CN108795961A - 肠道病毒pcr质控品装甲rna及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了肠道病毒PCR质控品装甲RNA及制备方法，该装甲RNA的表达载体为pET32a‑MS2‑CP‑ENV‑2B质粒，该表达载体pET32a‑MS2‑CP‑ENV‑2B质粒转入大肠杆菌原核表达菌株BL21中，诱导表达，超声波破碎后，离心收集沉淀，获得肠道病毒PCR质控品装甲RNA的病毒样颗粒，其中该表达载体pET32a‑MS2‑CP‑ENV‑2B质粒中，MS2‑CP的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:1所示，ENV‑2B的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:2所示；该装甲RNA储存时不会受到RNase酶降解，是性能稳定的肠道病毒PCR质控品；该装甲RNA的制备方法操作简单、安全和有效。

Description

肠道病毒PCR质控品装甲RNA及制备方法
技术领域
本发明涉及肠道病毒属病毒的检测技术，具体涉及肠道病毒PCR质控品装甲RNA及制备方法。
背景技术
肠道病毒(Enterovirus)属于微小RNA病毒科(Picornaviridae) 、肠道病毒属（Enterovir-us），已知有64种血清型会感染人体，包括脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒和一些新型肠道病毒和甲型肝炎病毒等。比如1998年台湾地区爆发了由肠道病毒71型(EV71) 流行感染的手足口病和疱疹性咽呷炎，感染人数超过10万，几百人因并发脑炎、无菌性脑膜炎、肺水肿和出血、急性弛缓性麻痹和心肌炎而死亡；近年还有一些研究表明糖尿病也与肠道病毒有关。现有的肠道病毒的检测技术，以PCR技术为代表的分子生物学技术，具有快速、灵敏、成本低等优势，但核酸检测必须使用质控品进行质量控制。目前RNA病毒的质控品主要为病毒颗粒、裸露的RNA片段和装甲RNA。病毒颗粒包括减毒、灭活病毒或疫苗，目前除黄热病毒、汉坦病毒少数有减毒活疫苗其余病毒性出血热外均无疫苗。国内目前市面在售各类出血热病毒检测试剂盒一般采用合成RNA或DNA片段，RNA模板容易在环境中受到RNase酶降解。以噬菌体为基础的内嵌核酸病毒盔甲颗粒因其与全病毒颗粒最为接近，已成为标准物质研制的一个热点，如将MS2噬菌体相应cDNA序列克隆至原核表达载体并插入特定病毒序列，经转录、翻译噬菌体衣壳蛋白组装成病毒样颗粒（装甲RNA），具备RNase抗性便于存储和运输。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种肠道病毒PCR质控品装甲RNA及制备方法，该装甲RNA储存时不会受到RNase酶降解，是性能稳定的肠道病毒PCR质控品；该装甲RNA的制备方法操作简单、安全和有效。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为： 肠道病毒PCR质控品装甲RNA，该装甲RNA的表达载体为 pET32a- MS2-CP-ENV-2B质粒，该表达载体pET32a- MS2-CP-ENV-2B质粒转入大肠杆菌原核表达菌株BL21中，诱导表达，超声波破碎后离心收集沉淀，获得肠道病毒PCR质控品装甲RNA的病毒样颗粒，其中该表达载体pET32a- MS2-CP-ENV-2B质粒中，MS2-CP的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:1所示，ENV-2B的核苷酸序列为序列表中SEQID NO:2所示。
肠道病毒PCR质控品装甲RNA的制备方法，其步骤如下：
a. ENV-2B获得：以肠道病毒属CODEHOP引物E4559/ FE4937扩增临床分离的阳性CODEHOP样本，并将扩增序列克隆至pUCm-T质粒载体中，获得目的序列片段pUCm-ENV-2B；
b. 噬菌体MS2-CP获得：以Genbank数据库中噬菌体MS2基因序列为基本序列，将序列递交生物公司进行合成，序列包括5’非编码区序列、成熟酶蛋白基因序列、衣壳蛋白基因序列、包装位点和复制酶基因序列，在序列5’端和3’端分别插入Kpn I 、BamHI酶切位点，双酶切后插入到原核表达载体pET32a中，获得表达载体pET32a-MS2-CP；
c. pET32a- MS2-CP-ENV-2B质粒获得：将pET32a-MS2-CP和pUCm-ENV-2B均使用BamHI、Not I双酶切，回收pET32a-MS2-CP和ENV-2B序列片段并相互连接，然后转化至DH5α菌株，获得肠道病毒装甲RNA表达载体 pET32a- MS2-CP-ENV-2B质粒；
d. 肠道病毒装甲RNA获得：将pET32a-MS2-CP-ENV-2B质粒转入大肠杆菌原核表达菌株BL21中，诱导表达，超声波破碎后离心、收集沉淀，获得肠道病毒装甲RNA的病毒样颗粒。
与现有技术相比，本发明的优点在于肠道病毒PCR质控品装甲RNA及制备方法，该装甲RNA的表达载体为 pET32a- MS2-CP-ENV-2B质粒，该表达载体pET32a- MS2-CP-ENV-2B质粒转入大肠杆菌原核表达菌株BL21中，诱导表达，超声波破碎后，离心收集沉淀，获得肠道病毒PCR质控品装甲RNA的病毒样颗粒，其中该表达载体pET32a- MS2-CP-ENV-2B质粒中，MS2-CP的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:1所示，ENV-2B的核苷酸序列为序列表中SEQID NO:2所示；该装甲RNA储存时不会受到RNase酶降解，是性能稳定的肠道病毒PCR质控品；该装甲RNA的制备方法操作简单、安全和有效。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1：肠道病毒属病毒2B基因装甲RNA的获得和鉴定
肠道病毒ENV-2B基因扩增：使用QiaGen RNeasy Mini Kit提取试剂盒（购自Qiagen公司）提取临床CODEHOP阳性样本RNA，方法参照试剂盒说明书。采用肠病毒病毒属CODEHOP 通用型引物E4559（市售）/ FE4937（市售）扩增阳性样本，该对引物可用于肠道病毒属病毒检测。引物序列如序列表中SEQ ID NO:3和4所示，反应体系为：2 X 1 step buffer 10µL、PrimerScript 1 setp Enzyme Mix 0.8µL、引物E4559/FE4937 （20pmol）1µL、待检RNA 1µL、补充Rnase free water 至20µL。反应条件：42℃ 30min，94℃ 2sec，94℃30s，56℃30sec，72℃ 1min（35cycle），72℃ 10min。选用1.5%琼脂糖凝胶电泳观察PCR扩增效果。选用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit回收400bp左右的目的片段，方法参照试剂盒说明书。扩增片段插入至pUCm-T载体，得到pUCm- ENV-2B。取5μL连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，进行蓝白斑筛选。在转化的LB平板上挑取白色克隆，接种2mL LB液体培养基，37℃过夜培养，使用TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit小型质粒提取试剂盒提取质粒，方法参照说明书。使用BamHI 、Not I双酶切pUCm-ENV-2B质粒，反应体系：10 X K Buffer 1µL、BamHI（15units/µL）1µL 、Not I（10units/µL）1µL, 0.1% BSA1µL,质粒1µL，DDW 15µL，37℃酶切1h电泳观察PCR扩增效果，使用MiniBEST Agarose Gel DNAExtraction Kit 胶回收试剂盒回收400bp左右ENV-2B片段，方法参照说明书。载体片段pET32a- MS2-CP获得：设计合成包含噬菌体MS2-CP蛋白序列片段并在序列两端分别插入Kpn I 1.BamHI酶切位点,并对MS2-CP蛋白部分核酸序列进行优化，合成MS2-CP蛋白的核苷酸序列如序列表中ID NO:1所示（委托生物公司合成并测序）。将合成MS2-CP蛋白的核苷酸序列和表达Pet-32a载体双酶切，酶切反应体系：10 X K Buffer 1µL、BamHI（15units/µL）1µL 、Kpn I（10units/µL）1µL,合成片段1µL，DDw 16µL，37℃酶切1h。使用MiniBEST AgaroseGel DNA Extraction Kit 胶回收试剂盒分别回收1800bp左右的MS2-CP蛋白的序列片段和6000bp左右的pET32a质粒载体。反应体系：10 X T4 DNA ligase Buffer 2µL、CP 3µL，pET32a 1µL，T4 DNA Ligase 1µL，DDW 13µL，16℃过夜反应。将连接质粒转化感受态细胞进行蓝白斑筛选。在转化的LB平板上挑取白色克隆，接种2mL LB液体培养基，37℃过夜培养，使用TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit小型质粒提取质粒，使用BamHI 、Not I双酶切鉴定，酶切方法参照ENV-2B酶切方法。使用MiniBEST Agarose Gel DNA ExtractionKit 胶回收试剂盒回收8000bp左右pET32a- MS2-CP片段。装甲RNA表达载体的构建和诱导表达：将酶切回收的ENV-2B和pET32a- MS2-CP片段连接，将连接质粒转化DH5α感受态细胞进行蓝白斑筛选。在转化的LB平板上挑取白色克隆，接种2mL LB液体培养基，37℃过夜培养，试剂盒提取质粒，使用引物M13上下游引物扩增片段并测序。得到pET32a-MS2-CP-ENV-2B质粒。将质粒pET32a-CP-ENV-2B转化BL21（DE3）菌株，挑取鉴定好的pET-32a-MS2-CP-ENV-2B阳性菌按1:100比例转接种2mL 2×YT液体培养基，37℃ 200rpm摇4h后，加1mMIPTG，诱导5h后，终止培养。离心收集菌体，超声波破碎后离心取上清，得到粗制的肠道病毒PCR质控品装甲RNA病毒样颗粒产物。
实施例2：肠道病毒装甲RNA的鉴定
取20µLCODEHOP病毒使用100U RNase A和2U DNaseI，37℃作用1h,使用QiaGen RNeasyMini Kit提取试剂盒（购自Qiagen公司）提取RNA，使用肠病毒引物分别进行PCR和RT-PCR扩增，PCR反应体系： 10 X PCR Buffer 2µL、dNTP（2.5mM each）1.6µL、rTaq（5U/µL）0.4µL、Mgcl2 1.2µL 、引物E4559/FE4937 （20pmol）1µL、DDW 11.8µL、提取核酸 1µL。反应条件94℃ 5min，94℃ 30sec，52℃ 30sec，72℃ 1min（35cycle）72℃ 7min。RT-PCR反应体系：RNase Free Water 20.2μl ，5×RT-PCR Buffer 10μl，10mM dNTP Mixture 2μl，EnzymeMix 2μl，RNase Inhibitor 1μl，引物E4559/FE4937 （20pmol）1µL，模板1µL。反应条件42℃30min，94℃ 2sec，94℃30s，56℃ 30sec，72℃ 1min（35cycle），72℃ 10min。电泳观察PCR扩增效果。
实施案例3：装甲RNA质控品稳定性验证
1、不同环境条件下存储稳定性实验：将粗制的病毒样颗粒产物使用RNase A和DNaseI，完全消化，置于37℃、4℃、-20℃，放置15d、30d、45d、60d、75d、90d后，并以-70℃保存样品作为对照，使用QiaGen RNeasy Mini Kit提取RNA，使用肠病毒引物扩增后进行琼脂糖凝胶电泳检测实验结果；
2、不同质控酶消化实验：用实验室保存的人肠道EV71病毒RNA、CoxA16病毒RNA制备的4份，分两组进行实验，一组加入100U RNase A和2U DNaseI，37℃作用1h。另一组不做处理。使用RNA提取试剂盒提取RNA，使用紫外分光光度计测量浓度，稀释至同一浓度，使用引物E4559/FE4937进行RT-PCR检测。结果显示：人肠道EV71病毒RNA、CoxA16病毒RNA未经酶处理有目的条带，而经酶处理后均无目的条带，肠道病毒装甲RNA酶处理组和未处理组均有条带。
实施案例4：应用于检测临床鼠类样品携带肠道病毒
1.临床样本的分离及核酸提取：2016年从宁波港区捕获鼠类样品165只，无菌条件下取得约50 mg鼠类肠道内容物样品，加入1mL 1×PBS缓冲液，放入组织研磨仪进行研磨。取200μL匀浆液，参照Qiagen公司RNA提取试剂盒使用说明书提取病毒RNA，用50μL无RNA酶的超纯水溶解，于-80℃保存备用。取50ng进行RT-PCR反应。同时使用实施案例1中制备的肠道病毒装甲RNA质控；
2.RT-PCR反应按照实施例2中操作，对扩增产物使用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测；
3.结果表明使用本方法检测到2份鼠类肠道病毒样本，2份扩增到特异性条带。阳性质控结果均复合要求，说明制备的肠道病毒装甲RNA可作为肠道病毒属检测的全程有效质控。
序列表
<110>中华人民共和国大榭出入境检验检疫局
<120>肠道病毒PCR质控品装甲RNA及制备方法
<160>4
<170> PatentIn version 3.1
<210>1
<211> 1832
<212> DNA
<213>噬菌体MS2目标片段的基因序列MS2-CP
<400>1
cgcggtaccc ctttcggggt cctgctcaac ttcctgtcga gctaatgcca tttttaatgt 60
ctttagcgag acgctaccat ggctatcgct gtaggtagcc ggaattccat tcctaggagg 120
tttgacctgt gcgagctttt agtacccttg atagggagaa cgagaccttc gtcccctccg 180
ttcgcgttta cgcggacggt gagactgaag ataactcatt ctctttaaaa tatcgttcga 240
actggactcc cggtcgtttt aactcgactg gggccaaaac gaaacagtgg cactacccct 300
ctccgtattc acggggggcg ttaagtgtca catcgataga tcaaggtgcc tacaagcgaa 360
gtgggtcatc gtggggtcgc ccgtacgagg agaaagccgg tttcggcttc tccctcgacg 420
cacgctcctg ctacagcctc ttccctgtaa gccaaaactt gacttacatc gaagtgccgc 480
agaacgttgc gaaccgggcg tcgaccgaag tcctgcaaaa ggtcacccag ggtaatttta 540
accttggtgt tgctttagca gaggccaggt cgacagcctc acaactcgcg acgcaaacca 600
ttgcgctcgt gaaggcgtac actgccgctc gtcgcggtaa ttggcgccag gcgctccgct 660
accttgccct aaacgaagat cgaaagtttc gatcaaaaca cgtggccggc aggtggttgg 720
agttgcagtt cggttggtta ccactaatga gtgatatcca gggtgcatat gagatgctta 780
cgaaggttca ccttcaagag tttcttccta tgagagccgt acgtcaggtc ggtactaaca 840
tcaagttaga tggccgtctg tcgtatccag ctgcaaactt ccagacaacg tgcaacatat 900
cgcgacgtat cgtgatatgg ttttacataa acgatgcacg tttggcatgg ttgtcgtctc 960
taggtatctt gaacccacta ggtatagtgt gggaaaaggt gcctttctca ttcgttgtcg 1020
actggctcct acctgtaggt aacatgctcg agggccttac ggcccccgtg ggatgctcct 1080
acatgtcagg aacagttact gacgtaataa cgggtgagtc catcataagc gttgacgctc 1140
cctacgggtg gactgtggag agacagggca ctgctaaggc ccaaatctca gccatgcatc 1200
gaggggtaca atccgtatgg ccaacaactg gcgcgtacgt aaagtctcct ttctcgatgg 1260
tccatacctt agatgcgtta gcattaatca ggcaacggct ctctagatag agccctcaac 1320
cggagtttga agcatggctt ctaactttac tcagttcgtt ctcgtcgaca atggcggaac 1380
tggcgacgtg actgtcgccc caagcaactt cgctaacggg gtcgctgaat ggatcagctc 1440
taactcgcgt tcacaggctt acaaagtaac ctgtagcgtt cgtcagagct ctgcgcagaa 1500
tcgcaaatac accatcaaag tcgaggtgcc taaagtggca acccagactg ttggtggtgt 1560
agagcttcct gtagccgcat ggcgttcgta cttaaatatg gaactaacca ttccaatttt 1620
cgctacgaat tccgactgcg agcttattgt taaggcaatg caaggtctcc taaaagatgg 1680
aaacccgatt ccctcagcaa tcgcagcaaa ctccggcatc tactaataga cgccggccat 1740
tcaaacatga ggattaccca tgtcgaagac aacaaagaag ttcaactctt tatgtattga 1800
tcttcctcgc gatctttctc tcgggatccg cg 1832
<210>2
<211> 416
<212> DNA
<213>肠道病毒的病毒阳性样本目标片段的基因序列ENV-2B
<400>2
cagatccaga tcattttgat ggatacgacc agcaggtagt tacagtgatg gacgatttgt 60
gtcaaaaccc cgatggtaag gatatgtctc tgttctgtca aatggtatcc accgtagatt 120
tcattccacc aatggcttct ctcgaggaga agggagtttc cttcacctct aagtttgtca 180
tcgcatccac taatgccagc aatatcatag tgccaacagt gtctgattct gacgctattc 240
gccgcaggtt ttacatggac tgtgacattg aagtgacaga ctcatacaag acagatctag 300
gtagactgga tgcagggcga gccgctaaac tgtgttctga aaacaacact gcaaatttca 360
aacggtgcag cccattagtc tgcggcaagg caattcaatt tatggaaaga agaaca 416
<210> 3
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>肠道病毒基因的引物E4559
<400> 3
CAGATCCAGA TCATTTTGAT GGAtayranc arca 34
<210>4
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>肠道病毒基因的引物FE4937
<400>4
TGTTCTTCTA TCCATAAATT GAATTGCYTT NCCRCANA 38

Claims (2)

1.肠道病毒PCR质控品装甲RNA，其特征在于该装甲RNA的表达载体为 pET32a- MS2-CP-ENV-2B质粒，该表达载体pET32a- MS2-CP-ENV-2B质粒转入大肠杆菌原核表达菌株BL21中，诱导表达，超声波破碎后离心收集沉淀，获得肠道病毒PCR质控品装甲RNA的病毒样颗粒，其中该表达载体pET32a- MS2-CP-ENV-2B质粒中，MS2-CP的核苷酸序列为序列表中SEQID NO:1所示，ENV-2B的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:2所示。
2.权利要求1所述的肠道病毒PCR质控品装甲RNA的制备方法，其特征在于步骤如下：
a. ENV-2B获得：以肠道病毒属CODEHOP引物E4559/ FE4937扩增临床分离的阳性CODEHOP样本，并将扩增序列克隆至pUCm-T质粒载体中，获得目的序列片段pUCm-ENV-2B；
b. 噬菌体MS2-CP获得：以Genbank数据库中噬菌体MS2基因序列为基本序列，将序列递交生物公司进行合成，序列包括5’非编码区序列、成熟酶蛋白基因序列、衣壳蛋白基因序列、包装位点和复制酶基因序列，在序列5’端和3’端分别插入Kpn I 、BamHI酶切位点，双酶切后插入到原核表达载体pET32a中，获得表达载体pET32a-MS2-CP；
c. pET32a- MS2-CP-ENV-2B质粒获得：将pET32a-MS2-CP和pUCm-ENV-2B均使用BamHI、Not I双酶切，回收pET32a-MS2-CP和ENV-2B序列片段并相互连接，然后转化至DH5α菌株，获得肠道病毒装甲RNA表达载体 pET32a- MS2-CP-ENV-2B质粒；
d. 肠道病毒装甲RNA获得：将pET32a-MS2-CP-ENV-2B质粒转入大肠杆菌原核表达菌株BL21中，诱导表达，超声波破碎后离心、收集沉淀，获得肠道病毒装甲RNA的病毒样颗粒。
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