CN115896316A

CN115896316A - 一种结核病的检测方法

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Publication number: CN115896316A
Application number: CN202211305506.4A
Authority: CN
Inventors: 逄宇; 任卫聪; 李传友; 李姗姗
Original assignee: Beijing Chest Hospital; Beijing Tuberculosis and Thoracic Tumor Research Institute
Current assignee: Beijing Chest Hospital; Beijing Tuberculosis and Thoracic Tumor Research Institute
Priority date: 2022-10-24
Filing date: 2022-10-24
Publication date: 2023-04-04

Abstract

本发明涉及医药分子生物学技术领域，采用传统PCR技术扩增目标靶基因DNA序列，利用T7转录生成ssRNA，利用cas‑13a识别靶序列及非特异性切割反应体系中的荧光报告RNA，使荧光检测信号放大，实现低拷贝目标靶基因的高灵敏度检测，提供一个简单、快速、无须昂贵设备即可进行结核分枝杆菌的检测方法，具有高灵敏度、特异性的优点。

Description

一种结核病的检测方法

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别涉及结核分枝杆菌的检测方法。

背景技术

规律成簇间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats，CRISPR)系统是存在于细菌和古细菌中的获得性免疫系统，CRISPR-Cas系统是存在于约48％的细菌和约80％的古细菌中的自适应免疫系统。CRISPR基因座在大肠杆菌中以高度同源的重复序列呈现。依据Cas基因与位点结构之间的序列相似性将CRISPR-Cas系统分为两大类：第一类系统(包括括Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型)存在于细菌和古细菌中，通常形成多亚基蛋白-crRNA效应复合物；第二类系统(包括Ⅱ、Ⅴ和Ⅵ型)依赖于一个单一的crRNA引导蛋白进行目标干扰。其中能够非特异性切割单链RNA的Cas13a属于VI类，VI类中还有Cas13b、Cas13c等几种亚型。Cas13a(二类Ⅵ-A型)不同于其他的两类CRISPR效应蛋白，其缺少一个DNA酶的结构域，具有两个保守的高等真核生物及原核生物核酸结合功能区，该功能区使其具有了RNA酶的活性。Cas13是第一个被描述用于RNA引导RNA靶向的单蛋白效应器，独特的RNA靶向机制，为RNA引导的RNA靶向研究提供了新思路。

CRISPR-Cas13a检测技术在感染性疾病诊断中的应用如：Cas13a对靶点RNA序列识别后可呈现出强大且对非特异RNA序列的“平行切割”效应。East-Seletsky等首次利用LbuCas13a蛋白对目标RNA的核酸进行检测，结果表明仅能对10pmol/L的RNA分子进行检测，无法达到临床诊断的检测要求。随后，Gootenberg等发现检测效率更高的LwCas13a蛋白，并首次将其与重组聚合酶等温扩增技术(reconbinase polymeraseamplificationRPA)结合，建立敏感度达单拷贝、特异性达单碱基的高敏感、高特异性核酸检测方法SHERLOCK，该系统可用于生物样本(血液或尿液)中寨卡以及登革热病毒的检测，并且可以进一步区分其特定型别(如非洲寨卡和美洲寨卡)，鉴定病原菌以及人体内游离的突变肿瘤DNA。Myhrvold等开发出一种与SHERLOCK配对可直接从体液中检测病毒的HUDSON技术可以在2h内从患者的全血、血清和唾液样本中高度敏感地检测出登革热病毒，同时可区分4种登革热病毒血清型，以及2015至2016年流行的寨卡病毒区域特异株。

结核病(Tuberculosis，TB)由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，Mtb)感染引起的古老的慢性传染病至今依然严重危害人类健康，因此对潜伏感染者的早期精准干预意义重大。

目前，临床上诊断肺结核的方法仍是影像学及细菌学，痰涂片抗酸染色法简单、快速、经济，但敏感性差，痰菌培养周期长，不利于临床结核病的诊断和治疗。针对结核分枝杆菌核酸的检测主要有GenXpert和PCR法检测痰液中的结核分枝杆菌TB基因，GenXpert的敏感度和特异度均明显升高，但其费用高，在基层单位尚未完全普及。在于佳佳等人的研究中，将PCR扩增技术与CRISPR_Cas13a检测技术相结合，通过对含MTB DNA的质粒模板、标准菌株H37Rv及6种非结核分枝杆菌进行敏感度及特异度分析，研究结果表明不同浓度质粒模板和标准菌株H37Rv的敏感度，敏感度在拷贝数10拷贝/ul和100拷贝/ul时较好。

CRISPR/Cas系统在医学等领域的有效应用受到了脱靶效应的影响，同时CRISPR/Cas系统在不同基因组位点的切割效率具有一定差异，因此，CRISPR_Cas13a技术的应用随着目标序列的不同，其检测的灵敏度会受到显著的影响，寻找特异性更强、互补识别更精确的的目标序列成为更好的使用CRISPR CAS13a RNA酶技术的关键因素。尤其在结核病和耐药的准确诊断中迫切需要一种快速、高效、敏感、经济的结核分枝杆菌诊断方法。

发明内容

基于CRISPR-Cas系统中Cas13a蛋白具有RNA酶的活性，可在CRISPR RNA(crRNA)的引导下识别目标靶序列的单链核糖核酸(single-stranded ribonucleic acid，ssRNA)，并进行剪切，同时还可对非目标RNA进行非特异剪切特性，具有信号放大的功能。CRISPR_Cas13a技术的应用随着目标序列的不同，其检测的灵敏度会受到显著的影响，寻找特异性更强、互补识别更精确的的目标序列成为更好的使用CRISPR CAS13a RNA酶技术的关键因素，本发明确定了结核分枝杆菌的特定crDNA序列，能够高效、精准的与CRISPR CAS13a RNA酶互补识别，实现低拷贝特定目标靶基因的高灵敏度检测，提供了一个简单、快速、无须昂贵设备即可进行结核分枝杆菌的检测方法。因此，

第一方面，本发明提供一组用于检测结核分枝杆菌TB DNA的crDNA序列，所述crDNA序列可被T7转录生成crRNA，进而能够被CRISPR Cas13a所识别；所述crDNA选自如下序列：

IS1081-a crDNA

GGGGATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGGACTAAAACTTCGGACCCGCCCGCTCGATGCCGGCCC(SEQ IN NO:1)

IS1081-b crDNA

GGGGATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGGACTAAAACCCCGCCCGCTCGATGCCGGCCCGTATAC(SEQ IN NO:2)

IS1081-c crDNA

GGGGATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGGACTAAAACGCCCGCAGCGGCCTGGCAGCGCTGCAGA(SEQ IN NO:3)

IS1081-d crDNA

GGGGATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGGACTAAAACCGCCAGGGCAGCTATTTCCCGGACTGGC(SEQ IN NO:4)

IS1081-e crDNA

GGGGATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGGACTAAAACCGGACCCGCCCGCTCGATGCCGGCCCGT(SEQ IN NO:5)；

该crDNA序列是转录为RNA序列时能够被CRISPR Cas13a所识别的特异性序列，筛选与cas13a结合，切割活性好、荧光信号强的crDNA，进一步的，该crDNA序列优选为IS1081-bcrDNA：

GGGGATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGGACTAAAACCCCGCCCGCTCGATGCCGGCCCGTATAC(SEQ IN NO:2)。

本发明第一方面所述结核分枝杆菌TB DNA的crDNA序列的选取设计在目标靶基因IS1081的不同位置，筛选与cas13a结合后，切割活性好、荧光信号强的crDNA，即设计单链的DNA序列作为扩增模板，序列包含重复序列+靶点序列。因此，

第二方面本发明提供一种基于结核分枝杆菌TB DNA单链的DNA序列作为扩增模板设计crDNA进行PCR扩增的引物，所述引物包含上游引物和下游引物，其中上游引物包含T7转录所需共有序列和20nt的重复序列。所述上游引物序列为：

T7-crRNA-F：TAATACGACTCACTATAGGGGATTTAGACTACCCCAA(SEQ IN NO:6)；

所述下游引物选自如下序列：

IS1081-a-R：GGGCCGGCATCGAGCGGGCG(SEQ IN NO:7)；

IS1081-b-R：GTATACGGGCCGGCATCGAG(SEQ IN NO:8)；

IS1081-c-R：TCTGCAGCGCTGCCAGGCCG(SEQ IN NO:9)；

IS1081-d-R：GCCAGTCCGGGAAATAGCTG(SEQ IN NO:10)；

IS1081-e-R：ACGGGCCGGCATCGAGCGGG(SEQ IN NO:11)；

进一步的，所述被CRISPR Cas13a所识别的RNA序列为crRNA，比较不同crRNA的信号强弱，选择荧光信号最强的crRNA确定为检测方法中下游引物，优选的引物组合为：

上游引物为：T7-crRNA-F：TAATACGACTCACTATAGGGGATTTAGACTACCCCAA(SEQ INNO:6)；

下游引物为：IS1081-b-R：GTATACGGGCCGGCATCGAG(SEQ IN NO:8)；

进一步的，T7转录所需共有序列为5’-TAATACGACTCACTATA-3’；

进一步的，所述20nt的重复序列来自crRNA的5’端带有39nt的重复序列5’-GGGGAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAAC-3’，该段重复序列可与LwCas13a蛋白结合，即5’-GGGGATTTAGACTACCCCAA-3’；

进一步的，所述T7转录所需共有序列是可以被T7 RNA聚合酶识别，进一步利用cas-13a识别靶序列及非特异性切割反应体系中的荧光报告RNA，使荧光检测信号放大。

第三方面，本发明提供一检测结核分枝杆菌的试剂盒，所述试剂盒包括用于检测结核分枝杆菌TB DNA的crDNA序列、以及将crDNA序列转录为crRNA的试剂，CRISPR Cas13a和荧光报告RNA。

进一步的，所述用于检测结核分枝杆菌TB DNA的crDNA序列包括：

IS1081-a crDNA

IS1081-b crDNA

IS1081-c crDNA

IS1081-d crDNA

IS1081-e crDNA

进一步的，所述crDNA序列通过T7 RNA聚合酶识别转录为crRNA，进而能够被CRISPR Cas13a所识别；

第四方面，本发明提供一种本发明第一方面的用于检测结核分枝杆菌TB DNA的crDNA在制备检测结核分枝杆菌试剂盒中的用途。

进一步的，所述用途包括结核病及其相关病症的检测诊断。

第五方面，本发明提供一种PCR扩增技术联合CRISPR-Cas13a系统在检测结核分枝杆菌中的方法中的应用。

所述的方法包括以下步骤：

S01提取待测样本的DNA作为检测模板；

S02检测模板通过设计的扩增靶点序列的引物进行扩增，得到目标靶序列DNA；

S03配制反应体系，震荡混匀反应体系，利用特异性的引物扩增靶点序列(经变性、退火、延伸过程)即S02中获得的目标靶序列DNA，设计能够扩增靶点序列的引物，并在引物的5’端加入一段T7转录序列，使得PCR扩增得到的双链DNA(dsDNA)可以被T7 RNA聚合酶识别并且进行转录生成ssRNA。

S04采用荧光定量PCR仪对扩增产物进行检测，根据荧光信号进行识别判断。

进一步的，所述提取待测样本的DNA作为检测模板，所述待测样本来源包括人呼吸道分泌物-痰液，支气管灌洗液，脓液等；

进一步的，所述扩增靶点序列的引物5’端加入一段T7转录序列，使得PCR扩增得到的目标靶序列DNA可以被T7 RNA聚合酶识别并且进行转录生成ssRNA；其中扩增靶点序列的引物包括：

TB_IS1081F ACAAAGCTTTCCAAGTCGCA(SEQ ID NO:12)；

TB_IS1081_R1 AATTCTAATACGACTCACTATAGGGCCCAGGATCTCTCGGTAGC

(SEQ ID NO:13)。

进一步的，所述采用荧光定量PCR仪对扩增产物进行检测中，所述扩增产物为本发明合成的ssRNA；

进一步的，可以识别靶序列的crRNA为本发明的crDNA序列通过T7 RNA聚合酶识别并且进行转录获得；

进一步的，所述crDNA序列选自SEQ ID NO:1-5。

本发明的有益效果：

本发明将PCR扩增技术和CRISPR-Cas13a检测技术相结合，通过提供的结核分枝杆菌TB DNA的crDNA，开发了一个简单、快速、稳定、不须昂贵设备即可进行结核分枝杆菌的筛检方式，对于即时快速结核病的诊断，具有高灵敏度、特异性强的特点。

附图说明

图1.CRISPR检测crRNA的筛选。

图2.CRISPR检测TB DNA灵敏度结果。

图3.CRISPR检测TB DNA特异度结果。

图4.CRISPR检测临床样本判读结果。

图5.采用CRISPR、xpert、痰培养和抗酸染色对临床样本检测

具体实施方式

Xpert MTB/RIF(以下简称Xpert)是由美国Cepheid公司在2009年开发的应用于结核病诊断和药物耐药性检测的新型分子生物检测测方法，该检测技术是基于PCR(Polymerase Chain Reaction)分子扩增技术的一种整合微流体测试系统，是集样本外理DNA提取核扩增结核分枝杆菌检测以及利福平耐药基因突变检测干一体的快速诊断结核病和结核病耐药的内方法，包括GeneXpert仪器，XpertMTB/RIF测试试剂盒，自动化反应程序(DNA扩增和荧光检测同时进行)及内部质控(样本处理质控和探针检查质控)。只需要将标本放入一次性容器后，在2h内可自动检测结核分枝杆菌，且该该技术使用5种分子信标，包含细菌RNA聚合酶B亚基的编码基因(ropB基因)81bp即利福平耐药核心区，能够检测ropB基因是否存在突变，判断利福平耐药性。2010年，世界卫生组织建议将Xpert用干艾滋病毒合并结核病患者的诊断。2014年，世界卫生组织指出，Xpert优于常规检测(包括常规显微镜检查、培养或组织病理学)。在本发明中，在使用本发明的方法进行灵敏度评价实施例中，选择抗酸染色、分支杆菌培养、Xpert进行参照实验，其本发明的灵敏度显著优于抗酸染色、分支杆菌培养的方法，和权威认可的Xpert实验数据相比，灵敏度相差无别，说明本方法也是一种比较快速且操作简单的新型检测方法。

本发明的引物是参考NCBI基因数据库的病原基因序列和在线Primer 3引物设计原则，设计和合成了多条引物。在设计过程中，避免形成引物二聚体、发卡结构等影响扩增产物效率因素，还考虑到影响T7转录效率问题。crDNA的选取设计在目标靶基因的不同位置，筛选与cas13a结合后，切割活性好、荧光信号强的crDNA，引物和crDNA的筛选实验表明，本发明的引物和crDNA特异性强、扩增效率高，可有效、快速地检测结核分枝杆菌。

本文所述术语“crRNA(CRISPR RNA)”为CRISPR相关RNA，crRNA通过5’端茎环结构与Cas13a识别并结合，靶ssRNA进入crRNA-Cas13a复合物内与crRNA发生碱基互补配对，诱发Cas13a发生构象变化，从而激活crRNA-Cas13a复合物的酶切活性，从而进一步降解靶RNA序列。在本发明中，所述“crRNA”是指在目标序列的不同位置选定crDNA序列，然后用PCR方法进行扩增，得到crDNA，通过T7转录成crRNA，在根据荧光信号进行crRNA的筛选。在一种实施例中，crRNA序列由结核分枝杆菌TB DNA的crDNA序列通过T7 RNA聚合酶识别转录为crRNA，以便于被cas13a识别结合后，发挥切割活性，同时还可对非目标RNA进行非特异剪切特性，具有信号放大的功能，从而实现低拷贝特定目标靶基因的高灵敏度检测。

本文所使用术语“ssRNA”ssRNA(single-stranded ribonucleic acid)是指由目标靶序列通过T7 RNA聚合酶生成的单链核糖核酸，在一种实施方式中，目标靶序列为结核分枝杆菌TB DNA的IS1081序列，设计能够扩增靶点序列的引物，并在引物的5’端加入一段T7转录序列，使得PCR扩增得到的双链DNA(dsDNA)可以被T7 RNA聚合酶识别并且进行转录(ssRNA)。

实施例1目标靶序列的引物设计与制备

1.1引物设计

参考NCBI基因数据库的病原基因特异性序列IS1081和在线Primer3引物设计原则，设计引物，得到目标靶序列；在目标靶序列扩增引物设计中，引物长度约为20-45nt，引物中带有T7转录所必须的共有序列5’-TAATACGACTCACTATA-3’。

结核分枝杆菌TB基因上游引物序列为TB_IS1081F ACAAAGCTTTCCAAGTCGCA；

下游引物序列TB_IS1081_R1为：

AATTCTAATACGACTCACTATAGGGCCCAGGATCTCTCGGTAGC，其中带有T7转录所必须的共有序列。

实施例2 crDNA的引物筛选预制备

2.1 crDNA的设计和筛选

在保守特异性序列IS1081的不同位置，分别设计多条crDNA和筛选下游引物，采用共用的上游引物，设计单链的DNA序列作为扩增模板，序列包含重复序列+靶点序列，设计上游引物包含T7序列5’-TAATACGACTCACTATA-3’和20nt的重复序列5’-GGGGATTTAGACTACCCCAA-3’，下游引物设计为靶序列3’端20nt左右的反向互补序列(表1)。

crRNA的5’端带有39nt的重复序列，该段序列可与LwCas13a蛋白结合，5’-GGGGAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAAC-3’，随后回收PCR扩增后的双链DNA比较不同crRNA的信号强弱，选择荧光信号最强的crRNA确定为检测方法中的crDNA和筛选后的下游引物，引物长度约为20-45nt，在靶序列IS1081不同位置设计多条引物，从中筛选出灵敏度高且特异性好的引物。

表1用于检测TB DNA的crDNA序列及引物

其中，粗体标示的序列分别为效果最好的crDNA及其crDNA的引物。

2.2crRNA的制备

采用表1中引物通过PCR扩增，回收PCR扩增后的双链DNA，Nanodrop分光光度计检测浓度后取1ug作为转录模板，使用T7 Quick High Yield RNA Synthesis kit转录得到crRNA。得到的crRNA利用AgencourtRNACleanXP磁珠进行纯化。过程如下所示：

将上述序列用ddH₂O稀释成10μM。配制PCR反应体系如表2所示：

表2 PCR扩增体系

设置PCR反应条件如下：

95℃5min；95℃30s；60℃30s；72℃15s；72℃10min；16℃+∞；38个循环

PCR产物进行回收(Tris-平衡酚溶液)，测浓度，取1μg产物使用T7转录试剂盒转录crRNA，体系如下表3：

表3 crRNA转录体系

注：*X为DNA模板体积。

上述体系混匀后，37℃转录过夜，使用DNaseⅠ去除多余的DNA，上一步得到的转录产物加入20μL无RNase的水，加入2μL DNaseⅠ，混匀，37℃孵育15min。

2.2crRNA的纯化

按照Agencourt RNA Clean XP说明书纯化转录的RNA：

磁珠振荡混匀，向转录产物中加入1.8倍体积的磁珠，涡旋30s，室温静置5min。将反应体系放到磁力架，静置5-10min以分离磁珠。轻轻吸出体系中的液体，避免磁珠被吸出，向磁珠中加入200μl 70％的乙醇(无RNase水配制)，室温孵育30s，吸出乙醇；重复此过程3次。室温晾干体系，去除体系中的乙醇。加入50μL RNase-free水，涡旋30s，吸出上清液，放入无RNase的1.5mL离心管中，Nanodrop测定纯化得到的crRNA浓度，-80℃分装备用。

2.3靶点ssRNA的制备和纯化

以结核分枝杆菌IS1081为检测的靶基因，克隆至载体pUC57上，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成质粒，来验证crRNA的特异性。并设计了扩增IS1081的引物，引物序列如下：

表4引物序列

经普通PCR扩增后，PCR产物经纯化、浓度检测后，转录、纯化得到相应的ssRNA。靶点DNA按照下述体系进行PCR扩增(50μL)：

表5靶点序列的PCR扩增体系

PCR扩增反应条件如下：

95℃5min；95℃20s；60℃20s；72℃20s；72℃10min；16℃+∞；36个循环；

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳DNA纯化回收试剂盒回收，测定浓度，按照如下体系进行转录，37℃转录过夜。

表6靶点RNA转录体系

注：*X为模板体积

转录后的产物ssRNA，经磁珠纯化，测定浓度备用。

2.4 crRNA的荧光检测

配制LwCas13a检测ssRNA的检测体系，靶点为TB ssRNA，crRNA使用上一步转录得到的IS1081-a，b，c，d，e检测荧光信号变化。结果显示：IS1081-b crRNA荧光信号最强，可作为检测方法的备用crRNA(图1)。

实施例2CRISPR检测TB DNA的灵敏度评价

将含有IS1081片段的质粒进行梯度稀释(10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹、100copies/uL)，每个模板取2μL，采用引物TB_IS1081F：ACAAAGCTTTCCAAGTCGCA和TB_IS1081_R1

AATTCTAATACGACTCACTATAGGGCCCAGGATCTCTCGGTAGC进行PCR扩增，取2uL产物上机检测荧光强度值，对检测的敏感度进行分析。结果所示(如图2)，10⁰-10⁶copies/μL的质粒扩增产物的荧光信号显著高于阴性对照，不同浓度模板对应10min时荧光信号与阴性对照相比，荧光强度均具有统计学差异(t检验，P<0.001)，说明在PCR扩增后10min内分辨出单拷贝的TB DNA。

实施例3 CRISPR检测TB DNA特异度评价

对戈登分枝杆菌、胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、鸟分枝杆菌、偶发分枝杆菌6种非结核分枝杆菌，结核分枝杆菌复合菌MTB及BCG和大肠杆菌、链霉菌提取基因组DNA后进行PCR扩增，取2uL产物上机检测荧光强度值，分析其检测的特异度。结果所示(如图3)：MTB扩增产物的荧光信号显著高于其它菌株及阴性对照，对MTB的检测具有良好的特异度。

实施例4建立检测结核分枝杆菌TB方法

1、收集临床样本

收集痰液、支气管灌洗液、脓液。收集条件为：支气管灌洗液226例，痰标本160例，脓液15例。经临床诊断确诊为结核病患者的临床样本为268例，非结核病患者为133例。

2、样本的核酸提取

采用煮沸法或自动化样本核酸提取仪，进行临床样本的核酸提取。

3、PCR扩增靶基因序列

采用引物TB_IS1081F：ACAAAGCTTTCCAAGTCGCA和TB_IS1081_R1

AATTCTAATACGACTCACTATAGGGCCCAGGATCTCTCGGTAGC进行PCR扩增，模板为提取临床样本DNA，模板为ddH₂O为阴性对照管，模板以BCG基因组为阳性对照组，采用MightyAmp^TMDNA Polymerase Ver.3(TaKaRa)进行靶基因的扩增。

4荧光检测

将上一步反应的产物2uL进行检测，体系如下表：

表7 CRISPR检测体系

体系放入荧光定量PCR仪，FAM通道检测荧光信号变化。设置37℃反应30s，37℃反应30s(收集荧光)，共30个循环。

5.CRISPR结果判定

阴性对照(NC)基本无荧光信号的变化，复孔检测结果基本一致；阳性对照(PC)荧光信号明显升高，满足以上两条说明实验结果可信。

阳性结果：检测结果以样品荧光信号与阴性对照具有显著性差异为阳性。阴性结果：样品荧光信号无明显升高，与阴性对照无显著性差异(图4)。

对上述401例临床样本检测结果进行了统计分析，结果如表9和图5所示：抗酸染色阳性的标本为130例，痰培养阳性的标本为192例，Xpert阳性的标本为260例，CRISPR阳性的标本为261例。灵敏度分别为48.5％，71.6％，97.0％，97.4％。同时对样本类型进行分类，对支气管灌洗液检测的灵敏度为39.3％，64.3％，99.1％，97.3％；对痰标本检测的灵敏度为39.3％，64.3％，99.1％,97.3％。以上结果说明：CRISPR对结核病的诊断灵敏度显著优于抗酸染色、分支杆菌培养的方法，和权威认可的Xpert实验数据相比，灵敏度相差无别，说明本方法也是一种比较快速且操作简单的新型检测方法，具有很好的灵敏度，对提高结核病的诊断具有重要意义。

表8抗酸染色、，痰培养、xpert、CRISPR这4种方法对临床样本检测的灵敏度和特异度比较

****McNemar test,P<0.0001；^####Fisher’s exact test,P<0.0001

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一组用于检测结核分枝杆菌TB DNA的crDNA序列，其特征在于所述crDNA序列可被T7转录生成crRNA，进而能够被CRISPR Cas13a所识别，所述crDNA选自如下序列：

IS1081-a crDNA

GGGGATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGGACTAAAACTTCGGACCCGCCCGCTCGATGCCGGCCC(SEQIN NO:1)

IS1081-b crDNA

GGGGATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGGACTAAAACCCCGCCCGCTCGATGCCGGCCCGTATAC(SEQIN NO:2)

IS1081-c crDNA

GGGGATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGGACTAAAACGCCCGCAGCGGCCTGGCAGCGCTGCAGA(SEQIN NO:3)

IS1081-d crDNA

GGGGATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGGACTAAAACCGCCAGGGCAGCTATTTCCCGGACTGGC(SEQIN NO:4)

IS1081-e crDNA

GGGGATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGGACTAAAACCGGACCCGCCCGCTCGATGCCGGCCCGT(SEQIN NO:5)。

2.一种基于结核分枝杆菌TB DNA单链的DNA序列作为扩增模板设计crDNA进行PCR扩增的引物，所述引物包含上游引物和下游引物，其中上游引物包含T7转录所需共有序列和20nt的重复序列，所述上游引物序列为：T7-crRNA-F：TAATACGACTCACTATAGGGGATTTAGACTACCCCAA(SEQ IN NO:6)；

所述下游引物选自如下序列：

IS1081-a-R：GGGCCGGCATCGAGCGGGCG(SEQ IN NO:7)；

IS1081-b-R：GTATACGGGCCGGCATCGAG(SEQ IN NO:8)；

IS1081-c-R：TCTGCAGCGCTGCCAGGCCG(SEQ IN NO:9)；

IS1081-d-R：GCCAGTCCGGGAAATAGCTG(SEQ IN NO:10)；

IS1081-e-R：ACGGGCCGGCATCGAGCGGG(SEQ IN NO:11)。

3.如权利要求1所述一种基于结核分枝杆菌TB DNA单链的DNA序列作为扩增模板设计crDNA进行PCR扩增的引物，其特征在于所述T7转录所需共有序列和20nt的重复序列是可以被T7 RNA聚合酶识别，进一步利用cas-13a识别靶序列及非特异性切割反应体系中的荧光报告RNA，具有使荧光检测信号放大的功能。

4.一种检测结核分枝杆菌的试剂盒，所述试剂盒包括用于检测结核分枝杆菌TB DNA的crDNA序列、以及将crDNA序列转录为crRNA的试剂，CRISPR Cas13a和荧光报告RNA，所述用于检测结核分枝杆菌TB DNA的crDNA选自如下序列：

IS1081-a crDNA

GGGGATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGGACTAAAACTTCGGACCCGCCCGCTCGATGCCGGCCC(SEQIN NO:1)

IS1081-b crDNA

GGGGATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGGACTAAAACCCCGCCCGCTCGATGCCGGCCCGTATAC(SEQIN NO:2)

IS1081-c crDNA

GGGGATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGGACTAAAACGCCCGCAGCGGCCTGGCAGCGCTGCAGA(SEQIN NO:3)

IS1081-d crDNA

GGGGATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGGACTAAAACCGCCAGGGCAGCTATTTCCCGGACTGGC(SEQIN NO:4)

IS1081-e crDNA

5.如权利要求4所述一种检测结核分枝杆菌的试剂盒，其特征在于所述crDNA序列可被T7 RNA聚合酶识别合成crRNA，进而能够被CRISPR Cas13a所识别。

6.一种用于检测结核分枝杆菌TB DNA的crDNA在制备检测结核分枝杆菌试剂盒中的用途。

7.如权利要求6所述一种用于检测结核分枝杆菌TB DNA的crDNA在制备检测结核分枝杆菌试剂盒中的用途。

8.一种PCR扩增技术联合CRISPR-Cas13a系统在检测结核分枝杆菌的方法中的应用；所述应用包括以下步骤：

S01提取待测样本的DNA作为检测模板；

S03配制反应体系，震荡混匀反应体系，以目标靶序列DNA在扩增靶点序列的引物下，通过PCR仪扩增得到的双链DNA(dsDNA)，

9.如权利要求8所述一种PCR扩增技术联合CRISPR-Cas13a系统在检测结核分枝杆菌中方法中的应用，其特征在于所述扩增靶点序列的引物5’端加入一段T7转录序列，使得PCR扩增得到的双链DNA(dsDNA)可以被T7 RNA聚合酶识别并且进行转录生成ssRNA；其中扩增靶点序列的引物包括：

上游引物TB_IS1081F ACAAAGCTTTCCAAGTCGCA(SEQ ID NO:12)；

下游引物TB_IS1081_R1

AATTCTAATACGACTCACTATAGGGCCCAGGATCTCTCGGTAGC(SEQ ID NO:13)。

10.如权利要求8所述一种PCR扩增技术联合CRISPR-Cas13a系统在检测结核分枝杆菌的方法中的应用，所述采用荧光定量PCR仪对扩增产物进行检测中，包括可以识别靶序列的crRNA，其为本发明的crDNA序列通过T7 RNA聚合酶识别并且进行转录获得，其crDNA序列包括SEQ IN NO:1-5。