CN111235130B - II类V型CRISPR蛋白CeCas12a及其在基因编辑的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医学领域，具体涉及本发明属于生物医学领域，具体涉及一种来自于Coprococcus eutactus细菌中的II类V型CRISPR蛋白CeCas12a及其应用。所述CeCas12a的氨基酸序列如SED ID NO.1所示，其编码核苷酸序列如SED ID NO.2所示。本发明首次在Coprococcus eutactus菌株中鉴定出具有基因编辑效应的II类V型CRISPR蛋白CeCas12a；所述CeCas12a能够在crRNA的介导下定点对原核生物和真核生物基因组进行基因编辑，CeCas12a的发现进一步扩大了基因编辑工具的种类，对基础科研和临床治疗具有十分重要的作用。

Description

II类V型CRISPR蛋白CeCas12a及其在基因编辑的应用

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种来自于Coprococcus eutactus细菌中的II类V 型CRISPR蛋白Cas12a，命名为CeCas12a，在基因编辑中的应用。

背景技术

自2013年以来，基因编辑技术取得了突破性进展，此项技术已经在基础科学研究、医药、临床、生物技术等许多领域引起了新的变革。除了具有代表性的Cas9系统之外，Cas12，又名Cpf1，作为又一种被发现的具有基因编辑效应的CRISPR系统新成员，极大的扩大了基因编辑系统靶点的可编辑范围，相比于Cas9系统，Cas12a所具有的加工前提RNA的功能，为其介导多基因编辑提供了相比与Cas9系统更为便捷高效的编辑能力。除此之外，相比于 Cas9的向导RNA，Cas12a的向导RNA组成更为简单，设计更为方便。

2015年，张峰团队首次发现了Cas9系统之外的另外一种具有基因编辑能力的新成员， Cas12a，又名Cpf1，将其划分到CRISPR系统2类V型中。相比于Cas9系统，Cas12a的编辑效率与Cas9的效率相当，在有些靶点低于Cas9。Cas12a的脱靶率极低，相比于Cas9脱靶率高的特性，Cas12a是一种安全的基因编辑工具。Cas12a在切割之后形成粘性末端，而 Cas9形成平末端，已有研究表明，Cas12a切割之后的粘性末端相比于Cas9的平末端而言，更容易发生同源重组修复，这也为基因的定点插入和修复提供了更好的工具。在向导RNA 的加工方面，Cas12a具有明显的优势，仅仅只需要Cas12a本身就能够完成对前提RNA的加工，而Cas9系统则需要RNaseIII的加工，这极大地促进Cas12a在多基因编辑上的应用。在 PAM的识别上，Cas12a识别5’-TTTN-3’或5’-KYTV-3’，Cas9则识别5’-NGG-3’。

因此，Cas12a作为一种新型基因编辑工具，与Cas9系统一道，为科学研究和疾病的治疗提供了有力的工具。基于对目前已有的Cas12a的研究，为应对将来各种情况下的基因编辑事件，发现更多的具有一定特性的Cas12a是一件具有重要意义的事情。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，目的在于提供一种来自于Coprococcus eutactus细菌中的II 类V型CRISPR蛋白CeCas12a及其在基因编辑中的应用。

为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案为：

一种来自于Coprococcus eutactus细菌中的II类V型CRISPR蛋白CeCas12a，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

上述方案中，所述CeCas12a识别的PAM序列为TTTV、TCTA、TTCA、或CTTA，更为优选的PAM序列为TTTV，所述V表示A、C、或G。

用于编辑蛋白CeCas12a氨基酸序列的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

上述CeCas12a在基因编辑中的应用。

上述CeCas12a在原核生物基因编辑中的应用。

上述CeCas12a在真核生物基因编辑中的应用。

上述CeCas12a在体外基因编辑中的应用。

本发明所述蛋白CeCas12a的氨基酸序列如下：

(1)原核细胞中：

NNNTNNSFEPFIGGNSVSKTLRNELRVGSEYTGKHIKECAIIAEDAVKAENQYIVKEMMDD FYRDFINRKLDALQGINWEQLFDIMKKAKLDKSNKVSKELDKIQESTRKEIVKIFSSDPIYK DMLKADMISKILPEYIVDKYGDAASRIEAVKVFYGFSGYFIDFWASRKNVFSDKNIASAIPH RIVNVNARIHLDNITAFNRIAEIAGDEVAGIAEDACAYLQNMSLEDVFTGACYGEFICQKDI DRYNNICGVINQHMNQYCQNKKISRSKFKMERLHKQILCRSESGFEIPIGFQTDGEVIDAIN SFSTILEEKDILDRLRTLSQEVTGYDMERIYVSSKAFESVSKYIDHKWDVIASSMYNYFSGA VRGKDDKKDAKIQTEIKKIKSCSLLDLKKLVDMYYKMDGMCLEHEATEYVAGITEILVDF NYKTFDMDDSVKMIQNEHMINEIKEYLDTYMSIYHWAKDFMIDELVDRDMEFYSELDEIY YDLSDIVPLYNKVRNYVTQKPYSQDKIKLNFGSPTLANGWSKSKEFDNNVVVLLRDEKIY LAILNVGNKPSKDIMAGEDRRRSDTDYKKMNYYLLPGASKTLPHVFISSNAWKKSHGIPD EIMYGYNQNKHLKSSPNFDLEFCRKLIDYYKECIDSYPNYQIFNFKFAATETYNDISEFYKD VERQGYKIEWSYISEDDINQMDRDGQIYLFQIYNKDFAPNSKGMQNLHTLYLKNIFSEENL SDVVIKLNGEAELFFRKSSIQHKRGHKKGSVLVNKTYKTTEKTENGQGEIEVIESVPDQCY LELVKYWSEGGVGQLSEEASKYKDKVSHYAATMDIVKDRRYTEDKFFIHMPITINFKADN RNNVNEKVLKFIAENDDLHVIGIDRGERNLLYVSVIDSRGRIVEQKSFNIVENYESSKNVIR RHDYKGKLVNKEHYRNEARKSWKEIGKIKEIKEGYLSQVIHEISKLVLKYNAIIVMEDLNY GFKRGRFKVERQVYQKFETMLINKLAYLVDKSRAVDEPGGLLKGYQLTYVPDNLGELGSQ CGIIFYVPAAYTSKIDPVTGFVDVFDFKAYSNAEARLDFINKLDCIRYDASRNKFEIAFDYGN FRTHHTTLAKTSWTIFIHGDRIKKERGSYGWKDEIIDIEARIRKLFEDTDIEYADGHNLIGDI NELESPIQKKFVGELFDIIRFTVQLRNSKSEKYDGTEKEYDKIISPVMDEEGVFFTTDSYIRA DGTELPKDADANGAYCIALKGLYDVLAVKKYWKEGEKFDRKLLAITNYNWFDFIQNRRF

(2)真核细胞中：

PKKKRKVNNNTNNSFEPFIGGNSVSKTLRNELRVGSEYTGKHIKECAIIAEDAVKAENQYIV KEMMDDFYRDFINRKLDALQGINWEQLFDIMKKAKLDKSNKVSKELDKIQESTRKEIVKIF SSDPIYKDMLKADMISKILPEYIVDKYGDAASRIEAVKVFYGFSGYFIDFWASRKNVFSDKN IASAIPHRIVNVNARIHLDNITAFNRIAEIAGDEVAGIAEDACAYLQNMSLEDVFTGACYGEF ICQKDIDRYNNICGVINQHMNQYCQNKKISRSKFKMERLHKQILCRSESGFEIPIGFQTDGE VIDAINSFSTILEEKDILDRLRTLSQEVTGYDMERIYVSSKAFESVSKYIDHKWDVIASSMY NYFSGAVRGKDDKKDAKIQTEIKKIKSCSLLDLKKLVDMYYKMDGMCLEHEATEYVAGIT EILVDFNYKTFDMDDSVKMIQNEHMINEIKEYLDTYMSIYHWAKDFMIDELVDRDMEFYS ELDEIYYDLSDIVPLYNKVRNYVTQKPYSQDKIKLNFGSPTLANGWSKSKEFDNNVVVLLR DEKIYLAILNVGNKPSKDIMAGEDRRRSDTDYKKMNYYLLPGASKTLPHVFISSNAWKKS HGIPDEIMYGYNQNKHLKSSPNFDLEFCRKLIDYYKECIDSYPNYQIFNFKFAATETYNDISE FYKDVERQGYKIEWSYISEDDINQMDRDGQIYLFQIYNKDFAPNSKGMQNLHTLYLKNIFS EENLSDVVIKLNGEAELFFRKSSIQHKRGHKKGSVLVNKTYKTTEKTENGQGEIEVIESVPD QCYLELVKYWSEGGVGQLSEEASKYKDKVSHYAATMDIVKDRRYTEDKFFIHMPITINFK ADNRNNVNEKVLKFIAENDDLHVIGIDRGERNLLYVSVIDSRGRIVEQKSFNIVENYESSKN VIRRHDYKGKLVNKEHYRNEARKSWKEIGKIKEIKEGYLSQVIHEISKLVLKYNAIIVMEDL NYGFKRGRFKVERQVYQKFETMLINKLAYLVDKSRAVDEPGGLLKGYQLTYVPDNLGEL GSQCGIIFYVPAAYTSKIDPVTGFVDVFDFKAYSNAEARLDFINKLDCIRYDASRNKFEIAFD YGNFRTHHTTLAKTSWTIFIHGDRIKKERGSYGWKDEIIDIEARIRKLFEDTDIEYADGHNLI GDINELESPIQKKFVGELFDIIRFTVQLRNSKSEKYDGTEKEYDKIISPVMDEEGVFFTTDSYI RADGTELPKDADANGAYCIALKGLYDVLAVKKYWKEGEKFDRKLLAITNYNWFDFIQNR RFKRPAATKKAGQAKKKKGSYPYDVPDYAYPYDVPDYAYPYDVPDYA

其中在CeCas12a蛋白氨基酸序列的N端加入PKKKRKV序列(该序列为N端NLS入核序列)，在CeCas12a蛋白氨基酸序列的C端加入KRPAATKKAGQAKKKK序列(该序列为C 端NLS入核序列)，随后用GS序列连接YPYDVPDYAYPYDVPDYAYPYDVPDYA序列(该序列为3HA序列)。

编码本发明所述蛋白CeCas12a的核苷酸序列如下：

aacaacaacaccaacaacagcttcgagcccttcatcggcggcaacagcgtgagcaagaccctgcgcaacgagctgcgcgtgggcagcgagtacaccggcaag cacatcaaggagtgcgccatcatcgccgaggacgccgtgaaggccgagaaccagtacatcgtgaaggagatgatggacgacttctaccgcgacttcatcaaccgc aagctggacgccctgcagggcatcaactgggagcagctgttcgacatcatgaagaaggccaagctggacaagagcaacaaggtgagcaaggagctggacaag atccaggagagcacccgcaaggagatcgtgaagatcttcagcagcgaccccatctacaaggacatgctgaaggccgacatgatcagcaagatcctgcccgagta catcgtggacaagtacggcgacgccgccagccgcatcgaggccgtgaaggtgttctacggcttcagcggctacttcatcgacttctgggccagccgcaagaacgt gttcagcgacaagaacatcgccagcgccatcccccaccgcatcgtgaacgtgaacgcccgcatccacctggacaacatcaccgccttcaaccgcatcgccgagat cgccggcgacgaggtggccggcatcgccgaggacgcctgcgcctacctgcagaacatgagcctggaggacgtgttcaccggcgcctgctacggcgagttcatct gccagaaggacatcgaccgctacaacaacatctgcggcgtgatcaaccagcacatgaaccagtactgccagaacaagaagatcagccgcagcaagttcaagatg gagcgcctgcacaagcagatcctgtgccgcagcgagagcggcttcgagatccccatcggcttccagaccgacggcgaggtgatcgacgccatcaacagcttcag caccatcctggaggagaaggacatcctggaccgcctgcgcaccctgagccaggaggtgaccggctacgacatggagcgcatctacgtgagcagcaaggccttc gagagcgtgagcaagtacatcgaccacaagtgggacgtgatcgccagcagcatgtacaactacttcagcggcgccgtgcgcggcaaggacgacaagaaggac gccaagatccagaccgagatcaagaagatcaagagctgcagcctgctggacctgaagaagctggtggacatgtactacaagatggacggcatgtgcctggagca cgaggccaccgagtacgtggccggcatcaccgagatcctggtggacttcaactacaagaccttcgacatggacgacagcgtgaagatgatccagaacgagcacatgatcaacgagatcaaggagtacctggacacctacatgagcatctaccactgggccaaggacttcatgatcgacgagctggtggaccgcgacatggagttctacagc gagctggacgagatctactacgacctgagcgacatcgtgcccctgtacaacaaggtgcgcaactacgtgacccagaagccctacagccaggacaagatcaagct gaacttcggcagccccaccctggccaacggctggagcaagagcaaggagttcgacaacaacgtggtggtgctgctgcgcgacgagaagatctacctggccatcc tgaacgtgggcaacaagcccagcaaggacatcatggccggcgaggaccgccgccgcagcgacaccgactacaagaagatgaactactacctgctgcccggcg ccagcaagaccctgccccacgtgttcatcagcagcaacgcctggaagaagagccacggcatccccgacgagatcatgtacggctacaaccagaacaagcacctg aagagcagccccaacttcgacctggagttctgccgcaagctgatcgactactacaaggagtgcatcgacagctaccccaactaccagatcttcaacttcaagttcgc cgccaccgagacctacaacgacatcagcgagttctacaaggacgtggagcgccagggctacaagatcgagtggagctacatcagcgaggacgacatcaaccag atggaccgcgacggccagatctacctgttccagatctacaacaaggacttcgcccccaacagcaagggcatgcagaacctgcacaccctgtacctgaagaacatct tcagcgaggagaacctgagcgacgtggtgatcaagctgaacggcgaggccgagctgttcttccgcaagagcagcatccagcacaagcgcggccacaagaagg gcagcgtgctggtgaacaagacctacaagaccaccgagaagaccgagaacggccagggcgagatcgaggtgatcgagagcgtgcccgaccagtgctacctgg agctggtgaagtactggagcgagggcggcgtgggccagctgagcgaggaggccagcaagtacaaggacaaggtgagccactacgccgccaccatggacatc gtgaaggaccgccgctacaccgaggacaagttcttcatccacatgcccatcaccatcaacttcaaggccgacaaccgcaacaacgtgaacgagaaggtgctgaag ttcatcgccgagaacgacgacctgcacgtgatcggcatcgaccgcggcgagcgcaacctgctgtacgtgagcgtgatcgacagccgcggccgcatcgtggagca gaagagcttcaacatcgtggagaactacgagagcagcaagaacgtgatccgccgccacgactacaagggcaagctggtgaacaaggagcactaccgcaacgag gcccgcaagagctggaaggagatcggcaagatcaaggagatcaaggagggctacctgagccaggtgatccacgagatcagcaagctggtgctgaagtacaacg ccatcatcgtgatggaggacctgaactacggcttcaagcgcggccgcttcaaggtggagcgccaggtgtaccagaagttcgagaccatgctgatcaacaagctgg cctacctggtggacaagagccgcgccgtggacgagcccggcggcctgctgaagggctaccagctgacctacgtgcccgacaacctgggcgagctgggcagcc agtgcggcatcatcttctacgtgcccgccgcctacaccagcaagatcgaccccgtgaccggcttcgtggacgtgttcgacttcaaggcctacagcaacgccgaggc ccgcctggacttcatcaacaagctggactgcatccgctacgacgccagccgcaacaagttcgagatcgccttcgactacggcaacttccgcacccaccacaccacc ctggccaagaccagctggaccatcttcatccacggcgaccgcatcaagaaggagcgcggcagctacggctggaaggacgagatcatcgacatcgaggcccgca tccgcaagctgttcgaggacaccgacatcgagtacgccgacggccacaacctgatcggcgacatcaacgagctggagagccccatccagaagaagttcgtgggc gagctgttcgacatcatccgcttcaccgtgcagctgcgcaacagcaagagcgagaagtacgacggcaccgagaaggagtacgacaagatcatcagccccgtgat ggacgaggagggcgtgttcttcaccaccgacagctacatccgcgccgacggcaccgagctgcccaaggacgccgacgccaacggcgcctactgcatcgccctg aagggcctgtacgacgtgctggccgtgaagaagtactggaaggagggcgagaagttcgaccgcaagctgctggccatcaccaactacaactggttcgacttcatc cagaaccgccgcttc

本发明中Coprococcus eutactus菌株基因组中部分CRISPR array如图2所示，基因组中黑体显示CRISPR array序列为“ATCTACAACAGTAGAAATTATCTATAGGTTCTTGG”，因此，使用的crRNA direct repeat序列为5’-AATTTCTACTGTTGTAGAT-3’。

本发明的有益效果：本发明首次在Coprococcus eutactus菌株中鉴定出具有基因编辑效应的II类V型CRISPR蛋白，命名为CeCas12a；所述CeCas12a能够在crRNA的介导下定点对原核生物和真核生物基因组进行基因编辑，CeCas12a的发现进一步扩大了基因编辑工具的种类，同时也为后续各种不同情况的基因编辑提供了重要的备选工具，对基础科研和临床治疗具有十分重要的作用。

附图说明

图1为Coprococcus eutactus菌株CRISPR array及crRNA direct repeat图示。

图2为Coprococcus eutactus菌株基因组中存在的部分CRISPR array示意图。

图3为体外切割EGFP片段靶点示意图。

图4为原核表达CeCas12a之后，体外切割实验，S表示substrate；P表示product。

图5为体外实验验证CeCas12a的PAM，S表示substrate；P表示product。

图6为体内验证CeCas12a基因编辑，S表示substrate；P表示product。

图7为体内验证CeCas12a利用加工前提crRNA来同时编辑多个基因。

图8为深度测序验证CeCas12a的脱靶率。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

实施例1

CeCas12a体外不同时间梯度切割实验，包括以下实验步骤：

(1)CeCas12a蛋白的表达与纯化：将CeCas12a基因序列合成到pet28a表达载体上，且在C末端加上6His标签，随后将合成好的质粒转化到E.Coli Rosseta 2(DE3)表达菌株中，挑取单克隆，小量表达检测确定蛋白表达后进行蛋白的大量表达与纯化；重组蛋白依次经过 Ni柱亲和层析，heparin柱层析，superdex 200分子筛纯化后，保存在buffer(10mMTris-HCl， 200mM NaCl，1mM MgCl)中，并冻存于-80℃备用；

(2)使用crRNA direct repeat序列为：5’-AATTTCTACTGTTGTAGAT-3’，在体外转录获得crRNA；将步骤(1)所得CeCas12a蛋白与crRNA混合得到CeCas12a-crRNA复合物；

(3)取100nM CeCas12a-crRNA复合物与300ng线性化的底物(图4所示)混匀，37℃孵育分别孵育0,1,2,5,10min后，加入适量蛋白酶K，58℃消化60min，跑2％琼脂糖胶，结果如图4所示，CeCas12a具有良好的体外切割能力。

实施例2

CeCas12a识别PAM的确定

(1)设计NNNN四个位置随机组合的上下游引物(N表示A、G、C、T)，以EGFP片段作为模板，采用overlap PCR方法进行PCR，得到256种带有不同PAM序列，但spacer 序列一样的1.1kb的线性化底物；

(2)取100nM CeCas12a-crRNA复合物与300ng线性化的底物混匀，37℃孵育分别孵育10min后，加入适量蛋白酶K，58℃消化60min，跑2％琼脂糖胶，部分结果如图5所示，CeCas12a能够识别不同的PAM：TTTA、TCTA、TTCA、CTTA，但最优PAM为TTTV(V 表示A,C,G)。

实施例3

CeCas12a在哺乳动物细胞内不同基因的编辑：

(1)构建CeCas12a真核表达质粒：将CeCas12a基因序列合成到pet28a表达载体上构建CeCas12a真核表达质粒；

(2)在哺乳动物细胞中，以293T细胞为例选择TRAC、TRBC、B2M、CTLA4、PD1五个基因，分别以这五个基因为目标，构建5个由U6启动子启动转录的U6-crRNA spacer真核表达质粒；

(3)分别针对这五个基因的切割靶点附近设计surveyor primer，并验证PCR引物的特异性；

(4)消化293T细胞，适当浓度铺24孔板，每孔500ul；

(5)24孔板共转CeCas12a真核表达质粒(700ng)和U6-crRNA spacer真核表达质粒(300ng)，48h后裂解细胞，取1ul裂解液作为模板、以步骤(3)设计的surveyor primer引物进行PCR，纯化PCR产物；

(6)取300ng PCR产物与1ul 10XT7EI buffer混匀，按以下PCR程序进行复性95℃10min，95℃至85℃-2℃/S，85℃到25℃-0.25℃/S，25℃持续1min，复性之后产物加入 1ulT7EI，37℃酶切20min，跑2％琼脂糖胶，结果如图6所示在TRAC、TRBC、B2M、CTLA4、 PD1能够进行基因编辑，编辑效率分别为12％，18％，31％，26％，19％(本案例中的四个基因只是作为代表进行列举)。

实施例4

CeCas12a在哺乳动物细胞内进行多基因编辑：

(1)选取并设计由一个U6启动子启动转录形成pre-crRNA array，pre-crRNA为同时包括TRAC、TRBC、B2M、CTLA4四个基因的crRNA序列；

(2)切割靶点附近设计surveyor primer，并验证PCR引物的特异性；

(3)消化293T细胞，适当浓度铺24孔板，每孔500ul；

(4)24孔板共转CeCas12a真核表达质粒(700ng)和步骤(1)获得的包含TRAC、TRBC、B2M、CTLA4四个基因的U6-crRNA spacer真核表达质粒(300ng)，48h后裂解细胞，取1ul 裂解液作为模板、以步骤(3)设计的surveyor primer引物进行PCR，纯化PCR产物；

(5)取300ngPCR产物与1ul 10XT7EI buffer混匀，按以下PCR程序进行复性95℃10min，95℃至85℃-2℃/S，85℃到25℃-0.25℃/S，25℃持续1min。

(6)复性之后产物加入1ul T7EI，37℃酶切20min，跑2％琼脂糖胶，结果如图7所示，采用灰度分析可得对TRAC、TRBC、B2M、CTLA4四个基因靶点的切割效率分别为15％，25％， 45％，45％。

实施例5

(1)选取DNMT1、HBB、IL12A、POLQ、B2M 5个基因5个靶点进行脱靶分析，用软件(http://www.rgenome.net/cas-offinder/)预测了41个脱靶位点，并设计相应引物。

(2)24孔板共转As/Lb/CeCas12a真核表达质粒(700ng)和U6-crRNA spacer真核表达质粒(300ng)，48h后裂解细胞，取1ul裂解液作为模板并采用1)中设计的引物进行扩增，然后纯化，进行二代测序，统计结构如图8所示，AsCas12a，LbCas12a，CeCas12a都具有很低的脱靶率，但CeCas12a相比于AsCas12a，LbCas12a具有更低的脱靶率。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。

序列表

<110>武汉大学

<120>II类V型CRISPR 蛋白CeCas12a及其用于基因编辑的应用

<160>2

<210> 1

<211> 1286

<212> PRT

<213>Coprococcus eutactus细菌

<400>1

Asn Asn Asn Thr Asn Asn Ser Phe Glu Pro Phe Ile Gly Gly Asn Ser

1 5 10 15

Val Ser Lys Thr Leu Arg Asn Glu Leu Arg Val Gly Ser Glu Tyr Thr

20 25 30

Gly Lys His Ile Lys Glu Cys Ala Ile Ile Ala Glu Asp Ala Val Lys

35 40 45

Ala Glu Asn Gln Tyr Ile Val Lys Glu Met Met Asp Asp Phe Tyr Arg

50 55 60

Asp Phe Ile Asn Arg Lys Leu Asp Ala Leu Gln Gly Ile Asn Trp Glu

65 70 75 80

Gln Leu Phe Asp Ile Met Lys Lys Ala Lys Leu Asp Lys Ser Asn Lys

85 90 95

Val Ser Lys Glu Leu Asp Lys Ile Gln Glu Ser Thr Arg Lys Glu Ile

100 105 110

Val Lys Ile Phe Ser Ser Asp Pro Ile Tyr Lys Asp Met Leu Lys Ala

115 120 125

Asp Met Ile Ser Lys Ile Leu Pro Glu Tyr Ile Val Asp Lys Tyr Gly

130 135 140

Asp Ala Ala Ser Arg Ile Glu Ala Val Lys Val Phe Tyr Gly Phe Ser

145 150 155 160

Gly Tyr Phe Ile Asp Phe Trp Ala Ser Arg Lys Asn Val Phe Ser Asp

165 170 175

Lys Asn Ile Ala Ser Ala Ile Pro His Arg Ile Val Asn Val Asn Ala

180 185 190

Arg Ile His Leu Asp Asn Ile Thr Ala Phe Asn Arg Ile Ala Glu Ile

195 200 205

Ala Gly Asp Glu Val Ala Gly Ile Ala Glu Asp Ala Cys Ala Tyr Leu

210 215 220

Gln Asn Met Ser Leu Glu Asp Val Phe Thr Gly Ala Cys Tyr Gly Glu

225 230 235 240

Phe Ile Cys Gln Lys Asp Ile Asp Arg Tyr Asn Asn Ile Cys Gly Val

245 250 255

Ile Asn Gln His Met Asn Gln Tyr Cys Gln Asn Lys Lys Ile Ser Arg

260 265 270

Ser Lys Phe Lys Met Glu Arg Leu His Lys Gln Ile Leu Cys Arg Ser

275 280 285

Glu Ser Gly Phe Glu Ile Pro Ile Gly Phe Gln Thr Asp Gly Glu Val

290 295 300

Ile Asp Ala Ile Asn Ser Phe Ser Thr Ile Leu Glu Glu Lys Asp Ile

305 310 315 320

Leu Asp Arg Leu Arg Thr Leu Ser Gln Glu Val Thr Gly Tyr Asp Met

325 330 335

Glu Arg Ile Tyr Val Ser Ser Lys Ala Phe Glu Ser Val Ser Lys Tyr

340 345 350

Ile Asp His Lys Trp Asp Val Ile Ala Ser Ser Met Tyr Asn Tyr Phe

355 360 365

Ser Gly Ala Val Arg Gly Lys Asp Asp Lys Lys Asp Ala Lys Ile Gln

370 375 380

Thr Glu Ile Lys Lys Ile Lys Ser Cys Ser Leu Leu Asp Leu Lys Lys

385 390 395 400

Leu Val Asp Met Tyr Tyr Lys Met Asp Gly Met Cys Leu Glu His Glu

405 410 415

Ala Thr Glu Tyr Val Ala Gly Ile Thr Glu Ile Leu Val Asp Phe Asn

420 425 430

Tyr Lys Thr Phe Asp Met Asp Asp Ser Val Lys Met Ile Gln Asn Glu

435 440 445

His Met Ile Asn Glu Ile Lys Glu Tyr Leu Asp Thr Tyr Met Ser Ile

450 455 460

Tyr His Trp Ala Lys Asp Phe Met Ile Asp Glu Leu Val Asp Arg Asp

465 470 475 480

Met Glu Phe Tyr Ser Glu Leu Asp Glu Ile Tyr Tyr Asp Leu Ser Asp

485 490 495

Ile Val Pro Leu Tyr Asn Lys Val Arg Asn Tyr Val Thr Gln Lys Pro

500 505 510

Tyr Ser Gln Asp Lys Ile Lys Leu Asn Phe Gly Ser Pro Thr Leu Ala

515 520 525

Asn Gly Trp Ser Lys Ser Lys Glu Phe Asp Asn Asn Val Val Val Leu

530 535 540

Leu Arg Asp Glu Lys Ile Tyr Leu Ala Ile Leu Asn Val Gly Asn Lys

545 550 555 560

Pro Ser Lys Asp Ile Met Ala Gly Glu Asp Arg Arg Arg Ser Asp Thr

565 570 575

Asp Tyr Lys Lys Met Asn Tyr Tyr Leu Leu Pro Gly Ala Ser Lys Thr

580 585 590

Leu Pro His Val Phe Ile Ser Ser Asn Ala Trp Lys Lys Ser His Gly

595 600 605

Ile Pro Asp Glu Ile Met Tyr Gly Tyr Asn Gln Asn Lys His Leu Lys

610 615 620

Ser Ser Pro Asn Phe Asp Leu Glu Phe Cys Arg Lys Leu Ile Asp Tyr

625 630 635 640

Tyr Lys Glu Cys Ile Asp Ser Tyr Pro Asn Tyr Gln Ile Phe Asn Phe

645 650 655

Lys Phe Ala Ala Thr Glu Thr Tyr Asn Asp Ile Ser Glu Phe Tyr Lys

660 665 670

Asp Val Glu Arg Gln Gly Tyr Lys Ile Glu Trp Ser Tyr Ile Ser Glu

675 680 685

Asp Asp Ile Asn Gln Met Asp Arg Asp Gly Gln Ile Tyr Leu Phe Gln

690 695 700

Ile Tyr Asn Lys Asp Phe Ala Pro Asn Ser Lys Gly Met Gln Asn Leu

705 710 715 720

His Thr Leu Tyr Leu Lys Asn Ile Phe Ser Glu Glu Asn Leu Ser Asp

725 730 735

Val Val Ile Lys Leu Asn Gly Glu Ala Glu Leu Phe Phe Arg Lys Ser

740 745 750

Ser Ile Gln His Lys Arg Gly His Lys Lys Gly Ser Val Leu Val Asn

755 760 765

Lys Thr Tyr Lys Thr Thr Glu Lys Thr Glu Asn Gly Gln Gly Glu Ile

770 775 780

Glu Val Ile Glu Ser Val Pro Asp Gln Cys Tyr Leu Glu Leu Val Lys

785 790 795 800

Tyr Trp Ser Glu Gly Gly Val Gly Gln Leu Ser Glu Glu Ala Ser Lys

805 810 815

Tyr Lys Asp Lys Val Ser His Tyr Ala Ala Thr Met Asp Ile Val Lys

820 825 830

Asp Arg Arg Tyr Thr Glu Asp Lys Phe Phe Ile His Met Pro Ile Thr

835 840 845

Ile Asn Phe Lys Ala Asp Asn Arg Asn Asn Val Asn Glu Lys Val Leu

850 855 860

Lys Phe Ile Ala Glu Asn Asp Asp Leu His Val Ile Gly Ile Asp Arg

865 870 875 880

Gly Glu Arg Asn Leu Leu Tyr Val Ser Val Ile Asp Ser Arg Gly Arg

885 890 895

Ile Val Glu Gln Lys Ser Phe Asn Ile Val Glu Asn Tyr Glu Ser Ser

900 905 910

Lys Asn Val Ile Arg Arg His Asp Tyr Lys Gly Lys Leu Val Asn Lys

915 920 925

Glu His Tyr Arg Asn Glu Ala Arg Lys Ser Trp Lys Glu Ile Gly Lys

930 935 940

Ile Lys Glu Ile Lys Glu Gly Tyr Leu Ser Gln Val Ile His Glu Ile

945 950 955 960

Ser Lys Leu Val Leu Lys Tyr Asn Ala Ile Ile Val Met Glu Asp Leu

965 970 975

Asn Tyr Gly Phe Lys Arg Gly Arg Phe Lys Val Glu Arg Gln Val Tyr

980 985 990

Gln Lys Phe Glu Thr Met Leu Ile Asn Lys Leu Ala Tyr Leu Val Asp

995 1000 1005

Lys Ser Arg Ala Val Asp Glu Pro Gly Gly Leu Leu Lys Gly Tyr Gln

1010 1015 1020

Leu Thr Tyr Val Pro Asp Asn Leu Gly Glu Leu Gly Ser Gln Cys Gly

1025 1030 1035 1040

Ile Ile Phe Tyr Val Pro Ala Ala Tyr Thr Ser Lys Ile Asp Pro Val

1045 1050 1055

Thr Gly Phe Val Asp Val Phe Asp Phe Lys Ala Tyr Ser Asn Ala Glu

1060 1065 1070

Ala Arg Leu Asp Phe Ile Asn Lys Leu Asp Cys Ile Arg Tyr Asp Ala

1075 1080 1085

Ser Arg Asn Lys Phe Glu Ile Ala Phe Asp Tyr Gly Asn Phe Arg Thr

1090 1095 1100

His His Thr Thr Leu Ala Lys Thr Ser Trp Thr Ile Phe Ile His Gly

1105 1110 1115 1120

Asp Arg Ile Lys Lys Glu Arg Gly Ser Tyr Gly Trp Lys Asp Glu Ile

1125 1130 1135

Ile Asp Ile Glu Ala Arg Ile Arg Lys Leu Phe Glu Asp Thr Asp Ile

1140 1145 1150

Glu Tyr Ala Asp Gly His Asn Leu Ile Gly Asp Ile Asn Glu Leu Glu

1155 1160 1165

Ser Pro Ile Gln Lys Lys Phe Val Gly Glu Leu Phe Asp Ile Ile Arg

1170 1175 1180

Phe Thr Val Gln Leu Arg Asn Ser Lys Ser Glu Lys Tyr Asp Gly Thr

1185 1190 1195 1200

Glu Lys Glu Tyr Asp Lys Ile Ile Ser Pro Val Met Asp Glu Glu Gly

1205 1210 1215

Val Phe Phe Thr Thr Asp Ser Tyr Ile Arg Ala Asp Gly Thr Glu Leu

1220 1225 1230

Pro Lys Asp Ala Asp Ala Asn Gly Ala Tyr Cys Ile Ala Leu Lys Gly

1235 1240 1245

Leu Tyr Asp Val Leu Ala Val Lys Lys Tyr Trp Lys Glu Gly Glu Lys

1250 1255 1260

Phe Asp Arg Lys Leu Leu Ala Ile Thr Asn Tyr Asn Trp Phe Asp Phe

1265 1270 1275 1280

Ile Gln Asn Arg Arg Phe

1285

<210> 2

<211> 3858bp

<212> DNA

<213>Coprococcus eutactus细菌

<400>2

aacaacaaca ccaacaacag cttcgagccc ttcatcggcg gcaacagcgt gagcaagacc 60

ctgcgcaacg agctgcgcgt gggcagcgag tacaccggca agcacatcaa ggagtgcgcc 120

atcatcgccg aggacgccgt gaaggccgag aaccagtaca tcgtgaagga gatgatggac 180

gacttctacc gcgacttcat caaccgcaag ctggacgccc tgcagggcat caactgggag 240

cagctgttcg acatcatgaa gaaggccaag ctggacaaga gcaacaaggt gagcaaggag 300

ctggacaaga tccaggagag cacccgcaag gagatcgtga agatcttcag cagcgacccc 360

atctacaagg acatgctgaa ggccgacatg atcagcaaga tcctgcccga gtacatcgtg 420

gacaagtacg gcgacgccgc cagccgcatc gaggccgtga aggtgttcta cggcttcagc 480

ggctacttca tcgacttctg ggccagccgc aagaacgtgt tcagcgacaa gaacatcgcc 540

agcgccatcc cccaccgcat cgtgaacgtg aacgcccgca tccacctgga caacatcacc 600

gccttcaacc gcatcgccga gatcgccggc gacgaggtgg ccggcatcgc cgaggacgcc 660

tgcgcctacc tgcagaacat gagcctggag gacgtgttca ccggcgcctg ctacggcgag 720

ttcatctgcc agaaggacat cgaccgctac aacaacatct gcggcgtgat caaccagcac 780

atgaaccagt actgccagaa caagaagatc agccgcagca agttcaagat ggagcgcctg 840

cacaagcaga tcctgtgccg cagcgagagc ggcttcgaga tccccatcgg cttccagacc 900

gacggcgagg tgatcgacgc catcaacagc ttcagcacca tcctggagga gaaggacatc 960

ctggaccgcc tgcgcaccct gagccaggag gtgaccggct acgacatgga gcgcatctac 1020

gtgagcagca aggccttcga gagcgtgagc aagtacatcg accacaagtg ggacgtgatc 1080

gccagcagca tgtacaacta cttcagcggc gccgtgcgcg gcaaggacga caagaaggac 1140

gccaagatcc agaccgagat caagaagatc aagagctgca gcctgctgga cctgaagaag 1200

ctggtggaca tgtactacaa gatggacggc atgtgcctgg agcacgaggc caccgagtac 1260

gtggccggca tcaccgagat cctggtggac ttcaactaca agaccttcga catggacgac 1320

agcgtgaaga tgatccagaa cgagcacatg atcaacgaga tcaaggagta cctggacacc 1380

tacatgagca tctaccactg ggccaaggac ttcatgatcg acgagctggt ggaccgcgac 1440

atggagttct acagcgagct ggacgagatc tactacgacc tgagcgacat cgtgcccctg 1500

tacaacaagg tgcgcaacta cgtgacccag aagccctaca gccaggacaa gatcaagctg 1560

aacttcggca gccccaccct ggccaacggc tggagcaaga gcaaggagtt cgacaacaac 1620

gtggtggtgc tgctgcgcga cgagaagatc tacctggcca tcctgaacgt gggcaacaag 1680

cccagcaagg acatcatggc cggcgaggac cgccgccgca gcgacaccga ctacaagaag 1740

atgaactact acctgctgcc cggcgccagc aagaccctgc cccacgtgtt catcagcagc 1800

aacgcctgga agaagagcca cggcatcccc gacgagatca tgtacggcta caaccagaac 1860

aagcacctga agagcagccc caacttcgac ctggagttct gccgcaagct gatcgactac 1920

tacaaggagt gcatcgacag ctaccccaac taccagatct tcaacttcaa gttcgccgcc 1980

accgagacct acaacgacat cagcgagttc tacaaggacg tggagcgcca gggctacaag 2040

atcgagtgga gctacatcag cgaggacgac atcaaccaga tggaccgcga cggccagatc 2100

tacctgttcc agatctacaa caaggacttc gcccccaaca gcaagggcat gcagaacctg 2160

cacaccctgt acctgaagaa catcttcagc gaggagaacc tgagcgacgt ggtgatcaag 2220

ctgaacggcg aggccgagct gttcttccgc aagagcagca tccagcacaa gcgcggccac 2280

aagaagggca gcgtgctggt gaacaagacc tacaagacca ccgagaagac cgagaacggc 2340

cagggcgaga tcgaggtgat cgagagcgtg cccgaccagt gctacctgga gctggtgaag 2400

tactggagcg agggcggcgt gggccagctg agcgaggagg ccagcaagta caaggacaag 2460

gtgagccact acgccgccac catggacatc gtgaaggacc gccgctacac cgaggacaag 2520

ttcttcatcc acatgcccat caccatcaac ttcaaggccg acaaccgcaa caacgtgaac 2580

gagaaggtgc tgaagttcat cgccgagaac gacgacctgc acgtgatcgg catcgaccgc 2640

ggcgagcgca acctgctgta cgtgagcgtg atcgacagcc gcggccgcat cgtggagcag 2700

aagagcttca acatcgtgga gaactacgag agcagcaaga acgtgatccg ccgccacgac 2760

tacaagggca agctggtgaa caaggagcac taccgcaacg aggcccgcaa gagctggaag 2820

gagatcggca agatcaagga gatcaaggag ggctacctga gccaggtgat ccacgagatc 2880

agcaagctgg tgctgaagta caacgccatc atcgtgatgg aggacctgaa ctacggcttc 2940

aagcgcggcc gcttcaaggt ggagcgccag gtgtaccaga agttcgagac catgctgatc 3000

aacaagctgg cctacctggt ggacaagagc cgcgccgtgg acgagcccgg cggcctgctg 3060

aagggctacc agctgaccta cgtgcccgac aacctgggcg agctgggcag ccagtgcggc 3120

atcatcttct acgtgcccgc cgcctacacc agcaagatcg accccgtgac cggcttcgtg 3180

gacgtgttcg acttcaaggc ctacagcaac gccgaggccc gcctggactt catcaacaag 3240

ctggactgca tccgctacga cgccagccgc aacaagttcg agatcgcctt cgactacggc 3300

aacttccgca cccaccacac caccctggcc aagaccagct ggaccatctt catccacggc 3360

gaccgcatca agaaggagcg cggcagctac ggctggaagg acgagatcat cgacatcgag 3420

gcccgcatcc gcaagctgtt cgaggacacc gacatcgagt acgccgacgg ccacaacctg 3480

atcggcgaca tcaacgagct ggagagcccc atccagaaga agttcgtggg cgagctgttc 3540

gacatcatcc gcttcaccgt gcagctgcgc aacagcaaga gcgagaagta cgacggcacc 3600

gagaaggagt acgacaagat catcagcccc gtgatggacg aggagggcgt gttcttcacc 3660

accgacagct acatccgcgc cgacggcacc gagctgccca aggacgccga cgccaacggc 3720

gcctactgca tcgccctgaa gggcctgtac gacgtgctgg ccgtgaagaa gtactggaag 3780

gagggcgaga agttcgaccg caagctgctg gccatcacca actacaactg gttcgacttc 3840

atccagaacc gccgcttc 3858

Claims (1)

1.一种来自于Coprococcus eutactus细菌中的II类V型CRISPR蛋白CeCas12a在原核生物基因编辑、真核生物基因编辑、体外基因编辑中的应用，所述CeCas12a的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述CeCas12a识别的PAM序列为TTTV、TCTA、TTCA或CTTA，所述V表示A、C或G。

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