctgtctg

4441 tgtggaaact aaagccatag tttcaactat acagcgtaaa tataagggta ttaaaataca

4501 agagggtgtg gttgattatg gtgctagatt ttacttttac accagtaaaa caactgtagc

4561 gtcacttatc aacacactta acgatctaaa tgaaactctt gttacaatgc cacttggcta

4621 tgtaacacat ggcttaaatt tggaagaagc tgctcggtat atgagatctc tcaaagtgcc

4681 agctacagtt tctgtttctt cacctgatgc tgttacagcg tataatggtt atcttacttc

4741 ttcttctaaa acacctgaag aacattttat tgaaaccatc tcacttgctg gttcctataa

4801 agattggtcc tattctggac aatctacaca actaggtata gaatttctta agagaggtga

4861 taaaagtgta tattacacta gtaatcctac cacattccac ctagatggtg aagttatcac

4921 ctttgacaat cttaagacac ttctttcttt gagagaagtg aggactatta aggtgtttac

4981 aacagtagac aacattaacc tccacacgca agttgtggac atgtcaatga catatggaca

5041 acagtttggt ccaacttatt tggatggagc tgatgttact aaaataaaac ctcataattc

5101 acatgaaggt aaaacatttt atgttttacc taatgatgac actctacgtg ttgaggcttt

5161 tgagtactac cacacaactg atcctagttt tctgggtagg tacatgtcag cattaaatca

5221 cactaaaaag tggaaatacc cacaagttaa tggtttaact tctattaaat gggcagataa

5281 caactgttat cttgccactg cattgttaac actccaacaa atagagttga agtttaatcc

5341 acctgctcta caagatgctt attacagagc aagggctggt gaagctgcta acttttgtgc

5401 acttatctta gcctactgta ataagacagt aggtgagtta ggtgatgtta gagaaacaat

5461 gagttacttg tttcaacatg ccaatttaga ttcttgcaaa agagtcttga acgtggtgtg

5521 taaaacttgt ggacaacagc agacaaccct taagggtgta gaagctgtta tgtacatggg

5581 cacactttct tatgaacaat ttaagaaagg tgttcagata ccttgtacgt gtggtaaaca

5641 agctacaaaa tatctagtac aacaggagtc accttttgtt atgatgtcag caccacctgc

5701 tcagtatgaa cttaagcatg gtacatttac ttgtgctagt gagtacactg gtaattacca

5761 gtgtggtcac tataaacata taacttctaa agaaactttg tattgcatag acggtgcttt

5821 acttacaaag tcctcagaat acaaaggtcc tattacggat gttttctaca aagaaaacag

5881 ttacacaaca accataaaac cagttactta taaattggat ggtgttgttt gtacagaaat

5941 tgaccctaag ttggacaatt attataagaa agacaattct tatttcacag agcaaccaat

6001 tgatcttgta ccaaaccaac catatccaaa cgcaagcttc gataatttta agtttgtatg

6061 tgataatatc aaatttgctg atgatttaaa ccagttaact ggttataaga aacctgcttc

6121 aagagagctt aaagttacat ttttccctga cttaaatggt gatgtggtgg ctattgatta

6181 taaacactac acaccctctt ttaagaaagg agctaaattg ttacataaac ctattgtttg

6241 gcatgttaac aatgcaacta ataaagccac gtataaacca aatacctggt gtatacgttg

6301 tctttggagc acaaaaccag ttgaaacatc aaattcgttt gatgtactga agtcagagga

6361 cgcgcaggga atggataatc ttgcctgcga agatctaaaa ccagtctctg aagaagtagt

6421 ggaaaatcct accatacaga aagacgttct tgagtgtaat gtgaaaacta ccgaagttgt

6481 aggagacatt atacttaaac cagcaaataa tagtttaaaa attacagaag aggttggcca

6541 cacagatcta atggctgctt atgtagacaa ttctagtctt actattaaga aacctaatga

6601 attatctaga gtattaggtt tgaaaaccct tgctactcat ggtttagctg ctgttaatag

6661 tgtcccttgg gatactatag ctaattatgc taagcctttt cttaacaaag ttgttagtac

6721 aactactaac atagttacac ggtgtttaaa ccgtgtttgt actaattata tgccttattt

6781 ctttacttta ttgctacaat tgtgtacttt tactagaagt acaaattcta gaattaaagc

6841 atctatgccg actactatag caaagaatac tgttaagagt gtcggtaaat tttgtctaga

6901 ggcttcattt aattatttga agtcacctaa tttttctaaa ctgataaata ttataatttg

6961 gtttttacta ttaagtgttt gcctaggttc tttaatctac tcaaccgctg ctttaggtgt

7021 tttaatgtct aatttaggca tgccttctta ctgtactggt tacagagaag gctatttgaa

7081 ctctactaat gtcactattg caacctactg tactggttct ataccttgta gtgtttgtct

7141 tagtggttta gattctttag acacctatcc ttctttagaa actatacaaa ttaccatttc

7201 atcttttaaa tgggatttaa ctgcttttgg cttagttgca gagtggtttt tggcatatat

7261 tcttttcact aggtttttct atgtacttgg attggctgca atcatgcaat tgtttttcag

7321 ctattttgca gtacatttta ttagtaattc ttggcttatg tggttaataa ttaatcttgt

7381 acaaatggcc ccgatttcag ctatggttag aatgtacatc ttctttgcat cattttatta

7441 tgtatggaaa agttatgtgc atgttgtaga cggttgtaat tcatcaactt gtatgatgtg

7501 ttacaaacgt aatagagcaa caagagtcga atgtacaact attgttaatg gtgttagaag

7561 gtccttttat gtctatgcta atggaggtaa aggcttttgc aaactacaca attggaattg

7621 tgttaattgt gatacattct gtgctggtag tacatttatt agtgatgaag ttgcgagaga

7681 cttgtcacta cagtttaaaa gaccaataaa tcctactgac cagtcttctt acatcgttga

7741 tagtgttaca gtgaagaatg gttccatcca tctttacttt gataaagctg gtcaaaagac

7801 ttatgaaaga cattctctct ctcattttgt taacttagac aacctgagag ctaataacac

7861 taaaggttca ttgcctatta atgttatagt ttttgatggt aaatcaaaat gtgaagaatc

7921 atctgcaaaa tcagcgtctg tttactacag tcagcttatg tgtcaaccta tactgttact

7981 agatcaggca ttagtgtctg atgttggtga tagtgcggaa gttgcagtta aaatgtttga

8041 tgcttacgtt aatacgtttt catcaacttt taacgtacca atggaaaaac tcaaaacact

8101 agttgcaact gcagaagctg aacttgcaaa gaatgtgtcc ttagacaatg tcttatctac

8161 ttttatttca gcagctcggc aagggtttgt tgattcagat gtagaaacta aagatgttgt

8221 tgaatgtctt aaattgtcac atcaatctga catagaagtt actggcgata gttgtaataa

8281 ctatatgctc acctataaca aagttgaaaa catgacaccc cgtgaccttg gtgcttgtat

8341 tgactgtagt gcgcgtcata ttaatgcgca ggtagcaaaa agtcacaaca ttgctttgat

8401 atggaacgtt aaagatttca tgtcattgtc tgaacaacta cgaaaacaaa tacgtagtgc

8461 tgctaaaaag aataacttac cttttaagtt gacatgtgca actactagac aagttgttaa

8521 tgttgtaaca acaaagatag cacttaaggg tggtaaaatt gttaataatt ggttgaagca

8581 gttaattaaa gttacacttg tgttcctttt tgttgctgct attttctatt taataacacc

8641 tgttcatgtc atgtctaaac atactgactt ttcaagtgaa atcataggat acaaggctat

8701 tgatggtggt gtcactcgtg acatagcatc tacagatact tgttttgcta acaaacatgc

8761 tgattttgac acatggttta gccagcgtgg tggtagttat actaatgaca aagcttgccc

8821 attgattgct gcagtcataa caagagaagt gggttttgtc gtgcctggtt tgcctggcac

8881 gatattacgc acaactaatg gtgacttttt gcatttctta cctagagttt ttagtgcagt

8941 tggtaacatc tgttacacac catcaaaact tatagagtac actgactttg caacatcagc

9001 ttgtgttttg gctgctgaat gtacaatttt taaagatgct tctggtaagc cagtaccata

9061 ttgttatgat accaatgtac tagaaggttc tgttgcttat gaaagtttac gccctgacac

9121 acgttatgtg ctcatggatg gctctattat tcaatttcct aacacctacc ttgaaggttc

9181 tgttagagtg gtaacaactt ttgattctga gtactgtagg cacggcactt gtgaaagatc

9241 agaagctggt gtttgtgtat ctactagtgg tagatgggta cttaacaatg attattacag

9301 atctttacca ggagttttct gtggtgtaga tgctgtaaat ttacttacta atatgtttac

9361 accactaatt caacctattg gtgctttgga catatcagca tctatagtag ctggtggtat

9421 tgtagctatc gtagtaacat gccttgccta ctattttatg aggtttagaa gagcttttgg

9481 tgaatacagt catgtagttg cctttaatac tttactattc cttatgtcat tcactgtact

9541 ctgtttaaca ccagtttact cattcttacc tggtgtttat tctgttattt acttgtactt

9601 gacattttat cttactaatg atgtttcttt tttagcacat attcagtgga tggttatgtt

9661 cacaccttta gtacctttct ggataacaat tgcttatatc atttgtattt ccacaaagca

9721 tttctattgg ttctttagta attacctaaa gagacgtgta gtctttaatg gtgtttcctt

9781 tagtactttt gaagaagctg cgctgtgcac ctttttgtta aataaagaaa tgtatctaaa

9841 gttgcgtagt gatgtgctat tacctcttac gcaatataat agatacttag ctctttataa

9901 taagtacaag tattttagtg gagcaatgga tacaactagc tacagagaag ctgcttgttg

9961 tcatctcgca aaggctctca atgacttcag taactcaggt tctgatgttc tttaccaacc

10021 accacaaacc tctatcacct cagctgtttt gcagagtggt tttagaaaaa tggcattccc

10081 atctggtaaa gttgagggtt gtatggtaca agtaacttgt ggtacaacta cacttaacgg

10141 tctttggctt gatgacgtag tttactgtcc aagacatgtg atctgcacct ctgaagacat

10201 gcttaaccct aattatgaag atttactcat tcgtaagtct aatcataatt tcttggtaca

10261 ggctggtaat gttcaactca gggttattgg acattctatg caaaattgtg tacttaagct

10321 taaggttgat acagccaatc ctaagacacc taagtataag tttgttcgca ttcaaccagg

10381 acagactttt tcagtgttag cttgttacaa tggttcacca tctggtgttt accaatgtgc

10441 tatgaggccc aatttcacta ttaagggttc attccttaat ggttcatgtg gtagtgttgg

10501 ttttaacata gattatgact gtgtctcttt ttgttacatg caccatatgg aattaccaac

10561 tggagttcat gctggcacag acttagaagg taacttttat ggaccttttg ttgacaggca

10621 aacagcacaa gcagctggta cggacacaac tattacagtt aatgttttag cttggttgta

10681 cgctgctgtt ataaatggag acaggtggtt tctcaatcga tttaccacaa ctcttaatga

10741 ctttaacctt gtggctatga agtacaatta tgaacctcta acacaagacc atgttgacat

10801 actaggacct ctttctgctc aaactggaat tgccgtttta gatatgtgtg cttcattaaa

10861 agaattactg caaaatggta tgaatggacg taccatattg ggtagtgctt tattagaaga

10921 tgaatttaca ccttttgatg ttgttagaca atgctcaggt gttactttcc aaagtgcagt

10981 gaaaagaaca atcaagggta cacaccactg gttgttactc acaattttga cttcactttt

11041 agttttagtc cagagtactc aatggtcttt gttctttttt ttgtatgaaa atgccttttt

11101 accttttgct atgggtatta ttgctatgtc tgcttttgca atgatgtttg tcaaacataa

11161 gcatgcattt ctctgtttgt ttttgttacc ttctcttgcc actgtagctt attttaatat

11221 ggtctatatg cctgctagtt gggtgatgcg tattatgaca tggttggata tggttgatac

11281 tagtttgtct ggttttaagc taaaagactg tgttatgtat gcatcagctg tagtgttact

11341 aatccttatg acagcaagaa ctgtgtatga tgatggtgct aggagagtgt ggacacttat

11401 gaatgtcttg acactcgttt ataaagttta ttatggtaat gctttagatc aagccatttc

11461 catgtgggct cttataatct ctgttacttc taactactca ggtgtagtta caactgtcat

11521 gtttttggcc agaggtattg tttttatgtg tgttgagtat tgccctattt tcttcataac

11581 tggtaataca cttcagtgta taatgctagt ttattgtttc ttaggctatt tttgtacttg

11641 ttactttggc ctcttttgtt tactcaaccg ctactttaga ctgactcttg gtgtttatga

11701 ttacttagtt tctacacagg agtttagata tatgaattca cagggactac tcccacccaa

11761 gaatagcata gatgccttca aactcaacat taaattgttg ggtgttggtg gcaaaccttg

11821 tatcaaagta gccactgtac agtctaaaat gtcagatgta aagtgcacat cagtagtctt

11881 actctcagtt ttgcaacaac tcagagtaga atcatcatct aaattgtggg ctcaatgtgt

11941 ccagttacac aatgacattc tcttagctaa agatactact gaagcctttg aaaaaatggt

12001 ttcactactt tctgttttgc tttccatgca gggtgctgta gacataaaca agctttgtga

12061 agaaatgctg gacaacaggg caaccttaca agctatagcc tcagagttta gttcccttcc

12121 atcatatgca gcttttgcta ctgctcaaga agcttatgag caggctgttg ctaatggtga

12181 ttctgaagtt gttcttaaaa agttgaagaa gtctttgaat gtggctaaat ctgaatttga

12241 ccgtgatgca gccatgcaac gtaagttgga aaagatggct gatcaagcta tgacccaaat

12301 gtataaacag gctagatctg aggacaagag ggcaaaagtt actagtgcta tgcagacaat

12361 gcttttcact atgcttagaa agttggataa tgatgcactc aacaacatta tcaacaatgc

12421 aagagatggt tgtgttccct tgaacataat acctcttaca acagcagcca aactaatggt

12481 tgtcatacca gactataaca catataaaaa tacgtgtgat ggtacaacat ttacttatgc

12541 atcagcattg tgggaaatcc aacaggttgt agatgcagat agtaaaattg ttcaacttag

12601 tgaaattagt atggacaatt cacctaattt agcatggcct cttattgtaa cagctttaag

12661 ggccaattct gctgtcaaat tacagaataa tgagcttagt cctgttgcac tacgacagat

12721 gtcttgtgct gccggtacta cacaaactgc ttgcactgat gacaatgcgt tagcttacta

12781 caacacaaca aagggaggta ggtttgtact tgcactgtta tccgatttac aggatttgaa

12841 atgggctaga ttccctaaga gtgatggaac tggtactatc tatacagaac tggaaccacc

12901 ttgtaggttt gttacagaca cacctaaagg tcctaaagtg aagtatttat actttattaa

12961 aggattaaac aacctaaata gaggtatggt acttggtagt ttagctgcca cagtacgtct

13021 acaagctggt aatgcaacag aagtgcctgc caattcaact gtattatctt tctgtgcttt

13081 tgctgtagat gctgctaaag cttacaaaga ttatctagct agtgggggac aaccaatcac

13141 taattgtgtt aagatgttgt gtacacacac tggtactggt caggcaataa cagttacacc

13201 ggaagccaat atggatcaag aatcctttgg tggtgcatcg tgttgtctgt actgccgttg

13261 ccacatagat catccaaatc ctaaaggatt ttgtgactta aaaggtaagt atgtacaaat

13321 acctacaact tgtgctaatg accctgtggg ttttacactt aaaaacacag tctgtaccgt

13381 ctgcggtatg tggaaaggtt atggctgtag ttgtgatcaa ctccgcgaac ccatgcttca

13441 gtcagctgat gcacaatcgt ttttaaacgg gtttgcggtg taagtgcagc ccgtcttaca

13501 ccgtgcggca caggcactag tactgatgtc gtatacaggg cttttgacat ctacaatgat

13561 aaagtagctg gttttgctaa attcctaaaa actaattgtt gtcgcttcca agaaaaggac

13621 gaagatgaca atttaattga ttcttacttt gtagttaaga gacacacttt ctctaactac

13681 caacatgaag aaacaattta taatttactt aaggattgtc cagctgttgc taaacatgac

13741 ttctttaagt ttagaataga cggtgacatg gtaccacata tatcacgtca acgtcttact

13801 aaatacacaa tggcagacct cgtctatgct ttaaggcatt ttgatgaagg taattgtgac

13861 acattaaaag aaatacttgt cacatacaat tgttgtgatg atgattattt caataaaaag

13921 gactggtatg attttgtaga aaacccagat atattacgcg tatacgccaa cttaggtgaa

13981 cgtgtacgcc aagctttgtt aaaaacagta caattctgtg atgccatgcg aaatgctggt

14041 attgttggtg tactgacatt agataatcaa gatctcaatg gtaactggta tgatttcggt

14101 gatttcatac aaaccacgcc aggtagtgga gttcctgttg tagattctta ttattcattg

14161 ttaatgccta tattaacctt gaccagggct ttaactgcag agtcacatgt tgacactgac

14221 ttaacaaagc cttacattaa gtgggatttg ttaaaatatg acttcacgga agagaggtta

14281 aaactctttg accgttattt taaatattgg gatcagacat accacccaaa ttgtgttaac

14341 tgtttggatg acagatgcat tctgcattgt gcaaacttta atgttttatt ctctacagtg

14401 ttcccaccta caagttttgg accactagtg agaaaaatat ttgttgatgg tgttccattt

14461 gtagtttcaa ctggatacca cttcagagag ctaggtgttg tacataatca ggatgtaaac

14521 ttacatagct ctagacttag ttttaaggaa ttacttgtgt atgctgctga ccctgctatg

14581 cacgctgctt ctggtaatct attactagat aaacgcacta cgtgcttttc agtagctgca

14641 cttactaaca atgttgcttt tcaaactgtc aaacccggta attttaacaa agacttctat

14701 gactttgctg tgtctaaggg tttctttaag gaaggaagtt ctgttgaatt aaaacacttc

14761 ttctttgctc aggatggtaa tgctgctatc agcgattatg actactatcg ttataatcta

14821 ccaacaatgt gtgatatcag acaactacta tttgtagttg aagttgttga taagtacttt

14881 gattgttacg atggtggctg tattaatgct aaccaagtca tcgtcaacaa cctagacaaa

14941 tcagctggtt ttccatttaa taaatggggt aaggctagac tttattatga ttcaatgagt

15001 tatgaggatc aagatgcact tttcgcatat acaaaacgta atgtcatccc tactataact

15061 caaatgaatc ttaagtatgc cattagtgca aagaatagag ctcgcaccgt agctggtgtc

15121 tctatctgta gtactatgac caatagacag tttcatcaaa aattattgaa atcaatagcc

15181 gccactagag gagctactgt agtaattgga acaagcaaat tctatggtgg ttggcacaac

15241 atgttaaaaa ctgtttatag tgatgtagaa aaccctcacc ttatgggttg ggattatcct

15301 aaatgtgata gagccatgcc taacatgctt agaattatgg cctcacttgt tcttgctcgc

15361 aaacatacaa cgtgttgtag cttgtcacac cgtttctata gattagctaa tgagtgtgct

15421 caagtattga gtgaaatggt catgtgtggc ggttcactat atgttaaacc aggtggaacc

15481 tcatcaggag atgccacaac tgcttatgct aatagtgttt ttaacatttg tcaagctgtc

15541 acggccaatg ttaatgcact tttatctact gatggtaaca aaattgccga taagtatgtc

15601 cgcaatttac aacacagact ttatgagtgt ctctatagaa atagagatgt tgacacagac

15661 tttgtgaatg agttttacgc atatttgcgt aaacatttct caatgatgat actctctgac

15721 gatgctgttg tgtgtttcaa tagcacttat gcatctcaag gtctagtggc tagcataaag

15781 aactttaagt cagttcttta ttatcaaaac aatgttttta tgtctgaagc aaaatgttgg

15841 actgagactg accttactaa aggacctcat gaattttgct ctcaacatac aatgctagtt

15901 aaacagggtg atgattatgt gtaccttcct tacccagatc catcaagaat cctaggggcc

15961 ggctgttttg tagatgatat cgtaaaaaca gatggtacac ttatgattga acggttcgtg

16021 tctttagcta tagatgctta cccacttact aaacatccta atcaggagta tgctgatgtc

16081 tttcatttgt acttacaata cataagaaag ctacatgatg agttaacagg acacatgtta

16141 gacatgtatt ctgttatgct tactaatgat aacacttcaa ggtattggga acctgagttt

16201 tatgaggcta tgtacacacc gcatacagtc ttacaggctg ttggggcttg tgttctttgc

16261 aattcacaga cttcattaag atgtggtgct tgcatacgta gaccattctt atgttgtaaa

16321 tgctgttacg accatgtcat atcaacatca cataaattag tcttgtctgt taatccgtat

16381 gtttgcaatg ctccaggttg tgatgtcaca gatgtgactc aactttactt aggaggtatg

16441 agctattatt gtaaatcaca taaaccaccc attagttttc cattgtgtgc taatggacaa

16501 gtttttggtt tatataaaaa tacatgtgtt ggtagcgata atgttactga ctttaatgca

16561 attgcaacat gtgactggac aaatgctggt gattacattt tagctaacac ctgtactgaa

16621 agactcaagc tttttgcagc agaaacgctc aaagctactg aggagacatt taaactgtct

16681 tatggtattg ctactgtacg tgaagtgctg tctgacagag aattacatct ttcatgggaa

16741 gttggtaaac ctagaccacc acttaaccga aattatgtct ttactggtta tcgtgtaact

16801 aaaaacagta aagtacaaat aggagagtac acctttgaaa aaggtgacta tggtgatgct

16861 gttgtttacc gaggtacaac aacttacaaa ttaaatgttg gtgattattt tgtgctgaca

16921 tcacatacag taatgccatt aagtgcacct acactagtgc cacaagagca ctatgttaga

16981 attactggct tatacccaac actcaatatc tcagatgagt tttctagcaa tgttgcaaat

17041 tatcaaaagg ttggtatgca aaagtattct acactccagg gaccacctgg tactggtaag

17101 agtcattttg ctattggcct agctctctac tacccttctg ctcgcatagt gtatacagct

17161 tgctctcatg ccgctgttga tgcactatgt gagaaggcat taaaatattt gcctatagat

17221 aaatgtagta gaattatacc tgcacgtgct cgtgtagagt gttttgataa attcaaagtg

17281 aattcaacat tagaacagta tgtcttttgt actgtaaatg cattgcctga gacgacagca

17341 gatatagttg tctttgatga aatttcaatg gccacaaatt atgatttgag tgttgtcaat

17401 gccagattac gtgctaagca ctatgtgtac attggcgacc ctgctcaatt acctgcacca

17461 cgcacattgc taactaaggg cacactagaa ccagaatatt tcaattcagt gtgtagactt

17521 atgaaaacta taggtccaga catgttcctc ggaacttgtc ggcgttgtcc tgctgaaatt

17581 gttgacactg tgagtgcttt ggtttatgat aataagctta aagcacataa agacaaatca

17641 gctcaatgct ttaaaatgtt ttataagggt gttatcacgc atgatgtttc atctgcaatt

17701 aacaggccac aaataggcgt ggtaagagaa ttccttacac gtaaccctgc ttggagaaaa

17761 gctgtcttta tttcacctta taattcacag aatgctgtag cctcaaagat tttgggacta

17821 ccaactcaaa ctgttgattc atcacagggc tcagaatatg actatgtcat attcactcaa

17881 accactgaaa cagctcactc ttgtaatgta aacagattta atgttgctat taccagagca

17941 aaagtaggca tactttgcat aatgtctgat agagaccttt atgacaagtt gcaatttaca

18001 agtcttgaaa ttccacgtag gaatgtggca actttacaag ctgaaaatgt aacaggactc

18061 tttaaagatt gtagtaaggt aatcactggg ttacatccta cacaggcacc tacacacctc

18121 agtgttgaca ctaaattcaa aactgaaggt ttatgtgttg acatacctgg catacctaag

18181 gacatgacct atagaagact catctctatg atgggtttta aaatgaatta tcaagttaat

18241 ggttacccta acatgtttat cacccgcgaa gaagctataa gacatgtacg tgcatggatt

18301 ggcttcgatg tcgaggggtg tcatgctact agagaagctg ttggtaccaa tttaccttta

18361 cagctaggtt tttctacagg tgttaaccta gttgctgtac ctacaggtta tgttgataca

18421 cctaataata cagatttttc cagagttagt gctaaaccac cgcctggaga tcaatttaaa

18481 cacctcatac cacttatgta caaaggactt ccttggaatg tagtgcgtat aaagattgta

18541 caaatgttaa gtgacacact taaaaatctc tctgacagag tcgtatttgt cttatgggca

18601 catggctttg agttgacatc tatgaagtat tttgtgaaaa taggacctga gcgcacctgt

18661 tgtctatgtg atagacgtgc cacatgcttt tccactgctt cagacactta tgcctgttgg

18721 catcattcta ttggatttga ttacgtctat aatccgttta tgattgatgt tcaacaatgg

18781 ggttttacag gtaacctaca aagcaaccat gatctgtatt gtcaagtcca tggtaatgca

18841 catgtagcta gttgtgatgc aatcatgact aggtgtctag ctgtccacga gtgctttgtt

18901 aagcgtgttg actggactat tgaatatcct ataattggtg atgaactgaa gattaatgcg

18961 gcttgtagaa aggttcaaca catggttgtt aaagctgcat tattagcaga caaattccca

19021 gttcttcacg acattggtaa ccctaaagct attaagtgtg tacctcaagc tgatgtagaa

19081 tggaagttct atgatgcaca gccttgtagt gacaaagctt ataaaataga agaattattc

19141 tattcttatg ccacacattc tgacaaattc acagatggtg tatgcctatt ttggaattgc

19201 aatgtcgata gatatcctgc taattccatt gtttgtagat ttgacactag agtgctatct

19261 aaccttaact tgcctggttg tgatggtggc agtttgtatg taaataaaca tgcattccac

19321 acaccagctt ttgataaaag tgcttttgtt aatttaaaac aattaccatt tttctattac

19381 tctgacagtc catgtgagtc tcatggaaaa caagtagtgt cagatataga ttatgtacca

19441 ctaaagtctg ctacgtgtat aacacgttgc aatttaggtg gtgctgtctg tagacatcat

19501 gctaatgagt acagattgta tctcgatgct tataacatga tgatctcagc tggctttagc

19561 ttgtgggttt acaaacaatt tgatacttat aacctctgga acacttttac aagacttcag

19621 agtttagaaa atgtggcttt taatgttgta aataagggac actttgatgg acaacagggt

19681 gaagtaccag tttctatcat taataacact gtttacacaa aagttgatgg tgttgatgta

19741 gaattgtttg aaaataaaac aacattacct gttaatgtag catttgagct ttgggctaag

19801 cgcaacatta aaccagtacc agaggtgaaa atactcaata atttgggtgt ggacattgct

19861 gctaatactg tgatctggga ctacaaaaga gatgctccag cacatatatc tactattggt

19921 gtttgttcta tgactgacat agccaagaaa ccaactgaaa cgatttgtgc accactcact

19981 gtcttttttg atggtagagt tgatggtcaa gtagacttat ttagaaatgc ccgtaatggt

20041 gttcttatta cagaaggtag tgttaaaggt ttacaaccat ctgtaggtcc caaacaagct

20101 agtcttaatg gagtcacatt aattggagaa gccgtaaaaa cacagttcaa ttattataag

20161 aaagttgatg gtgttgtcca acaattacct gaaacttact ttactcagag tagaaattta

20221 caagaattta aacccaggag tcaaatggaa attgatttct tagaattagc tatggatgaa

20281 ttcattgaac ggtataaatt agaaggctat gccttcgaac atatcgttta tggagatttt

20341 agtcatagtc agttaggtgg tttacatcta ctgattggac tagctaaacg ttttaaggaa

20401 tcaccttttg aattagaaga ttttattcct atggacagta cagttaaaaa ctatttcata

20461 acagatgcgc aaacaggttc atctaagtgt gtgtgttctg ttattgattt attacttgat

20521 gattttgttg aaataataaa atcccaagat ttatctgtag tttctaaggt tgtcaaagtg

20581 actattgact atacagaaat ttcatttatg ctttggtgta aagatggcca tgtagaaaca

20641 ttttacccaa aattacaatc tagtcaagcg tggcaaccgg gtgttgctat gcctaatctt

20701 tacaaaatgc aaagaatgct attagaaaag tgtgaccttc aaaattatgg tgatagtgca

20761 acattaccta aaggcataat gatgaatgtc gcaaaatata ctcaactgtg tcaatattta

20821 aacacattaa cattagctgt accctataat atgagagtta tacattttgg tgctggttct

20881 gataaaggag ttgcaccagg tacagctgtt ttaagacagt ggttgcctac gggtacgctg

20941 cttgtcgatt cagatcttaa tgactttgtc tctgatgcag attcaacttt gattggtgat

21001 tgtgcaactg tacatacagc taataaatgg gatctcatta ttagtgatat gtacgaccct

21061 aagactaaaa atgttacaaa agaaaatgac tctaaagagg gttttttcac ttacatttgt

21121 gggtttatac aacaaaagct agctcttgga ggttccgtgg ctataaagat aacagaacat

21181 tcttggaatg ctgatcttta taagctcatg ggacacttcg catggtggac agcctttgtt

21241 actaatgtga atgcgtcatc atctgaagca tttttaattg gatgtaatta tcttggcaaa

21301 ccacgcgaac aaatagatgg ttatgtcatg catgcaaatt acatattttg gaggaataca

21361 aatccaattc agttgtcttc ctattcttta tttgacatga gtaaatttcc ccttaaatta

21421 aggggtactg ctgttatgtc tttaaaagaa ggtcaaatca atgatatgat tttatctctt

21481 cttagtaaag gtagacttat aattagagaa aacaacagag ttgttatttc tagtgatgtt

21541 cttgttaaca actaaacgaa caatgtttgt ttttcttgtt ttattgccac tagtctctag

21601 tcagtgtgtt aatcttacaa ccagaactca attaccccct gcatacacta attctttcac

21661 acgtggtgtt tattaccctg acaaagtttt cagatcctca gttttacatt caactcagga

21721 cttgttctta cctttctttt ccaatgttac ttggttccat gctatacatg tctctgggac

21781 caatggtact aagaggtttg ataaccctgt cctaccattt aatgatggtg tttattttgc

21841 ttccactgag aagtctaaca taataagagg ctggattttt ggtactactt tagattcgaa

21901 gacccagtcc ctacttattg ttaataacgc tactaatgtt gttattaaag tctgtgaatt

21961 tcaattttgt aatgatccat ttttgggtgt ttattaccac aaaaacaaca aaagttggat

22021 ggaaagtgag ttcagagttt attctagtgc gaataattgc acttttgaat atgtctctca

22081 gccttttctt atggaccttg aaggaaaaca gggtaatttc aaaaatctta gggaatttgt

22141 gtttaagaat attgatggtt attttaaaat atattctaag cacacgccta ttaatttagt

22201 gcgtgatctc cctcagggtt tttcggcttt agaaccattg gtagatttgc caataggtat

22261 taacatcact aggtttcaaa ctttacttgc tttacataga agttatttga ctcctggtga

22321 ttcttcttca ggttggacag ctggtgctgc agcttattat gtgggttatc ttcaacctag

22381 gacttttcta ttaaaatata atgaaaatgg aaccattaca gatgctgtag actgtgcact

22441 tgaccctctc tcagaaacaa agtgtacgtt gaaatccttc actgtagaaa aaggaatcta

22501 tcaaacttct aactttagag tccaaccaac agaatctatt gttagatttc ctaatattac

22561 aaacttgtgc ccttttggtg aagtttttaa cgccaccaga tttgcatctg tttatgcttg

22621 gaacaggaag agaatcagca actgtgttgc tgattattct gtcctatata attccgcatc

22681 attttccact tttaagtgtt atggagtgtc tcctactaaa ttaaatgatc tctgctttac

22741 taatgtctat gcagattcat ttgtaattag aggtgatgaa gtcagacaaa tcgctccagg

22801 gcaaactgga aagattgctg attataatta taaattacca gatgatttta caggctgcgt

22861 tatagcttgg aattctaaca atcttgattc taaggttggt ggtaattata attacctgta

22921 tagattgttt aggaagtcta atctcaaacc ttttgagaga gatatttcaa ctgaaatcta

22981 tcaggccggt agcacacctt gtaatggtgt tgaaggtttt aattgttact ttcctttaca

23041 atcatatggt ttccaaccca ctaatggtgt tggttaccaa ccatacagag tagtagtact

23101 ttcttttgaa cttctacatg caccagcaac tgtttgtgga cctaaaaagt ctactaattt

23161 ggttaaaaac aaatgtgtca atttcaactt caatggttta acaggcacag gtgttcttac

23221 tgagtctaac aaaaagtttc tgcctttcca acaatttggc agagacattg ctgacactac

23281 tgatgctgtc cgtgatccac agacacttga gattcttgac attacaccat gttcttttgg

23341 tggtgtcagt gttataacac caggaacaaa tacttctaac caggttgctg ttctttatca

23401 ggatgttaac tgcacagaag tccctgttgc tattcatgca gatcaactta ctcctacttg

23461 gcgtgtttat tctacaggtt ctaatgtttt tcaaacacgt gcaggctgtt taataggggc

23521 tgaacatgtc aacaactcat atgagtgtga catacccatt ggtgcaggta tatgcgctag

23581 ttatcagact cagactaatt ctcctcggcg ggcacgtagt gtagctagtc aatccatcat

23641 tgcctacact atgtcacttg gtgcagaaaa ttcagttgct tactctaata actctattgc

23701 catacccaca aattttacta ttagtgttac cacagaaatt ctaccagtgt ctatgaccaa

23761 gacatcagta gattgtacaa tgtacatttg tggtgattca actgaatgca gcaatctttt

23821 gttgcaatat ggcagttttt gtacacaatt aaaccgtgct ttaactggaa tagctgttga

23881 acaagacaaa aacacccaag aagtttttgc acaagtcaaa caaatttaca aaacaccacc

23941 aattaaagat tttggtggtt ttaatttttc acaaatatta ccagatccat caaaaccaag

24001 caagaggtca tttattgaag atctactttt caacaaagtg acacttgcag atgctggctt

24061 catcaaacaa tatggtgatt gccttggtga tattgctgct agagacctca tttgtgcaca

24121 aaagtttaac ggccttactg ttttgccacc tttgctcaca gatgaaatga ttgctcaata

24181 cacttctgca ctgttagcgg gtacaatcac ttctggttgg acctttggtg caggtgctgc

24241 attacaaata ccatttgcta tgcaaatggc ttataggttt aatggtattg gagttacaca

24301 gaatgttctc tatgagaacc aaaaattgat tgccaaccaa tttaatagtg ctattggcaa

24361 aattcaagac tcactttctt ccacagcaag tgcacttgga aaacttcaag atgtggtcaa

24421 ccaaaatgca caagctttaa acacgcttgt taaacaactt agctccaatt ttggtgcaat

24481 ttcaagtgtt ttaaatgata tcctttcacg tcttgacaaa gttgaggctg aagtgcaaat

24541 tgataggttg atcacaggca gacttcaaag tttgcagaca tatgtgactc aacaattaat

24601 tagagctgca gaaatcagag cttctgctaa tcttgctgct actaaaatgt cagagtgtgt

24661 acttggacaa tcaaaaagag ttgatttttg tggaaagggc tatcatctta tgtccttccc

24721 tcagtcagca cctcatggtg tagtcttctt gcatgtgact tatgtccctg cacaagaaaa

24781 gaacttcaca actgctcctg ccatttgtca tgatggaaaa gcacactttc ctcgtgaagg

24841 tgtctttgtt tcaaatggca cacactggtt tgtaacacaa aggaattttt atgaaccaca

24901 aatcattact acagacaaca catttgtgtc tggtaactgt gatgttgtaa taggaattgt

24961 caacaacaca gtttatgatc ctttgcaacc tgaattagac tcattcaagg aggagttaga

25021 taaatatttt aagaatcata catcaccaga tgttgattta ggtgacatct ctggcattaa

25081 tgcttcagtt gtaaacattc aaaaagaaat tgaccgcctc aatgaggttg ccaagaattt

25141 aaatgaatct ctcatcgatc tccaagaact tggaaagtat gagcagtata taaaatggcc

25201 atggtacatt tggctaggtt ttatagctgg cttgattgcc atagtaatgg tgacaattat

25261 gctttgctgt atgaccagtt gctgtagttg tctcaagggc tgttgttctt gtggatcctg

25321 ctgcaaattt gatgaagacg actctgagcc agtgctcaaa ggagtcaaat tacattacac

25381 ataaacgaac ttatggattt gtttatgaga atcttcacaa ttggaactgt aactttgaag

25441 caaggtgaaa tcaaggatgc tactccttca gattttgttc gcgctactgc aacgataccg

25501 atacaagcct cactcccttt cggatggctt attgttggcg ttgcacttct tgctgttttt

25561 cagagcgctt ccaaaatcat aaccctcaaa aagagatggc aactagcact ctccaagggt

25621 gttcactttg tttgcaactt gctgttgttg tttgtaacag tttactcaca ccttttgctc

25681 gttgctgctg gccttgaagc cccttttctc tatctttatg ctttagtcta cttcttgcag

25741 agtataaact ttgtaagaat aataatgagg ctttggcttt gctggaaatg ccgttccaaa

25801 aacccattac tttatgatgc caactatttt ctttgctggc atactaattg ttacgactat

25861 tgtatacctt acaatagtgt aacttcttca attgtcatta cttcaggtga tggcacaaca

25921 agtcctattt ctgaacatga ctaccagatt ggtggttata ctgaaaaatg ggaatctgga

25981 gtaaaagact gtgttgtatt acacagttac ttcacttcag actattacca gctgtactca

26041 actcaattga gtacagacac tggtgttgaa catgttacct tcttcatcta caataaaatt

26101 gttgatgagc ctgaagaaca tgtccaaatt cacacaatcg acggttcatc cggagttgtt

26161 aatccagtaa tggaaccaat ttatgatgaa ccgacgacga ctactagcgt gcctttgtaa

26221 gcacaagctg atgagtacga acttatgtac tcattcgttt cggaagagac aggtacgtta

26281 atagttaata gcgtacttct ttttcttgct ttcgtggtat tcttgctagt tacactagcc

26341 atccttactg cgcttcgatt gtgtgcgtac tgctgcaata ttgttaacgt gagtcttgta

26401 aaaccttctt tttacgttta ctctcgtgtt aaaaatctga attcttctag agttcctgat

26461 cttctggtct aaacgaacta aatattatat tagtttttct gtttggaact ttaattttag

26521 ccatggcaga ttccaacggt actattaccg ttgaagagct taaaaagctc cttgaacaat

26581 ggaacctagt aataggtttc ctattcctta catggatttg tcttctacaa tttgcctatg

26641 ccaacaggaa taggtttttg tatataatta agttaatttt cctctggctg ttatggccag

26701 taactttagc ttgttttgtg cttgctgctg tttacagaat aaattggatc accggtggaa

26761 ttgctatcgc aatggcttgt cttgtaggct tgatgtggct cagctacttc attgcttctt

26821 tcagactgtt tgcgcgtacg cgttccatgt ggtcattcaa tccagaaact aacattcttc

26881 tcaacgtgcc actccatggc actattctga ccagaccgct tctagaaagt gaactcgtaa

26941 tcggagctgt gatccttcgt ggacatcttc gtattgctgg acaccatcta ggacgctgtg

27001 acatcaagga cctgcctaaa gaaatcactg ttgctacatc acgaacgctt tcttattaca

27061 aattgggagc ttcgcagcgt gtagcaggtg actcaggttt tgctgcatac agtcgctaca

27121 ggattggcaa ctataaatta aacacagacc attccagtag cagtgacaat attgctttgc

27181 ttgtacagta agtgacaaca gatgtttcat ctcgttgact ttcaggttac tatagcagag

27241 atattactaa ttattatgag gacttttaaa gtttccattt ggaatcttga ttacatcata

27301 aacctcataa ttaaaaattt atctaagtca ctaactgaga ataaatattc tcaattagat

27361 gaagagcaac caatggagat tgattaaacg aacatgaaaa ttattctttt cttggcactg

27421 ataacactcg ctacttgtga gctttatcac taccaagagt gtgttagagg tacaacagta

27481 cttttaaaag aaccttgctc ttctggaaca tacgagggca attcaccatt tcatcctcta

27541 gctgataaca aatttgcact gacttgcttt agcactcaat ttgcttttgc ttgtcctgac

27601 ggcgtaaaac acgtctatca gttacgtgcc agatcagttt cacctaaact gttcatcaga

27661 caagaggaag ttcaagaact ttactctcca atttttctta ttgttgcggc aatagtgttt

27721 ataacacttt gcttcacact caaaagaaag acagaatgat tgaactttca ttaattgact

27781 tctatttgtg ctttttagcc tttctgctat tccttgtttt aattatgctt attatctttt

27841 ggttctcact tgaactgcaa gatcataatg aaacttgtca cgcctaaacg aacatgaaat

27901 ttcttgtttt cttaggaatc atcacaactg tagctgcatt tcaccaagaa tgtagtttac

27961 agtcatgtac tcaacatcaa ccatatgtag ttgatgaccc gtgtcctatt cacttctatt

28021 ctaaatggta tattagagta ggagctagaa aatcagcacc tttaattgaa ttgtgcgtgg

28081 atgaggctgg ttctaaatca cccattcagt acatcgatat cggtaattat acagtttcct

28141 gtttaccttt tacaattaat tgccaggaac ctaaattggg tagtcttgta gtgcgttgtt

28201 cgttctatga agacttttta gagtatcatg acgttcgtgt tgttttagat ttcatctaaa

28261 cgaacaaact aaaatgtctg ataatggacc ccaaaatcag cgaaatgcac cccgcattac

28321 gtttggtgga ccctcagatt caactggcag taaccagaat ggagaacgca gtggggcgcg

28381 atcaaaacaa cgtcggcccc aaggtttacc caataatact gcgtcttggt tcaccgctct

28441 cactcaacat ggcaaggaag accttaaatt ccctcgagga caaggcgttc caattaacac

28501 caatagcagt ccagatgacc aaattggcta ctaccgaaga gctaccagac gaattcgtgg

28561 tggtgacggt aaaatgaaag atctcagtcc aagatggtat ttctactacc taggaactgg

28621 gccagaagct ggacttccct atggtgctaa caaagacggc atcatatggg ttgcaactga

28681 gggagccttg aatacaccaa aagatcacat tggcacccgc aatcctgcta acaatgctgc

28741 aatcgtgcta caacttcctc aaggaacaac attgccaaaa ggcttctacg cagaagggag

28801 cagaggcggc agtcaagcct cttctcgttc ctcatcacgt agtcgcaaca gttcaagaaa

28861 ttcaactcca ggcagcagta ggggaacttc tcctgctaga atggctggca atggcggtga

28921 tgctgctctt gctttgctgc tgcttgacag attgaaccag cttgagagca aaatgtctgg

28981 taaaggccaa caacaacaag gccaaactgt cactaagaaa tctgctgctg aggcttctaa

29041 gaagcctcgg caaaaacgta ctgccactaa agcatacaat gtaacacaag ctttcggcag

29101 acgtggtcca gaacaaaccc aaggaaattt tggggaccag gaactaatca gacaaggaac

29161 tgattacaaa cattggccgc aaattgcaca atttgccccc agcgcttcag cgttcttcgg

29221 aatgtcgcgc attggcatgg aagtcacacc ttcgggaacg tggttgacct acacaggtgc

29281 catcaaattg gatgacaaag atccaaattt caaagatcaa gtcattttgc tgaataagca

29341 tattgacgca tacaaaacat tcccaccaac agagcctaaa aaggacaaaa agaagaaggc

29401 tgatgaaact caagccttac cgcagagaca gaagaaacag caaactgtga ctcttcttcc

29461 tgctgcagat ttggatgatt tctccaaaca attgcaacaa tccatgagca gtgctgactc

29521 aactcaggcc taaactcatg cagaccacac aaggcagatg ggctatataa acgttttcgc

29581 ttttccgttt acgatatata gtctactctt gtgcagaatg aattctcgta actacatagc

29641 acaagtagat gtagttaact ttaatctcac atagcaatct ttaatcagtg tgtaacatta

29701 gggaggactt gaaagagcca ccacattttc accgaggcca cgcggagtac gatcgagtgt

29761 acagtgaaca atgctaggga gagctgccta tatggaagag ccctaatgtg taaaattaat

29821 tttagtagtg ctatccccat gtgattttaa tagcttctta ggagaatgac aaaaaaaaaa

29881 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa

Claims (10)

1.一种新型冠状病毒核酸检测用假病毒标准物质，所述新型冠状病毒是2019-nCoV(亦称为SARS-CoV-2)；其特征在于，标准物质中包括蛋白包裹RNA的假病毒颗粒；

所述RNA选自以下：

SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3中任选1～3个核苷酸片段；或

SEQ ID NO.4所示序列的核苷酸。

2.权利要求1所述的假病毒标准物质，由以下组分组成：

1)权利要求1所述的假病毒颗粒和病毒保护剂制成的假病毒冻干物；

2)用于假病毒冻干物复溶的无RNA酶水溶液；

制成所述病毒保护剂的原料组成为：糖0～2重量份，牛血清白蛋白0～1重量份。

3.权利要求1或2所述的假病毒标准物质，所述蛋白包裹RNA，是慢病毒外壳蛋白包裹新型冠状病毒RNA。

4.权利要求3所述的假病毒标准物质，所述慢病毒的表达载体选自pCDH、pLentilox3.7、pLKO.1、pBoBi、pLV、pLVX或pWPXL。

5.权利要求2所述的假病毒标准物质，所述病毒保护剂的原料组成为：海藻糖5～10重量份，牛血清白蛋白1～5重量份，蔗糖1～3重量份；

将所述冻干物用无RNA酶水复溶后，其RNA浓度为1×10¹～1×10⁶copies/μL。

6.权利要求1所述标准物质的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)通过PCR扩增将SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4所示序列的核酸克隆；

2)利用同源重组的方法，将上述克隆获得的基因连接到慢病毒表达载体，获得重组表达质粒。

3)分别将获得的重组表达质粒、假病毒包装质粒和假病毒包膜质粒转化到大肠杆菌中，进行扩增，并分别提取相应的质粒；

4)将上一步获得的重组表达质粒、假病毒包装质粒和包膜质粒共同转染至细胞后进行假病毒颗粒的包装，得到分泌在上清中包装了SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4所示序列RNA的假病毒颗粒；

5)收集上一步的细胞培养液上清，离心过滤后获得假病毒颗粒的粗产物。

7.权利要求6所述的制备方法，步骤3)中，所述假病毒包装质粒选自pCMV-dR8.91、psPAX2、pMDLg/pRRE、pLP1或pNL4-3；假病毒包膜质粒选自pMD2.G、pCMV-VSV-G、pLP VSV-G或pVSV-G。

8.权利要求6所述标准物质的制备方法，产物的纯化和后处理方法如下：

1)将假病毒颗粒的粗产物进行DNase I消化；

2)进行蔗糖密度梯度超速离心，收集假病毒颗粒，重悬于PBS中；

3)将假病毒颗粒的PBS溶液制备成所需浓度的假病毒溶液，加入冻干保护剂后进行冻干，得到假病毒冻干物。

9.权利要求1所述的假病毒标准物质的用途，包括以下：

1)新冠病毒核酸定性和定量检测方法的验证评价以及实验室质量控制；

2)新冠病毒核酸检测试剂研制和质量评价；

3)新冠病毒预防治疗疫苗和药物制备。

10.一种新型冠状病毒核酸检测用假病毒标准物质的定值方法，为数字PCR法，具体操作如下：

用无RNA酶水对标准物质冻干物进行复水溶解，充分混匀后提取RNA，采用一步法逆转录数字PCR对新型冠状病毒RNA进行定量检测，实验结果以拷贝数浓度(copies/μL)表示，定值结果表示为：标准值±扩展不确定度。

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