CN104975098A - 一种常温等温荧光快速同时检测多核酸目标物的方法 - Google Patents

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CN104975098A CN201510420456.8A CN201510420456A CN104975098A CN 104975098 A CN104975098 A CN 104975098A CN 201510420456 A CN201510420456 A CN 201510420456A CN 104975098 A CN104975098 A CN 104975098A
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李贤祯
周国辉
程奇
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Abstract

本发明涉及一种常温等温荧光快速同时检测多核酸目标物的方法，包括恒温条件下，单链结合蛋白将多个模板双链的母链局部打开成单链；重组酶与多对引物结合成复合体，在辅助蛋白的作用下结合到母链上，多个荧光探针也与互补区域结合；DNA聚合酶结合到引物的3’末端，进行子链的延生；核酸外切酶识别双链状态下的多个荧光探针上的四氢呋喃位点，酶切后使荧光基团和淬灭基团得以分离，释放荧光；多个荧光探针被切断后，露出了原本被探针3'末端修饰所封闭掉的3'-OH端，DNA聚合酶可以继续延伸形成子链；通过检测扩增曲线的形状，和荧光信号的强弱，可对待测样本进行定性且半定量检测。本发明的可在常温且恒温的条件下同时对多个目标物进行定性且半定量测定。

Description

一种常温等温荧光快速同时检测多核酸目标物的方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及一种常温等温荧光快速同时检测多核酸目标物的方法，是一种在常温等温条件下，对多个核酸目标物同时进行快速、实时、特异性检测的方法，可在体外临床检测、食品安全、生物安全以及农业领域具有广阔的应用前景。
背景技术
核酸等温扩增技术是一类分子生物学技术的总称，它们能在某一特定温度下保持恒定，实现特定DNA或RNA片段拷贝数快速增加的过程。在核酸扩增技术领域里，以聚合酶链式反应(PCR)为代表的核酸非等温扩增技术，在过去的20年里，已在疾病的临床诊断方面，以其快速、灵敏和特异的优势，日益取代了传统的诊断方法，并也使一些之前无法完成的诊断成为可能。以微生物病原体的诊断为例，传统的金标法培养法与后续发展的免疫检测法，都存在检测时间过长、操作繁琐、以及灵敏性与特异性一般等缺点。但是PCR扩增可将原本需要几天，甚至半个月才获得结果的检测流程简化至1-2天，给临床诊断检测领域带来了质的飞越。
由于PCR是以物理反复式变温方式不断产生线性DNA模板进行扩增与复制，因此，其注定需依赖温度循环仪(thermocycler)实现检测。相比而言，核酸扩增技术的新分支，核酸等温扩增技术则具有更大的优势。因为此类扩增反应的全过程均在同一温度条件下进行，使对仪器的精密程度要求大大简化，反应时间也相应明显缩短。例如可通过金属浴、水浴锅、甚至是孵育箱或室温即可完成反应，因而它们更能满足现场、临床、突发性或应急性检测的需求，进而具有更大、更广泛的应用价值。
正是基于核酸等温扩增技术的广阔应用前景，世界各国都在此领域进行积极与广泛的研究。目前技术成熟且研究较多的核酸等温扩增技术主要包括以下几种：环介导核酸等温扩增技术(Loop mediated isothermal amplification,LAMP)，依赖于核酸序列的扩增技术(NASBA)，滚环扩增技术(RCA)，单引物等温扩增技术(SPIA)，依赖于解旋酶的等温扩增技术(HDA)，链替换扩增技术(SDA)，自主序列复制系统(3SR)与切刻内切酶核酸恒温扩增技术(NEMA)。但由于工作原理或引物设计原理的不同，其中仅有NASBA曾在同一反应管中实现过同时检测两种RNA的表达水平。此外，SDA法则是通过与微芯片技术相结合后，才实现了多重扩增。因此在同一检测管中，类似荧光定量PCR，通过荧光探针法在常温等温的条件下实现核酸的多重检测的案例，目前尚未见报道。
当前，荧光定量PCR或其多重反应，因具备实时检测、同时检出多项指标、高灵敏度和准确性等优点，成为体外分子诊断的主要技术之一，被广泛的应用到许多领域，例如临床疾病诊断、病原菌的检出、出入境动植物的检验检疫等。但是它对精密设备，即荧光定量PCR仪，的高度依赖性，使其主要集中在中心实验室内使用，未能帮助实验人员真正在现场实现核酸的快速检测。此外，由于荧光定量PCR仪的高精密性，使得整个实验设置过程相对复杂，因此不但实验操作，而且结果的解读也都需要受过专业训练的技术人员才能完成。这些缺点更让荧光定量PCR难以在基层检测实验室或单位推广，因而资源匮乏的边远地区则更不便于使用。
发明内容
本发明的目的是针对以上问题提供一种常温等温荧光快速同时检测多核酸目标物的方法，克服目前荧光PCR对精密仪器的依赖较大，且核酸等温扩增技术的PCR产物定量不够精确、目前尚不能实现同时检测多个目标物的问题。
本发明通过以下技术方案来实现：一种常温等温荧光快速同时检测多核酸目标物的方法，该方法包括以下步骤：
(1)单链结合蛋白将多个模板双链的母链局部打开成单链；
(2)重组酶与多对引物结合成复合体，在辅助蛋白的作用下结合到母链上，多个荧光探针也与互补区域结合，所述的多个荧光探针中部标记有四氢呋喃，四氢呋喃两侧分别为荧光基团和淬灭基团，荧光基团和淬灭基团之间间距为2-6nt，荧光探针3’末端标记阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团；
(3)DNA聚合酶结合到引物的3’末端，进行子链的延生；
(4)核酸外切酶识别双链状态下的多个荧光探针上的四氢呋喃位点，酶切后使荧光基团和淬灭基团得以分离，释放荧光；
(5)多个荧光探针被切断后，露出了原本被探针3'末端修饰所封闭掉的3'-OH端，DNA聚合酶可以继续延伸形成子链；
(6)通过检测扩增曲线的形状，和荧光信号的强弱，可对待测样本进行定性且半定量检测。
进一步的，所述的荧光探针长度为46-52nt。
进一步的，所述的荧光探针3’末端标记阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团为C3-spacer、磷酸基团、生物素、生物素-TEG或胺基中任意一种。
进一步的，所述的荧光基团为FAM、HEX、VIC、JOE、Texas Red、Cy3、Cy5或TAMRA中的任意一种。
进一步的，所述的淬灭基团为BHQ1或BHQ2。
进一步的，所述的重组酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，辅助蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，单链结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，核酸外切酶的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。
进一步的，所述的恒温条件为25-42度。
更详细的，本发明中：
多对引物，是针对多个核酸目标物分别设计的多条寡核苷酸，其特征是：每两条寡核苷酸组成一对引物，分别特异性识别一个核酸目标物的上下游核苷酸序列；长度在30-35核苷酸(nt)之间，序列中无回文序列、连续单碱基重复序列和内部二级结构区；引物Tm值不作为设计时主要考虑因素；最佳引物对需通过试验优化筛选出，其扩增产物为单一条带，无非特异性扩增和明显的引物二聚体；多对引物之间也不能相互形成结构牢固的寡核苷酸双链。
多个荧光探针(图1)，是针对多个核酸目标物分别设计的多条寡核苷酸长单链，其特征是：每条寡核苷酸单链专一性识别一个核酸目标物序列的中部，不与引物特异识别位点重叠；长度为46-52nt，序列避免回文序列、连续单碱基重复和内部二级结构；共有4个修饰位点，中部距离5’端约30nt位置标记一dSpacer，即四氢呋喃(THF)，作为核酸内切酶识别位点，由于识别位点仅为一个核苷酸，因此设计探针显得更为简单，也便于做多重检测时的探针设计；THF位点两侧分别标记一个荧光基团与一个淬灭基团，两基团间距为2-6nt；3’末端标记阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团，例如C3-spacer、磷酸基团、生物素、生物素-TEG或胺基；探针的Tm值不作为设计的主要考虑因素；荧光基团可从FAM、HEX、JOE、VIC、Texas Red、Cy3、Cy5或TAMRA中选择，淬灭基团可选择BHQ1或BHQ2，以最大限度地降低背景荧光噪音为原则。
重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶、辅助蛋白、与核酸外切酶，是经基因工程改造的重组工程酶，包括：1)均来源于天然菌中的有特定功能的活性蛋白，后经基因工程改造；2)在体外经化学试剂，例如IPTG，或温度的诱导后，在发酵培养的大肠杆菌细胞内可获得大量表达的目的蛋白；3)细胞破碎后，均经过两次蛋白纯化，例如镍柱纯化与肝素柱纯化，从而获得高纯度的单一蛋白；4)纯化后，蛋白经过酶活性鉴定测试，从而获得具有高活力单位的蛋白酶；5)重组酶，负责与引物分别形成起始反应复合物，可从大肠杆菌(E.coli)重组酶RecA或T4噬菌体重组酶uvsX等天然菌中选取；6)单链结合蛋白，负责结合DNA单链，并稳定解链时所形成的气泡区，可从E.coli或T4的gp32蛋白等天然菌中选取；7)DNA聚合酶，同时具备聚合活性与链置换活性，可从E.coli的DNA聚合酶I Klenow大片段、Bst聚合酶、Phi-29聚合酶、或枯草芽胞杆菌PolI(Bsu)等天然菌中选取；8)辅助蛋白，负责协助、促进并稳定起始反应复合物与DNA链间的结合，例如可选择T4的uvsY蛋白；9)核酸外切酶，负责识别探针与子链形成的带有切口的DNA双链，作用于切口处酶切探针，释放荧光基团的信号以便相应仪器检测到，例如可选择E.coli的核酸外切酶exoIII或exoIV。各种蛋白的序列详见序列表。
其它化学组分，是维持最适反应环境的多种化学成分的混合物，所含组分包括2-3％聚乙二醇(PEG)、20-30mMTris碱、90-110mM乙酸钾(KAc)、4-6mM二硫苏糖醇(DTT)、2-3mM三磷酸腺苷(ATP)、45-55mM磷酸肌酸二钠盐(PCr，Creatine phosphate disodiumsalt)、90-110ng/μl磷酸肌酶(CK，Creatine kinase)、200-250uM脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、5.5-6.5％海藻糖(Trehalose)、6-10％甘露醇(Mannitol)等；在反应中的功用包括保证最适盐离子浓度、酸碱浓度、提供反应所需能量、提供复制过程中所需原料、或抑制并保证冷冻干燥处理中反应组分的活性等。
冷冻干燥过程，是对配制的反应组分进行干化处理的一种流程，目的在于延长反应体系的使用期，并保证经运输后不影响反应活性，1)包括主干燥与再干燥两步骤；主干燥反应条件是-30～-40度，3-10小时；再干燥条件是10-20度，1-2小时；2)最佳的反应程序需根据实际干燥的试剂量再优化确定；3)冷冻干燥后的反应混合物状态为白色、干燥、粉末状物质，经双蒸水重悬后，能完全溶解，无任何固态残留。
从冷冻干燥后的反应混合物到最终检测，还需添加一些反应组分，以便将引物、探针、模板与反应混合物进行最终反应，在相应检测仪器上实现荧光检测，包括：1)5-6％的PEG、350-450nM引物、100-130nM荧光探针、一定浓度的模板、双蒸水与12-15mM醋酸镁；2)醋酸镁最后添加，起到启动反应作用；3)针对低浓度或低拷贝样品，建议在反应进行到3-4分钟时，进行一次手动或机械动颠倒或震荡混匀的操作，可大大增加低浓度样品的检出率和检测准确性；4)检测仪器可有多种选择：大型的荧光定量PCR仪，可满足高通量检测需求；小型便携的Twista或ESE Tube Scanner，可满足现场快速检测需要；多功能荧光酶标仪，也可满足部分检测需求。
该方法的工作原理(图2)，是一种能保证核酸物质在常温等温条件下快速扩增的反应机理：重组酶与引物形成起始复合物，该复合物在辅助蛋白的帮助下，有效地但非特别牢固地结合到DNA链上；因单链结合蛋白可结合DNA单链，故可形成局部气泡状区域，帮助打开DNA双链，进而方便起始复合物在DNA链上滑行并扫描；一旦复合物通过碱基互补配对原则找到匹配区域，重组酶从引物上脱落，同时DNA聚合酶介入，从引物的3’端进行子链的聚合与延伸；由于DNA聚合酶具有链置换活性，因此在子链的聚合过程中，子链会逐步将同源母链置换，进而与互补母链形成双链；由于置换子链与母链形成的双链完全不同于母链双链，置换子链的其中一端是从引物序列起始，所以起始复合物在第二轮扩增中，在此节省了链扫描时间，可直接或在更短时间内找到匹配的区域，因而能更快地进行子链合成；基本在第三或第四轮聚合过程中，仅以待测目标序列形成的双链开始成为主要模板，并以此为模板再进行的后续核酸扩增将会更快速；荧光检测时，因增加了核酸外切酶与荧光探针，因此在上述反应过程中，一旦子链开始生成，荧光探针也相应地结合到与之碱基互补的母链上，并嵌入新生成的子链中，此时核酸外切酶识别双链中的THF位点，进行酶切后将该位点两侧的荧光与淬灭基团分离，进而瞬时释放荧光信号，同时因探针的3’端修饰基团被切除后生成的新3’末端，就成为了DNA聚合酶继续合成的起点，所以不会影响子链与母链杂合双链的生成；同时因该杂合双链上携带有荧光基团，因此荧光检测设备记录的荧光信号与生成的子链在数量上是一一对应的，所以新方法记录的荧光信号也是累积荧光。
多个核酸目标物的同时快速检测，是指在同一反应管中完成多个核酸目标物的同时实时检出，其特征是：将多对引物(350-450nM)、多条荧光探针(100-130nM)、反应重悬缓冲液(5-6％PEG)、模板、双蒸水与醋酸镁(12-15mM)添加入冷冻干燥后的同一反应管中，使反应终体积为50ul；或者在冻干过程中，将引物、荧光探针和醋酸镁与其它反应组分一齐处理成干粉后，再用双蒸水、缓冲液与模板重悬干粉至50ul，从而完成反应体系的配制；随后将50ul反应总体系置于荧光检测设备，例如荧光定量PCR仪，或GenieII中，进行温育的同时，可完成多个核酸目标物的检测；针对低拷贝样本，如在反应进行至4-5分钟时，通过机械或人工的方式给反应体系一个混匀操作，将有助于提高其检测出率。
闭管检测，有效防止气溶胶污染，是指整个检测过程仅一次性加样，并且反应管在反应中和反应后均保持密闭，从而有效防止因大量扩增子所引发的假阳性干扰。
采用上述技术方案的积极效果：
1)常温等温反应：与几种主要的核酸等温扩增技术相比，常温反应只需在一个较低且恒定的温度下进行，因此检测仪器的选择也相对更灵活与简化。此外，常温的特色使与之匹配的检测设备具有更大空间进行小型化与微型化的发展，因此可适用于更广阔的领域，例如原位常温核酸扩增可在细胞级别进行分子检测，同时还能避免对细胞的损伤。
2)反应快速：因为常温等温反应是通过多种工程酶与其它化学组分的协同作用，最大化模拟生物体中核酸自然扩增的过程，因此反应速度更快。与荧光定量PCR相比，反应时间由大约1小时30分钟缩短到20-40分钟，明显提高了扩增效率。
3)多重检测：对于荧光定量PCR而言，多重检测很常见，但是对于核酸等温扩增技术来说，同样基于荧光探针的方法在同一反应管中进行多重检测则并不常见。更何况是在常温条件下，以极快的速度完成多项指标的检测，更使新方法具备了独特的应用优势。
4)实时监测：因荧光基团与新子链之间数量上一一对应，所以采集的荧光信号是累积的。此外，检测仪器每间隔一定时间采集一次荧光信号，因此随着时间的变化，可实时观测到累积信号的变化过程。再者，通过不同检测通道对不同荧光基团波长的区别分辨，在不同检测通道中同时监测不同目标物可以实现。
5)定性与定量检测：定性检测可依据扩增曲线的线型进行快速判断，S型表示阳性扩增，平直为无扩增。半定量检测可依据扩增曲线与阈值线交点(交点在横坐标对应的时间值)出现的先后，对待测样品中所含目标核酸的比例作出大致判断，例如时间值小的样品中的目标核酸量必定高于时间值大的样品。定量检测可通过对已知浓度样本的标准曲线绘制帮助完成。
6)检测准确且灵敏：一对引物与一条荧光探针可保证对一个核酸目标物的特异性识别，再利用不同荧光基团进行区别检测，因此准确且专一。已有实验数据表明，在20分钟内，单个核酸目标物检测时，灵敏度可达1.0×103拷贝/μl，达到～1.0fg/μl检测级别；双核酸目标物检测的灵敏度可达～10fg/μl；三核酸目标检测物可达～1.0pg/μl，但在40分钟内，三核酸检测的灵敏度可达～10fg/μl。基于此，本发明涉及的新方法已符合农产品检测要求，同时初步具备在临床样本上进行测试的基础与条件。
7)操作简便且结果解读简单：主要反应组分经过前期试剂配制后，已冻干成干粉状，在实际操作时只需添加相应样品(含核酸模板)、双蒸水和缓冲液等组分即可完成加样过程，所以对试验操作技巧要求不高，一般实验人员可完成。反应完成后的定性结果解读也简单直观，仅通过图形判断，也是普通技术人员可以实现的，因此新方法将更适于在基层检测单位进行推广。
8)应用面广：因具有常温、等温、多重、荧光、快速反应等特点，新方法既可适用目前的多种荧光检测设备，例如荧光定量PCR仪或酶标仪，也可适用于将来开发的小型便携式检测设备，例如已有的GenieII或ESE Tube Scanner，也可适用于将来的微流控分子检测平台。此外，由于是核酸检测技术，因此在临床诊断、病原体检测、食品安全与生物安全等领域将有巨大的应用潜力。
附图说明
图1是荧光探针结构图；
图中，红色F表示荧光基团，灰色Q表示淬灭基团，THF是中部的四氢呋喃位点，3’-block是3’末端修饰基团，2-6nt是荧光与淬灭基团之间的距离，+30nt是探针左臂的长度，46-52nt是探针的总长度，exoIII是一种核酸外切酶，特异识别THF位点，进行酶切，分离荧光与淬灭基团，释放荧光；
图2是新方法工作原理图；
图中，第一步，重组酶与引物分别形成起始复合物，开始模板扫描；第二步，引物找到匹配区域后，进行结合；第三步，在单链结合蛋白的帮助下，DNA聚合酶进入形成的气泡区，开始从3’端进行子链延伸，并在聚合酶的作用下，替换模板；第四步，在子链延伸过程中，荧光探针找到匹配区域，核酸外切酶E识别双链状态下的THF位点，酶切启动，荧光基团与淬灭基团分离；第五步，探针被E酶切后，荧光释放，子链继续从探针的3’端进行合成，并延伸，新双链生成；指数扩增的实现依赖于ATP提供能量，使5步不断循环继续；
图3是MTB-6110与IC在Twista仪器上进行的常温恒温双重荧光反应的扩增图谱；
图3-1是FAM检测通道下的扩增图，图3-2是TAMRA检测通道下的扩增图；绿色平直的样本是阴性样本，呈S型曲线的样本为阳性样本，共5次平行重复测试；
图4是MTB-6110、MTB-1081与HBB在ABI7500上进行的常温恒温三重荧光反应的扩增图谱；
图4-1是FAM检测通道下的扩增图，图4-2是Cy3检测通道下的扩增图，图4-3是Cy5检测通道下的扩增图；图中L8-L4分别表示每微升模板中所含目的基因拷贝数(108到104)，NTC是阴性对照。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，但不应理解为对本发明的限制：
本发明中使用的生物材料来源：
1.含有结核分枝杆菌复合菌群(MTB)的插入序列IS6110基因的质粒pUC57-6110，含有MTB插入序列IS1081基因的质粒pUC57-1081，含有人工合成序列IC的质粒pUC57-IC，以及含有人类血红蛋白β链(HBB)基因的质粒pUC57-HBB，均委托上海生工生物工程股份有限公司进行合成与制备。
2.扩增用引物与荧光探针，均委托上海生工生物工程股份有限公司进行合成。
实施例1
本实施例用于说明在Twista仪器上进行的常温恒温双重荧光反应。
1.根据NCBI GenBank与相关文献报道，从MTB的插入序列IS6110中选取了一段523bp的序列(SEQ ID No.6)进行基因合成，并克隆到载体pUC57中，制备成重组质粒pUC57-6110。
2.人工合成了一段141bp的核苷酸序列(SEQ ID No.7)，天然界中不存在，进行基因合成，也克隆到载体pUC57中，制备成重组质粒pUC57-IC。
3.基于引物与荧光探针设计原则，依据序列SEQ ID No.6与SEQ ID No.7设计了两对引物，分别是6110-F/R(SEQ ID No.8/9)与IC-F/R(SEQ ID No.10/11)；和两条荧光探针，分别是Pro-6110(SEQ ID No.12)与Pro-IC(SEQ ID No.13)。
SEQ ID No.6：
5’-CTCCGACCGACGGTTGGATGCCTGCCTCGGCGAGCCGCTCGCTGAACCGGATCGATGTGTACTGAGATCCCCTATCCGTATGGTGGATAACGTCTTTCAGGTCGAGTACGCCTTCTTGTTGGCGGGTCCAGATGGCTTGCTCGATCGCGTCGAGGACCATGGAGGTGGCCATCGTGGAAGCGACCCGCCAGCCCAGGATCCTGCGAGCGTAGGCGTCGGTGACAAAGGCCACGTAGGCGAACCCTGCCCAGGTCGACACATAGGTGAGGTCTGCTACCCACAGCCGGTTAGGTGCTGGTGGTCCGAAGCGGCGCTGGACGAGATCGGCGGGACGGGCTGTGGCCGGATCAGCGATCGTGGTCCTGCGGGCTTTGCCGCGGGTGGTCCCGGACAGGCCGAGTTTGGTCATCAGCCGTTCGACGGTGCATCTGGCCACCTCGATGCCCTCACGGTTCAGGGTTAGCCACACTTTGCGGGCACCGTAAACACCGTAGTTGGCGGCGTGGACGCGGCTGATGTGCTC-3’
SEQ ID No.7：
5’-ATCGCTGATCCGGCCACATATCGCGTTTATGCGAGGTCGGGTGGGCGGGTCGATAGATTCGTTTTGGGCATACATGGCCTTTGTCACCGAACCGTGATCTAGCCTACGGGTTATCGTTCGGGAGGGTTTCTTGATCCTAGC-3’
6110-F：5’-GTGGATAACGTCTTTCAGGTCGAGTACGC-3’(SEQ ID No.8)
6110-R：5’-CGCCGATCTCGTCCAGCGCCGCTTCGGAC-3’(SEQ ID No.9)
IC-F：5’-ATCGCTGATCCGGCCACATATCGCGTTTAT-3’(SEQ ID No.10)
IC-R：5’-GCTAGGATCAAGAAACCCTCCCGAACGATA-3’(SEQ ID No.11)
Pro-6110：
5’-CGAACCCTGCCCAGGTCGACACATAGGTGAGGTCTGCTACCCACAGCCGGTTA-3’，52nt，35位碱基T标记6-FAM，36位碱基G标记dSpacer，38位碱基T标记BHQ1，3’末端标记Biotin-TEG；(SEQ ID No.12)
Pro-IC：5’-AGATCACGGTTCGGTGACAAAGGCCATGTATGCCCAAAACGAATCT-3’，45nt，29位碱基T标记TAMRA，30位碱基A标记dSpacer，31位碱基T标记BHQ2，3’末端标记Biotin-TEG；(SEQ ID No.13)
4.利用冻干技术，将反应主要组分按如下体系进行配制，并制成干粉状后再进行后续试验：
Tris-Ac 5ul
E-mix 2.5ul
CK 100ng/ul
dNTP 235uM
海藻糖 6％
甘露醇 7％
PEG35000 2.3％
重组酶 0.28ug/ul
辅助蛋白 0.08ug/ul
单链结合蛋白 0.3ug/ul
DNA聚合酶 0.11ug/ul
核酸外切酶 95ng/ul
KAc 105mM
其中，Tris-Ac由0.6gTris碱、0.98g乙酸钾与250ul的2M DTT溶于10ml双蒸水中，pH调节到8.3配制获得。E-mix由0.3g ATP与2.55g PCr溶于10ml双蒸水中配制而得。
5.采用特异性引物6110-F/R与IC-F/R，荧光探针Pro-6110与Pro-IC，以含有SEQ IDNo.1的重组质粒pUC57-6110，和含有SEQ ID No.2的重组质粒pUC57-IC为模板进行双重荧光扩增与检测。扩增的反应体系为：
冻干粉反应试剂 1管
PEG35000 5％
6110-F 400nM
6110-R 400nM
Pro-6110 120nM
IC-F 300nM
IC-R 300nM
Pro-IC 80nM
模板 2μl
醋酸镁 14mM
双蒸水 补至50ul
扩增反应程序：39度恒温，20分钟。
结果如图3所示，图3-1，检测通道为FAM，用于检测双重反应中的IS6110目标序列；总共5次阳性重复，一次阴性对照；阳性品呈现为S型扩增曲线，扩增起始点均约在9-10分钟范围内，说明重复样品的重复性很好；阴性品呈现为平直线，说明没有任何明显扩增，因此阳性品的结果是有效的。
图3-2，检测通道为TAMARA，用于检测双重反应中的IC目标序列；同样总共5次阳性重复，一次阴性对照；阳性品呈现为S型扩增曲线，扩增起始点都在8-9分钟范围内，说明重复样品的重复性很好；阴性品呈现为平直线，说明为任何有效扩增，因此阳性品的结果有效；另外，同时反应的两目标物IS6110和IC可通过两不同检测通道而被检测到，同时该反应过程又是在常温恒温条件下进行，因此说明本发明提供的方法可在常温恒温条件下实现两个核酸目标物的同时、实时检测，并且重复性较好。
实施例2
本实施例用于说明在ABI7500仪器上进行的常温恒温三重荧光反应。
1.根据NCBI GenBank与相关文献报道，从MTB的插入序列IS1081中选取了一段600bp的序列(SEQ ID No.14)进行基因合成，并克隆到载体pUC57中，制备成重组质粒pUC57-1081。
2.根据NCBI GenBank与相关文献报道，从人类基因组中的HBB基因中选取了一段500bp的序列(SEQ ID No.15)进行基因合成，并克隆到载体pUC57中，制备成重组质粒pUC57-HBB。
3.基于引物与荧光探针设计原则，依据序列SEQ ID No.9与SEQ ID No.10设计了两对引物，分别是1081-F/R(SEQ ID No.16/17)与HBB-F/R(SEQ ID No.18/19)；和两条荧光探针，分别是Pro-1081(SEQ ID No.20)与Pro-HBB(SEQ ID No.21)。
SEQ ID No.14：
5’-GGGCAGGTAAGGCCGGTGGGCGTGTCGTAGCCCAGTAGTGGGCGGTCATCGCGTGATCCTTCGAAACGACCAGCAAAAGTCAATCGAAGGAAATGACGCAATGACCTCTTCTCATCTTATCGACACCGAGCAGCTTCTGGCTGACCAACTCGCACAGGCGAGCCCGGATCTGCTGCGCGGGCTGCTCTCGACGTTCATCGCCGCCTTGATGGGGGCTGAAGCCGACGCCCTGTGCGGGGCGGGCTACCGCGAACGCAGCGATGAGCGGTCCAATCAGCGCAACGGCTACCGCCACCGTGATTTCGACACCCGTGCCGCAACCATCGACGTCGCGATCCCCAAGCTGCGCCAGGGCAGCTATTTCCCGGACTGGCTGCTGCAGCGCCGCAAGCGAGCTGAACGCGCACTGACCAGCGTGGTGGCGACCTGCTACCTGCTGGGAGTATCCACTCGCCGGATGGAGCGCCTGGTCGAAACACTTGGTGTGACAAAGCTTTCCAAGTCGCAAGTGTCGATCATGGCCAAAGAGCTCGACGAAGCCGTAGAGGCGTTTCGGACCCGCCCGCTCGATGCCGGCCCGTATACCTTCCTCGCCGCCGA-3’
SEQ ID No.15：
5’-ACATTTGCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGCAACCTCAAACAGACACCATGGTGCATCTGACTCCTGAGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTGGTGAGGCCCTGGGCAGGTTGGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCATGTGGAGACAGAGAAGACTCTTGGGTTTCTGATAGGCACTGACTCTCTCTGCCTATTGGTCTATTTTCCCACCCTTAGGCTGCTGGTGGTCTACCCTTGGACCCAGAGGTTCTTTGAGTCCTTTGGGGATCTGTCCACTCCTGATGCTGTTATGGGCAACCCTAAGGTGAAGGCTCATGGCAAGAAAGTGCTCGGTGCCTTTAGTGATGGCCTGGCTCACCTGGACAACCTCAAGGGCACCTTTGCCACACTGAGTGAGCTGCACTGTGACAAGCTGCACGTGGATCCTGAGAACTTCAGGGTGAG-3’
1081-F：5’-CAGTAGTGGGCGGTCATCGCGTGATCCTTCGAAACGACC-3’(SEQ IDNo.16)
1081-R：5’-CTCGCCTGTGCGAGTTGGTCAGCCAGAAGCTG-3’(SEQ ID No.17)
HBB-F：5’-CATTTGCTTCTGACACAACTGTGTTCACTA-3’(SEQ ID No.18)
HBB-R：5’-TTGGTCTCCTTAAACCTGTCTTGTAACCTT-3’(SEQ ID No.19)
Pro-1081：
5’-CGATAAGATGAGAAGAGGTCATTGCGTCATTTCCTTCGATTGACTTTTGCT-3’，50nt，32位碱基T标记Cy3，33位碱基C标记dSpacer，35位碱基T标记BHQ1，3’末端标记Biotin-TEG；(SEQ ID No.20)
Pro-HBB：
5’-GCATCTGACTCCTGAGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAGGTG-3’，51nt，31位碱基T标记Cy5，32位碱基A标记dSpacer，34位碱基T标记BHQ2，3’末端标记Biotin-TEG；(SEQ ID No.21)
4.利用冻干技术，将反应主要组分按如下体系进行配制，并制成干粉状后再进行后续试验：
Tris-Ac 5ul
E-mix 2.5ul
CK 100ng/ul
dNTP 235uM
海藻糖 6％
甘露醇 7％
PEG35000 2.3％
重组酶 0.28ug/ul
辅助蛋白 0.08ug/ul
单链结合蛋白 0.3ug/ul
DNA聚合酶 0.11ug/ul
核酸外切酶 95ng/ul
KAc 105mM
其中，Tris-Ac由0.6gTris碱、0.98g乙酸钾与250ul的2M DTT溶于10ml双蒸水中，pH调节到8.3配制获得。E-mix由0.3g ATP与2.55g PCr溶于10ml双蒸水中配制而得。
5.采用特异性引物6110-F/R、1081-F/R与HBB-F/R，荧光探针Pro-6110、Pro-1081与Pro-HBB，以含有SEQ ID No.1的重组质粒pUC57-6110，含有SEQ ID No.9的重组质粒pUC57-1081，和含有SEQ ID No.10的重组质粒pUC57-HBB为模板，进行三重荧光扩增与检测。扩增的反应体系为：
冻干粉反应试剂 1管
PEG35000 5％
6110-F 460nM
6110-R 460nM
Pro-6110 140nM
1081-F 600nM
1081-R 600nM
Pro-1081 180nM
HBB-F 280nM
HBB-R 280nM
Pro-HBB 80nM
模板 3μl
醋酸镁 14mM
双蒸水 补至50ul
扩增反应程序：39度，3.5分钟；8-10次颠倒混匀；(39度，30秒；39度，30秒，采集荧光)，40循环。
结果如图4所示，图4-1，检测通道为FAM，用于检测三重反应中的IS6110目标核酸；L8-L4是模板浓度依次10倍梯度稀释的阳性模板，拷贝数分别为108-104拷贝/微升，NTC是阴性品；从图可见，随着阳性样本的拷贝数越来越低，其被检测的时间也越来越推迟，因此可用于半定量测定阳性样本的浓度高低。
图4-2，检测通道为Cy3，用于检测三重反应中的1081目标核酸；L8-L4是模板浓度依次10倍梯度稀释的阳性模板，拷贝数分别为108-104拷贝/微升，NTC是阴性品；从图可见，随着阳性样本的拷贝数越来越低，其被检测的时间也越来越推迟，因此可用于半定量测定阳性样本的浓度高低。
图4-3，检测通道为Cy5，用于检测三重反应中的HBB目标核酸；L8-L4是模板浓度依次10倍梯度稀释的阳性模板，拷贝数分别为108-104拷贝/微升，NTC是阴性品；从图可见，随着阳性样本的拷贝数越来越低，其被检测的时间也越来越推迟，因此可用于半定量测定阳性样本的浓度高低；此外，同时反应的三个目标物IS6110，1081，和HBB可通过三个不同检测通道而被检测到，同时该反应过程又是在常温恒温条件下进行，因此说明本发明提供的方法可在常温恒温条件下，实现三个核酸目标物的同时、实时检测，并且能通过扩增曲线的起始扩增点的数值大小，从而以半定量的形式推测出起始样本的浓度高低。

Claims (7)

1.一种常温等温荧光快速同时检测多核酸目标物的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：
(1)单链结合蛋白将多个模板双链的母链局部打开成单链；
(2)重组酶与多对引物结合成复合体，在辅助蛋白的作用下结合到母链上，多个荧光探针也与互补区域结合，所述的多个荧光探针中部标记有四氢呋喃，四氢呋喃两侧分别为荧光基团和淬灭基团，荧光基团和淬灭基团之间间距为2-6nt，荧光探针3’末端标记阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团；
(3)DNA聚合酶结合到引物的3’末端，进行子链的延生；
(4)核酸外切酶识别双链状态下的多个荧光探针上的四氢呋喃位点，酶切后使荧光基团和淬灭基团得以分离，释放荧光；
(5)多个荧光探针被切断后，露出了原本被探针3'末端修饰所封闭掉的3'-OH端，DNA聚合酶可以继续延伸形成子链；
(6)通过检测扩增曲线的形状，和荧光信号的强弱，可对待测样本进行定性且半定量检测。
2.根据权利要求1所述的常温等温荧光快速同时检测多核酸目标物的方法，其特征在于：所述的荧光探针长度为46-52nt。
3.根据权利要求1所述的常温等温荧光快速同时检测多核酸目标物的方法，其特征在于：所述的荧光探针3’末端标记阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团为C3-spacer、磷酸基团、生物素、生物素-TEG或胺基中任意一种。
4.根据权利要求1所述的常温等温荧光快速同时检测多核酸目标物的方法，其特征在于：所述的荧光基团为FAM、HEX、VIC、JOE、Texas Red、Cy3、Cy5或TAMRA中的任意一种。
5.根据权利要求1所述的常温等温荧光快速同时检测多核酸目标物的方法，其特征在于：所述的淬灭基团为BHQ1或BHQ2。
6.根据权利要求1所述的常温等温荧光快速同时检测多核酸目标物的方法，其特征在于：所述的重组酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，辅助蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，单链结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，核酸外切酶的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。
7.根据权利要求1所述的常温等温荧光快速同时检测多核酸目标物的方法，其特征在于：所述的恒温条件为25-42度。
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