CN107385089B - 一种检测隐孢子虫卵囊的核酸组合、试剂盒以及方法 - Google Patents

一种检测隐孢子虫卵囊的核酸组合、试剂盒以及方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种检测隐孢子虫卵囊的核酸组合、试剂盒以及方法，涉及生物技术领域。该核酸组合包括：SEQ ID NO.1所示的上游引物、SEQ ID NO.2所示的下游引物、以及SEQ ID NO.3所示的荧光探针。该检测隐孢子虫卵囊的方法，包括：采用上述核酸组合进行RPA反应。该核酸组合通过RPA技术可快速、特异、灵敏的检测样品中的隐孢子虫卵囊。该方法无需调整温度，检测时间短，且检测限低、特异性强，没有假阳性。

Description

一种检测隐孢子虫卵囊的核酸组合、试剂盒以及方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种检测隐孢子虫卵囊的核酸组合、试剂盒以及方法。
背景技术
隐孢子虫病是由隐孢子虫引发的人兽共患传染病，症状通常于感染后7天左右出现，包括腹痛、水泻、呕吐及发热。大部分患者的病症持续6-10天，但也有可能会持续数星期。免疫功能低下患者病情可能非常严重，甚至威胁生命。隐孢子虫可以感染包括人在内的280多种动物，其卵囊广泛存在于动物和环境中，常通过水或食物传播造成大规模暴发流行，存在较高的公共安全风险，对人和动物健康造成严重威胁。因此，快速、简便、准确的发现隐孢子虫是防治该病的关键。
目前，隐孢子虫感染的检测，主要有三种方法：镜检法、ELISA法和分子生物学法。其中，常规镜检法是通过形态学区别鉴定来检测，实际操作时粪便中干扰成分很多，如果不是经验丰富的检测者，很难从粪渣中分辨出隐孢子虫卵囊，虽然经过染色后容易分辨一些，其结果的准确性仍然依赖于检测者经验。ELISA法，由于其检测的是抗体，而不是抗原本身，通常不用于临床样本的检测，而是用于流行病学调查和特殊人群抗体监测；该法检测到抗体的存在，不代表现症感染，而且存在可能的假阳性或假阴性。分子生物学法，主要为PCR，即聚合酶链式反应，该法由于需要不断变性、复性、延伸，循环往复，温度需要不断调整，而温度调整的过程，使得整个反应时间延长近一倍。
另外，新近出现了LAMP等温扩增方法，该方法不同于PCR，使用4-6条引物，不需要不断变性、复性、延伸，循环往复，不需要调整温度，将反应时间缩短二分之一到三分之一。LAMP法需要62-65℃的高温，并需要85℃的高温终止反应，需要特殊的加热装置，因为其需要在相对精准的温度下反应1小时。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种检测隐孢子虫卵囊的核酸组合，该核酸组合通过RPA技术可快速、特异、灵敏的检测样品中的隐孢子虫卵囊。
本发明的第二目的在于提供一种上述核酸组合的应用。
本发明的第三目的在于提供一种检测隐孢子虫卵囊的试剂盒。
本发明的第四目的在于提供一种检测隐孢子虫卵囊的方法，该方法采用RPA等温扩增技术，无需调整温度，检测时间短，且检测限低、特异性强，没有假阳性。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种检测隐孢子虫卵囊的核酸组合，其包括：SEQ ID NO.1所示的上游引物、SEQID NO.2所示的下游引物、以及SEQ ID NO.3所示的荧光探针。
一种上述核酸组合在制备隐孢子虫卵囊的检测试剂中的用途。
一种检测隐孢子虫卵囊的试剂盒，其包括上述核酸组合。
一种检测隐孢子虫卵囊的方法，其包括：采用上述核酸组合进行RPA反应。
与现有技术相比，本发明的有益效果例如包括：
本公开内容提供的核酸组合，利用RPA等温扩增技术可实现快速、特异、灵敏的检测样品中的隐孢子虫卵囊。相应地，本公开内容提供的检测隐孢子虫卵囊的方法，具有以下优点：
(1)该方法的检测对象是隐孢子虫的18S rRNA基因组DNA，隐孢子虫该基因DNA具有保守、稳定的特点，而本发明提供的核酸组合中的上游引物和下游引物以及荧光探针是针对该保守序列设计的，因此RPA扩增产物也具有特异和稳定的特点，从而使得该方法无需依赖于对形态学经验的积累，而只需要学会简单的DNA操作即可掌握。
(2)该方法是针对病原学的检测，阳性结果即代表现症感染，由于引物和探针的特异性，基本没有假阳性，检测结果的准确度高。
(3)该方法采用等温扩增技术，为常温反应(35-45℃)，在一个温度范围内即可进行有效扩增，不需要精确的温度，因此无需特殊的加热装置，更无需像采用PCR检测时反复调整温度等繁琐程序，且检测时间大幅减少，可实现高效检测。
(4)该方法所使用的仪器都是常规仪器，离心机和恒温水浴锅或者其他恒温设备，无需昂贵的PCR仪设备，成本大大降低。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为实施例1中提供的荧光探针的结构示意图；
图2为实施例3中提供的使用该检测方法对不同浓度的模板DNA的检测结果；
图3为实施例4中提供的使用该检测方法对临床粪便样品检测结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例提供的一种检测隐孢子虫卵囊的核酸组合、试剂盒以及方法进行具体说明。
重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)技术是一种新兴的核酸恒温扩增技术，相比于传统的PCR技术，这种核酸恒温扩增技术具有高灵敏度高、特异性强、反应快速等特点。鉴于此，发明人利用RPA技术检测隐孢子虫卵囊。
一方面，本实施方式提供一种检测隐孢子虫卵囊的核酸组合，其包括：SEQ IDNO.1所示的上游引物、SEQ ID NO.2所示的下游引物、以及SEQ ID NO.3所示的荧光探针。
上游引物(CRYF1)的碱基序列为：5’-cagcaggcgcgcaaattacccaatcctaatac-3’(SEQ ID NO.1)；
下游引物(CRYR1)的碱基序列为：5’-caccagacttgccctccaattgatacttgt-3’(SEQID NO.2)。
荧光探针(CRYP1)的碱基序列为：5’-ggtagtgacaagaaataacaatacaggact[dTR][THF]t[dTQ]ggttttgtaattgga-3’磷酸化(SEQ ID NO.3)。
其中，在荧光探针的碱基序列中，[THF]为THF残基；[dTR]表示被荧光发光基团标记的胸腺嘧啶脱氧核苷酸；[dTQ]表示被荧光淬灭基团标记的胸腺嘧啶脱氧核苷酸。
进一步地，荧光探针具有荧光发光基团和荧光淬灭基团，荧光发光基团和荧光淬灭基团配对使用，选自FAM和BHQ-1、HEX和BHQ-1、TET和BHQ-1、Cy3和BHQ-2、Cy5和BHQ-2、TAMRA和BHQ-2中的任意一组，在本实施方式较为具体的实施例中，荧光发光基团和荧光淬灭基团分别为FAM和BHQ-1。
本实施方式提供的核酸组合是通过生物信息学分析隐孢子虫及其同属近缘寄生虫的基因序列差异，基于隐孢子虫分离GZ155 18s tRNA序列(GenBank登录号：KU198182.1)设计得到的。
采用本实施方式提供的核酸组合，通过RPA技术，可快速、特异、灵敏的检测样品中的隐孢子虫卵囊。
另一方面，本实施方式提供一种上述核酸组合在检测隐孢子虫卵囊的检测试剂中的用途。
另一方面，本实施方式提供一种检测隐孢子虫卵囊的试剂盒，其包括上述核酸组合。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述试剂盒还包括：重组酶、单链DNA结合蛋白、链置换DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+和用于等温扩增反应的缓冲液。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述重组酶为能结合单链核酸的重组酶。
另一方面，本发明还提供一种检测隐孢子虫卵囊的方法，其包括：采用上述核酸组合进行RPA反应。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，该RPA反应的反应体系包括：核酸组合、重组酶、单链DNA结合蛋白、链置换DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+和用于等温扩增反应的缓冲液。
可选地，在本发明的一些实施方案中，50μL的RPA反应总体系包括：29.5μL的TwistAmp Buffer，2.1μL的上游引物，2.1μL的下游引物，0.6μL的探针，13.2μL的样本DNA/水，2.5μL的280mM MgOAc。进一步可选的，反应体系在孵育前及孵育第4～5分钟均混匀1次。
进一步地，RPA反应的反应条件为：37～42℃下孵育15～25min后终止；或者为在38～40℃下孵育18～23min后终止；或者为在38～39℃下孵育20min后终止；或者为在39℃下孵育20min后终止。
进一步的，该RPA反应的反应体系按下面程序反应：加好反应体系，震荡10*25秒，开始收集反应液的荧光强度，每隔10～30秒收集一次荧光强度；4～5min时取出反应液，于1400～1600rmp下震荡10～20秒，离心后继续收集反应液的荧光强度，直至反应结束。
更为具体地，将该反应体系放在Twista仪器上孵育，37～42度，并用TwistaStudio软件在反应过程中每20s实时检测荧光值。
进一步地，将RPA反应过程中检测到的荧光强度与反应时间作图，当荧光强度呈对数曲线上升时，即为阳性，表明样品中存在隐孢子虫卵囊。
本实施方式提供的检测隐孢子虫卵囊的方法，具有以下优点：(1)该方法的检测对象是隐孢子虫的18S rRNA基因组DNA，隐孢子虫该基因DNA具有保守、稳定的特点，而本发明提供的核酸组合中的上游引物和下游引物以及荧光探针是针对该保守序列设计的，因此RPA扩增产物也具有特异和稳定的特点，从而使得该方法无需依赖于对形态学经验的积累，而只需要学会简单的DNA操作即可掌握。(2)该方法是针对病原学的检测，阳性结果即代表现症感染，由于引物和探针的特异性，基本没有假阳性，检测结果的准确度高。(3)该方法采用等温扩增技术，为常温反应(35-45℃)，在一个温度范围内即可进行有效扩增，不需要精确的温度，因此无需特殊的加热装置，更无需像采用PCR检测时反复调整温度等繁琐程序，且检测时间大幅减少，可实现高效检测。(4)该方法所使用的仪器都是常规仪器，离心机和恒温水浴锅或者其他恒温设备，无需昂贵的PCR仪设备，成本大大降低。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述：
实施例1
本实施例提供一种检测隐孢子虫卵囊的核酸组合，其包括：SEQ ID NO.1所示的上游引物、SEQ ID NO.2所示的下游引物、以及SEQ ID NO.3所示的荧光探针。
上游引物(CRYF1)的碱基序列为：5’-cagcaggcgcgcaaattacccaatcctaatac-3’(SEQ ID NO.1)；
下游引物(CRYR1)的碱基序列为：5’-caccagacttgccctccaattgatacttgt-3’(SEQID NO.2)。
荧光探针(CRYP1)的碱基序列为：5’-ggtagtgacaagaaataacaatacaggact[dTFAM][THF]t[dTBHQ1]ggttttgtaattgga-3’磷酸化(SEQ ID NO.3)。
其中，在荧光探针的碱基序列中，[THF]为THF残基；[dTFAM]表示被荧光发光基团FAM标记的胸腺嘧啶脱氧核苷酸；[dTBHQ1]表示被荧光淬灭基团BHQ1标记的胸腺嘧啶脱氧核苷酸，该荧光探针的结构如图1所示。
按照上述序列进行引物和探针合成，即可进行RPA检测。采用本实施例提供的核酸组合，通过RPA技术，可快速、特异、灵敏的检测样品中的隐孢子虫卵囊。
实施例2
本实施例提供一种检测隐孢子虫卵囊的方法，其包括以下步骤：
1.配制50μL的RPA反应体系：29.5μL的TwistAmp Buffer，2.1μL的上游引物，2.1μL的下游引物，0.6μL的探针，13.2μL的样本DNA/水，2.5μL的280mM MgOAc。反应体系在孵育前及孵育第4分钟均混匀1次。
2.按照如下程序进行RPA反应：将反应体系震荡10*25秒，于39℃下恒温孵育20min，并在反应开始时收集反应液的荧光强度，每20秒收集一次荧光强度，4分钟时取出反应液于1500rmp下震荡15秒，离心后继续收集荧光强度，直至20分钟反应结束。
3.结果分析：将RPA反应过程中检测到的荧光强度与反应时间作图，当荧光强度呈对数曲线上升时，即为阳性，表明样品中存在隐孢子虫卵囊；否则，即为阴性，表明样品中没有隐孢子虫卵囊。
实施例3
本实施例对实施例2提供的检测方法的灵敏度进行验证：
合成18S rRNA基因，克隆到T载体，提取质粒DNA，测定浓度，倍比稀释为不同浓度作为模板DNA，采用实施例2提供的检测方法对检出限进行测定。
结果如图2所示，用50μL反应体系，选择FAM为17％，可以在10min之内明显区分107-104拷贝/毫升的阳性质粒与阴性水对照，20min内明显区分103拷贝/毫升的阳性质粒与阴性水对照，30min内明显区分102拷贝/毫升的阳性质粒与阴性水对照，101拷贝/毫升的阳性质粒与阴性对照都没有明显扩增曲线，所以该条件下最低检测限为102拷贝/毫升，说明该方法检测隐孢子虫卵囊的灵敏度高。
实施例4
临床粪便样品中的隐孢子虫卵囊进行检测：
用实施例2提供的检测方法检测4份临床粪便样品，同时用镜检做对照。
结果如图3所示，镜检结果为阴性，即表明该临床粪便样品中无隐孢子虫卵囊；而采用实施例2的RPA检测结果则呈现阳性扩增反应，即反应液的荧光强度呈对数扩增曲线。由此说明，本发明提供的检测方法灵敏度高，可用于临床样品的检测。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (4)

1.一种检测隐孢子虫卵囊的核酸组合，其特征在于，其包括：SEQ ID NO.1所示的上游引物、SEQ ID NO.2所示的下游引物、以及SEQ ID NO.3所示的荧光探针；所述荧光探针具有荧光发光基团和荧光淬灭基团，所述荧光发光基团和所述荧光淬灭基团配对使用并选自FAM和BHQ-1、HEX和BHQ-1、TET和BHQ-1、Cy3和BHQ-2、Cy5和BHQ-2、TAMRA和BHQ-2中的任意一组。
2.一种检测隐孢子虫卵囊的试剂盒，其特征在于，其包括如权利要求1所述的核酸组合。
3.根据权利要求2所述的检测隐孢子虫卵囊的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：重组酶、单链DNA结合蛋白、链置换DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+和用于等温扩增反应的缓冲液。
4.根据权利要求3所述的检测隐孢子虫卵囊的试剂盒，其特征在于，所述重组酶为能结合单链核酸的重组酶。
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