CN111197098A

CN111197098A - 一种从痰液中检测结核分枝杆菌的方法

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Publication number: CN111197098A
Application number: CN202010103989.4A
Authority: CN
Inventors: 李传友; 刘毅; 张旭霞; 于佳佳
Original assignee: Beijing Chest Hospital
Current assignee: Beijing Chest Hospital; Beijing Tuberculosis and Thoracic Tumor Research Institute
Priority date: 2020-02-20
Filing date: 2020-02-20
Publication date: 2020-05-26
Anticipated expiration: 2040-02-20
Also published as: CN111197098B

Abstract

本发明公开了一种从痰液中检测结核分枝杆菌的方法。本发明提供了一种试剂盒，其包括如下1)‑3)所示的物质：1)扩增含有6110‑crRNA靶序列的引物对；2)6110‑crRNA，其靶序列为序列3；3)LwCas13a蛋白，其氨基酸序列由序列表中序列2所示的氨基酸残基组成。本发明在CRISPR‑Cas13a检测技术的基础上，首次将PCR扩增技术和CRISPR‑Cas13a检测技术相结合，PCR技术因其技术稳定，实用性强，更适合应用于临床核酸检测；建立了一个新的高灵敏、高特异核酸检测方法。

Description

一种从痰液中检测结核分枝杆菌的方法

技术领域

本发明属于诊断试剂领域，涉及结核病诊断试剂及试剂盒，具体涉及一种从痰液中检测结核分枝杆菌的方法。

背景技术

全球范围内，结核病仍是导致死亡的十大原因之一，据世界卫生组织(WorldHealth Organization,WHO)报道：2017年全球估计有1000万新发结核病患者，中国估计有88.9万新发患者。结核病疫情严重，对于结核病的诊治仍迫在眉睫。目前结核病细菌学诊断和免疫学诊断方面都面临很多问题，敏感性和特异性及检测的快捷方便和成本问题均不同程度存在问题。现阶段检测临床样本中的结核分枝杆菌诊断技术是临床上的综合诊断。目前结核病诊断的金标准为痰涂片阳性、分枝杆菌分离培养阳性、分子生物学检测阳性或者肺组织病理学检查阳性等。(一)、细菌学诊断：(1)涂片：抗酸染色敏感度低；(2)改良罗氏培养：时间长，需观察8周，敏感性不高；(3)BACTEC MGIT960快速培养系统：1-3周,仪器试剂昂贵；(二)分子生物学诊断：(1)XpertMtb /RIF检测:Mtb特异的实时PCR，是集标本处理、PCR、利福平耐药基因检测为一体的全自动快速检测方法，仪器试剂昂贵；(2)溶解曲线：用于诊断耐药结核病；(3)基因芯片技术：芯片的制备比较复杂，样本准备和标记又较为繁琐，检测成本高，需昂贵的特殊设备，难以常规开展；(4)线性探针技术：可同时检测INH和RFP耐药基因的突变，用于耐多药结核病；(5)环介导等温扩增技术(LAMP)：对结核分枝杆菌目的 DNA片段进行检测从而诊断结核病；(6)同步恒温扩增技术：对结核分枝杆菌目的RNA 片段进行检测从而诊断结核病。

目前的检测方法均存在有检测时间长、成本高、准确性和特异度低等问题，分子生物学诊断方法有其快速简便的特性，但目前的分子生物学方法仍然存在有敏感度不高，特异性低的问题。因此，研制出新型的快速便捷的核酸分子生物学诊断试剂极为迫切。

发明内容

本发明一个目的是提供一种试剂盒。

本发明提供的试剂盒，其包括如下1)-3)所示的物质：

1)扩增含有6110-crRNA靶序列的引物对；

2)6110-crRNA，其靶序列为序列3；

3)LwCas13a蛋白，其氨基酸序列如下a)-d)中任一种：

a)、氨基酸序列由序列表中序列2所示的氨基酸残基组成；

b)将a)所限定的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

c)与a)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；

d)a)-c)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的蛋白。

上述试剂盒还包括RNA聚合酶，还可以包括实施例表5所示体系中的其他组分。

本发明还提供了一个试剂盒，其包括如下A和B所示的物质：

A)扩增含有6110-crRNA靶序列的引物对；

B)含有6110-crRNA和LwCas13a蛋白的扩增体系；

上述扩增体系还包括RNA聚合酶，还可以包括表5所示体系中的其他组分，在本发明的实施例中，具体扩增体系就是表5中除了目标扩增产物的其他组分组成的体系。

所述6110-crRNA的靶序列为序列3；

所述LwCas13a蛋白，其氨基酸序列如下a)-d)中任一种：

a)、氨基酸序列由序列表中序列2所示的氨基酸残基组成；

上述试剂盒中，所述6110-crRNA的核苷酸序列为序列4。

上述试剂盒中，所述扩增含有6110-crRNA靶序列的引物对由引物1和引物2组成：

所述引物1为如下1)或2)：

1)序列5所示的单链DNA分子；

2)将1)所限定的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的单链DNA分子；

所述引物2为如下3)或4)：

3)序列6所示的单链DNA分子；

4)将3)所限定的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的单链DNA分子。

上述试剂盒中1)-3)所述的物质均单独包装；

或上述试剂盒中A和B所述的物质均单独包装。

上述试剂盒为具有如下1)和/或2)功能的试剂盒；

1)检测待测菌是否为结核分枝杆菌；

2)检测待测样本是否含有或感染结核分枝杆菌。

上述试剂盒在制备检测待测样本是否感染或候选感染或含有或候选含有结核分枝杆菌产品中的应用也是本发明保护的范围。

或，上述试剂盒在制备检测待测菌是否为或候选为结核分枝杆菌产品中的应用也是本发明保护的范围。

上述试剂盒中1)-3)所示的物质或A和B所示的物质在制备检测待测样本是否感染或候选感染或含有或候选含有结核分枝杆菌产品中的应用也是本发明保护的范围；

上述试剂盒中1)-3)所示的物质或A和B所示的物质在制备检测待测菌是否为或候选为结核分枝杆菌产品的应用也是本发明保护的范围。

上述中，所述待测样本为质粒、菌液或唾液(痰液)。

本发明还提供了检测待测样本中是否感染或含有结核分枝杆菌的方法，具体如下：

1)对待测样本的核酸进行目标检测产物扩增，得到目标检测产物；

扩增所需引物为用6110-crDNA-R:5’ATCTCGTCCAGCGCCGCTT3’及 6110-crDNA-F:5’TAATACGACTCACTATAGGGGATTTAGACTACCCCAA 3’，模板为待测样本的核酸；

2)将目标检测产物、6110-crRNA、LwCas13a蛋白在PCR-CRISPR检测体系(表 5)中进行荧光定量PCR反应(37度恒温扩增)，得到反应产物；以不加入目标检测产物作为阴性对照。

检测反应产物的荧光信号变化值(变化值＝反应后荧光值-初始荧光值)，若待测样本反应产物的荧光信号变化值大于阴性对照反应产物的荧光信号变化值，则待测样本含有或感染结核分枝杆菌；若待测样本反应产物的荧光信号变化值不大于阴性对照反应产物的荧光信号变化值，则待测样本不含有或未感染结核分枝杆菌。

本发明还提供了检测待测菌是否为结核分枝杆菌的方法，具体如下：

1)对待测菌的核酸进行目标检测产物扩增，得到目标检测产物；

2)将目标检测产物、6110-crRNA、LwCas13a蛋白在PCR-CRISPR检测体系(表 5)中进行荧光定量PCR反应，得到反应产物；以不加入目标检测产物作为阴性对照。

检测反应产物的荧光信号变化值(变化值是反应后荧光值-初始荧光值)，若待测菌反应产物的荧光信号变化值大于阴性对照反应产物的荧光信号变化值，则待测菌为或候选为结核分枝杆菌；若待测菌反应产物的荧光信号变化值不大于阴性对照反应产物的荧光信号变化值，则待测菌不为或候选不为结核分枝杆菌。

本发明由于采取以上技术方案，其具有以下优点：

(1)特异性强：本发明所涉及到的是CRISPR VI型系统的Cas13a，该系统是RNA 引导RNA靶向的单蛋白效应器，独特的RNA靶向机制，Cas13a在识别靶点RNA序列后呈现出对非特异RNA序列的强大“平行切割”效应；利用这种效应可应用于核酸快速检测的系统。

(2)敏感性高：本发明所应用的是Leptotrichiawadei的Cas13a蛋白(LwCas13a)，具有更强的RNA酶(RNase)活性，在检测过程中可获得更强的检测信号。ssRNA中靶点序列与crRNA对应序列相匹配，激活LwCas13a的平行切割效应，剪切报告RNA以示体系中目标核酸的存在。

(3)稳定及实用性强：本发明在CRISPR-Cas13a检测技术的基础上，首次将PCR 扩增技术和CRISPR-Cas13a检测技术相结合，PCR技术因其技术稳定，实用性强，更适合应用于临床核酸检测；建立了一个新的高灵敏、高特异核酸检测方法。

(4)快速简捷：其检测快速简捷，利用CRISPR-Cas13a检测技术敏感、特异、快速、简捷的检测临床样本中的结核分枝杆菌。

附图说明

图1为检测3条crRNA活性比较的筛选图。

图2为10⁰-10⁶copies/ul的标准质粒的PCR-CRISPR检测结果图。

图3为10⁰-10⁶copies/ul的标准菌株H37RV的PCR-CRISPR检测结果柱状图。

图4为10^-1-10⁵copies/ul的标准菌株H37RV的PCR-CRISPR检测结果柱状图。

图5为Sp+、xpert检测阳性痰液标本PCR-CRISPR检测结果图。

图6为Sp+、xpert检测阳性痰液标本PCR-CRISPR检测结果柱状图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、鉴定检测结核分枝杆菌的方法

一、Lw Cas13a蛋白的制备

Lw Cas13a蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2，其编码基因的核苷酸序列为序列表中序列1。

Lw Cas13a蛋白可通过原核表达纯化制备，具体方法如下：

1、Lw Cas13a蛋白的诱导表达

LwCas13a蛋白表达质粒Twinstrep-SUMO-huLwCas13a购自Addgene公司(ID：90097，该质粒中含有Lw Cas13a蛋白编码基因，表达重组蛋白Lw Cas13a，LwCas13a 蛋白含有1,152个氨基酸，大小约150kD左右，重组蛋白Lw Cas13a为将LwCas13a蛋白末端带有2个标签(His-tag和Strep-tag)。SUMO酶切位点可用于纯化时蛋白与固相介质的分离，也可防止标签对蛋白活性的影响。

将上述LwCas13a蛋白表达质粒参考说明书转化Rosetta(DE3)Competent Cell 感受态细胞中，挑取单菌落接菌，于37℃恒温摇床培养过夜(约16h)。提取质粒并进行测序鉴定，确保单克隆中含有Twinstrep-SUMO-huLwCas13a表达质粒，并比对 LwCas13a序列是否正确，测序正确的单克隆保存甘油菌，命名为含有LwCas13a蛋白表达质粒的重组菌。

取10μL冻存的甘油菌接入5mL氨苄抗性LB液体培养基，培养过夜，接入500 mL TB培养基中，300rpm，37℃摇菌至OD 600＝0.6(约3h)，加入终浓度为500μM 的IPTG，18℃培养16h诱导蛋白表达。4℃，5200g离心15min收集菌体，进行后续纯化过程或放-80℃保存。

2、Lw Cas13a蛋白的纯化

LwCas13a蛋白含有1,152个氨基酸，大小约150kD左右，重组蛋白LwCas13a 后带有2个标签(His-tag和Strep-tag)可用于蛋白的初步纯化，并且在标签与蛋白之间，设置了SUMO酶切位点，可用于纯化时蛋白与固相介质的分离，也可防止标签对蛋白活性的影响。根据蛋白序列分析其等电点特性显示，带有标签的LwCas13a蛋白等电点为9.6，去掉标签后，等电点为9.37，本发明利用蛋白的标签和等电点特性进行蛋白的纯化。

1)LwCas13a蛋白的镍柱纯化

上述1得到的含有LwCas13a蛋白表达质粒的重组菌菌体称重，取5g菌体加入 50mL裂解液，并按照体积比1:100比例加入0.5ml(10mg/mL)溶菌酶(Sigma-Aldrich； CAS号：L6876，酶活>40,000U/mg)、1ml全能核酸酶(出售公司Sigma-Aldrich及产品目录号E8263，酶活>250U/μL)和1ml蛋白酶抑制剂(meck公司，539134)；超声破碎，超声5s，停10s，超声时间1.5h，确保净超声时间30min，超声破碎后可发现菌液澄清。若超声后菌液无明显变化，可适当增加裂解液用量，稀释菌体继续超声。充分破碎的菌液放入离心管中，12000rpm，4℃离心10min。收集离心后的上清加入咪唑，使终浓度为10mM，调节pH至8.0，0.22μm滤膜过滤。镍柱(HisTrap HP column)使用A液平衡到基线，柱子通过裂解的菌液，目的蛋白通过His标签与柱子结合，使用100mM咪唑(20％B)洗脱与柱子非特异结合的杂蛋白,200mM(40％ B)、300mM(60％B)、500mM咪唑(100％B)洗脱目的蛋白，不同浓度咪唑的蛋白洗脱峰收集样品电泳鉴定，获得洗脱得到的蛋白。

2)LwCas13a蛋白透析和SUMO酶切

利用蛋白带有的His标签，通过镍柱初步纯化的蛋白中含有一定浓度的咪唑，需通过透析去除；为防止LwCas13a蛋白上的标签对蛋白活性的影响，且后续离子交换纯化步骤不依赖蛋白标签进行；故经透析处理后的蛋白需利用SUMO酶切去除相应标签结构。

将1)洗脱得到的蛋白加入透析袋，封口，放入500mL SUMO Protease Buffer中， 4℃搅拌透析，约1h换一次外液，换3次。收集透析液，检测透析液中蛋白浓度，根据蛋白总量加入SUMO蛋白酶(上海康朗生物科技有限公司；KL25841)，酶切体系如表 1所示，4℃旋转混合酶切过夜，得到酶切产物，即为SUMO酶切后目的蛋白。

表1 SUMO酶切体系

随后，利用SDS-PAGE电泳对酶切后的蛋白进行鉴定，如有沉淀产生，5000g离心10min去除沉淀。

结果，得到150kD的SUMO酶切后目的蛋白。

3)LwCas13a蛋白的离子交换纯化

上述2)得到的SUMO酶切后目的蛋白经SDS-PAGE电泳鉴定后，若发现蛋白分子量变小，则可以表明蛋白酶切成功，可进行后续的纯化。阳离子交换纯化基于样品的等电点特征，利用高浓度的氯化钠进行洗脱，降低蛋白样品中氯化钠的浓度。

将上述2)得到的SUMO酶切后目的蛋白中加入1.5倍体积的ddH2O稀释至氯化钠浓度为200mM，调节pH＝8.0，离子交换柱用C液平衡至pH 8.0后上样，上样结束后C液平衡至基线，用200mM、500mM、1M的氯化钠水溶液(20％、50％和100％D) 和0.5M NaOH水溶液洗脱，各峰蛋白留样电泳。

经电泳鉴定后的目的蛋白LwCas13a，向该目的蛋白中加入DTT和氯化钠，使其终浓度分别为2mM和600mM，按照Bradford蛋白浓度测定试剂盒说明书检测蛋白样品浓度，蛋白定量后分装存放于-80℃，得到LwCas13a蛋白溶液，溶剂为0.5M NaCL 水溶液。

4)LwCas13a蛋白的Western Blot鉴定

将1)得到的洗脱得到的蛋白、2)得到的SUMO酶切后目的蛋白和3)得到的目的蛋白LwCas13a分别经SDS-PAGE电泳后转印于NC膜，100mA电转2h，转印后的NC 膜用10％脱脂牛奶(TBST配制)室温封闭2h，1：500稀释anti-His-HRP抗体，4℃ 孵育过夜，TBST洗膜4次，每次10min，ECL显色。

结果，1)洗脱得到的蛋白大小约为175KD,2)得到的SUMO酶切后目的蛋白大小为150kD KD,3)得到的目的蛋白LwCas13a大小为150KD，与预期一致。

二、6110-crRNA的制备

1、6110-crRNA的筛选

6110作为结合分枝杆菌的保守序列，其可以作为crRNA的靶基因，选取6110上不同过的crRNA靶序列和设计合成6110-crRNA，具体为如下表2所示：

表2为诊断结核分枝杆菌的crRNA设计

采用ssRNA为靶点的Cas13a检测体系筛选不同的crRNA，具体体系如下表3：

表3

上述crRNA分别为表2中的6110-crRNA(第3列第二行)、6110-1-crRNA(第3 列第3行)和6110-2-crRNA(第3列第4行)。

将表3所示的体系进行荧光定量PCR反应，反应程序为37℃90min，每1min读取数值，共90cycles，检测报告RNA荧光信号变化。

结果如图1所示，可以看出，6110-crRNA检测结果显示出的荧光值出现明显变化，但6110-1-crRNA和6110-2-crRNA全程荧光值变化不明显，因此6110-crRNA为最佳检测结果。

2、6110-crRNA的制备

上述6110-crRNA可以直接合成，也可以按照如下方法制备：

1)、6110-crDNA的PCR扩增

以

6110-crDNA:5’GGGGATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGGACTAAAACGGTGGTCCGAAGCGGCGCTGG ACGAGAT3’(生工生物工程(上海)股份有限公司GN20184187)为模板，用 6110-crDNA-R:5’ATCTCGTCCAGCGCCGCTT3’(序列5)及 6110-crDNA-F:5’TAATACGACTCACTATAGGGGATTTAGACTACCCCAA 3’(序列6)引物进行PCR扩增，得到200-300bp的6110-crDNA PCR扩增产物。

2、6110-crRNA的转录

1)、6110-crDNA的PCR产物回收

①氯仿+苯酚(1：1)混合，离心1min，去上清；

②上述1得到的PCR产物(200ul)加入3倍体积(900ul)苯酚氯仿混合液，12000rpm×1min；

③取上清相移入新的EP管，加入无水乙醇，使PCR产物：乙醇＝3：7，混匀，12000rpm×10min；

④去上清，加入70％乙醇(500ul)洗涤，12000rpm×10min×3次；

⑤枪尖吸去上清，可见管底白色沉淀，室温/60℃烘干

⑥加入DEPC水50ul，Nanodrop测定纯化得到的crDNA浓度，-80℃分装备用。

2)、6110-crDNA的转录

用上述1)回收的crDNA作为模板，按照如下表4所示的体系转录，得到 6110-crRNA。

表4为crDNA转录为引导RNA(crRNA)体系：

注：*X为DNA模板体积。

上述体系混匀后，37℃转录过夜，得到的转录产物加入20μL无RNase的水。

3)引导RNA(crRNA)的纯化

按照Agencourt RNA Clean XP说明书纯化转录的RNA：磁珠振荡混匀，向上述 2)得到的转录产物中加入1.8倍体积的磁珠，吹打10次或涡旋30s以混匀磁珠和转录体系，室温静置5min。将反应体系放到磁力架，静置5-10min以分离磁珠。轻轻吸出体系中的液体，避免磁珠被吸出，向磁珠中加入200μl 70％的乙醇(无RNase 水配制)，室温孵育30s，吸出乙醇；重复此过程清洗磁珠，共3次。室温晾干体系，去除体系中的乙醇，约10min。加入50μLRNase-free水，涡旋30s或用移液器吹打10次，吸出上清液，放入无RNase的1.5mL离心管中，Nanodrop测定纯化得到的crRNA浓度，-80℃分装备用。

6110-crRNA的浓度为45nM。

三、检测待测样本中结合分枝杆菌的方法的建立

1、标准品质粒的制备

将含有IS6110目标片段的质粒作为标准品进行稀释，得到不同浓度的标准品质粒，浓度从10⁰-10⁶copies/ul，生工生物工程(上海)股份有限公司合成的质粒。

含有IS6110目标片段的质粒为将IS6110目标片段(序列7)插入pMD19-Tsimple 中得到的质粒。

质粒浓度copies/ul＝(6.02×10²³)×(g/ml)/(DNA长度×660)或＝(6.02×10²³)×(ng/ul×10^-9)/(DNA长度×660)。

2、目标检测产物扩增

以不同浓度的标准品质粒为模板，用6110-crDNA-R:5’ ATCTCGTCCAGCGCCGCTT3’及 6110-crDNA-F:5’TAATACGACTCACTATAGGGGATTTAGACTACCCCAA 3’引物进行PCR扩增，得到不同浓度的标准品质粒的目标检测产物。

上述PCR扩增程序如下：

3、PCR-CRISPR检测方法

分别将不同浓度的标准品质粒的目标检测产物、上述二中的6110-crRNA和上述一制备的LwCas13a蛋白按照如下表5所示的体系配制，然后将上述体系加入8联排 PCR管，放入荧光定量PCR仪中，设置激发光FAM通道，进行荧光定量PCR反应。

上述荧光定量PCR反应的程序为37℃恒温扩增90分钟，其中每1min读取数值，共90cycles，检测报告RNA荧光信号变化。Blank是阴性对照，加入RNase free water 代替目标检测产物。

表5为PCR-CRISPR检测体系

上述用量中，涉及浓度的均为体系中的终浓度。

表6为10×Nuclease assay buffer配制

名称	用量	终浓度
			1M Tris-HCl储存液	40ml	400mM
5M氯化钠储存液	12ml	600mM
			1M MgCl<sub>2</sub>	6ml	60mM

上述表6中各个物质吸取各自的用量，盐酸调节pH至7.3，加Nuclease-free water定容至100mL，4℃保存备用。

结果如图2所示，可以看出，10⁰-10⁶拷贝/ul的质粒扩增产物的荧光信号变化值显著高于阴性对照结果变化值；观察不同浓度质粒模板的荧光强度发现，模板浓度为 10⁰-10⁴拷贝/ul时，随着模板浓度的升高，荧光信号增强；但是当模板浓度为10⁵-10⁶拷贝/ul时，随着模板浓度的升高，荧光信号变化没有明显的对应关系。

从上图可以看出，荧光信号值在有质粒的目标检测产物和无质粒的目标检测产物(阴性对照)中检测差异显著，因此，可以通过如下方法进行检测待测样本中是否感染或含有结核分枝杆菌，也可以检测待测菌是否结核分枝杆菌，方法命名为 PCR-CRISPR，具体如下：

检测待测样本中是否感染或含有结核分枝杆菌的方法，包括如下步骤：

1)对待测样本的核酸(样本核酸的最低浓度可为1-10拷贝数之间)进行目标检测产物扩增，得到目标检测产物；

上述荧光定量PCR反应为37℃恒温扩增90分钟。

检测反应产物的荧光信号变化值(变化值是反应后荧光值-初始荧光值)，若待测样本反应产物的荧光信号变化值大于阴性对照反应产物的荧光信号变化值，则待测样本含有或感染结核分枝杆菌；

若待测样本反应产物的荧光信号变化值不大于阴性对照反应产物的荧光信号变化值，则待测样本不含有或未感染结核分枝杆菌。

检测待测菌是否为结核分枝杆菌的方法，包括如下步骤：

上述荧光定量PCR反应为37℃恒温扩增90分钟。

检测反应产物的荧光信号变化值(变化值是反应后荧光值-初始荧光值)，若待测菌反应产物的荧光信号变化值大于阴性对照反应产物的荧光信号变化值，则待测菌为或候选为结核分枝杆菌；

若待测菌反应产物的荧光信号变化值不大于阴性对照反应产物的荧光信号变化值，则待测菌不为或候选不为结核分枝杆菌。

本发明提供的检测待测样本中是否感染或含有结核分枝杆菌的试剂盒包括扩增6110-crRNA靶序列的引物、LwCas13a蛋白和6110-crRNA；

其中LwCas13a蛋白的氨基酸序列为序列2；

6110-crRNA的核苷酸序列为序列4；

扩增6110-crRNA靶序列的引物由序列5所示的单链DNA分子和序列6所示的单链DNA分子组成。

实施例2、PCR-CRISPR鉴定结核分枝杆菌

1、待测菌的目标检测产物扩增

罗氏培养基置于37℃温箱内固体培养3周，培养结核分枝杆菌标准菌株H37RV(ATCC27294)，刮取菌株并研磨；测量菌株OD值，最终定量为1OD，(0.2OD相当于 10⁸copies/ul)对菌株进行10倍梯度稀释，得到浓度10⁰-10⁵copies/ul的H37RV菌液。

分别提取浓度10⁰-10⁵copies/ul的H37RV菌液的基因组DNA作为模板，用 6110-crDNA-R:5’ATCTCGTCCAGCGCCGCTT3’及 6110-crDNA-F:5’TAATACGACTCACTATAGGGGATTTAGACTACCCCAA 3’引物进行PCR扩增，得到不同浓度的目标检测产物。

2、PCR-CRISPR检测方法

将不同浓度的目标检测产物、实施例1的二制备的6110-crRNA和实施例1的一制备的LwCas13a蛋白分别按照上述表5所示的体系配制，然后将上述体系加入8联排PCR管，放入荧光定量PCR仪中，设置激发光FAM通道。37℃反应90min，每1min 读取数值，共90cycles，检测报告RNA荧光信号变化。blank为只加入RNase free water 而不加入目标检测产物。

若待测菌反应产物的荧光信号变化值大于阴性对照反应产物的荧光信号变化值，则待测菌为或候选为结核分枝杆菌；

结果如图3和图4所示，可以看出，10⁰-10⁶copies/ul的标准菌株H37RV菌液扩增产物的荧光信号变化值显著高于阴性对照结果变化值；可以实现检测结核分枝杆菌 H37RV，且检测灵敏度为10⁰。

实施例3、PCR-CRISPR鉴定检测临床样本中是否含有结核分枝杆菌

1、待测样本的目标检测产物扩增

取自北京昌平区结核病防治所的100例已经痰涂片、geneXpert检测确定感染结核分枝杆菌的痰液样本(SP、xpert检测阳性)。

①消化痰液：取1ml痰样本置于15ml离心管中，根据痰液的情况，以样品消化液：样品(v/v)1:1-2:1的比例加入样品消化液(Xpert消化液)，用力震荡10-20次。在静置5-10分钟时，再次用力震荡10-20次，室温静置15分钟使样品充分液化。

②离心，洗涤：取消化充分的样品1.5ml置于2ml离心管中4℃,12000g离心15 分钟。取出离心管，小心弃上清，加入1.5mlPBS混匀4℃,12000g离心15分钟离心。取出离心管，小心吸弃上清。每个样品分别加入100ul去离子水。

③煮沸法获取样品DNA：上述处理完成样品置于100℃煮沸20分钟。

分别以不同病例样本痰液的基因组DNA作为模板，用6110-crDNA-R:5’ATCTCGTCCAGCGCCGCTT3’及 6110-crDNA-F:5’TAATACGACTCACTATAGGGGATTTAGACTACCCCAA3’引物进行PCR扩增，得到不同浓度的目标检测产物。

2、PCR-CRISPR检测方法

若待测样本反应产物的荧光信号变化值大于阴性对照反应产物的荧光信号变化值，则待测样本含有或感染结核分枝杆菌；

结果如图5和图6所示，可以看出，共检测了100例，其中95例Sp+、xpert检测阳性痰液标本荧光信号变化值显著高于阴性对照结果变化值；检测准确度为95％。

上述各实施例仅用于说明本发明，其中各部件的结构、连接方式和制作工艺等都是可以有所变化的，凡是在本发明技术方案的基础上进行的等同变换和改进，均不应排除在本发明的保护范围之外。

SEQUENCE LISTING

<110>首都医科大学附属北京胸科医院

<120>一种从痰液中检测结核分枝杆菌的方法

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3456

<212> DNA

<213>Artificial sequence

<400> 1

atgaaagtga ccaaggtcga cggcatcagc cacaagaagt acatcgaaga gggcaagctc 60

gtgaagtcca ccagcgagga aaaccggacc agcgagagac tgagcgagct gctgagcatc 120

cggctggaca tctacatcaa gaaccccgac aacgcctccg aggaagagaa ccggatcaga 180

agagagaacc tgaagaagtt ctttagcaac aaggtgctgc acctgaagga cagcgtgctg 240

tatctgaaga accggaaaga aaagaacgcc gtgcaggaca agaactatag cgaagaggac 300

atcagcgagt acgacctgaa aaacaagaac agcttctccg tgctgaagaa gatcctgctg 360

aacgaggacg tgaactctga ggaactggaa atctttcgga aggacgtgga agccaagctg 420

aacaagatca acagcctgaa gtacagcttc gaagagaaca aggccaacta ccagaagatc 480

aacgagaaca acgtggaaaa agtgggcggc aagagcaagc ggaacatcat ctacgactac 540

tacagagaga gcgccaagcg caacgactac atcaacaacg tgcaggaagc cttcgacaag 600

ctgtataaga aagaggatat cgagaaactg tttttcctga tcgagaacag caagaagcac 660

gagaagtaca agatccgcga gtactatcac aagatcatcg gccggaagaa cgacaaagag 720

aacttcgcca agattatcta cgaagagatc cagaacgtga acaacatcaa agagctgatt 780

gagaagatcc ccgacatgtc tgagctgaag aaaagccagg tgttctacaa gtactacctg 840

gacaaagagg aactgaacga caagaatatt aagtacgcct tctgccactt cgtggaaatc 900

gagatgtccc agctgctgaa aaactacgtg tacaagcggc tgagcaacat cagcaacgat 960

aagatcaagc ggatcttcga gtaccagaat ctgaaaaagc tgatcgaaaa caaactgctg 1020

aacaagctgg acacctacgt gcggaactgc ggcaagtaca actactatct gcaagtgggc 1080

gagatcgcca cctccgactt tatcgcccgg aaccggcaga acgaggcctt cctgagaaac 1140

atcatcggcg tgtccagcgt ggcctacttc agcctgagga acatcctgga aaccgagaac 1200

gagaacggta tcaccggccg gatgcggggc aagaccgtga agaacaacaa gggcgaagag 1260

aaatacgtgt ccggcgaggt ggacaagatc tacaatgaga acaagcagaa cgaagtgaaa 1320

gaaaatctga agatgttcta cagctacgac ttcaacatgg acaacaagaa cgagatcgag 1380

gacttcttcg ccaacatcga cgaggccatc agcagcatca gacacggcat cgtgcacttc 1440

aacctggaac tggaaggcaa ggacatcttc gccttcaaga atatcgcccc cagcgagatc 1500

tccaagaaga tgtttcagaa cgaaatcaac gaaaagaagc tgaagctgaa aatcttcaag 1560

cagctgaaca gcgccaacgt gttcaactac tacgagaagg atgtgatcat caagtacctg 1620

aagaatacca agttcaactt cgtgaacaaa aacatcccct tcgtgcccag cttcaccaag 1680

ctgtacaaca agattgagga cctgcggaat accctgaagt ttttttggag cgtgcccaag 1740

gacaaagaag agaaggacgc ccagatctac ctgctgaaga atatctacta cggcgagttc 1800

ctgaacaagt tcgtgaaaaa ctccaaggtg ttctttaaga tcaccaatga agtgatcaag 1860

attaacaagc agcggaacca gaaaaccggc cactacaagt atcagaagtt cgagaacatc 1920

gagaaaaccg tgcccgtgga atacctggcc atcatccaga gcagagagat gatcaacaac 1980

caggacaaag aggaaaagaa tacctacatc gactttattc agcagatttt cctgaagggc 2040

ttcatcgact acctgaacaa gaacaatctg aagtatatcg agagcaacaa caacaatgac 2100

aacaacgaca tcttctccaa gatcaagatc aaaaaggata acaaagagaa gtacgacaag 2160

atcctgaaga actatgagaa gcacaatcgg aacaaagaaa tccctcacga gatcaatgag 2220

ttcgtgcgcg agatcaagct ggggaagatt ctgaagtaca ccgagaatct gaacatgttt 2280

tacctgatcc tgaagctgct gaaccacaaa gagctgacca acctgaaggg cagcctggaa 2340

aagtaccagt ccgccaacaa agaagaaacc ttcagcgacg agttggaact gatcaacctg 2400

ctgaacctgg acaacaacag agtgaccgag gacttcgagc tggaagccaa cgagatcggc 2460

aagttcctgg acttcaacga aaacaaaatc aaggaccgga aagagctgaa aaagttcgac 2520

accaacaaga tctatttcga cggcgagaac atcatcaagc accgggcctt ctacaatatc 2580

aagaaatacg gcatgctgaa tctgctggaa aagatcgccg ataaggccaa gtataagatc 2640

agcctgaaag aactgaaaga gtacagcaac aagaagaatg agattgaaaa gaactacacc 2700

atgcagcaga acctgcaccg gaagtacgcc agacccaaga aggacgaaaa gttcaacgac 2760

gaggactaca aagagtatga gaaggccatc ggcaacatcc agaagtacac ccacctgaag 2820

aacaaggtgg aattcaatga gctgaacctg ctgcagggcc tgctgctgaa gatcctgcac 2880

cggctcgtgg gctacaccag catctgggag cgggacctga gattccggct gaagggcgag 2940

tttcccgaga accactacat cgaggaaatt ttcaatttcg acaactccaa gaatgtgaag 3000

tacaaaagcg gccagatcgt ggaaaagtat atcaacttct acaaagaact gtacaaggac 3060

aatgtggaaa agcggagcat ctactccgac aagaaagtga agaaactgaa gcaggaaaaa 3120

aaggacctgt acatccggaa ctacattgcc cacttcaact acatccccca cgccgagatt 3180

agcctgctgg aagtgctgga aaacctgcgg aagctgctgt cctacgaccg gaagctgaag 3240

aacgccatca tgaagtccat cgtggacatt ctgaaagaat acggcttcgt ggccaccttc 3300

aagatcggcg ctgacaagaa gatcgaaatc cagaccctgg aatcagagaa gatcgtgcac 3360

ctgaagaatc tgaagaaaaa gaaactgatg accgaccgga acagcgagga actgtgcgaa 3420

ctcgtgaaag tcatgttcga gtacaaggcc ctggaa 3456

<210> 2

<211> 1152

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 2

Met Lys Val Thr Lys Val Asp Gly Ile Ser His Lys Lys Tyr Ile Glu

1 5 10 15

Glu Gly Lys Leu Val Lys Ser Thr Ser Glu Glu Asn Arg Thr Ser Glu

20 25 30

Arg Leu Ser Glu Leu Leu Ser Ile Arg Leu Asp Ile Tyr Ile Lys Asn

35 40 45

Pro Asp Asn Ala Ser Glu Glu Glu Asn Arg Ile Arg Arg Glu Asn Leu

50 55 60

Lys Lys Phe Phe Ser Asn Lys Val Leu His Leu Lys Asp Ser Val Leu

65 70 75 80

Tyr Leu Lys Asn Arg Lys Glu Lys Asn Ala Val Gln Asp Lys Asn Tyr

85 90 95

Ser Glu Glu Asp Ile Ser Glu Tyr Asp Leu Lys Asn Lys Asn Ser Phe

100 105 110

Ser Val Leu Lys Lys Ile Leu Leu Asn Glu Asp Val Asn Ser Glu Glu

115 120 125

Leu Glu Ile Phe Arg Lys Asp Val Glu Ala Lys Leu Asn Lys Ile Asn

130 135 140

Ser Leu Lys Tyr Ser Phe Glu Glu Asn Lys Ala Asn Tyr Gln Lys Ile

145 150 155 160

Asn Glu Asn Asn Val Glu Lys Val Gly Gly Lys Ser Lys Arg Asn Ile

165 170 175

Ile Tyr Asp Tyr Tyr Arg Glu Ser Ala Lys Arg Asn Asp Tyr Ile Asn

180 185 190

Asn Val Gln Glu Ala Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Lys Glu Asp Ile Glu

195 200 205

Lys Leu Phe Phe Leu Ile Glu Asn Ser Lys Lys His Glu Lys Tyr Lys

210 215 220

Ile Arg Glu Tyr Tyr His Lys Ile Ile Gly Arg Lys Asn Asp Lys Glu

225 230 235 240

Asn Phe Ala Lys Ile Ile Tyr Glu Glu Ile Gln Asn Val Asn Asn Ile

245 250 255

Lys Glu Leu Ile Glu Lys Ile Pro Asp Met Ser Glu Leu Lys Lys Ser

260 265 270

Gln Val Phe Tyr Lys Tyr Tyr Leu Asp Lys Glu Glu Leu Asn Asp Lys

275 280 285

Asn Ile Lys Tyr Ala Phe Cys His Phe Val Glu Ile Glu Met Ser Gln

290 295 300

Leu Leu Lys Asn Tyr Val Tyr Lys Arg Leu Ser Asn Ile Ser Asn Asp

305 310 315 320

Lys Ile Lys Arg Ile Phe Glu Tyr Gln Asn Leu Lys Lys Leu Ile Glu

325 330 335

Asn Lys Leu Leu Asn Lys Leu Asp Thr Tyr Val Arg Asn Cys Gly Lys

340 345 350

Tyr Asn Tyr Tyr Leu Gln Val Gly Glu Ile Ala Thr Ser Asp Phe Ile

355 360 365

Ala Arg Asn Arg Gln Asn Glu Ala Phe Leu Arg Asn Ile Ile Gly Val

370 375 380

Ser Ser Val Ala Tyr Phe Ser Leu Arg Asn Ile Leu Glu Thr Glu Asn

385 390 395 400

Glu Asn Gly Ile Thr Gly Arg Met Arg Gly Lys Thr Val Lys Asn Asn

405 410 415

Lys Gly Glu Glu Lys Tyr Val Ser Gly Glu Val Asp Lys Ile Tyr Asn

420 425 430

Glu Asn Lys Gln Asn Glu Val Lys Glu Asn Leu Lys Met Phe Tyr Ser

435 440 445

Tyr Asp Phe Asn Met Asp Asn Lys Asn Glu Ile Glu Asp Phe Phe Ala

450 455 460

Asn Ile Asp Glu Ala Ile Ser Ser Ile Arg His Gly Ile Val His Phe

465 470 475 480

Asn Leu Glu Leu Glu Gly Lys Asp Ile Phe Ala Phe Lys Asn Ile Ala

485 490 495

Pro Ser Glu Ile Ser Lys Lys Met Phe Gln Asn Glu Ile Asn Glu Lys

500 505 510

Lys Leu Lys Leu Lys Ile Phe Lys Gln Leu Asn Ser Ala Asn Val Phe

515 520 525

Asn Tyr Tyr Glu Lys Asp Val Ile Ile Lys Tyr Leu Lys Asn Thr Lys

530 535 540

Phe Asn Phe Val Asn Lys Asn Ile Pro Phe Val Pro Ser Phe Thr Lys

545 550 555 560

Leu Tyr Asn Lys Ile Glu Asp Leu Arg Asn Thr Leu Lys Phe Phe Trp

565 570 575

Ser Val Pro Lys Asp Lys Glu Glu Lys Asp Ala Gln Ile Tyr Leu Leu

580 585 590

Lys Asn Ile Tyr Tyr Gly Glu Phe Leu Asn Lys Phe Val Lys Asn Ser

595 600 605

Lys Val Phe Phe Lys Ile Thr Asn Glu Val Ile Lys Ile Asn Lys Gln

610 615 620

Arg Asn Gln Lys Thr Gly His Tyr Lys Tyr Gln Lys Phe Glu Asn Ile

625 630 635 640

Glu Lys Thr Val Pro Val Glu Tyr Leu Ala Ile Ile Gln Ser Arg Glu

645 650 655

Met Ile Asn Asn Gln Asp Lys Glu Glu Lys Asn Thr Tyr Ile Asp Phe

660 665 670

Ile Gln Gln Ile Phe Leu Lys Gly Phe Ile Asp Tyr Leu Asn Lys Asn

675 680 685

Asn Leu Lys Tyr Ile Glu Ser Asn Asn Asn Asn Asp Asn Asn Asp Ile

690 695 700

Phe Ser Lys Ile Lys Ile Lys Lys Asp Asn Lys Glu Lys Tyr Asp Lys

705 710 715 720

Ile Leu Lys Asn Tyr Glu Lys His Asn Arg Asn Lys Glu Ile Pro His

725 730 735

Glu Ile Asn Glu Phe Val Arg Glu Ile Lys Leu Gly Lys Ile Leu Lys

740 745 750

Tyr Thr Glu Asn Leu Asn Met Phe Tyr Leu Ile Leu Lys Leu Leu Asn

755 760 765

His Lys Glu Leu Thr Asn Leu Lys Gly Ser Leu Glu Lys Tyr Gln Ser

770 775 780

Ala Asn Lys Glu Glu Thr Phe Ser Asp Glu Leu Glu Leu Ile Asn Leu

785 790 795 800

Leu Asn Leu Asp Asn Asn Arg Val Thr Glu Asp Phe Glu Leu Glu Ala

805 810 815

Asn Glu Ile Gly Lys Phe Leu Asp Phe Asn Glu Asn Lys Ile Lys Asp

820 825 830

Arg Lys Glu Leu Lys Lys Phe Asp Thr Asn Lys Ile Tyr Phe Asp Gly

835 840 845

Glu Asn Ile Ile Lys His Arg Ala Phe Tyr Asn Ile Lys Lys Tyr Gly

850 855 860

Met Leu Asn Leu Leu Glu Lys Ile Ala Asp Lys Ala Lys Tyr Lys Ile

865 870 875 880

Ser Leu Lys Glu Leu Lys Glu Tyr Ser Asn Lys Lys Asn Glu Ile Glu

885 890 895

Lys Asn Tyr Thr Met Gln Gln Asn Leu His Arg Lys Tyr Ala Arg Pro

900 905 910

Lys Lys Asp Glu Lys Phe Asn Asp Glu Asp Tyr Lys Glu Tyr Glu Lys

915 920 925

Ala Ile Gly Asn Ile Gln Lys Tyr Thr His Leu Lys Asn Lys Val Glu

930 935 940

Phe Asn Glu Leu Asn Leu Leu Gln Gly Leu Leu Leu Lys Ile Leu His

945 950 955 960

Arg Leu Val Gly Tyr Thr Ser Ile Trp Glu Arg Asp Leu Arg Phe Arg

965 970 975

Leu Lys Gly Glu Phe Pro Glu Asn His Tyr Ile Glu Glu Ile Phe Asn

980 985 990

Phe Asp Asn Ser Lys Asn Val Lys Tyr Lys Ser Gly Gln Ile Val Glu

995 1000 1005

Lys Tyr Ile Asn Phe Tyr Lys Glu Leu Tyr Lys Asp Asn Val Glu

1010 1015 1020

Lys Arg Ser Ile Tyr Ser Asp Lys Lys Val Lys Lys Leu Lys Gln

1025 1030 1035

Glu Lys Lys Asp Leu Tyr Ile Arg Asn Tyr Ile Ala His Phe Asn

1040 1045 1050

Tyr Ile Pro His Ala Glu Ile Ser Leu Leu Glu Val Leu Glu Asn

1055 1060 1065

Leu Arg Lys Leu Leu Ser Tyr Asp Arg Lys Leu Lys Asn Ala Ile

1070 1075 1080

Met Lys Ser Ile Val Asp Ile Leu Lys Glu Tyr Gly Phe Val Ala

1085 1090 1095

Thr Phe Lys Ile Gly Ala Asp Lys Lys Ile Glu Ile Gln Thr Leu

1100 1105 1110

Glu Ser Glu Lys Ile Val His Leu Lys Asn Leu Lys Lys Lys Lys

1115 1120 1125

Leu Met Thr Asp Arg Asn Ser Glu Glu Leu Cys Glu Leu Val Lys

1130 1135 1140

Val Met Phe Glu Tyr Lys Ala Leu Glu

1145 1150

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

atctcgtcca gcgccgcttc ggaccacc 28

<210> 4

<211> 67

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg gugguccgaa gcggcgcugg 60

acgagau 67

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

atctcgtcca gcgccgctt 19

<210> 6

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 6

taatacgact cactataggg gatttagact accccaa 37

<210> 7

<211> 314

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 7

ccagatgcac cgtcgaacgg ctgatgacca aactcggcct gtccgggacc acccgcggca 60

aagcccgcag gaccacgatc gctgatccgg ccacagcccg tcccgccgat ctcgtccagc 120

gccgcttcgg accaccagca cctaaccggc tgtgggtagc agacctcacc tatgtgtcga 180

cctgggcagg gttcgcctac gtggcctttg tcaccgacgc ctacgctcgc aggatcctgg 240

gctggcgggt cgcttccacg atggccacct ccatggtcct cgacgcgatc gagcaagcca 300

tctggacccg ccaa 314

Claims

1.一种试剂盒，其包括如下1)-3)所示的物质：

1)扩增含有6110-crRNA靶序列的引物对；

2)6110-crRNA，其靶序列为序列3；

3)LwCas13a蛋白，其氨基酸序列如下a)-d)中任一种：

a)、氨基酸序列由序列表中序列2所示的氨基酸残基组成；

2.一种试剂盒，包括如下A和B所示的物质：

A)扩增含有6110-crRNA靶序列的引物对；

B)含有6110-crRNA和LwCas13a蛋白的扩增体系；

所述6110-crRNA的靶序列为序列3；

所述LwCas13a蛋白，其氨基酸序列如下a)-d)中任一种：

a)、氨基酸序列由序列表中序列2所示的氨基酸残基组成；

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述6110-crRNA的核苷酸序列为序列4。

4.根据权利要求1-3中任一所述的试剂盒，其特征在于：所述扩增含有6110-crRNA靶序列的引物对由引物1和引物2组成：

所述引物1为如下1)或2)：

1)序列5所示的单链DNA分子；

所述引物2为如下3)或4)：

3)序列6所示的单链DNA分子；

5.根据权利要求1-4中任一所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中1)-3)所述的物质均单独包装；

或所述试剂盒中A和B所述的物质均单独包装。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：

所述试剂盒为具有如下1)和/或2)功能的试剂盒；

1)检测待测菌是否为结核分枝杆菌；

2)检测待测样本是否含有或感染结核分枝杆菌。

7.权利要求1-6中任一所述的试剂盒在制备检测待测样本是否感染或候选感染或含有或候选含有结核分枝杆菌产品中的应用；

或，权利要求1-6中任一所述的试剂盒在制备检测待测菌是否为或候选为结核分枝杆菌产品中的应用。

8.权利要求1-6中任一中1)-3)所示的物质或A和B所示的物质在制备检测待测样本是否感染或候选感染或含有或候选含有结核分枝杆菌产品中的应用；

或，权利要求1-6中任一中1)-3)所示的物质或A和B所示的物质在制备检测待测菌是否为或候选为结核分枝杆菌产品的应用。

9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于：所述待测样本为质粒、菌液或唾液。