CN104593509A - 罗非鱼无乳链球菌特异性核酸探针斑点杂交检测试剂盒 - Google Patents

罗非鱼无乳链球菌特异性核酸探针斑点杂交检测试剂盒 Download PDF

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刘志刚
朱华平
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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Abstract

本发明涉及罗非鱼无乳链球菌特异性核酸探针斑点杂交检测试剂盒，属于水产生物制品，它公开了该试剂盒用特定引物通过PCR合成了地高辛标记的无乳链球菌探针，通过斑点分子杂交，这些探针可用于检测病料样品或菌株煮沸后的上清液中有否无乳链球菌特异性核酸的存在，用于判定是否有无乳链球菌感染。本发明涉及的试剂盒利用病料组织DNA提取物或待检菌株水煮后的上清液作斑点分子杂交，均可在16h～24h内完成检测并报告结果，特异性强，准确性高。

Description

罗非鱼无乳链球菌特异性核酸探针斑点杂交检测试剂盒
技术领域
本发明涉及一种罗非鱼无乳链球菌特异性核酸探针斑点杂交检测试剂盒，属于水产生物制品领域。
背景技术
无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)也称B群链球菌(GBS)，是一类广泛存在于自然界的革兰氏阳性菌，宿主范围广，对哺乳类、爬行类、两栖类及鱼类均可造成危害。1958年在日本养殖虹鳟(Oncorhychus mikiss)中首次发现了链球菌病，其后鱼类链球菌病的报道逐渐增多。2009年以来，该病在我国多流行于养殖的罗非鱼，其感染性强，死亡率高，治疗困难，如何在感染早期快速、准确、灵敏地检测无乳链球菌成为研究的热点。
目前罗非鱼无乳链球菌实验室检测方法包括常规的生化检测法，血清学检测法和分子生物学检测法。常规生化检测主要建立在生物化学中的快速专有酶反应和细菌代谢产物的检测技术，该方法耗时较长、阳性率低，对无乳链球菌早期快速批量筛查有一定的局限性；血清学检测方法，其方法简便、快捷，但不能完全排除假阴性结果；分子生物学检测，实验条件要求高，容易受到种种检测条件的影响，难以普及推广。LAMP环介导等温技术，简便快速、灵敏度高，所需仪器也较简单，但对检测的实验环境及人员操作要求相对较高，可能受人为误差因素影响，产生假阳性结果。
因此现有无乳链球菌检测技术还有待于改进和发展，以满足不同阶层工作人员的需求。
发明内容
鉴于现有无乳链球菌检测技术的不足，本发明的目的在于提供一种罗非鱼无乳链球菌的探针斑点杂交检测试剂盒，旨在解决现有的检测方法耗时长、阳性率低、条件高、易受认为误差因素影响的问题。本发明所提供的试剂盒利用特异性地高辛核酸片段探针，能同时鉴别性的检测大量样品中的罗非鱼无乳链球菌。通过对病料组织样品DNA提取物或细菌样品的煮沸后的上清液进行斑点分子杂交，特异的检测样品中的无乳链球菌。
本发明所涉及的试剂盒是利用罗非鱼无乳链球菌cfb片段(序列1)为模板，用特定引物(序列2和3)通过PCR合成了地高辛标记(Digoxiaenin，DIG)的探针。通过斑点杂交，这些探针(Digoxigenin-labelled cfb probe)可用于检测病料样品或菌株煮沸后的上清液中无乳链球菌特异性核酸的存在，用于判定是否有无乳链球菌感染。利用这一方法，在1张8ⅹ8cm大小的尼龙膜上可同时检测约80份病料或菌株的核酸样品。并可在16h～24h内完成检测并报告结果。
本发明的详细描述
(一)无乳链球菌地高辛标记探针的制备及验证
1.无乳链球菌cfb片段(序列1)的扩增(用作非标记的对照DNA)
模板：无乳链球菌菌株-T3-cfb克隆质粒(本发明人制备和测序并保存)，PCR反应体系如下：10ⅹPCR buffer(Mg+)，5μL；dNTP stock solution(2mmol/L each)，5μL；Forwardprimer(10μmol/L)(序列2)，5μL；Reverse primer(10μmol/L)(序列3)，5μL；Enzyme mix(3.5U/μL)，0.75μL；DNA模板，1μL；ddH2O，28.25μL。将上述成分加入灭菌的PCR管中，混合均匀后，离心后置于PCR扩增仪，扩增程序为：94℃，5min；94℃，30S，57℃，30s，72℃，1min，32个循环；72℃延伸10min；4℃保存备用。
2.无乳链球菌cfb片段(序列1)PCR法制备地高辛标记探针
以上-T3-cfb质粒DNA为模板进行PCR扩增，反应体系如下：10ⅹPCR buffer(Mg+)，5μL；PCR DIG Probe Synthesis mixture，5μL；Forward primer(10μmol/L)(序列2)，5μL；Reverse primer(10μmol/L)(序列3)，5μL；Enzyme mix(3.5U/μL)，0.75μL；-T3-cfb质粒DNA，1μL；ddH2O，28.25μL。将上述成分加入灭菌的PCR管中，混合均匀，离心后置于PCR扩增仪，扩增程序为：94℃，5min；94℃，30S，57℃，30s，72℃，1min，32个循环；72℃延伸10min；4℃保存备用。1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，并测序验证。
(以上模板用质粒DNA浓度，PCR终浓度要求为10pg～100pg；若用基因组DNA，PCR体系终浓度为1ng～50ng)
(二)试剂盒组成
1.探针
试剂1：地高辛标记的罗非鱼无乳链球菌cfb片段(序列1)探针，1μg/μL，10μL～50μL/瓶。序列1(471碱基)：
CAGTAATCAAGCCCAGCAAATGGCTCAAAAGCTTGATCAAGATAGCATTCAGTTGAGAAATATCAAAGATAATGTTCAGGGAACAGATTATGAAAAACCGGTTAATGAGGCTATTACTAGTGTTGAAAAATTAAAGACTTCATTGCGTGCCAACCCTGAGACAGTTTATGATTTGAATTCTATTGGTAGTCGTGTAGAAGCCTTAACAGATGTGATTGAAGCAATCACTTTTTCAACTCAACATTTAGCAAATAAGGTTAGTCAAGCAAATATTGATATGGGATTTGGGATAACTAAGCTAGTTATTCGCATTTTAGATCCATTTGCTTCAGTTGATTCAATTAAAGCTCAAGTTAACGATGTAAAGGCATTAGAACAAAAGGTTTTAACTTATCCTGATTTAAAACCAACTGATAGAGCTACCATCTATACAAAATCAAAACTTGATAAGGAAATCTGGAATACACGCTT
2.未标记的cfb片段对照DNA
试剂2：罗非鱼无乳链球菌cfb片段(471碱基的序列1)PCR扩增的DNA，10pg/μL，50μL/瓶。
3.PCR引物
试剂3：罗非鱼无乳链球菌特异性正向引物，5’-AAGCGTGTATTCCAGATTTCCT-3’(序列2)；
试剂4：罗非鱼无乳链球菌特异性反向引物，5’-CAGTAATCAAGCCCAGCAA-3’(序列3)。
4.尼龙膜8cmⅹ8cm，20～100片(可根据样品多少，裁剪适合大小使用)
5.其他试剂
试剂5：封闭试剂(购自Roche公司，Cat.No.1096176，1g/瓶)
试剂6：碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体(购自Roche公司，10μL/瓶，anti-Digoxigenin-Ap Conjugate，Cat.No 1093274)
试剂7：碱性磷酸酶发光底物(CSPD ready-to-use)(购自Roche公司，Cat.No.11755633001，100mL)。
试剂8：杂交液颗粒(购自Roche公司，DIG Easy Hyb Granules，Cat.No.11796895001)
6.自备试剂及耗材
20×SSC溶液(3M Nacl，0.03枸橼酸三钠，调整pH至7.0)，可封口塑料袋，尖头一次性滴头，洗涤缓冲液(0.1M马来酸，0.15M NaCl；pH 7.5；0.3％v/v吐温20)，马来酸缓冲液(0.1M马来酸，0.15M NaCl，pH 7.5)，检测缓冲液(0.1M Tris-HCl，0.1M NaCl，pH 9.5)，10×SDS溶液。
7.设备
水浴锅，压模机，5μL、100μL移液器。
(二)试剂盒的操作方法：
1.核酸样品的制备：
(1)上清液核酸样品：取2～5个待检测菌株菌落或1mL菌液离心后的沉淀菌株，溶于100μL无菌水，100℃水浴15min，立即冰浴3min，稍离心，取上清备用。
(2)病料核酸样品：取发病罗非鱼待检组织脑或肝脏，利用基因组提取试剂盒DNeasy blood&Tissue Kit提取基因组，保存备用；必要时也可以基因组为模板，利用引物2和3对基因组进行PCR扩增(反应体系：；扩增程序：94℃，5min；94℃，30S，57℃，30s，72℃，1min，32个循环；72℃延伸10min；)，扩增产物无凝胶需电泳确认，可直接保存备用。
2.杂交及免疫检测：
(1)取2μL核酸样品(上述上清液或基因组或PCR产物)，点样于适当大小的尼龙膜上(尼龙膜划好格子，长和宽做好标记)。
(2)在2ⅹSSC中简单洗膜，120°下烘烤尼龙膜30min。(可保存于4℃)
(3)将上述转膜好的尼龙膜(点样面朝上)放入适量体积的DIG Easy Hyb缓冲液(事先预热至40℃)，温和震荡30min，进行预杂交。
(4)取适量地高辛标记的DNA探针，沸水浴中变性5min，后立即置于冰上冷切。将变性的地高辛标记探针加入到预热的DIG Easy Hyb缓冲液中，充分混匀，避免产生气泡。(杂交液中探针终浓度约为25ng/mL)
(5)倒出(3)中预杂交液，在膜上加入(4)中的探针杂交液，40℃温和震荡孵育至过夜。
(6)用足量的2×SSC，0.1％×SDS在室温(15℃～25℃)连续振荡洗膜两次，每次5min。
(7)用足量的0.5×SSC，0.1％×SDS(预热到洗涤温度)，65℃连续振荡洗膜两次，每次15min。
(8)将膜简单的用洗涤缓冲液漂洗1min～5min(37℃下振荡)；
(9)在100mL(每100cm膜)封闭溶液工作液中孵育30min(37℃下振荡)；
(10)在20mL(每100cm膜)抗体溶液工作液中孵育30min～1h(37℃下振荡)；
(11)在100mL(每100cm膜)洗涤缓冲液洗涤两次，每次15min(37℃下振荡)；
(12)在20mL(每100cm膜)检测缓冲液中平衡2min～5min(37℃下振荡)；
(13)将DNA点样的膜面朝上，置于杂交袋(塑料袋压模机封口制成，大小可根据膜大小随意调节)中，向膜上加入1mL CSPD ready-to-use，立即盖上封盖使CSPD平均分布在膜的表面，并防气泡的产生。擦去溢出杂交袋多余液体，室温(15℃～25℃)孵育5min；将湿膜置于37℃孵育10min。
(14)在15℃～25℃条件下，采用图像系统曝光5min～20min。
(15)结果判读：有斑点反应即表示无乳链球菌阳性，无斑点反应，即表示无乳链球菌阴性。
本发明的优点是能利用病料组织DNA提取物或待检菌株水煮后的上清液作斑点分子杂交，均可在16h～24h内完成检测并报告结果，特异性强，准确性高。
具体实施方式
实施例1：本发明试剂盒检测无乳链球菌的敏感性
(1)样品：罗非鱼无乳链球菌。
(2)样品处理：按分子克隆常规方法提取无乳链球菌DNA(原始浓度为：364.5μg/mL)或直接100℃水煮菌株，冰浴3min，离心取上清液，并将其做倍比稀释。
(3)取2μL核酸样点样于适当大小的尼龙膜上(尼龙膜划好格子，长和宽做好标记)。
(4)在2ⅹSSC中简单洗膜，120°下烘烤尼龙膜30min。(可保存于4℃备用)
(5)将上述转膜好的尼龙膜(点样面朝上)放入适量体积的DIG Easy Hyb缓冲液(事先预热至40℃)，温和震荡30min，进行预杂交。
(6)取适量地高辛标记的DNA探针，沸水浴中变性5min后，立即置于冰上冷切。将变性的地高辛标记探针加入到预热的DIG Easy Hyb缓冲液中，充分混匀，避免产生气泡。(杂交液中探针终浓度约为25ng/mL较好)
(7)倒出(5)中预杂交液，在膜上加入(6)中的探针杂交液，40℃温和震荡孵育至过夜。
(8)用足量的2×SSC，0.1％×SDS，在室温(15℃～25℃)连续振荡洗膜两次，每次5min。
(9)用足量的0.5×SSC，0.1％×SDS(预热到洗涤温度)，65℃连续振荡洗膜两次，每次15min。
(10)将膜简单的用洗涤缓冲液漂洗1min～5min(37℃下振荡)；
(11)在100mL(每100cm膜)封闭溶液工作液中孵育30min(37℃下振荡)；
(12)在20mL(每100cm膜)抗体溶液工作液中孵育30min～1h(37℃下振荡)；
(13)在100mL(每100cm膜)洗涤缓冲液洗涤两次，每次15min(37℃下振荡)；
(14)在20mL(每100cm膜)检测缓冲液中平衡2min～5min(37℃下振荡)；
(15)将DNA点样的膜面朝上，置于杂交袋(塑料袋压模机封口制成，大小可根据膜大小随意调节)中，向膜上加入1mL CSPD ready-to-use，不要产生气泡，立即封口使CSPD平均分布在膜的表面。擦去溢出杂交袋的多余液体，室温(15℃～25℃)孵育5min，37℃孵育10min。
(16)室温(15℃～25℃)条件下，采用图像系统曝光5min～20min或X光片曝光15min～25min。
(17)敏感性结果：
采用本发明试剂盒能检测罗非鱼无乳链球菌的最低核酸量为1.5pg/μL，表明本检测方法具有较好的敏感性。
本发明利用特定引物序列2和序列3所述的引物，通过PCR合成了经地高辛标记的探针，通过斑点分子杂交，这些探针可用于检测病料样品中无乳链球菌特异性核酸的存在或鉴定无乳链球菌病原。
实施例2：本发明试剂盒检测无乳链球菌的特异性
(1)样品：罗非鱼无乳链球菌样品5株和其他细菌样品12株(包括海豚链球菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、迟缓爱德华氏菌、浅绿气球菌、金黄色葡萄球菌、普通变形杆菌、乳酸杆菌、点状气单胞菌等)。
(2)取1mL菌液，离心后，溶于100μL无菌水，100℃水浴15min，立即冰浴3min，稍离心，取上清备用。
(3)取2μL核酸样点样于适当大小的尼龙膜上(尼龙膜划好格子，长和宽做好标记)。
(4)在2ⅹSSC中简单洗膜，120℃下烘烤尼龙膜30min。(可保存于4℃)
(5)将上述转膜好的尼龙膜(点样面朝上)放入适量体积的DIG Easy Hyb缓冲液(事先预热至40℃)，温和震荡30min，进行预杂交。
(6)取适量地高辛标记的DNA探针，沸水浴中变性5min，后立即置于冰上冷切。将变性的地高辛标记探针加入到预热的DIG Easy Hyb缓冲液中，充分混匀，避免产生气泡。(杂交液中探针浓度约为25ng/mL)
(7)倒出(5)中预杂交液，在膜上加入(6)中的探针杂交液，40℃温和震荡孵育至过夜。
(8)用足量的2×SSC，0.1％×SDS，室温(15～25℃)连续振荡洗膜两次，每次5min。
(9)用足量的0.5×SSC，0.1％×SDS(预热到洗涤温度)，65℃连续振荡洗膜两次，每次15min。
(10)在杂交和严谨洗涤步骤后，将膜简单的用洗涤缓冲液漂洗1min～5min(37℃下振荡)；
(11)在100mL(每100cm膜)封闭溶液工作液中孵育30min(37℃下振荡)；
(12)在20mL(每100cm膜)抗体溶液工作液中孵育30min～1h(37℃下振荡)；
(13)在100mL(每100cm膜)洗涤缓冲液洗涤两次，每次15min(37℃下振荡)；
(14)在20mL(每100cm膜)检测缓冲液中平衡2min～5min(37℃下振荡)；
(15)将DNA点样的膜面朝上，置于杂交袋中，向膜上加入1mL CSPD ready-to-use，防止产生气泡，立即封口使CSPD平均分布在膜的表面。擦去溢出杂交袋多余液体，15℃～25℃孵育5min。
(16)将湿膜置于37℃孵育10min。
(17)在15℃～25℃条件下，采用图像系统曝光5min～20min。
(18)结果
无乳链球菌菌株均有斑点反应，其他菌株均无斑点反应发生。
(19)结果验证
以上经过斑点检测显示为阳性，均可通过其他生理生化及分子生物学方法检测无乳链球菌的存在；经过斑点检测为阴性的，通过生理生化及分子生物学方法检测确认均不含无乳链球菌。表明本检测方法特异性强，检测结果准确可靠。
本发明的试剂盒的试验结果判定是利用无乳链球菌促溶血因子cfb基因片段的特异性，作DNA与DNA的斑点分子杂交，根据有无斑点反应，可特异性检测无乳链球菌。

Claims (3)

1.罗非鱼无乳链球菌特异性核酸探针斑点杂交检测试剂盒，其特征在于该试剂盒含有：
(1)经地高辛标记的有471碱基的序列1所述的探针；
(2)未经标记的作为对照用471碱基的序列1所述的探针；
(3)序列2和序列3所述的用于探针制备及样品DNA扩增正向引物、反向引物的一对无乳链球菌特异性引物；
(4)尼龙膜、封闭试剂、碱基磷酸酶标记的抗地高辛抗体、碱性磷酸酶发光底物、杂交液颗粒。
2.如权利1所述的罗非鱼无乳链球菌特异性核酸探针斑点杂交检测试剂盒，其特征在于该试剂盒的试验结果判定是利用无乳链球菌促溶血因子cfb基因片段的特异性，作DNA与DNA的斑点分子杂交，根据有无斑点反应，可特异性检测无乳链球菌。
3.如权利1所述的罗非鱼无乳链球菌特异性核酸探针斑点杂交检测试剂盒的制备方法，其特征在于利用特定引物序列2和序列3所述的引物，通过PCR合成了经地高辛标记的探针，通过斑点分子杂交，这些探针可用于检测病料样品中无乳链球菌特异性核酸的存在或鉴定无乳链球菌病原。
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