CN103146844A

CN103146844A - 猪瘟活疫苗中病毒含量测定方法及猪瘟病毒兔化弱毒核酸探针试剂盒

Info

Publication number: CN103146844A
Application number: CN201310082099XA
Authority: CN
Inventors: 崔治中; 马诚太; 赵鹏
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2013-03-14
Filing date: 2013-03-14
Publication date: 2013-06-12

Abstract

本发明涉及建立一种猪瘟活疫苗中病毒含量测定方法及猪瘟病毒兔化弱毒核酸探针试剂盒。本发明采用PCR法制备HCLV特异性地高辛标记的DNA探针，同时将HCLV疫苗梯度稀释后接种于24孔培养板上的ST细胞中，在培养7天后分别从接种各稀释度的不同孔细胞中提取RNA后，用RT-PCR结合斑点杂交的方法检测病毒感染。应用该方法能很好的对疫苗病毒实施以TCID₅₀为单位的准确定量，多次重复实验发现对同一批次疫苗间定量的重复性好，相互结果相差不大（5.3×10⁴TCID₅₀/头份、3.0×10⁴TCID₅₀/头份、3.0×10⁴TCID₅₀/头份）。本发明技术方案的实验结果表明RT-PCR结合斑点杂交定量方法能准确、完全的对疫苗HCLV定量，值得推广应用。

Description

猪瘟活疫苗中病毒含量测定方法及猪瘟病毒兔化弱毒核酸探针试剂盒

技术领域

本发明涉及一种猪瘟活疫苗中病毒含量测定方法及猪瘟病毒兔化弱毒核酸探针试剂盒，属于兽用生物制品制造领域。

背景技术

猪瘟（classical swine fever,CSF）是由猪瘟病毒（classical swine fever virus,CSFV）引起的一种急性、热性和高度接触性传染病，HCL在世界养猪国家有不同程度流行，被世界动物卫生组织(OIE)列为法定报告动物疫病，我国将其列为一类动物疫病（王琴.猪瘟病毒流行病学、病原致病特性及猪瘟综合防制研究.中国农业科技导报，2006，8(5)：13-18）。HCLV是黄病毒科（Flaviviridae）瘟病毒属（Pestivirus）的一个成员。病毒基因组为单股正链RNA，全长12.3kb，包括一个大的ORF，编码由3898个氨基酸残基组成的多聚蛋白，此多聚蛋白又进一步被加工成4个成熟的结构蛋白（C、E0、E1、E2）和7个非结构蛋白(Npro、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B)（Rumenapf T,Meyers G,Stark R,et al.Molecularcharacterization of hog cholera virus.Arch virol Suppl.1991,3:7-18；Van Ri jn P A,VanGennip H G P,Moormann R J M.An experimental marker vaccine and accompanyingserological diagnostic test both based on envelope glycoprotein E2 of classicalswinefever(CSFV).Vaccine,1999,17:433-440）。

1955年我国研制出用经人工诱变获得的猪瘟病毒兔化弱毒（HCLV）株（又称C株）制备的猪瘟活疫苗，该疫苗具有高度安全性和优良的免疫原性至今仍在世界范围内被广泛应用（仇华吉，童光志，沈荣显.猪瘟兔化弱毒疫苗-半个世纪的回顾.中国农业科学，2005，38(8)：1675-1685），该疫苗对控制猪瘟起到了重要作用，在预防猪瘟方面做出了巨大贡献。因此，疫苗合格与否十分重要，因此疫苗的质量也变得至关重要。检测疫苗质量的关键指标就是疫苗的效价，因此对疫苗的准确完全定量显得极为重要。HCLV可以在PK-15、ST等多种细胞上生长，但是均不产生细胞病变（CPE）。因此，迄今为止对猪瘟弱毒疫苗中的病毒含量还没有一个稳定的重复性好定量方法。在过去60多年中，兔体定型热反应法一直是对其疫苗效价测定的经典方法。但是该方法需要时间太长，并且实验中有很多不可控制的因素影响结果的可靠性和稳定性。特别是兔子对疫苗病毒热反应的个体差异性会显著影响检测结果。。但是至今却不能为该疫苗完全定量，近年来国内外建立了数种检测方法，特别是荧光定量RT-PCR技术应用于检测CSFV的比较多（温国元，万超.应用荧光定量PCR技术快速定量检测猪瘟病毒.武汉大学学报：理学版，2004，50(6)：746-750；Hoffmann B,Beer M,Schelp C,et al.Validation ofa real-time RT-PCR assay for sensitive and specific detection of classical swine fever.J VirolMethods,2005,130(1-2):36-44；高博，杨晓农，子掌辉，等.快速检测猪瘟兔化弱毒疫苗株的TaqMan荧光定量RT-PCR方法的建立应用.西南民族大学学报：自然科学版，2009，35(1)：92-97；朱中武，黄萍，鲁杏华，等.实时荧光RT-PCR快速检测猪源性食品中猪瘟病毒的研究.中国预防兽医学报，2009，31(8)：627-630），但这些方法都不是完全定量的方法。目前建立的Taq-Man实时荧光定量RT-PCR方法可以对疫苗中的病毒核酸做定量，并且具有很高的灵敏度。但是该方法不能将疫苗中的有复制能力的活病毒粒子与死亡的病毒粒子区别开来，不能区别具有感染力和不具有感染力的病毒，还是没有实现对疫苗所必须的活病毒的定量。

RT-PCR作为一种先进的生物学技术具有很高灵敏度已经被广泛应用于猪瘟病毒病原（罗廷荣,莫扬,吴文德,等.RT-CR技术诊断猪瘟的应用研究.中国预防兽医学报,2003,25(3):219-222）和其他传染源的鉴定和临床诊断，但不能用于定量。而且该方法同样也难以区分疫苗中具有感染力和不具有感染力的病毒。并且还容易出现非特性产物，电泳后在凝胶成像仪下看到的条带不一定就是目的条带，易出现假阳性。同时，在凝胶成像仪下看不到目的条带也不一定就是阴性结果，因为电泳能看到的条带最少也是10ng级别，因此也容易出现假阴性，如同本实验的结果，RT-PCR的产物电泳后虽然除阳性对照外看不到任何条带.但是如果结合斑点杂交，结果却是不同，不仅解决了特异性的问题，也提高了灵敏度。本实验标记的HCLV-E2基因的核酸探针可以检测到RT-PCR产物的1～2pg的水平。

发明内容

本发明建立的定量方法是先将以不同稀释度的疫苗接种于ST细胞后用RT-PCR结合斑点杂交检测每个细胞孔的感染状态，具有准确，灵敏，特异的特点，是一个完全的定量方法。疫苗接种于细胞后可以除去无感染力细胞的干扰，实验中所标记的探针的重复性和稳定性较好。斑点杂交是一种特异性强、灵敏的检测技术，操作简单，结果易于判断。利用斑点杂交对鸡传染性贫血病毒（刘岳龙,崔治中,段玉友.PCR和斑点杂交检测鸡传染性贫血病毒.中国兽医学报,1996,16(1):38-41）、犬瘟热病毒（王宏俊,丁少忠.核酸探针检测犬瘟热病毒方法的建立和初步应用.中国兽药杂志.2006,40(5):19-22）等多种病毒成功做了相应的地高辛标记探针。地高辛是一种非放射性物质，对人及环境没有危害。此外，核酸探针检测法操作简便，一次可同时检测多个样品，且在检测时，对仪器的要求不高，特别适宜于基层的掌握和使用，因此，该方法不仅可以用于猪瘟兔化弱毒疫苗的定量，也可以作为一种猪瘟的检测方法和流行病学调查的手段在基层使用。

将疫苗接种于ST细胞，可以排除掉疫苗中不具有感染力的死病毒，具有准确的特点；RT-PCR可以扩增HCLV核酸片段，具有增强敏感度的特点；斑点杂交不仅敏感，而且具有很高的特异性，操作简单。上世纪90年代本发明人就用核酸探针检出Ⅰ型马立克氏病毒（崔治中.用非放射性DNA探针从感染鸡羽毛囊中检出Ⅰ型马立克氏病病毒.中国兽医科技,1992,22(9):20-21），因此，本发明将三者（接种细胞、RT-PCR和斑点杂交）的优势巧妙的结合在一起，组成了一种对HCLV完全的定量方法，该方法的特点就是准确，敏感，特异，完全，应用该方法对某疫苗公司不同批次的疫苗进行了检测，得到了理想的结果。

本发明的技术方案

1.本发明所涉及的一种猪瘟活疫苗中病毒含量测定的方法包括：

（1）是以HCLV-E2基因片段质粒为模板，用序列1和序列2所述序列的引物HCLV-F1/HCLV-R1进行扩增，采用地高辛标记技术将扩增产物制备成地高辛标记HCLV-E2DNA探针；

（2）以从24孔培养板上的被不同稀释度猪瘟活疫苗感染的ST细胞提取的RNA为模板用序列3和序列4所述序列的一对引物HCLV-F2/HCLV-R2进行RT-PCR；

（3）通过斑点杂交，根据在硝酸纤维膜点样后的显色，狄高辛标记的特异性核酸探针可检测经猪瘟活疫苗感染的ST细胞中猪瘟兔化弱毒病毒的特异性核酸的RT-PCR产物存在；

（4）根据不同稀释度样本在硝酸纤维膜点样后的显色反应，计算疫苗中以TCID₅₀/头份为单位的猪瘟兔化弱毒病毒的含量。

2．本发明所述的猪瘟活疫苗中病毒含量测定的方法用于测定的以TCID₅₀/头份为单位的猪瘟兔化弱毒病毒定量结果作为猪瘟活疫苗效力检验的质量标准。

3．一种实施本发明猪瘟病毒兔化弱毒株病毒含量测定的猪瘟病毒兔化弱毒特异性核酸探针试剂盒，含有：

（1）经狄高辛标记的HCLV-E2DNA探针；

（2）未感染的正常ST细胞提取RNA的RT-PCR产物做为阴性对照和猪瘟兔化弱毒病毒感染的ST细胞提取RNA的RT-PCR产物做为阳性对照；

（3）用于样品RNA扩增的一对特异性引物，其序列如序列3、序列4所示；

（4）硝酸纤维膜、封闭试剂、NCPI溶液、NBT溶液和20×SSC溶液。

4．本发明所涉及的猪瘟兔化弱毒特异性核酸探针试剂盒可用于猪瘟活疫苗成品检验中的效价检验；也可用于猪瘟病毒的检测和流行病学调查。

具体实施方式

1.HCLV-E2DNA探针制备和探针特异性与灵敏度的检测

（1）PCR法制备地高辛标记HCLV-E2DNA探针

以HCLV-E2基因片段质粒（由中国人民解放军军事兽医研究所涂长春研究员惠赠）为模板，用表1中的HCLV-F1/HCLV-R1引物扩增，出现预期450bp目的条带（图1）。PCR产物经测序无误后，回收、纯化及定量，采用地高辛PCR法标记技术，用罗氏公司的试剂盒（PCRDIG Probe Synthesis Kit，Cat.No.11636090910，Version December2005）进行地高辛标记E2基因片段DNA制备探针，探针标记方法按以上试剂盒操作说明书进行，标记的探针在电泳图谱上明显滞后于普通dNTP扩增产物条带（图2），说明探针标记成功，同时和DNA Marker条带比较，所标记探针的量大约为30ng/μl。

表1标记HCLV探针和HCLV株RT-PCR扩增的引物

以上引物均由上海Sangon公司合成。

（2）探针特异性和灵敏度的检测

将猪繁殖与呼吸综合症病毒（PRRSV）、猪圆环病毒（PCV-2）、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）基因质粒（本实验室保存）四种病毒的DNA片段及HCLV-E2基哠450bp片段的PCR回收产物DNA均做10倍梯度稀释，分别稀释至100pg 10pg、1pg、0.1`g、0.01pg的量检测所标记探针的灵敏度和牸异性。

□DNA□ □□ 80□□ 2h□□ 交、洗膜僊色（见附注）。通过斑点的有无判断结果，盓果见图3。

图3显示：A1-E1：HCLV-E2同源DNA，A1-C0出现防性斑点；A2-E2：PPV同源DNA，均无斑点；A3-E3：PCV同源DNA，均无斑点；A4-D4：PRV同源DNA，均无斑点；A5-E5-：PRRSV同源DNA；A6-E6，均无斑点：超纯水；A1-A5：100pg量的DNA；B1-B5：10pg量的DNA；C1-C5：1pg量的DNA；D1-D5：0.1pg量的DNA；E1-E5：0.01g量的DNA。

图3结果显示，制备的地高辛标记HCLV-E2 DNA探针具有很好的特异性，而且敏感性也很好，可以检测到1pg量的DNA。

2.猪瘟兔化弱毒疫苗株的定量

（1）疫苗接种于ST细胞

将长成单层的ST细胞胰酶消化后充分吹打，传代于24孔细胞培养板，于37℃5%的CO₂培养箱中培养，待其贴壁后将疫苗用3ml生长液稀释，分装于3个1.5ml离心管，漩涡振荡15S,12000r/min低温离心3分钟，取上清用一次性滤器过滤后再从10^-1～10^-6做10倍梯度倍比稀释，接种于单层细胞，除第六个稀释度留两个孔做阴性对照而只接种两个孔外，其他5个稀释度均做4个重复，每孔100μl，吸附3h后弃去上清和非吸附细胞，并加1ml1%FBS的维持液，连续观察7天后收获细胞，冻存于-80℃。

（2）RT-PCR扩增HCLV基因片段

用Viral RNA Kit（R6874-01购自公司）从猪瘟活疫苗中直接提取猪瘟兔化弱毒病毒RNA为模板用TakaRa RNA PCR Kit(AMV)V3.0（#DRR019A购自日本TakaRa公司）用HCLV-F2/HCLV-R2引物（见表1）进行RT-PCR，每个样品做两个重复。10μl RT体系包括1μl dNTP,2μlMg²⁺,1μl RT-Buffer,1μl HCLV-R2,0.5μl AMV条件：42℃延伸60min,99℃变性5min。PCR条件：95℃预变性4min后94℃变性30s,58℃退火30s,72℃延伸90s,32个循环，最后延伸10min分钟。

（3）斑点杂交检测扩增片段

按照附注记载的方法，用DIG Labeling and Detectiong Kit试剂盒（购自Roche公司公司）做斑点杂交，检测RT-PCR产物。

（4）重复性试验

1）批内重复试验：在相同条件下，对某一批次的猪瘟活疫苗做3个重复（A1、A2、A3），结果见图4、图5和图6。应用该方法能很好的对疫苗病毒进行定量，显示重复性很好，同一批次疫苗间三次重复定量结果相差不大（分别为5.3×10⁴TCID₅₀/头份、3.0×10⁴TCID₅₀/头份、3.0×10⁴TCID₅₀/头份）

图4显示：A1-H1:HCLV疫苗稀释3.0×10¹倍接到ST细胞提取RNA后RT-PCR产物，全部出现阳性把斑点；A2-H2:HCLV疫苗稀释3.0×10²倍接到ST细胞提取RNA后RT-PCR产物，全部出现阳性把斑点；A3-H3:HCLV疫苗稀释3.0×10³倍接到ST细胞提取RNA后RT-PCR产物，A3、B3、G3和H3出现斑点；A4-H4:HCLV疫苗稀释3.0×10⁴倍接到ST细胞提取RNA后RT-PCR产物，无斑点出现；A5-H5:HCLV疫苗稀释3.0×10⁵倍接到ST细胞提取RNA后RT-PCR产物；A6-H6:HCLV疫苗稀释3.0×10⁶倍接到ST细胞提取RNA后RT-PCR产物，无斑点出现；A7-D7:HCLV疫苗阳性对照，即直接提取HCLV疫苗RNA后RT-PCR产物，均出现斑点；E7-H7:未接毒的空白ST细胞提取RNA后RT-PCR产物，无斑点出现。

根据Reed-Meünch法计算得到疫苗A1定量结果为：3.0×10⁴个TCID₅₀/头份的病毒。

图5显示：A1-H1:HCLV疫苗稀释3.0×10¹倍接到ST细胞提取RNA后RT-PCR产物，全部出现阳性把斑点；A2-H2:HCLV疫苗稀释3.0×10²倍接到ST细胞提取RNA后RT-PCR产物，全部出现阳性把斑点；A3-H3:HCLV疫苗稀释3.0×10³倍接到ST细胞提取RNA后RT-PCR产物，A3、B3、C3、D3、G3和H3出现斑点；A4-H4:HCLV疫苗稀释3.0×10⁴倍接到ST细胞提取RNA后RT-PCR产物，无斑点出现；A5-H5:HCLV疫苗稀释3.0×10⁵倍接到ST细胞提取RNA后RT-PCR产物；A6-H6:HCLV疫苗稀释3.0×10⁶倍接到ST细胞提取RNA后RT-PCR产物，无斑点出现；A7-D7:HCLV疫苗阳性对照，即直接提取HCLV疫苗RNA后RT-PCR产物，均出现斑点；E7-H7:未接毒的空白ST细胞提取RNA后RT-PCR产物，无斑点出现。

根据Reed-Meünch法计算得到疫苗A2定量结果为：5.3×10⁴个TCID₅₀/头份的病毒。

图6显示：A1-H1:HCLV疫苗稀释3.0×10¹倍接到ST细胞提取RNA后RT-PCR产物，全部出现阳性把斑点；A2-H2:HCLV疫苗稀释3.0×10²倍接到ST细胞提取RNA后RT-PCR产物，全部出现阳性把斑点；A3-H3:HCLV疫苗稀释3.0×10³倍接到ST细胞提取RNA后RT-PCR产物，C3、D3、G3和H3出现斑点；A4-H4:HCLV疫苗稀释3.0×10⁴倍接到ST细胞提取RNA后RT-PCR产物，无斑点出现；A5-H5:HCLV疫苗稀释3.0×10⁵倍接到ST细胞提取RNA后RT-PCR产物；A6-H6:HCLV疫苗稀释3.0×10⁶倍接到ST细胞提取RNA后RT-PCR产物，无斑点出现；A7-D7:HCLV疫苗阳性对照，即直接提取HCLV疫苗RNA后RT-PCR产物，均出现斑点；E7-H7:未接毒的空白ST细胞提取RNA后RT-PCR产物，无斑点出现。

根据Reed-Meünch法计算得到疫苗A3定量结果为：3.0×10⁴个TCID₅₀/头份的病毒。

2）批间重复试验：在相同条件下，对3个不同批次的疫苗（A1、B、C）做独立的检测，结果见图4、图7和图8所示，表现为不同批次疫苗间的定量结果参差不齐（3.0×10⁴个TCID₅₀/头份，9.5×10³TCID₅₀/头份和1.7×10³TCID₅₀/头份）,相差17.5倍，是批内试验误差的10倍。这说明对猪瘟弱毒疫苗现行的定量方法很不准确。

图4疫苗A1的定量结果见上1）节所示疫苗A1定量结果为3.0×10⁴个TCID₅₀的病毒。

图7疫苗B的定量结果图中：A1-H1:HCLV疫苗稀释3.0×10¹倍接到ST细胞提取RNA后RT-PCR产物，全部出现阳性斑点；A2-H2:HCLV疫苗稀释3.0×10²倍接到ST细胞提取RNA后RT-PCR产物，全部出现阳性斑点；A7-D7:HCLV疫苗阳性对照，即直接提取HCLV疫苗RNA后RT-PCR产物，全部出现阳性斑点；其他点样位置均无斑点出现。

根据Reed-Meünch法计算得到疫苗B定量结果为：9.5×10³TCID₅₀/头份的病毒。

图8疫苗C的定量结果图中：A1-H1:HCLV疫苗稀释3.0×10¹倍接到ST细胞提取RNA后RT-PCR产物，全部出现阳性斑点；A2-H2:HCLV疫苗稀释3.0×10²倍接到ST细胞提取RNA后RT-PCR产物,仅C2和D2出现阳性斑点；A7-D7:HCLV疫苗阳性对照，即直接提取HCLV疫苗RNA后RT-PCR产物，全部出现阳性斑点；其他各点样位置上均无阳性斑点出现。

根据Reed-Meünch法计算得到疫苗B定量结果为：1.7×10³TCID₅₀/头份的病毒。

本发明使用主要试剂及其来源：

TaqDNA聚合酶(5U/μl)、dNTP Mixture(各2.5mmol/L)、（10×）PCR Buffer(含Mg²⁺)、DNAMarker(DL2000)等均购自宝生物工程（大连）有限公司；核酸回收试剂盒DNA Purification KitFrom Gels and Solutions购自OMEGA公司。DMEM干粉购自INVITROGEN公司。胎牛血清(FBS)购自美国GIBCO公司。尼龙膜，DNA Digoxigenin标记和检测试剂盒购自Roche公司。其他常规试剂均为国产分析纯。

附图说明

图1HCLV450bpPCR产物电泳结果M:2000DL；1:以HCLV质粒为模板的普通PCR扩增电泳结果。

图2HCLV核酸探针标记电泳结果M:2000DL;1:以回收450bp基因片段为模板PCR法标记的地高辛HCLV核酸探针；2:以回收450bp基因片段为模板的普通PCR结果；3:以超纯水为模板的普通PCR扩增结果。

图3：探针的灵敏度和特异性检测结果图中：A1-E1：HCLV-E2同源DNA；A2-E2：PPV同源DNA；A3-E3：PCV同源DNA；A4-D4：PRV同源DNA；A5-E5-：PRRSV同源DNA；A6-E6：超纯水；A1-A5：100pg量的DNA；B1-B5：10pg量的DNA；C1-C5：1pg量的DNA；D1-D5：0.1pg量的DNA；E1-E5：0.01g量的DNA。

图4疫苗A1定量结果图中：A1-H1:HCLV疫苗稀释3.0×10¹倍接到ST细胞提取RNA后RT-PCR产物，全部出现阳性把斑点；A2-H2:HCLV疫苗稀释3.0×10²倍接到ST细胞提取RNA后RT-PCR产物，全部出现阳性把斑点；A3-H3:HCLV疫苗稀释3.0×10³倍接到ST细胞提取RNA后RT-PCR产物，A3、B3、G3和H3出现斑点；A4-H4:HCLV疫苗稀释3.0×10⁴倍接到ST细胞提取RNA后RT-PCR产物，无斑点出现；A5-H5:HCLV疫苗稀释3.0×10⁵倍接到ST细胞提取RNA后RT-PCR产物；A6-H6:HCLV疫苗稀释3.0×10⁶倍接到ST细胞提取RNA后RT-PCR产物，无斑点出现；A7-D7:HCLV疫苗阳性对照，即直接提取HCLV疫苗RNA后RT-PCR产物，均出现斑点；E7-H7:未接毒的空白ST细胞提取RNA后RT-PCR产物，无斑点出现。

图5疫苗A2定量结果图中：A1-H1:HCLV疫苗稀释3.0×10¹倍接到ST细胞提取RNA后RT-PCR产物；A2-H2:HCLV疫苗稀释3.0×10²倍接到ST细胞提取RNA后RT-PCR产物；A3-H3:HCLV疫苗稀释3.0×10³倍接到ST细胞提取RNA后RT-PCR产物；A4-H4:HCLV疫苗稀释3.0×10⁴倍接到ST细胞提取RNA后RT-PCR产物；A5-H5:HCLV疫苗稀释3.0×10⁵倍接到ST细胞提取RNA后RT-PCR产物；A6-H6:HCLV疫苗稀释3.0×10⁶倍接到ST细胞提取RNA后RT-PCR产物；A7-D7:HCLV疫苗阳性对照，即直接提取HCLV疫苗RNA后RT-PCR产物；E7-H7:未接毒的空白ST细胞提取RNA后RT-PCR产物。

图6疫苗A3定量结果图中：A1-H1:HCLV疫苗稀释3.0×10¹倍接到ST细胞提取RNA后RT-PCR产物；A2-H2:HCLV疫苗稀释3.0×10²倍接到ST细胞提取RNA后RT-PCR产物；A3-H3:HCLV疫苗稀释3.0×10³倍接到ST细胞提取RNA后RT-PCR产物；A4-H4:HCLV疫苗稀释3.0×10⁴倍接到ST细胞提取RNA后RT-PCR产物；A5-H5:HCLV疫苗稀释3.0×10⁵倍接到ST细胞提取RNA后RT-PCR产物；A6-H6:HCLV疫苗稀释3.0×10⁶倍接到ST细胞提取RNA后RT-PCR产物；A7-D7:HCLV疫苗阳性对照，即直接提取HCLV疫苗RNA后RT-PCR产物；E7-H7:未接毒的空白ST细胞提取RNA后RT-PCR产物。

图7疫苗B的定量结果图中：A1-H1:HCLV疫苗稀释3.0×10¹倍接到ST细胞提取RNA后RT-PCR产物；A2-H2:HCLV疫苗稀释3.0×10²倍接到ST细胞提取RNA后RT-PCR产物；A3-H3:HCLV疫苗稀释3.0×10³倍接到ST细胞提取RNA后RT-PCR产物；A4-H4:HCLV疫苗稀释3.0×10⁴倍接到ST细胞提取RNA后RT-PCR产物；A5-H5:HCLV疫苗稀释3.0×10⁵倍接到ST细胞提取RNA后RT-PCR产物；A6-H6:HCLV疫苗稀释3.0×10⁶倍接到ST细胞提取RNA后RT-PCR产物；A7-D7:HCLV疫苗阳性对照，即直接提取HCLV疫苗RNA后RT-PCR产物；E7-H7:未接毒的空白ST细胞提取RNA后RT-PCR产物。

图8疫苗C的定量结果图中：A1-H1:HCLV疫苗稀释3.0×10¹倍接到ST细胞提取RNA后RT-PCR产物；A2-H2:HCLV疫苗稀释3.0×10²倍接到ST细胞提取RNA后RT-PCR产物；A3-H3:HCLV疫苗稀释3.0×10³倍接到ST细胞提取RNA后RT-PCR产物；A4-H4:HCLV疫苗稀释3.0×10⁴倍接到ST细胞提取RNA后RT-PCR产物；A5-H5:HCLV疫苗稀释3.0×10⁵倍接到ST细胞提取RNA后RT-PCR产物；A6-H6:HCLV疫苗稀释3.0×10⁶倍接到ST细胞提取RNA后RT-PCR产物；A7-D7:HCLV疫苗阳性对照，即直接提取HCLV疫苗RNA后RT-PCR产物；E7-H7:未接毒的空白ST细胞提取RNA后RT-PCR产物。

图9疫苗的定量结果疫苗1：A1-B1:HCLV疫苗稀释10⁰、C1-D1:疫苗稀释10^-1、E1-F1:疫苗稀释10^-2；A2-B2:HCLV疫苗稀释10^-3、C2-D2:疫苗稀释10^-4、E2-F2:疫苗稀释10^-5接到ST细胞提取RNA后RT-PCR产物；疫苗2：A3-B3:HCLV疫苗稀释10⁰、C3-D3:疫苗稀释10^-1、E3-F3:疫苗稀释10^-2；A4-B4:HCLV疫苗稀释10^-3、C4-D4:疫苗稀释10^-4、E4-F4:疫苗稀释10^-5接到ST细胞提取RNA后RT-PCR产物；A5-D5：为阳性对照；E5：为空白对照（DEPCH₂O）F5:阴性对照。

本发明涉及的微生物资源

本发明涉及的微生物为猪瘟病毒病毒（Classical swine fever virus，CSFV）兔化弱毒株，又称C株（HCLV，CVCC AV1412）；该毒株是我国和世界许多国家制备猪瘟活疫苗的生产毒株（中国兽医药品监察所，中国兽医微生物菌种保藏管理中心编著.中国兽医菌种目录，第二版2002，中国农业科学技术出版社，2002，p145）。

本发明的积极意义

本发明涉及建立一种猪瘟活疫苗中病毒含量测定方法及猪瘟病毒兔化弱毒核酸探针试剂盒。本发明采用PCR法制备HCLV特异性地高辛标记的DNA探针，同时将HCLV疫苗梯度稀释后接种于24孔培养板上的ST细胞中，在培养7天后分别从接种各稀释度的不同孔细胞中提取RNA后，用RT-PCR结合斑点杂交的方法检测病毒感染。应用该方法能很好的对疫苗病毒实施以TCID₅₀为单位的准确定量，多次重复实验发现对同一批次疫苗间定量的重复好，相互结果相差不大（5.3×10⁴TCID₅₀、3.0×10⁴TCID₅₀、3.0×10⁴TCID₅₀）。本发明技术方案的实验结果表明RT-PCR结合斑点杂交定量方法能准确、完全的对疫苗HCLV定量，值得推广应用。

实施例1

——疫苗检验的结果

（1）猪瘟活疫苗：浙江诺倍威生物技术有限公司生产，20头份/瓶。

疫苗1：起始用1ml DMEM稀释疫苗（10⁰）后，10倍梯度倍比稀释，共稀释成6个梯度（10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4和10^-5），每个梯度用Trizon法提取RNA（不做重复），每个梯度的RNA做两个平行的RT-PCR，点杂交时每个PCR产物点一个孔；

疫苗2:起始用500μl DMEM稀释疫苗后重复以上实验。

（2）疫苗接种于ST细胞

将长成单层的ST细胞胰酶消化后充分吹打，传代于24孔细胞培养板，于37℃5%的CO₂培养箱中培养，待其贴壁后将疫苗用3ml生长液稀释，分装于3个1.5ml离心管，漩涡振荡15S,12000r/min低温离心3分钟，取上清用一次性滤器过滤后再从10⁰～10^-5做10倍梯度倍比稀释，接种于单层细胞，每孔100μl，吸附3h后弃去上清和非吸附细胞，并加1ml 1%FBS的维持液，连续观察7天后收获细胞，冻存于-80℃。

（3）RT-PCR扩增HCLV基因片段

用Viral RNA Kit（R6874-01购自公司）从猪瘟活疫苗中直接提取猪瘟兔化弱毒病毒RNA为模板用TakaRa RNA PCR Kit(AMV)V3.0（#DRR019A购自日本TakaRa公司）用HCLV-F2/HCLV-R2引物（见表1）进行RT-PCR，每个样品做两个重复。10μl RT体系包括1μl dNTP,2μlMg²⁺,1μl RT-Buffer,1μl HCLV-R2,0.5μl AMV条件：42℃延伸60min,99℃变性5min。PCR条件：95℃预变性4min后94℃变性30s,65℃退火30s,72℃延伸90s,32个循环，最后延伸10min分钟。

（4）斑点杂交检测扩增片段

按照附注记载的方法，用DIG Labeling and Detectiong Kit试剂盒（购自Roche公司公司）做斑点杂交，检测RT-PCR产物，试验术式见表2所示。

表2疫苗检验术式和结果

由图9显示的结果，该批疫苗的病毒含量为：10^-4EID₅₀//头份。

附注：斑点杂交试验的操作方法

具体步骤如下（本发明所用试剂购自罗氏公司PCR DIG Probe Synthesis Kit，Cat.No.11636090910和DIG Nucleic Acid Detection Kit，Cat.No.11175041910）：

1）取一张适当大小的硝酸纤维素膜（NC膜，购自罗氏公司），划好格子（0.7cm×0.7cm），做好标记。

2）把每个提取的样品DNA分别点到NC膜上。

3）NC膜（点样面朝上）放于已用变性液（0.5mol/L NaOH，1.5mol/L NaCl）饱和的双层滤纸上变性10min，再放于已用中和液（0.5mol/L Tris-Cl，3.0mol/L NaCl，pH7.4）饱和的双层滤纸上中和5min。

4）NC膜室温干燥30min，然后在80℃干烤2h固定DNA。

5）将NC膜放于预杂交液（5×SSC，0.2%SDS，2%Blocking Reagen，）于68℃反应2h，期间经常摇动NC膜。

6）将探针于沸水中变性10min，取出后立即置于冰浴中冷却5min。

7）将变性的探针倒入预杂交液中，充分混匀即成杂交液，使NC膜在其中68℃（温度可调整）杂交6h以上。

8）将NC膜放于洗液I（2×SSC，0.1%SDS）中室温洗涤15min，2次。

9）将NC膜放于洗液II（0.5×SSC，0.1%SDS）中68℃洗涤15min，2次。

10）置NC膜于缓冲液I（0.1mol/L Tris-Cl，0.15mol/L NaCl，pH7.5）中洗1min。

11）置NC膜于缓冲液II（Buffer I中加入2%Blocking Reagen）中反应30min，再用缓冲液I洗1min。

12）在20ml缓冲液II中加入4μl抗狄可辛抗体的碱性磷酸酶标记物，用之前经10000r/min离心5min，），将膜放于其中37℃浸泡30min。

13）用缓冲液I洗涤NC膜；5min×5次。

14）置NC膜于缓冲液III（0.1mol/L Tris-Cl，0.1mol/L NaCl，0.05mol/L MgCl₂，pH9.5）中反应浸泡2min。

15）在适当大小的容器中加入10ml缓冲液III和100μl显色液（NBT和BCIP混合物），将NC膜放入其中显色一定时间，加入蒸馏水终止显色反应。

Claims

1.一种猪瘟活疫苗中病毒含量测定的方法，其特征在于：

2.如权利要求1所述一种猪瘟活疫苗中病毒含量测定的方法的应用，其特征在于用该方法测定的以TCID₅₀/头份为单位的猪瘟兔化弱毒病毒定量结果作为猪瘟活疫苗效价检验的质量标准。

3.一种实施权利要求1猪瘟病毒兔化弱毒株病毒含量测定的猪瘟病毒兔化弱毒特异性核酸探针试剂盒，其特征在于该试剂盒含有：

（1）经狄高辛标记的HCLV-E2DNA探针；

4.如权利要求3所述一种猪瘟兔化弱毒特异性核酸探针试剂盒的应用，其特征在于该试剂盒可用于猪瘟活疫苗成品检验中的效价检验。

5.如权利要求3所述一种猪瘟兔化弱毒特异性核酸探针试剂盒的应用，其特征在于该试剂盒可用于猪瘟病毒的检测和流行病学调查。