CN113943823A - 一种利用rna恒温扩增crispr检测的结核分枝杆菌核酸检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用RNA恒温扩增CRISPR检测的结核分枝杆菌核酸检测试剂盒。试剂盒主要包括：1)耐高温的扩增酶，2)TB扩增缓冲液；3)检测酶；4)TB检测缓冲液；5)矿物油；6)C‑tube(能在一管中将上下液体试剂分开的反应管)。本试剂盒检测痰液等样本中的结核分枝杆菌(TB)16S rRNA靶标，具有单管，一步，快速，特异性高，灵敏度高，扩增产物为RNA不易发生污染等特点。本试剂盒灵敏度可以高达1个菌/mL，或者2.5copies/每反应的样本。本发明能为临床上诊断结核分枝杆菌的感染提供分子水平的判断依据和帮助。

Description

一种利用RNA恒温扩增CRISPR检测的结核分枝杆菌核酸检测 试剂盒

技术领域：

本发明属于结核分枝杆菌核酸的分子检测技术领域，具体涉及靶标RNA的等温扩增和CRISPR/Cas蛋白检测的分子检测技术及其相应的检测试剂盒。本发明实现了在单管中一步法对结核分枝杆菌16S rRNA的恒温扩增和CRISPR/Cas13a检测。

技术背景：

世界卫生组织发布的2020年全球结核病报告，据估算2019年全球新发结核病患者约1000万，全球因结核死亡患者约141万。其中，中国新发患者数约83.3万，约占全球8.4％，居全球第三位，仅次于印度26％，印度尼西亚8.5％。因此我国的结核病的诊断，防治形势依然十分严峻。

结核病(TB)是一种由结核分枝杆菌(M.tuberculosis)感染引起传染性疾病，是单一感染原的主要死因，也是全球十大死因之一。结核病最主要是发生肺部感染，即肺结核，但也可累及其他部位，即肺外结核病。结核分枝杆菌属于放射菌目、分枝杆菌科、分支杆菌属，是一种革兰氏阳性的专性需氧细菌，是结构细长略带弯曲的棒状杆菌，大小1～4X 0.4μm，细胞壁一般含有大量的脂质，在干燥的环境下可存活长达数天到几个月。结核分枝杆菌的最适生长温度为37℃，最适pH值为6.8～7.2，在一般的培养基中每分裂1代需时18～24小时，生长较为缓慢。结核分枝杆菌一般包括：人结核分枝杆菌，牛结核分枝杆菌，田鼠结核分枝杆菌，非洲分枝杆菌等，坎纳分枝杆菌等，其中以人结核分枝杆菌感染人最为常见，牛结核分枝杆菌也可以感染人，其他结核分支杆菌感染人的情况比较少见。早期的肺结核症状一般较轻且不明显，这会使得许多活动的、有传染性的结核患者在较长的一段时间内不会被发现，容易在人群中发生传播。结核主要通过呼吸道飞沫和空气进行传播，结核感染患者可以通过咳嗽，打喷嚏或者正常说话等，向周围环境中释放含有结核分枝杆菌的飞沫，来感染周围的人群。大多数人在感染接触到结核分枝杆菌后，免疫系统在2-10周内会抑制结核杆菌的增值，从这一阶段开始有些感染者会发展成具有传染性的活动性肺结核，而大多数人并不会发展成活动性的肺结核。

目前对结核病的诊断主要是通过临床特征，影像学表现和实验室诊断相结合方式进行，实验室诊断主要包括，1)细菌学的检查方法：如涂片抗酸染色检查和结核菌培；2)免疫学方法检查：结核菌素皮肤试验和基于抗原抗体技术的ELISA和T-SPOT试验；核酸分子学检查：主要包括核酸的荧光定量PCR和等温扩增等。

(一)细菌学检查方法：

1.涂片抗酸染色检查是结核分枝杆菌最常用的检查手段，临床常通常根据镜检视野下阳性菌的数量作为诊断结果的等级划分，一般的报告标准如下：

抗酸染色阴性(-)：300连续视野(1000倍)未找到分枝杆菌；

抗酸染色阳性(报告抗酸杆菌菌数)：1～8个抗酸杆菌/300视野；

抗酸染色阳性(+)：3～9个抗酸杆菌/100视野，连续观察300视野；

抗酸染色阳性(++)：1～9个抗酸杆菌/10视野，连续观察100视野；

抗酸染色阳性(+++)：1～9个抗酸杆菌/每视野，连续观察10视野；

抗酸染色阳性(++++)：10个以上抗酸杆菌/每视野。

涂片抗酸染色虽然是最常用的诊断结核的方法，该方法具有简单、快速、易行的特点，但是其灵敏度较差，往往要达到较高的细菌数量(大于10⁴个)，才能检出阳性，临床上一般只能检出50％-70％左右的活动性肺结核，漏检的概率较大，此外非结核分支杆菌的抗酸染色结果也呈阳性，抗酸染色不能区分结核分支杆菌和非结核分支杆菌，所以一般都还需要进一步的实验室检测证据。

2.结核分枝杆菌培养：改良罗氏(L-J)培养的方法是诊断结核分枝杆菌的金标准，其培养的灵敏度相对较高，但是培养的周期的特别长，需要培养的到8周，需要消耗大量的时间和精力，这往往不能对结核分枝杆菌阳性的患者做出及时的诊断和进一步的治疗，所以结核分枝杆菌的培养检测一般都会配合着其他检测手段来进行诊断。

(二)免疫学方法：

1.结核菌素皮肤试验(TST)又称为PPD试验，是指通过皮内注射结核菌素，并根据注射部位的皮肤状况诊断结核杆菌感染所致Ⅳ型超敏反应的皮内试验，是诊断肺结核及其他结核病的一个重要参考指标。结核菌素是结核杆菌的菌体成分，包括纯蛋白衍生物(PPD)和旧结核菌素(OT)，一般皮内注射结核菌纯蛋白衍生物，72h后观察皮肤硬结直径大小，受试部位无红晕硬结为阴性；受试部位有针眼大小的红点或稍有红肿，硬结直径<5mm为弱阳性；5-10mm则为阳性也为(++)；10-15mm则为(+++)；15mm以上或者如果直径小于15mm，但是伴有局部皮肤水泡形成，则为(+++)，即强阳性。结核菌素皮肤试验(TST)在诊断结核分枝杆菌的中有着一定的参考意义，但是该方法的灵敏度和特异性都不高，并且接种预防结核卡介苗的人群，会对该方法产生假阳性的结果，因此该方法只能作为结核分枝杆菌的辅助检测手段，目前很多临床检测单位都用γ干扰素释放分析实验(IGRA)来替代该方法。

2.γ干扰素释放分析实验(IGRA)

结核分枝杆菌感染人体后，人体的免疫系统识别到结核分枝杆菌，经过一系列的免疫反应会产生结核特异性的效应T细胞，效应T细胞会分泌INF-γ等细胞因子，来攻击破坏感染的结核分枝杆菌，效应T细胞也可以转化为记忆性T细胞，当再次接触到结核分枝杆菌时，机体就会迅速的产生结核特异性的效应T细胞，分泌干扰素INF-γ等细胞因子，来攻击结核分枝杆菌。

干扰素释放试验分析实验IGRA是一种用于结核杆菌感染的体外免疫检测的方法。该方法主要是检查结核感染者体内存在特异的效应T淋巴细胞，结核特异的效应T淋巴细胞再次受到结核抗原刺激时会分泌INF-γ。因此通过在受到结核分枝杆菌抗原刺激时，检测者的淋巴细胞细胞是否分泌干扰素INF-γ，来判定检测者体内是否存在结核特异性的效应T细胞，从而判定是否感染了结核分枝杆菌。目前针对γ干扰素释放分析实验(IGRA)主要采用美联免疫吸附试验(ELISA)和酶联免疫斑点试验(ELISPOT)来进行，目前认为联免疫斑点试验(ELISPOT)的检测性能要优于传统的酶联免疫吸附法，针对结核分枝杆菌的酶联免疫斑点试验往往被称为T-SPOT或者T-SPOT.TB，T代表效应T细胞，SPOT即斑点，TB代表结核。T-SPOT检测可以检测到单个结核分枝杆菌的特异性效应T细胞分泌的干扰素-γ，每个斑点代表一个分泌细胞因子的T细胞，计数斑点数量可以评价外周血中结核致敏的T细胞数量。γ干扰素释放分析试验T-SPOT实验虽然有着较高的准确率和特异性，一般大于90％，但其是在4种非结核分支杆菌中反应也为阳性，并且往往不能区分活动性和潜伏性(LTBI)的结核分枝杆菌的感染；在临床上也有很多原因会导致T-SPOT实验的阴性，所以T-SPOT结果往往也是需要结合临床症状或者其他检测结果来进行诊断。

(三)核酸分子诊断方法：

目前诊断结核分支杆菌核酸分子的方法主要包括荧光定量PCR和等温扩增的检测方法。

1.荧光定量PCR是利用一对特异性引物在耐高温DNA聚合酶实现靶标核酸的分子的扩增，并在荧光探针或者荧光染料结合下，产生荧光报告信号的方法。荧光定量PCR法是目前分子诊断中最常用的方法，也是分子诊断中认可的金标准方法。目前很多的临床研究都证实了荧光定量PCR在检测结核分枝杆菌中都有着较高的灵敏度和特异性。特别是基于荧光定量PCR技术，美国赛沛公司开发的

MTB/RIF一体化检测试剂和检测仪器可以在两个小时内报告结核分枝杆菌的检测结果，并且具有操作简单的特点。但是

MTB/RIF一体化检测试剂和检测仪器非常昂贵，并且试剂的耗材和仪器的都非常的精密，从而影响了全球结核病负担最严重的国家对该产品的使用，即使普通的荧光定量PCR方法也存在很多缺点，该方法实施过程中同样需要昂贵且精密的荧光定量PCR仪器，需要较为严格的PCR实验室环境，对实验人员的要求也比较高，虽然荧光定量PCR是闭管反应检测的，但是其在实施过程中产生污染的风险一直存在，一旦发生后果严重，且难以消除。目前我们国家结核分枝杆菌的核酸分子检测最长用的方法还是荧光定量PCR-探针法，以及塞沛公司的

MTB/RIF产品。

2.与荧光定量PCR方法需要的循环的变温过程相比，近些年来分子诊断技术同样发展了许多等温扩增检测方法，例如，环介导等温扩增技术(LAMP)，重组酶聚合酶扩增技术(RPA)，核酸序列依赖的扩增技术(NASBA/TMA)，LAMP，RPA和NASBA/TMA这些等温扩增技术完成扩增后往往都是需要结合特异性的荧光报告探针来完成检测信号的报告。

LAMP技术是利用4对引物和具链置换活性的DNA聚合酶在65℃左右恒温的条件下，实现DNA靶标的扩增。LAMP法在检测的低浓度核酸时的灵敏度和信号的特异性都不高，两步的LAMP法扩增后需要开盖检测，往往会发生污染，产生假阳性。RPA(RecombinasePolymerase Amplification)重组酶聚合酶扩增技术是利用重组酶，DNA聚合酶和单链结合蛋白SSB在ATP存在的情况下利用一对引物实现靶标DNA的扩增，RPA技术在37-42℃的恒温反应下，就可以达到最佳的扩增条件，RPA的技术的优势在于反应的时间短，一般在15分钟内就可以完成扩增反应。但是RPA技术也存在很多缺点，RPA的扩增反应系统涉及的酶系统和反应体系比较复杂，达到高灵敏度的检测时对扩增引物要求比较高，另外RPA反应温度较低，即使全过程闭管反应，产生污染的风险也比较高。核酸序列依赖的扩增技术NASBA/TMA是利用逆转录酶、RNA酶H和T7 RNA聚合酶三种酶在一对特异性引物的作用下完成对单链RNA扩增的一种方法，其主要扩增后的产物为主要为反义单链RNA。NASBA/TMA方法的优点是反应体系简单，反应产物为RNA，不易产生污染。但是目前的NASBA/TMA在加入扩增酶前，需要在65℃下进行RNA二级结构的变性和引物的结合的过程，再将温度降低到41℃，加入扩增酶继续反应，这样增加了扩增反应操作的复杂性，不是真正的一步等温的反应过程，不利于大规模的应用。目前也有试剂通过TMA技术的方法对结核分枝杆菌的16S rRNA进行扩增检测，来进行结核分枝杆菌的核酸分子诊断。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种基于16S rRNA靶标恒温扩增CRISPR检测的结核分枝杆菌检测试剂盒，相比于目前的荧光定量PCR，本试剂盒不需要昂贵且精密的荧光定量PCR仪器，扩增检测产物为RNA，不易产生污染，可实现在实验条件比较差的地区或者不满足PCR实验室要求的条件下快速完成结核分枝杆菌核酸的检测。本发明为结核分枝杆菌的核酸检测提供了一种快速，方便，经济，灵敏度和特异性高的检测方法。

本发明实现了一步法将结核分枝杆菌16S rRNA靶标等温扩增和CRISPR/Cas13a检测在单管中闭管完成扩增和检测。

一种利用RNA恒温扩增CRISPR检测的结核分枝杆菌核酸检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

(1)扩增酶：主要包含逆转录酶AMV，耐高温T7 RNA聚合酶和耐高温RNA酶H；

(2)TB扩增缓冲液：主要包含一对结核分枝杆菌16S rRNA基因扩增引物，Tris-HCl，dNTP，NTP，ITP，DTT，二甲基亚砜DMSO，氯化镁，氯化钾，山梨醇，牛血清白蛋白BSA；

(3)检测酶：包含Cas13a，T7 RNA聚合酶和RNA酶抑制剂；

(4)TB检测缓冲液：主要包括结核分枝杆菌16S rRNA的crDNA，Tris-HCl，荧光报告探针，NTP，DTT，氯化钠，氯化镁，聚乙二醇4000；

(5)矿物油；

(6)C-tube，带有硅胶膜隔层，能在一管中将上下液体试剂分开的反应管；

(7)阳性对照：灭活的结核分枝杆菌PBS溶液；

(8)阴性对照：为无菌的PBS溶液。

进一步地，结核分枝杆菌16S rRNA基因的片段序列如SEQ ID NO.01所示，经过扩增酶在TB扩增缓冲液中扩增后产物的RNA序列如SEQ ID NO.02所示；

SEQ ID NO.1：

aggaccacgggatgcatgtcttgtggtggaaagcgctttagcggtgtgggatgagcccgcggcctatcagcttgttggtggggtgacggcctaccaaggcgacgacgggtagccggcctgagagggtgtccggccacactgggactgagatacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagcgacgccgcgtgggggatgacggcct；

SEQ ID NO.2：

Aggccgucaucccccacgcggcgucgcugcaucaggcuugcgcccauugugcaauauuccccacugcugccucccguaggagucugggccguaucucagucccaguguggccggacacccucucaggccggcuacccgucgucgccuugguaggccgucaccccaccaacaagcugauaggccgcgggcucaucccacaccgcuaaagcgcuuuccaccacaagacaugcaucccgugguccu。

进一步地，TB扩增缓冲液中的结核分枝杆菌16S rRNA基因的扩增引物由引物TB-FW和引物TBT7-RV组成，引物TB-FW序列如SEQ ID NO.03，引物TBT7-RV的序列如SEQ IDNO.04；

SEQ ID NO.3：aggaccacgggatgcatgtcttg

SEQ ID NO.4：aattctaatacgactcactatagggagaAGGCCGTCATCCCCCACGCGGC。

进一步地，TB检测缓冲液中的结核分枝杆菌16S rRNA基因的crDNA序列如SEQ IDNO.05所示，crDNA经过检测酶在TB检测缓冲液中反应后，产生的16S rRNA基因的crRNA序列如SEQ ID NO.06所示；

SEQ ID NO.5：

TaatacgactcactataggggatttagactaccccaaaaacgaaggggactaaaacGAAAGCgcTTTAGCGG

TGTGGGATGAGC

SEQ ID NO.6：

ggauuuagacuaccccaaaaacgaaggggacuaaaacGAAAGCgcUUUAGCGGUGUGGGAUGAGC。

进一步地，TB检测缓冲液中的荧光报告探针为一段单链的RNA序列的探针，5’端FAM荧光基团修饰，3’端BHQ1荧光淬灭基团修饰，并且两端均有甲基化的修饰，其序列如SEQID NO.7；

SEQ ID NO.7:FAM-/i2OMeA/AUGGC/i2OMeA/-BHQ1。

TB扩增缓冲液中的结核分枝杆菌16S rRNA基因的一条扩增引物TBT7-RV序列中的5’端都包含一段含有T7启动子的序列，用于在T7 RNA聚合酶的作用下产生RNA，序列如SEQID NO.8；

SEQ ID NO.8:aattctaatacgactcactatagggaga。

结核分枝杆菌16S rRNA的crDNA的5’端都包含一段T7启动子的序列，用于T7 RNA聚合酶的作用下产生crRNA，序列如SEQ ID NO.9；

SEQ ID NO.9：aatacgactcactataggg。

进一步地，本发明每个反应中的各个试剂组成如下：

(1)扩增酶：逆转录酶AMV 0.5-100U/反应，耐高温T7 RNA聚合酶1-1000U/反应，耐高温RNA酶H 0.02-5U/反应，20-300mM Potassium Phosphate,pH 7.5，1-10mMDithiothreitol(DTT)，20-50％(v/v)甘油，0.01％-1％Triton X-100，20-100mM Tris-HC1(pH 7.5)，0.01-0.5mM EDTA，20-200mM NaCl，20～200mM KCl；(2)TB扩增缓冲液：10-100mMTris-HCl pH7.5-pH8.5，扩增引物0.1～2μM，dNTP 0.1-10mM，NTP 0.2-20mM，ITP 0.1-5mM，1～10mM DTT，0-25％(v/v)二甲基亚砜DMSO，2-50mM氯化镁，20-100mM氯化钾，0.1M-3M甜菜碱，0.01M-0.5M山梨醇，牛血清白蛋白BSA 0.1-100μg/反应；TB扩增缓冲液中的结核分枝杆菌16S rRNA靶标扩增引物由引物TB-FW和引物TBT7-RV组成，引物TB-FW序列见序列表中SEQID NO.03，引物TBT7-RV的序列见序列表中Seq.04。(3)检测酶：Cas13a蛋白1ng-10μg/反应，T7 RNA聚合酶1-1000U/反应，RNA酶抑制剂1-200U/反应，20-100mM Tris-HC1(pH 7.5)，1-10mM Dithiothreitol(DTT)，20-50％(v/v)甘油，0.01％-1％Triton X-100，0.01-0.5mMEDTA，20-600mM NaCl；

(4)TB检测缓冲液：TB-16S rRNA-crDNA 1ng-100ng，荧光报告探针0.01-2μM，0.1-20mM NTP，1-20mM DTT，20-100mM氯化钠，1-50mM氯化镁，0-50mM氯化钾，1-50mM氯化镁，1％-25％(v/v)聚乙二醇4000；TB检测缓冲液中的结核分枝杆菌16S rRNA crDNA序列见序列表中SEQ ID NO.05；

(5)矿物油：矿物油5-100μL/反应；

(6)C-tube：C-tube是带有硅胶膜隔层，并且硅胶隔层中心位置有能开合的十字孔反应管；C-tube能在一管中将上下液体试剂分开，并且在扩增反应完成后可以通过瞬时离心将硅胶膜上层的液体离心到硅胶膜下方；

(7)阳性对照：为1x10⁵个/mL灭活的结核分枝杆菌；

(8)阴性对照：为无菌的PBS溶液。

本发明中结核分枝杆菌16S rRNA基因的crDNA序列和在检测反应中产生的crRNA序列不限于SEQ ID NO.6，包含基于结核分枝杆菌16S rRNA(NCBI中NR_102810的序列为参考)第208和209位的GC碱基所设计的所有Cas13a蛋白的crRNA和crDNA均在本发明专利的保护范围内，结核分枝杆菌16S rRNA序列见序列表中SEQ ID NO.10，在该序列其中第208和209位的碱基为GC。

本发明提供了一种基于RNA恒温扩增CRISPR检测的结核分枝杆菌的检测方法，即CNAD(Crispr-mediated Nucleic Acid Detection)技术，该技术主要是通过逆转录酶，耐高温的T7 RNA聚合酶和耐高温的RNA酶H，在50℃恒温下一步实现对单链RNA的扩增，并结合CRISPR/Cas13a蛋白实现一步单管的检测反应。相比于目前的荧光定量PCR和其他等温扩增检测技术，本试剂盒不需要精密的荧光定量PCR仪器，扩增检测产物为RNA，不易产生污染，实现了一步法将结核分枝杆菌16S rRNA靶标等温扩增和CRISPR/Cas13a检测在单管中闭管完成扩增检测，该方法和试剂盒可实现在实验条件比较差的地区或者不具备PCR实验室的条件下，快速、灵活完成结核分枝杆菌的核酸检测。

本发明试剂盒的主要优点在于：

(1)不需要昂贵且精密的荧光定量PCR仪器；

(2)反应的全过程中都不易产生污染；

(3)灵敏度高；

(4)特异性高；

(5)实现了结核分枝杆菌16S rRNA靶标的等温扩增和CRISPR/Cas13a检测的单管一步闭管反应检测。

(6)可以实现在实验条件比较差的地区或者不满足PCR实验室要求的条件下快速完成结核分枝杆菌核酸的检测。

附图说明

图1为本发明试剂盒实施过程的流程图。

图2为说明结核分枝杆菌灵敏度检测的结果，灵敏度达到5个菌/ml。

图3为说明结核分枝杆菌灵敏度检测的结果，灵敏度达到2.5copies/反应。

图4为说明结核分枝杆菌特异性的检测的结果，特异性高，常见的非结核分枝杆菌和其他病原体均是阴性的信号。

图5为说明临床痰液样本检测结果，其中TBP1-TBP8为结核分枝杆菌阳性的痰液样本，TBN1-TBN8为结核分枝杆菌阴性的痰液样本，检测结果均符合临床的诊断结果。

具体实施方式：

结合以下具体实施例对本发明提供的方法进行更详细的说明，这些实施例应理解成对本发明的具体说明和阐述，不应理解成为本发明范围的限制。以下实施例中所用到的试剂组分除特别说明外，均为本发明试剂盒中的组分。本领域的专业人员在本发明基础上的修改或者改动，这些等价修改的方式同样落在本发明权利要求书中所述的权利要求范围。

本发明结核分枝杆菌核酸检测试剂盒，具体实施例中每个反应中的各个试剂组成如下：

(1)扩增酶：逆转录酶AMV 4U/反应，耐高温T7 RNA聚合酶20U/反应，耐高温RNA酶H0.2U/反应，200mM Potassium Phosphate,pH 7.5，5mM Dithiothreitol(DTT)，50％(v/v)甘油，0.1％Triton X-100，20mM Tris-HC1(pH 7.5)，0.5mM EDTA，100mM NaCl，20mM KCl；

(2)TB扩增缓冲液：40mM Tris-HCl pH7.4，扩增引物0.2μM，dNTP 1mM，NTP 2mM，ITP 0.5mM，5mM DTT，15％(v/v)二甲基亚砜DMSO，12mM氯化镁，70mM氯化钾，50mM山梨醇，牛血清白蛋白BSA 1μg/反应；

其中，TB扩增缓冲液中的结核分枝杆菌16S rRNA扩增引物序列如下：

TB-FW(SEQ ID NO.3)：AGGACCACGGGATGCATGTCTTGTBT7-RV(SEQ ID NO.4)：

aattctaatacgactcactatagggagaAGGCCGTCATCCCCCACGCGGC

(3)检测酶：Cas13a蛋白0.3μg/反应，T7 RNA聚合酶20U/反应，RNA酶抑制剂20U/反应，40mM Tris-HC1(pH 7.5)，10mM Dithiothreitol(DTT)，50％(v/v)甘油，0.1％TritonX-100，1mM EDTA，600mM NaCl；

(4)TB检测缓冲液：TB-16S rRNA-crDNA 15ng，荧光报告探针0.04μM，0.5mM NTP，10mM DTT，60mM氯化钠，8mM氯化镁，10mM氯化钾，

(5)矿物油：矿物油10μL/反应；

(6)C-tube：C-tube是带有硅胶膜隔层，并且硅胶隔层中心位置有能开合的十字孔反应管；C-tube能在一管中将上下液体试剂分开，并且在扩增反应完成后可以通过瞬时离心将硅胶膜上层的液体离心到硅胶膜下方。

实施例1：本发明试剂盒灵敏度的检测

1.检测样本核酸的准备：

1)以结核分枝杆菌的培养物的灭活后10000个/mL的浓度为S1样本，依次用PBS按照1:10比例梯度稀释后为S2样本1000个/mL，S3样本约100copies/mL，S4样本约10个/mL，S5样本约1个/mL，NC样本为PBS溶液。上述S1-S5样本和NC样本经过核酸提取后，成为该实施例中试剂盒要检测的核酸样本溶液。核酸提取过程采用的是本公司(杭州杰毅生物技术有限公司)配套的病原物生物核酸提取试剂盒(货号MD005)进行。

2)通过带有T7启动子AATACGACTCACTATAGGG序列(SEQ ID NO.9)的TB 16S rRNA的DNA序列(SEQ ID NO.10)，经过体外转录得到TB 16S rRNA片段的RNA产物，RNA经过纯化，浓度测量，体外RNA转录试剂使用的是HiScribeT7 Quick High Yield RNA Synthesis kit(New England Biolabs)，RNA纯化试剂盒使用的是RNAClean&Concentrator-5kit(ZymoResearch)。纯化后的RNA用ddH₂O依次按照1:10稀释成1ng/μL，100pg/μL，10pg/μL，1pg/μL，100fg/μL；然后再稀释成要检测的浓度10fg/μL(约1.1x10⁴copies/μL)，1fg/μL(约1.1x10³copies/μL)，100ag/μL(约110copies/μL)，10ag/μL(约11copies/μL)，5ag/μL(约5copies/μL)，2.5ag/μL(约2.5copies/μL)。

2.扩增和检测具体的实施步骤：

1)将试剂盒中的TB检测缓冲液于室温解冻，并将各组分混匀。

2)扩增反应液配制：按照下表及检测样本的数量，在干净的离心管中取相应量的TB扩增缓冲液和扩增酶预混，配制成TB扩增反应液；

3)检测反应液：按照下表及检测样本的数量，在干净的离心管中取相应量的TB检测缓冲液和检测酶预混，配制成TB检测反应液。

4)吸取3.5μL步骤2)中TB扩增反应液，用枪头穿过C-tube的硅胶膜十字孔，将扩增反应液加入至C-tube底部，再向反应孔底部加入10μL矿物油，然后吸取1.5μL待测核酸样本溶液，用枪头穿过硅胶膜十字孔，加入到矿物油层下方，瞬时离心C-tube，保证液体全部位于管底。

5)吸取45μL步骤3)中TB检测反应液，加在反应管C-tube管盖内的凹槽内，小心盖好管盖后(此步不可离心)放在等温扩增反应设备(如PCR仪或者恒温金属浴)中50℃，反应50min。本反应等温扩增反应设备为本公司(杭州杰毅生物技术有限公司)生产的恒温金属浴(货号MI-960)。

6)等待50℃恒温反应完后，取下C-tube，在迷你离心机上瞬时离心，将检测反应液离心到管底，离心后的C-tube放入恒温金属浴中，37℃至少孵育15min。

7)孵育结束后，放入核酸扩增分析仪器中读取荧光值，为了确保检测结果的准确，孵育结束后的样本需在1个小时内，完成荧光值的检测读取。

本发明的试剂盒的荧光读取仪器设备适用于杭州杰毅生物技术有限公司生产的核酸扩增分析仪器FMS-800M。

3.阳性参考值的设定与解释

①检测靶点荧光值≥4500，表示结核分枝杆菌阳性；

②检测靶点荧光值≤4200，表示结核分枝杆菌阴性；

③检测靶点荧光值在4200～4500之间时，需要重复实验，若重做结果荧光值＞4200，该样本判断结核分枝杆菌为阳性，否则为阴性。

该实施列1的结果见附图图2和图3，说明本发明结核分枝杆菌检测试剂盒的灵敏度可以达到约1个菌/mL的样本或者约2.5copies/每反应。

实施例2：本发明试剂盒特异性的检测

1)检测样本核酸的准备：

以结核分枝杆菌M.tuberculosis培养物灭活后的样本为阳性对照PC样本，以常见的非结核结核分枝杆菌和肺部感染的常见的病原体作为特异性的干扰样本进行测试，这些病原体样本包括嗜鸟分枝杆菌M.avium，胞内分枝杆菌M.intracellulare，脓肿分枝杆菌M.abscessus，龟分枝杆菌M.chelonae，堪萨斯分枝杆菌M.kansasii，玛尔摩分枝杆菌M.malmoense，蟾蜍分枝杆菌M.xenopi，土分枝杆菌M.terrae，偶发分枝杆菌M.fortuitum，肺军团菌L.pneumophila，肺炎克雷伯菌K.pneumoniae，肺炎支原体M.pneumoniae，肺炎衣原体C.pneumoniae，百日咳杆菌B.pertussis，上述样本经过核酸提取后，成为该实施例中试剂盒要检测的核酸样本溶液。核酸体过程采用的是本公司(杭州杰毅生物技术有限公司)配套的病原物生物核酸提取试剂盒，(货号MD005)。

2)扩增和检测具体的实施步骤，检测结果的判定和解释均与实施例1相同。

该实施列2的检测结果见附图图4，说明本发明结核分枝杆菌检测的试剂盒的特异性高，在常见的非结核分枝杆菌和其他肺部感染的病原体中均不会产生信号。

实施例3：本发明试剂盒对临床痰液样本的检测

1)检测样本核酸的准备：

以临床上确认诊断为结核分枝杆菌感染的患者痰液样本，8例阳性患者的痰液样本提取好的核酸溶液，编号TBP1，TBP2，TBP3，TBP4，TBP5，TBP6，TBP7，TBP8；5个阴性痰液样本提取好的核酸溶液，编号TBN1，TBN2，TBN3，TBN4，TBN5，作为检测核酸样本。上述痰液核酸样本溶液均是由临床痰液样本经过本公司的病原微生物核酸提取试剂盒(磁珠法)(货号MD005)进行核酸提取后的核酸样本溶液。

该实施例中扩增和检测具体的实施步骤，检测结果的判定和解释均与实施例1相同。

该实施列3的检测结果见附图图5，说明本发明结核分枝杆菌试剂盒检测临床痰液样本与临床确认的诊断结果均符合。

序列表

<110> 杭州杰毅生物技术有限公司

<120> 一种利用RNA恒温扩增CRISPR检测的结核分枝杆菌核酸检测试剂盒

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 243

<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(M.tuberculosis)

<400> 1

aggaccacgg gatgcatgtc ttgtggtgga aagcgcttta gcggtgtggg atgagcccgc 60

ggcctatcag cttgttggtg gggtgacggc ctaccaaggc gacgacgggt agccggcctg 120

agagggtgtc cggccacact gggactgaga tacggcccag actcctacgg gaggcagcag 180

tggggaatat tgcacaatgg gcgcaagcct gatgcagcga cgccgcgtgg gggatgacgg 240

cct 243

<210> 2

<211> 243

<212> RNA

<213> 结核分枝杆菌(M.tuberculosis)

<400> 2

aggccgucau cccccacgcg gcgucgcugc aucaggcuug cgcccauugu gcaauauucc 60

ccacugcugc cucccguagg agucugggcc guaucucagu cccagugugg ccggacaccc 120

ucucaggccg gcuacccguc gucgccuugg uaggccguca ccccaccaac aagcugauag 180

gccgcgggcu caucccacac cgcuaaagcg cuuuccacca caagacaugc aucccguggu 240

ccu 243

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Manual sequence)

<400> 3

aggaccacgg gatgcatgtc ttg 23

<210> 4

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Manual sequence)

<400> 4

aattctaata cgactcacta tagggagaag gccgtcatcc cccacgcggc 50

<210> 5

<211> 72

<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(M.tuberculosis)

<400> 5

taatacgact cactataggg gatttagact accccaaaaa cgaaggggac taaaacgaaa 60

gcgctttagc gg 72

<210> 6

<211> 65

<212> RNA

<213> 结核分枝杆菌(M.tuberculosis)

<400> 6

ggauuuagac uaccccaaaa acgaagggga cuaaaacgaa agcgcuuuag cgguguggga 60

ugagc 65

<210> 7

<211> 5

<212> RNA

<213> 人工序列(Manual sequence)

<400> 7

auggc 5

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Manual sequence)

<400> 8

aattctaata cgactcacta tagggaga 28

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Manual sequence)

<400> 9

aatacgactc actataggg 19

<210> 10

<211> 1532

<212> DNA

<213> 结核分枝杆菌(M.tuberculosis)

<400> 10

tgtttggaga gtttgatcct ggctcaggac gaacgctggc ggcgtgctta acacatgcaa 60

gtcgaacgga aaggtctctt cggagatact cgagtggcga acgggtgagt aacacgtggg 120

tgatctgccc tgcacttcgg gataagcctg ggaaactggg tctaataccg gataggacca 180

cgggatgcat gtcttgtggt ggaaagcgct ttagcggtgt gggatgagcc cgcggcctat 240

cagcttgttg gtggggtgac ggcctaccaa ggcgacgacg ggtagccggc ctgagagggt 300

gtccggccac actgggactg agatacggcc cagactccta cgggaggcag cagtggggaa 360

tattgcacaa tgggcgcaag cctgatgcag cgacgccgcg tgggggatga cggccttcgg 420

gttgtaaacc tctttcacca tcgacgaagg tccgggttct ctcggattga cggtaggtgg 480

agaagaagca ccggccaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggg tgcgagcgtt 540

gtccggaatt actgggcgta aagagctcgt aggtggtttg tcgcgttgtt cgtgaaatct 600

cacggcttaa ctgtgagcgt gcgggcgata cgggcagact agagtactgc aggggagact 660

ggaattcctg gtgtagcggt ggaatgcgca gatatcagga ggaacaccgg tggcgaaggc 720

gggtctctgg gcagtaactg acgctgagga gcgaaagcgt ggggagcgaa caggattaga 780

taccctggta gtccacgccg taaacggtgg gtactaggtg tgggtttcct tccttgggat 840

ccgtgccgta gctaacgcat taagtacccc gcctggggag tacggccgca aggctaaaac 900

tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc ggcggagcat gtggattaat tcgatgcaac 960

gcgaagaacc ttacctgggt ttgacatgca caggacgcgt ctagagatag gcgttccctt 1020

gtggcctgtg tgcaggtggt gcatggctgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta 1080

agtcccgcaa cgagcgcaac ccttgtctca tgttgccagc acgtaatggt ggggactcgt 1140

gagagactgc cggggtcaac tcggaggaag gtggggatga cgtcaagtca tcatgcccct 1200

tatgtccagg gcttcacaca tgctacaatg gccggtacaa agggctgcga tgccgcgagg 1260

ttaagcgaat ccttaaaagc cggtctcagt tcggatcggg gtctgcaact cgaccccgtg 1320

aagtcggagt cgctagtaat cgcagatcag caacgctgcg gtgaatacgt tcccgggcct 1380

tgtacacacc gcccgtcacg tcatgaaagt cggtaacacc cgaagccagt ggcctaaccc 1440

tcgggaggga gctgtcgaag gtgggatcgg cgattgggac gaagtcgtaa caaggtagcc 1500

gtaccggaag gtgcggctgg atcacctcct tt 1532

Claims (6)

1.一种利用RNA恒温扩增CRISPR检测的结核分枝杆菌核酸检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

(1)扩增酶：主要包含逆转录酶AMV，耐高温T7 RNA聚合酶和耐高温RNA酶H；

(2)TB扩增缓冲液：主要包含一对结核分枝杆菌16S rRNA基因扩增引物，Tris-HCl，dNTP，NTP，ITP，DTT，二甲基亚砜DMSO，氯化镁，氯化钾，山梨醇，牛血清白蛋白BSA；

(3)检测酶：包含Cas13a，T7 RNA聚合酶和RNA酶抑制剂；

(4)TB检测缓冲液：主要包括结核分枝杆菌16S rRNA的crDNA，Tris-HCl，荧光报告探针，NTP，DTT，氯化钠，氯化镁，聚乙二醇4000；

(5)矿物油；

(6)C-tube，带有硅胶膜隔层，能在一管中将上下液体试剂分开的反应管；

(7)阳性对照：灭活的结核分枝杆菌PBS溶液；

(8)阴性对照：为无菌的PBS溶液。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，结核分枝杆菌16S rRNA基因的片段序列如SEQ ID NO.01所示，经过扩增酶在TB扩增缓冲液中扩增后产物的RNA序列如SEQ IDNO.02所示；

SEQ ID NO.1：

aggaccacgggatgcatgtcttgtggtggaaagcgctttagcggtgtgggatgagcccgcggcctatcagcttgttggtggggtgacggcctaccaaggcgacgacgggtagccggcctgagagggtgtccggccacactgggactgagatacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagcgacgccgcgtgggggatgacggcct；

SEQ ID NO.2：

aggccgucaucccccacgcggcgucgcugcaucaggcuugcgcccauugugcaauauuccccacugcugccucccguaggagucugggccguaucucagucccaguguggccggacacccucucaggccggcuacccgucgucgccuugguaggccgucaccccaccaacaagcugauaggccgcgggcucaucccacaccgcuaaagcgcuuuccaccacaagacaugcaucccgugguccu。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，TB扩增缓冲液中的结核分枝杆菌16SrRNA基因的扩增引物由引物TB-FW和引物TBT7-RV组成，引物TB-FW序列如SEQ ID NO.03，引物TBT7-RV的序列如SEQ ID NO.04；

SEQ ID NO.3：aggaccacgggatgcatgtcttg

SEQ ID NO.4：aattctaatacgactcactatagggagaAGGCCGTCATCCCCCACGCGGC。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，TB检测缓冲液中的结核分枝杆菌16SrRNA基因的crDNA序列如SEQ ID NO.05所示，crDNA经过检测酶在TB检测缓冲液中反应后，产生的16S rRNA基因的crRNA序列如SEQ ID NO.06所示；

SEQ ID NO.5：

TaatacgactcactataggggatttagactaccccaaaaacgaaggggactaaaacGAAAGCgcTTTAGCGGTGTGGGATGAGC

SEQ ID NO.6：

ggauuuagacuaccccaaaaacgaaggggacuaaaacGAAAGCgcUUUAGCGGUGUGGGAUGAGC。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，TB检测缓冲液中的荧光报告探针为一段单链的RNA序列的探针，5’端FAM荧光基团修饰，3’端BHQ1荧光淬灭基团修饰，并且两端均有甲基化的修饰，其序列如SEQ ID NO.7；

SEQ ID NO.7:FAM-/i2OMeA/AUGGC/i2OMeA/-BHQ1。

6.根据权利要求1-5任一权利要求所述的试剂盒，其特征在于，每个反应中的各个试剂组成如下：

(1)扩增酶：逆转录酶AMV 0.5-100U/反应，耐高温T7 RNA聚合酶1-1000U/反应，耐高温RNA酶H 0.02-5U/反应，20-300mM Potassium Phosphate,pH 7.5，1-10mM Dithiothreitol(DTT)，20-50％(v/v)甘油，0.01％-1％Triton X-100，20-100mM Tris-HC1(pH 7.5)，0.01-0.5mM EDTA，20-200mM NaCl，20～200mM KCl；(2)TB扩增缓冲液：10-100mM Tris-HClpH7.5-pH8.5，扩增引物0.1～2μM，dNTP 0.1-10mM，NTP 0.2-20mM，ITP 0.1-5mM，1～10mMDTT，0-25％(v/v)二甲基亚砜DMSO，2-50mM氯化镁，20-100mM氯化钾，0.01M-0.5M山梨醇，牛血清白蛋白BSA 0.1-100μg/反应；

(3)检测酶：Cas13a蛋白1ng-10μg/反应，T7 RNA聚合酶1～1000U/反应，RNA酶抑制剂1～200U/反应，20-100mM Tris-HC1(pH 7.5)，1-10mM Dithiothreitol(DTT)，20-50％(v/v)甘油，0.01％-1％Triton X-100，0.01-0.5mM EDTA，20-600mM NaCl；

(4)TB检测缓冲液：结核分枝杆菌16S rRNA基因的crDNA 1ng-100ng，荧光报告探针0.01-2μM，0.1-20mM NTP，1-20mM DTT，20-100mM氯化钠，1-50mM氯化镁，0-50mM氯化钾，1-50mM氯化镁，1％-25％(v/v)聚乙二醇4000；

(5)矿物油：矿物油5-100μL/反应；

(6)C-tube：C-tube是带有硅胶膜隔层，并且硅胶隔层中心位置有能开合的十字孔反应管；C-tube能在一管中将上下液体试剂分开，并且在扩增反应完成后可以通过瞬时离心将硅胶膜上层的液体离心到硅胶膜下方；

(7)阳性对照：为1x10⁵个/mL灭活的结核分枝杆菌；

(8)阴性对照：为无菌的PBS溶液。

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