CN104711373A - 耐RNase的登革病毒核酸检测质控品的制备方法 - Google Patents

耐RNase的登革病毒核酸检测质控品的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种耐RNase的登革病毒核酸检测质控品的制备方法；利用MS2噬菌体装甲技术和定点突变技术，制备了带有组氨酸标签和登革病毒3’URT基因的装甲RNA质控品，通过镍柱亲和层析纯化得到登革病毒装甲RNA质控品，该质控品具有易于纯化，稳定，高浓度，无生物传染性，耐RNase等特点，可对登革病毒检测中的病毒提取，逆转录，PCR等全过程进行质量控制。

Description

耐RNase的登革病毒核酸检测质控品的制备方法
技术领域
本发明涉及传染病检测技术领域，是一种耐RNase的登革病毒核酸检测质控品的制备方法。
背景技术
登革病毒属于黄病毒科(Flaviviridae)，为单股正链RNA病毒，是人类最重要的虫媒病毒，能够引起登革热和登革出血热，主要由埃及伊蚊和白纹伊蚊传播。该病广泛流行于热带和亚热带地区，是一种分布广、发病多、危害较大的人类传染病。近些年，全球气候变暖，人口流动等因素导致在亚洲、非洲和南美洲的热带以及亚热带地区登革病毒感染的发病率呈明显上升趋势，在我国南部地区也常有小范围的爆发流行。因此，能及时地检测和准确快速地诊断是控制疾病发展的首要步骤，核酸检测技术因具有快速、灵敏、特异性强等特点，已成为登革病毒的主要检测技术，广泛用于临床样品的检测和分子流行病学调查。
登革病毒依抗原性不同可分为1、2、3、4四个血清型，基因组RNA约含有11000个核苷酸，基因组只有一个开放读码框，编码三个结构蛋白(C、PrM和E)和七个非结构蛋白(NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5)，基因组的5′端和3′端均有一段高度保守的非编码区，是登革病毒通用核酸检测的主要靶基因。
目前，国内外针对登革病毒建立了多种核酸检测方法，其中应用最多是RT-PCR和荧光RT-PCR方法，市场上也有多种不同厂家生产的核酸检测试剂盒，这些试剂盒在检测特异性、灵敏度等方面均有不同，直接影响检测结果的一致性和准确性。此外，目前登革病毒通用核酸检测方法和试剂使用的质控样品多选择质粒DNA，不能实现核酸提取过程的有效监控，难以保证检测结果的准确性。因此，研制一种既稳定又没有传染性可用于登革病毒通用核酸检测的质控样品对于其检测方法和试剂的标准化、规范化使用及临床检测具有重要意义。
目前装甲RNA质控品多通过聚二乙醇沉淀或者氯化铯超速离心进行纯化，纯化方法繁琐，纯化效果一般，因此建立简便，高效的纯化方法也是制备和推广装甲RNA质控品的关键因素。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提出一种耐RNase的登革病毒核酸检测质控品的制备方法，操作简单，效果好。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：一种耐RNase的登革病毒核酸检测质控品的制备方法，包括以下步骤：
(1)、采用一步法RT-PCR，以MS2RNA为模板扩增外壳蛋白基因和成熟酶蛋白基因片段，回收片段和D-pET32a均用BamH I和Hind III双酶切后连接，转化DH-5α菌株，获得假病毒表达载体D-pET32a-CP；
(2)、用Site-Directed Mutagenesis Kit试剂盒通过PCR扩增的方法在D-pET32a-CP载体的衣壳蛋白基因第16个密码子后插入编码6个组氨酸的DNA序列，成功得到带有组氨酸标签的假病毒表达载体D-pET32a-CP-His；
(3)、登革病毒3’URT基因克隆于原核表达载体D-pET32a-CP-His中，获得表达载体D-pET32a-CP-His-DFV；
(4)、将表达载体D-pET32a-CP-His-DFV转入表达菌株中，诱导表达，离心，收集沉淀，镍柱亲和层析纯化获得病毒样颗粒。
优选的，登革病毒3’URT基因通过RT-PCR扩增获得。
优选的，步骤(4)具体操作为：将D-pET32a-CP-His-DFV质粒转化表达菌株BL21(DE3)，阳性克隆接入3mL含Amp(100μg/mL)的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜；1∶100接种过夜培养液至100mL含LB液体培养基中，37℃振荡培养3h左右至OD值0.6-0.8；在培养物中加入诱导剂IPTG至终浓度为1.0mmol/L，28℃继续振荡培养16h后取出，12000rpm收集菌体；用QIAgenNi-NTA Fast Start Kit纯化获得内含登革病毒3’URT基因装甲RNA病毒样颗粒。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：利用MS2噬菌体装甲技术和定点突变技术，制备了带有组氨酸标签和登革病毒3’URT基因的装甲RNA质控品，通过镍柱亲和层析纯化得到登革病毒装甲RNA质控品，该质控品具有易于纯化，稳定，高浓度，无生物传染性，耐RNase等特点，可对登革病毒检测中的病毒提取，逆转录，PCR等全过程进行质量控制。
经镍柱亲和层析纯化的登革病毒装甲RNA质控品，浓度可到达5×106拷贝数/μL，纯化方法简便，纯化浓度高，普通PCR无扩增，表明纯化颗粒中无质粒DNA污染。稳定性实验证实该质控品可以在-20℃～4℃条件下稳定存在至少半年以上，反复冻融对其的稳定性也影响不大。制备的装甲RNA质控品和阳性登革病毒感染样品检测后出现典型的扩增曲线，PBS等阴性样品无Ct值并且无扩增曲线，与预期结果相符。表明该装甲RNA标准物质可实现对样品核酸提取和检测过程的全程质量控制，可作为阳性质控样品应用到登革病毒通用型实时荧光RT-PCR检测方法中。
附图说明
图1为RT-PCR扩增产物凝胶电泳图；
图2为BamHI和Hind III双酶切D-pET32a-CP凝胶电泳图；
图3为RT-PCR和PCR方法扩增登革病毒假病毒登革病毒3’URT基因片段凝胶电泳图；
图4为登革病毒假病毒质控品RT-PCR扩增。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细描述，本部分的描述仅是示范性和解释性，不应对本发明的保护范围有任何的限制作用。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施实例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂供应商购买得到。
实施例1：内含组氨酸标签和登革病毒3’URT基因的装甲RNA的获得及鉴定
1、材料
1型登革病毒RNA，去除蛋白标签的D-pET32a质粒，MS2噬菌体RNA均为本室保存。
2、方法
1)引物设计
根据GenBank公布的I～IV型登革病毒全基因组序列比对分析，选择病毒高度保守的3’非编码区的序列作为扩增目的片段。Primer 5.0软件设计引物DFVF/DFVR，片段大小320bp，扩增引物中引入了HindIII/NotI酶切位点。为了扩增MS2噬菌体的外壳蛋白基因和成熟酶蛋白基因，设计引物对MSF和MSR，并分别在5’端添加BamHI和Hind III酶切位点。引物对MS-HISF/MS-HISR用于在衣壳蛋白基因第16个密码子后插入编码6个组氨酸的序列。所有引物和PCR扩增片段大小见表1。
表1基因克隆用引物
2)登革病毒3’URT基因的扩增
1型登革病毒RNA作为模板，RT-PCR扩增3’URT片段，RT-PCR体系为：上/下游引物(10μmol/L)1/1μL，模板2μL，PrimeScript 1Step EnzymeMix1μL，2×1step buffer 12.5μL，dH207.5μL。RT-PCR反应条件为50℃反转录30min；95℃变性5min；94℃1min，55℃1min，72℃1min，35个循环；72℃10min。PCR扩增产物经过电泳、回收、纯化后进行测序。
3)装甲RNA表达载体的构建
采用一步法RT-PCR，以MS2RNA为模板扩增CP基因片段，回收片段和D-pET32a均用BamHI和Hind III双酶切后连接，转化DH-5α菌株，获得假病毒表达载体D-pET32a-CP。利用Site-Directed MutagenesisKit试剂盒通过PCR扩增的方法在D-pET32a-CP载体的衣壳蛋白基因第16个密码子后插入编码6个组氨酸的序列，成功得到带有组氨酸标签的假病毒表达载体D-pET32a-CP-His。将D-pET32a-CP-His载体与登革病毒3’URT基因片段分别用Hind III和Not I酶切后，连接转化DH-5α菌株，获得的质粒测序鉴定，最终得到D-pET32a-CP-His-DFV质粒。
4)装甲RNA VLPs的诱导表达
将D-pET32a-CP-His-DFV质粒转化BL21(DE3)菌株，阳性克隆接入3mL含Amp(100μg/mL)的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜；1∶100接种过夜培养液至100mL含LB液体培养基中，37℃振荡培养3h左右至OD值0.6-0.8；在培养物中加入诱导剂IPTG至终浓度为1.0mmol/L，28℃继续振荡培养16h。
5)装甲RNA VLPs的纯化
将诱导后的菌液12000rpm离心，收集菌体。用QIAgen Ni-NTA Fast StartKit纯化获得内含登革病毒3’URT基因装甲RNA病毒样颗粒(VLPs)，具体过程按照Qiagen相关操作手册所述方法进行。
6)装甲RNA VLPs的鉴定
为鉴定所制备的装甲RNA病毒样颗粒含有登革病毒3’URT基因且没有质粒DNA残留，将纯化50uL VLPs悬液，用Qiagen RNA提取试剂盒提取RNA，将提取的RNA分作两份：一份进行RT-PCR扩增，另外一份不经反转录，直接进行PCR扩增。取扩增产物，电泳观察结果。
3、结果
1)登革病毒3’URT基因的扩增
以引物对DFVF/DFVR扩增，PCR产物电泳可见约300bp的特异性片段，与预期的目的片段大小相符，如图1所示。测序结果表明扩增产物是登革病毒3’URT基因，核苷酸序列如下：
CGAAAGCCACGGTTTGAGCAAGCCGTGCTGCCTGTAGCTCCATCGTGGGGATGTAAAAACCTGGGAGGCTGCAAACCATGGAAGCTGTACGCATGGGGTAGCAGACTAGTGGTTAGAGGAGACCCCTCCCAAAACACAACGCAGCAGCGGGGCCCAACACCTGGGAAAGCTGTACCCTGGTGGTAAGGACTAGAGGTTAGAGGAGACCCCCCGCATAACAATAAACAGCATATTGACGCTGGGAGAGACCAGAGATCCTGCTGTCTCTACAGCATCATTCCAGGCACAGAACGCCAGAAAATGGA。
2)装甲RNA病毒样颗粒(VLPs)表达载体的构建
扩增MS2噬菌体成熟酶蛋白基因和衣壳蛋白基因序列(CP基因片段)，定向克隆于表达载体D-pET32a中，提取质粒经和BamHI和Hind III双酶切鉴定阳性质粒，琼脂糖凝胶电泳结果可见约1800bp左右的目的条带和约6kb的载体条带，与预期大小相符，如图2所示。
利用Site-Directed Mutagenesis Kit试剂盒通过PCR扩增的方法在D-pET32a-CP载体的衣壳蛋白基因第16个密码子后插入编码6个组氨酸的序列，成功得到带有组氨酸标签的假病毒表达载体D-pET32a-CP-His。将D-pET32a-CP-His载体与登革病毒3’URT基因片段分别用Hind III和Not I酶切后，连接转化DH-5α菌株，获得的质粒测序鉴定，最终得到D-pET32a-CP-His-DFV质粒。
3)装甲RNA VLPs的鉴定
用QIAgen Ni-NTA Fast Start Kit纯化获得内含登革病毒3’URT基因装甲RNA病毒样颗粒(VLPs)。取50uL纯化VLPs悬液，用Qiagen RNA提取试剂盒提取RNA，将提取的RNA分作两份：一份进行RT-PCR扩增，另外一份不经反转录，直接进行PCR扩增。分别进行直接PCR和RT-PCR。电泳结果显示RT-PCR扩增后出现相应大小的目的条带，而直接PCR扩增没有出现目的条带，如图3所示。这些结果表明所制备的装甲RNA病毒样颗粒包裹了登革病毒3’URT基因片段，且没有质粒DNA的残留，可用于装甲RNA质控品的制备。
实施例2：装甲RNA质控品稳定性验证
1、不同保存条件的稳定性试验
采用实施例1中纯化的病毒样颗粒溶液用含有15％甘油的缓冲液稀释到105copies/mL，每管50uL分装分别置于室温、4℃、-20℃，放置5d、30d、60d、90d、120d、150d、180d，取样检测，观察其稳定性。另一管600uL病毒颗粒放置-70℃和37℃下反复冻融10次，检测其稳定性。将检测组与对照组(-70℃)数据作t检验分析表明检测组与对照组差异均无统计学意义(P＞0.5)，该标准物质在-20℃和4℃可至少保存6个月以上，室温保存期至少14天，反复冻融对假病毒的稳定性也影响不大，该标准物质具有良好的稳定性。
2、RNase攻击试验
随机抽取制备好的质控品10管，另取2管登革病毒裸露RNA，作为对照。分两组进行试验，一组加入RNase A(1μg/mL)37℃放置60min，另一组不做处理。之后同时提取RNA进行实时荧光RT-PCR检测，观察标准物质的耐RNase特性。结果裸露RNA经RNaseA处理后，检测为无Ct值且无扩增曲线；装甲RNA质控品RNase处理组和对照组实时荧光RT-PCR检测数据作t检验分析，结果表明差异均无统计学意义(P＞0.5)，说明制备的装甲RNA质控品能够抵抗RNase的降解。
实施例3：质控品在登革热核酸检测中的实际应用
1、试剂
核酸提取试剂：Viral RNA Mini RNA提取试剂盒
检测试剂：某针对登革病毒3’UTR区的商品化通用型荧光RT-PCR检测试剂盒
样品：内含登革病毒3’URT基因的装甲RNA质控品，实验室保存的1型和4型登革病毒阳性血液样本，临床阴性血液样本，PBS溶液。
2、核酸提取
按照Viral RNA Mini RNA提取试剂盒的提取方法分别对质控品、阳性血液和阴性血液样本提取RNA，将提取好的RNA溶于60μLDEPC水中。
3、荧光定量RT-PCR反应
荧光RT-PCR反应液配制：按照RT-PCR检测试剂盒规定的方法配制。
加样：突光RT-PCR扩增反应体系为25μL，每个样品测试反应体系需要20μL荧光RT-PCR反应液，之后每管分别加入提取的RNA溶液5μL。
上机反应：将PCR管放入荧光RT-PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。按如下循环条件设置反应：
第一阶段，反转录42℃/10min；
第二阶段，预变性94℃/15min；
第三阶段，94℃/15s，60℃/1min，40个循环，在第三阶段每个循环的退火延伸时收集荧光。试验检测结束后，根据收集的荧光曲线和Ct值判定结果。
结果判定：阴性无Ct值并且无扩增曲线。阳性Ct值≤38，且出现典型的扩增曲线。有效原则Ct＞38的样本建议重做。重做结果无Ct值者为阴性，否则为阳性。
4.质控品检测结果及质控性能评价
实施例1中制备的装甲RNA质控品和实验室保存的1型和4型登革病毒阳性血液样本检测后出现典型的扩增曲线且Ct值均小于38，临床阴性血液样本和PBS等阴性样品无Ct值并且无扩增曲线，与预期结果相符，如图4所示，表明该装甲RNA质控品可实现对样品核酸提取和检测过程的全程质量控制，可作为阳性质控样品应用到登革病毒通用荧光RT-PCR检测方法中。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种耐RNase的登革病毒核酸检测质控品的制备方法，包括以下步骤：
(1)、采用一步法RT-PCR，以MS2 RNA为模板扩增外壳蛋白基因和成熟酶蛋白基因片段，回收片段和D-pET32a均用BamH I和Hind III双酶切后连接，转化DH-5α菌株，获得假病毒表达载体D-pET32a-CP；
(2)、用Site-Directed Mutagenesis Kit试剂盒通过PCR扩增的方法在D-pET32a-CP载体的衣壳蛋白基因第16个密码子后插入编码6个组氨酸的DNA序列，成功得到带有组氨酸标签的假病毒表达载体D-pET32a-CP-His；
(3)、登革病毒3’URT基因克隆于原核表达载体D-pET32a-CP-His中，获得表达载体D-pET32a-CP-His-DFV；
(4)、将表达载体D-pET32a-CP-His-DFV转入表达菌株中，诱导表达，离心，收集沉淀，镍柱亲和层析纯化获得病毒样颗粒。
2.如权利要求1所述制备方法，其特征在于：登革病毒3’URT基因通过RT-PCR扩增获得。
3.如权利要求1所述制备方法，其特征在于：步骤(4)具体操作为：将D-pET32a-CP-His-DFV质粒转化表达菌株BL21(DE3)，阳性克隆接入3mL含Amp(100μg/mL)的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜；1∶100接种过夜培养液至100mL含LB液体培养基中，37℃振荡培养3h左右至OD值0.6-0.8；在培养物中加入诱导剂IPTG至终浓度为1.0mmol/L，28℃继续振荡培养16h后取出，12000rpm收集菌体；用QIAgen Ni-NTA Fast Start Kit纯化获得内含登革病毒3’URT基因装甲RNA病毒样颗粒。
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