CN117568501A - 基于实时荧光定量pcr技术检测蛇源隐孢子虫的引物探针组合、试剂盒及方法 - Google Patents
基于实时荧光定量pcr技术检测蛇源隐孢子虫的引物探针组合、试剂盒及方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117568501A CN117568501A CN202410054356.7A CN202410054356A CN117568501A CN 117568501 A CN117568501 A CN 117568501A CN 202410054356 A CN202410054356 A CN 202410054356A CN 117568501 A CN117568501 A CN 117568501A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- real
- quantitative pcr
- cryptosporidium
- snake
- detecting
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000000523 sample Substances 0.000 title claims abstract description 58
- 241000223935 Cryptosporidium Species 0.000 title claims abstract description 43
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 title claims abstract description 29
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 17
- 241000270295 Serpentes Species 0.000 claims abstract description 48
- 241000223936 Cryptosporidium parvum Species 0.000 claims abstract description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 19
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 16
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 13
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims description 12
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 9
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 6
- 238000010791 quenching Methods 0.000 claims description 6
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 claims description 6
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 5
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 5
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 5
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 claims description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 4
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 4
- UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 4-[4-[[2,5-dimethoxy-4-[(4-nitrophenyl)diazenyl]phenyl]diazenyl]-n-methylanilino]butanoic acid Chemical compound COC=1C=C(N=NC=2C=CC(=CC=2)N(C)CCCC(O)=O)C(OC)=CC=1N=NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 3
- 125000006853 reporter group Chemical group 0.000 claims description 3
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 2
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 claims description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 4
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 abstract description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 abstract description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 208000008953 Cryptosporidiosis Diseases 0.000 description 5
- 206010011502 Cryptosporidiosis infection Diseases 0.000 description 5
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 4
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 241000224482 Apicomplexa Species 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 241000270322 Lepidosauria Species 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 206010042674 Swelling Diseases 0.000 description 1
- 206010047700 Vomiting Diseases 0.000 description 1
- 208000022531 anorexia Diseases 0.000 description 1
- 229910052788 barium Inorganic materials 0.000 description 1
- DSAJWYNOEDNPEQ-UHFFFAOYSA-N barium atom Chemical compound [Ba] DSAJWYNOEDNPEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010364 biochemical engineering Methods 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 206010061428 decreased appetite Diseases 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 210000003250 oocyst Anatomy 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010837 poor prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 210000004215 spore Anatomy 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000008673 vomiting Effects 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
- 208000016261 weight loss Diseases 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6893—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for protozoa
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6851—Quantitative amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/90—Protozoa ; Processes using protozoa
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明基于实时荧光定量PCR技术提供一种检测蛇源隐孢子虫的引物探针组合、试剂盒及方法。所述引物探针组合包括正向引物、反向引物和探针,核苷酸序列如SEQ ID NO:1‑3所示。本发明提供的引物探针组合能够特异性检测样本中蛇源隐孢子虫,具有耗时短、特异性好、重复性好、灵敏度高的特点,便于快速准确地检测蛇源隐孢子虫,有利于蛇类养殖产业发展。
Description
技术领域
本发明所属生物检测领域,特别是涉及一种基于实时荧光定量PCR技术检测蛇源隐孢子虫的引物探针组合、试剂盒及方法。
背景技术
蛇源隐孢子虫属于顶复门隐孢子虫属, 虽然在其他爬行动物中也能检出,但是其主要感染蛇,寄生于蛇胃组织的上皮细胞。隐孢子虫属在感染宿主后的病症表现具有自限性,病况因宿主不同差异很大。蛇源隐孢子虫在感染蛇后8~28周可在粪便中发现卵囊,通常不表现明显的临床症状,一旦出现躯体中部肿胀、呕吐、厌食和体重减轻等,预后不良,死亡率较高。
近年来,由于观赏性蛇和药用蛇的需求不断加大,并伴随着抽屉式饲养箱的广泛应用,使得人工饲养蛇类的养殖密度和养殖规模均大幅增加。在缺乏相应检疫措施的情况下,蛇隐孢子虫病的发病率也在不断升高。同时,由于蛇源隐孢子虫症状急促,感染后很快发病死亡,给蛇类养殖业造成很大损失,因此,做好蛇隐孢子虫日常监测对于促进蛇类养殖业的健康发展具有重要的现实意义。
研究表明,在蛇样本中,除了蛇源隐孢子虫,还能同时检测到其他隐孢子虫属,如鼠隐孢子虫、泰式隐孢子虫和小隐孢子虫等,这类隐孢子虫可能是在蛇捕获的猎物中感染,通常对蛇不具有致病性,因此,研发一款快速的、特异性好的检测蛇源隐孢子虫的试剂成了防治蛇隐孢子虫感染的关键。
现有技术中,对于隐孢子虫病的诊断方法主要有钡剂造影、胃活检、抗酸染色、免疫荧光染色、血清抗体效价测定和PCR检测等,然而,现有的检测方法耗时长、结果准确性差,更重要的缺陷是不能区分蛇源隐孢子虫种和其他隐孢子虫种。
因此,本领域亟需一种耗时短、特异性高、重复性好、灵敏度高的蛇源隐孢子虫检测试剂及检测方法,为诊断蛇源隐孢子虫提供可靠的实验依据。
发明内容
为解决上述技术问题,本发明提供一种基于实时荧光定量PCR技术检测蛇源隐孢子虫的引物探针组合,其特征在于,所述引物探针组合包括正向引物、反向引物和探针,所述正向引物、反向引物和探针的核苷酸序列如下:
正向引物:5’-AACTGTTCAAGGTGATATGACAC-3’,如SEQ ID NO:1所示;
反向引物:5’-ATTCCTTTGTCTCACCTAAGTAGAT-3’,如SEQ ID NO:2所示;
探针:5’-CCATTCAAGGTTTGTCGTGGCCCAA-3’,如SEQ ID NO:3所示,所述探针中,5’端标记有荧光报告基团,3’端标记有荧光淬灭基团。
具体地,所述荧光报告基团选自FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas RED或LCRED460中任意一种,所述荧光淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3或MGB中任意一种。
本发明的第二方面,提供一种前述的基于实时荧光定量PCR技术检测蛇源隐孢子虫的探针组合在制备检测蛇源隐孢子虫试剂盒中的应用。
本发明的第三方面,提供一种基于实时荧光定量PCR技术检测蛇源隐孢子虫的试剂盒,所述试剂盒包括PCR反应液、酶混合液、阴性对照和阳性对照,所述PCR反应液包括检测蛇源隐孢子虫的引物探针组合,所述引物探针组合包括正向引物、反向引物和探针,所述正向引物、反向引物和探针的核苷酸序列如下:
正向引物:5’-AACTGTTCAAGGTGATATGACAC-3’,如SEQ ID NO:1所示;
反向引物:5’-ATTCCTTTGTCTCACCTAAGTAGAT-3’,如SEQ ID NO:2所示;
探针:5’-CCATTCAAGGTTTGTCGTGGCCCAA-3’,如SEQ ID NO:3所示,所述探针中,5’端标记有荧光报告基团,3’端标记有荧光淬灭基团。
具体地,所述荧光报告基团选自FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas RED或LCRED460中任意一种,所述BHQ1、BHQ2、BHQ3或MGB中任意一种。
具体地,所述PCR反应液还包括MgCl2、Tris、BSA和dNTPs。
具体地,所述酶混合液包括DNA聚合酶和热启动修饰抗体。
具体地,所述正向引物和反向引物的浓度均为0.1-1.0μM,所述探针的浓度为0.3μM。
具体地,所述MgCl2的浓度为1-5mM,所述Tris的浓度为30-70mM,所述BSA的浓度为100-400mg/L,所述dNTPs的浓度为10-100μM。
具体地,所述DNA聚合酶的浓度为5-10U/μL,所述热启动修饰抗体的浓度为1-5U/μL。
具体地,所述阳性对照为蛇源隐孢子虫阳性样本,所述阴性对照为超纯水。
本发明的第四方面,提供一种非诊断目的的基于实时荧光定量PCR技术检测蛇源隐孢子虫的方法,包括步骤:
1)提取待测样本总DNA;
2)制备反应体系,所述反应体系包括前述的引物探针组合、酶混合液、MgCl2、Tris、BSA和dNTPs;
3)以提取的待测样本总DNA为模板,同时添加阴性对照、阳性对照为质控模板,进行实时荧光定量PCR反应;
4)反应结束,根据Ct值判定检测结果。
具体地,所述实时荧光定量PCR反应的程序为:
Step1:95℃,5min;
Step2:95℃,10s,57℃,25s;
Step2执行40个循环。
有益效果:
本申请设计出用于实时荧光定量PCR的正逆向引物以及探针,能够快速且准确地检测出待测样本中蛇源隐孢子虫基因,特别适用于检测生物制药原料和产品,灵敏度高、特异性好。
本发明提供的引物探针组合、试剂盒及其检测方法,能够有效区分其他孢子虫与蛇源隐孢子虫,特异性好、实用性高,能够良好应用于蛇类隐孢子虫病的及时检测与防治,对于蛇类养殖产业的健康发展具有重要意义。
附图说明
图1为实施例2中,检测阳性样本的上机结果图。
图2为实施例3中,质粒线性扩增的上机结果图。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述,显然,所描述的实施例是本发明的一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例示出一种基于实时荧光定量PCR技术检测蛇源隐孢子虫的引物探针组合,包括正向引物、反向引物和探针,核苷酸序列如下:
正向引物:5’-AACTGTTCAAGGTGATATGACAC-3’,如SEQ ID NO:1所示;
反向引物:5’-ATTCCTTTGTCTCACCTAAGTAGAT-3’,如SEQ ID NO:2所示;
探针:5’-CCATTCAAGGTTTGTCGTGGCCCAA-3’,如SEQ ID NO:3所示。
探针的5’端标记有荧光报告基团FAM,探针的3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1。
本实施例还示出一种基于实时荧光定量PCR技术检测蛇源隐孢子虫的试剂盒,包括PCR反应液、酶混合液、阴性对照、阳性对照。
其中,PCR反应液包括如上所述的检测蛇源隐孢子虫的引物探针组合物、0.25μM的正向引物、0.25μM的反向引物、0.3μM的探针、2mM的MgCl2、70mM的Tris、300mg/L的BSA、100μM的dNTPs。酶混合液包括10U/μL的DNA聚合酶和2U/μL的热启动抗体。阳性对照为临床收集到的蛇源隐孢子虫强阳性样本,阴性对照为超纯水。
实施例2
本实施例示出使用前述的试剂盒检测蛇源隐孢子虫的方法,步骤如下:
(1)将上述试剂盒中的PCR反应液、酶混合液、阴性对照、阳性对照试剂充分融化混匀并瞬时离心以去除管壁附着液体。
(2)核算当次实验所需要的反应数(n),并根据如下表1所示反应体系计算当次实验所需要的各种试剂量。
n=阴性对照数(1T)+阳性对照数(1T)+误差预留量(1T)+样本数
表1
(3)在无菌离心管中加入上述计算好的PCR反应体系,充分混匀后瞬时离心。按照20μL/孔分装量将试剂分装至PCR管的孔上。
(4)使用商品化核酸提取试剂盒,进行DNA提取,作为待测样本备用。
(5)在步骤(3)制备好的芯片反应样本管中分别加入处理好的待测标本、阳性对照、阴性对照各5 .0μL,使反应终体积为25μL/孔,盖好PCR反应盖,转移到SLAN 96S型荧光定量PCR仪上进行PCR扩增,反应程序为:95℃,5min;95℃,10s,57℃,25s,40个循环;检测荧光选择FAM。
(6)读取检测结果,阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品的最高点。
阳性对照Ct值小于38,阴性对照Ct无数值;在阈值以上的荧光曲线应当是具有明显的S型曲线,否则该次实验视为无效,应检查仪器、试剂、扩增条件等方面的误差。
采用本发明提供的方法检测蛇源隐孢子虫时,判断标准如下:
1、检测样本Ct≤38 .0者判为阳性。
2、38 .0<Ct≤40的检测样本建议重做,重做结果中Ct值<40者为阳性,否则为阴性。
检测结果如图1所示,可以看出,本申请提供的引物探针组合、检测试剂盒及其检测方法能够高效准确地检测出待测样本中的蛇源隐孢子虫,具有所需时间短、检测特异性强,重复性好、灵敏度高的特点。
实施例3:
本实施例提供了一种使用实施例2中试剂盒检测蛇源隐孢子虫的方法来检测试剂的线性扩增,包括以下步骤:
(1)蛇源隐孢子虫阳性质粒的获取:委托上海生工合成。
(2)反应体系配制同实施例2。
(3)阳性质粒梯度稀释:选取2×109copies/mL的质粒进行10倍比稀释后按实施例2的方法加样上机扩增。
(4)检测结果如附图2(横坐标表示循环数,纵坐标表示相对荧光强度)所示,结果显示质粒的各个浓度与Ct值间呈线性关系,质粒浓度相差10倍,Ct值相差3.3,与理论值相符。
综上所述,上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限定本发明的保护范围,凡在本发明的精神和原则之内,所做的任何修改、等同替换、改进等,皆应包含在本发明的保护范围内。
Claims (12)
1.一种基于实时荧光定量PCR技术检测蛇源隐孢子虫的引物探针组合,其特征在于,所述引物探针组合包括正向引物、反向引物和探针,所述正向引物、反向引物和探针的核苷酸序列如下:
正向引物:5’-AACTGTTCAAGGTGATATGACAC-3’,如SEQ ID NO:1所示;
反向引物:5’-ATTCCTTTGTCTCACCTAAGTAGAT-3’,如SEQ ID NO:2所示;
探针:5’-CCATTCAAGGTTTGTCGTGGCCCAA-3’,如SEQ ID NO:3所示,所述探针中,5’端标记有荧光报告基团,3’端标记有荧光淬灭基团。
2. 一种基于实时荧光定量PCR技术检测蛇源隐孢子虫的引物探针组合,其特征在于,所述荧光报告基团选自FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas RED或LC RED460中任意一种,所述荧光淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3或MGB中任意一种。
3.权利要求1或2中任一项所述的基于实时荧光定量PCR技术检测蛇源隐孢子虫的引物探针组合在制备检测蛇源隐孢子虫试剂盒中的应用。
4.一种基于实时荧光定量PCR技术检测蛇源隐孢子虫的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括PCR反应液、酶混合液、阴性对照和阳性对照,所述PCR反应液包括权利要求1或2中任一项所述的基于实时荧光定量PCR技术检测蛇源隐孢子虫的引物探针组合。
5.根据权利要求4所述的基于实时荧光定量PCR技术检测蛇源隐孢子虫的试剂盒,其特征在于,所述PCR反应液还包括MgCl2、Tris、BSA和dNTPs。
6.根据权利要求4所述的基于实时荧光定量PCR技术检测蛇源隐孢子虫的试剂盒,其特征在于,所述酶混合液包括DNA聚合酶和热启动修饰抗体。
7.根据权利要求4所述的基于实时荧光定量PCR技术检测蛇源隐孢子虫的试剂盒,其特征在于,所述正向引物和反向引物的浓度均为0.1-1.0μM,所述探针的浓度为0.3μM。
8.根据权利要求5所述的基于实时荧光定量PCR技术检测蛇源隐孢子虫的试剂盒,其特征在于,所述MgCl2的浓度为1-5mM,所述Tris的浓度为30-70mM,所述BSA的浓度为100-400mg/L,所述dNTPs的浓度为10-100μM。
9.根据权利要求6所述的基于实时荧光定量PCR技术检测蛇源隐孢子虫的试剂盒,其特征在于,所述DNA聚合酶的浓度为5-10U/μL,所述热启动修饰抗体的浓度为1-5U/μL。
10.根据权利要求4所述的基于实时荧光定量PCR技术检测蛇源隐孢子虫的试剂盒,其特征在于,所述阳性对照为蛇源隐孢子虫阳性样本,所述阴性对照为超纯水。
11.一种非诊断目的的基于实时荧光定量PCR技术检测蛇源隐孢子虫的方法,其特征在于,包括步骤:
1)提取待测样本总DNA;
2)制备反应体系,所述反应体系包括权利要求4-10中任一项所述的PCR反应液和酶混合液;
3)以提取的待测样本总DNA为模板,同时添加阴性对照、阳性对照为质控模板,进行实时荧光定量PCR反应;
4)反应结束,根据Ct值判定检测结果。
12.根据权利要求11所述的非诊断目的的基于实时荧光定量PCR技术检测蛇源隐孢子虫的方法,其特征在于,所述实时荧光定量PCR反应的程序为:
Step1:95℃,5min;
Step2:95℃,10s, 57℃,25s;
Step2执行40个循环。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202410054356.7A CN117568501A (zh) | 2024-01-15 | 2024-01-15 | 基于实时荧光定量pcr技术检测蛇源隐孢子虫的引物探针组合、试剂盒及方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202410054356.7A CN117568501A (zh) | 2024-01-15 | 2024-01-15 | 基于实时荧光定量pcr技术检测蛇源隐孢子虫的引物探针组合、试剂盒及方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN117568501A true CN117568501A (zh) | 2024-02-20 |
Family
ID=89892139
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202410054356.7A Pending CN117568501A (zh) | 2024-01-15 | 2024-01-15 | 基于实时荧光定量pcr技术检测蛇源隐孢子虫的引物探针组合、试剂盒及方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN117568501A (zh) |
Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20020055116A1 (en) * | 2000-09-12 | 2002-05-09 | Cunningham Melissa M. | Compositions, methods and kits for determining the presence of cryptosporidium organisms in a test sample |
US20060258855A1 (en) * | 2002-08-22 | 2006-11-16 | Genetype Pty Ltd | High resolution analysis of genetic variation within cryptosporidium parvum |
CN103276088A (zh) * | 2013-05-31 | 2013-09-04 | 深圳市疾病预防控制中心 | 同时检测三种腹泻原虫的试剂盒及检测方法 |
CN107385089A (zh) * | 2017-09-05 | 2017-11-24 | 南京市疾病预防控制中心 | 一种检测隐孢子虫卵囊的核酸组合、试剂盒以及方法 |
CN108893526A (zh) * | 2018-03-07 | 2018-11-27 | 西北农林科技大学 | 一种微小隐孢子虫荧光lamp检测方法 |
CN114058722A (zh) * | 2021-11-07 | 2022-02-18 | 吉林大学 | 隐孢子虫活卵囊的双探针qRT-PCR检测试剂盒及其方法 |
CN116949197A (zh) * | 2023-08-25 | 2023-10-27 | 云南农业大学 | 四种常见隐孢子虫raa检测方法的建立 |
-
2024
- 2024-01-15 CN CN202410054356.7A patent/CN117568501A/zh active Pending
Patent Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20020055116A1 (en) * | 2000-09-12 | 2002-05-09 | Cunningham Melissa M. | Compositions, methods and kits for determining the presence of cryptosporidium organisms in a test sample |
US20060258855A1 (en) * | 2002-08-22 | 2006-11-16 | Genetype Pty Ltd | High resolution analysis of genetic variation within cryptosporidium parvum |
CN103276088A (zh) * | 2013-05-31 | 2013-09-04 | 深圳市疾病预防控制中心 | 同时检测三种腹泻原虫的试剂盒及检测方法 |
CN107385089A (zh) * | 2017-09-05 | 2017-11-24 | 南京市疾病预防控制中心 | 一种检测隐孢子虫卵囊的核酸组合、试剂盒以及方法 |
CN108893526A (zh) * | 2018-03-07 | 2018-11-27 | 西北农林科技大学 | 一种微小隐孢子虫荧光lamp检测方法 |
CN114058722A (zh) * | 2021-11-07 | 2022-02-18 | 吉林大学 | 隐孢子虫活卵囊的双探针qRT-PCR检测试剂盒及其方法 |
CN116949197A (zh) * | 2023-08-25 | 2023-10-27 | 云南农业大学 | 四种常见隐孢子虫raa检测方法的建立 |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
DEUVÂNIA C. DA SILVA等: "The detection of Cryptosporidium serpentis in snake fecal samples by real-time PCR", VETERINARY PARASITOLOGY, vol. 204, no. 3, 17 May 2014 (2014-05-17), pages 134 * |
JAMES E. BOGAN JR等: "Evaluation of a probe hybridization quantitative polymerase chain reaction assay for Cryptosporidium serpentis in eastern indigo snakes (Drymarchon couperi)", PARASITOLOGY RESEARCH, vol. 121, 29 September 2022 (2022-09-29), pages 3523 * |
梁楠等: "牛隐孢子虫和隐孢子虫病的研究进展", 中国兽医科学, vol. 36, no. 12, 28 December 2006 (2006-12-28), pages 1024 - 1030 * |
王进产等: "基于18S rRNA和HSP70基因序列的隐孢子虫种系发育分析", 畜牧兽医学报, vol. 38, no. 09, 15 September 2007 (2007-09-15), pages 947 - 953 * |
赵金凤等: "五步蛇源隐孢子虫分离株的分子鉴定", 西北农林科技大学学报(自然科学版), vol. 39, no. 06, 30 June 2011 (2011-06-30), pages 20 - 24 * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN112063756B (zh) | 多重检测呼吸道病毒核酸的方法及试剂盒 | |
CN109762942B (zh) | 一种快速检测呼吸道合胞病毒的含内参双重等温核酸扩增方法 | |
CN103773861B (zh) | 华支睾吸虫和广州管圆线虫双重实时荧光pcr检测试剂、试剂盒及其检测方法 | |
CN102146466A (zh) | 检测布鲁氏菌的试剂及复合探针荧光定量pcr检测布鲁氏菌的方法 | |
CN103725798B (zh) | 用于以rt-lamp法检测肾综合征出血热病毒的引物、试剂盒、检测方法 | |
CN104328164A (zh) | 荧光探针杂交法检测人egfr基因突变试剂盒 | |
CN103667514A (zh) | 一种人白介素28b基因多态性荧光pcr检测试剂盒 | |
CN108048589A (zh) | 牛双芽巴贝斯虫的Real-time PCR特异性引物和探针及检测试剂盒与检测方法 | |
CN111172273B (zh) | 一种smn1基因检测的引物组、试剂盒及检测方法 | |
CN103088151B (zh) | 用于乙型肝炎病毒四色荧光定量pcr检测的试剂盒及应用 | |
CN117568501A (zh) | 基于实时荧光定量pcr技术检测蛇源隐孢子虫的引物探针组合、试剂盒及方法 | |
CN101613752A (zh) | 快速检测杜氏利什曼原虫的荧光定量pcr试剂盒 | |
CN103540676A (zh) | 一种检测线粒体基因1555位a-g与1494位c-t突变的试剂盒 | |
WO2020134950A1 (zh) | 用于肺结节良恶性鉴别的基因突变/融合组合及试剂盒 | |
CN116254371A (zh) | 一种用于猴痘病毒野生型和突变型分子分型的引物分子信标组合及其应用 | |
CN111647650B (zh) | 检测人B-raf基因V600E突变的引物、引物探针组合物及试剂盒 | |
CN104593509A (zh) | 罗非鱼无乳链球菌特异性核酸探针斑点杂交检测试剂盒 | |
CN108085396A (zh) | 基于荧光定量pcr检测银鲳的引物和探针及其试剂盒与方法 | |
CN106460047B (zh) | 用于鉴定癌前结肠直肠息肉和结肠直肠癌的方法及试剂盒 | |
CN108950019A (zh) | 肝簇虫的Real-time PCR特异性引物和探针及检测试剂盒与检测方法 | |
CN111004868A (zh) | 一种用于检测山羊鼻内肿瘤病毒的荧光pcr引物、探针及试剂盒 | |
CN110029171A (zh) | 一种利用茎环引物检测pik3ca基因突变位点的试剂盒 | |
CN116024360B (zh) | 一种用于结核分枝杆菌复合群鉴定及耐药基因突变检测的引物组合及其应用 | |
CN116004926A (zh) | 快速鉴别新型冠状病毒Omicron株分支的试剂盒 | |
CN108118097B (zh) | 用于定量检测痢疾性阿米巴虫的引物探针、试剂盒及方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |