CN110878290B - II类V型CRISPR蛋白BfCas12a及其在基因编辑的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种来自于Butyrivibrio fibrisolvens MD2001细菌中的II类V型CRISPR蛋白BfCas12a及其应用。所述BfCas12a的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；其编码核苷酸序列如SED ID NO.2所示。本发明首次在Butyrivibrio fibrisolvens MD2001菌株中鉴定出具有基因编辑效应的II类V型CRISPR蛋白BfCas12a；所述BfCas12a能够在crRNA的介导下定点对原核生物和真核生物基因组进行基因编辑，BfCas12a的发现进一步扩大了基因编辑工具的种类，对基础科研和临床治疗具有十分重要的作用。

Description

II类V型CRISPR蛋白BfCas12a及其在基因编辑的应用

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种来自于Butyrivibrio fibrisolvensMD2001细菌中的II类V型CRISPR蛋白Cas12a，命名为BfCas12a，在基因编辑中的应用。

背景技术

自2013年以来，基因编辑技术取得了突破性进展，此项技术已经在基础科学研究、医药、临床、生物技术等许多领域引起了新的变革。除了具有代表性的Cas9系统之外，Cas12，又名Cpf1，作为又一种被发现的具有基因编辑效应的CRISPR系统新成员，极大的扩大了基因编辑系统靶点的可编辑范围，相比于Cas9系统，Cas12a所具有的加工前提RNA的功能，为其介导多基因编辑提供了相比与Cas9系统更为便捷高效的编辑能力。除此之外，相比于 Cas9的向导RNA，Cas12a的向导RNA组成更为简单，设计更为方便。

2015年，张峰团队首次发现了Cas9系统之外的另外一种具有基因编辑能力的新成员， Cas12a，又名Cpf1，将其划分到CRISPR系统2类V型中。相比于Cas9系统，Cas12a的编辑效率与Cas9的效率相当，在有些靶点低于Cas9。Cas12a的脱靶率极低，相比于Cas9脱靶率高的特性，Cas12a是一种安全的基因编辑工具。Cas12a在切割之后形成粘性末端，而 Cas9形成平末端，已有研究表明，Cas12a切割之后的粘性末端相比于Cas9的平末端而言，更容易发生同源重组修复，这也为基因的定点插入和修复提供了更好的工具。在向导RNA 的加工方面，Cas12a具有明显的优势，仅仅只需要Cas12a本身就能够完成对前提RNA的加工，而Cas9系统则需要RNaseIII的加工，这极大地促进Cas12a在多基因编辑上的应用。在 PAM的识别上，Cas12a识别5—TTTN—3或5—KYTV—3，Cas9则识别5—NGG—3.

因此，Cas12a作为一种新型基因编辑工具，与Cas9系统一道，为科学研究和疾病的治疗提供了有力的工具。基于对目前已有的Cas12a的研究，为应对将来各种情况下的基因编辑事件，发现更多的具有一定特性的Cas12a是一件具有重要意义的事情。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，目的在于提供一种来自于Butyrivibriofibrisolvens MD2001 细菌中的II类V型CRISPR蛋白BfCas12a及其在基因编辑中的应用。

为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案为：

一种来自于Butyrivibrio fibrisolvens MD2001细菌中的II类V型CRISPR蛋白BfCas12a，其氨基酸序列如SED ID NO.1所示。

上述方案中，所述BfCas12a识别的PAM序列为TTTV、TCTA、TTCA、TCCA、CTTA、或CCTA，更为优选的PAM序列为TTTV，所述V表示A、C、或G。

用于编辑蛋白BfCas12a氨基酸序列的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

上述BfCas12a在基因编辑中的应用。

上述BfCas12a在原核生物基因编辑中的应用。

上述BfCas12a在真核生物基因编辑中的应用。

上述BfCas12a在体外基因编辑中的应用。

本发明中所述蛋白BfCas12a的氨基酸序列如下：

(1)在原核细胞中：

YYESLTKLYPIKKTIRNELVPIGKTLENIKKNNILEADEDRKIAYIRVKAIMDDYHKRLINEA LSGFALIDLDKAANLYLSRSKSADDIESFSRFQDKLRKAIAKRLREHENFGKIGNKDIIPLLQ KLSENEDDYNALESFKNFYTYFESYNDVRLNLYSDKEKSSTVAYRLINENLPRFLDNIRAYD AVQKAGITSEELSSEAQDGLFLVNTFNNVLIQDGINTYNEDIGKLNVAINLYNQKNASVQGF RKVPKMKVLYKQILSDREESFIDEFESDTELLDSLESHYANLAKYFGSNKVQLLFTALRESK GVNVYVKNDIAKTSFSNVVFGSWSRIDELINGEYDDNNNRKKDEKYYDKRQKELKKNKS YTIEKIITLSTEDVDVIGKYIEKLESDIDDIRFKGKNFYEAVLCGHDRSKKLSKNKGAVEAIK GYLDSVKDFERDLKLINGSGQELEKNLVVYGEQEAVLSELSGIDSLYNMTRNYLTKKPFST EKIKLNFNKPTFLDGWDYGNEEAYLGFFMIKEGNYFLAVMDANWNKEFRNIPSVDKSDCY KKVIYKQISSPEKSIQNLMVIDGKTVKKNGRKEKEGIHSGENLILEELKNTYLPKKINDIRK RRSYLNGDTFSKKDLTEFIGYYKQRVIEYYNGYSFYFKSDDDYASFKEFQEDVGRQAYQIS YVDVPVSFVDDLINSGKLYLFRVYNKDFSEYSKGRLNLHTLYFKMLFDERNLKNVVYKLN GQAEVFYRPSSIKKEELIVHRAGEEIKNKNPKRAAQKPTRRLDYDIVKDRRYSQDKFMLHT SIIMNFGAEENVSFNDIVNGVLRNEDKVNVIGIDRGERNLLYVVVIDPEGKILEQRSLNCITD SNLDIETDYHRLLDEKESDRKIARRDWTTIENIKELKAGYLSQVVHIVAELVLKYNAIICLE DLNFGFKRGRQKVEKQVYQKFEKMLIDKLNYLVMDKSREQLSPEKISGALNALQLTPDFK SFKVLGKQTGIIYYVPAYLTSKIDPMTGFANLFYVKYENVDKAKEFFSKFDSIKYNKDGKN WNTKGYFEFAFDYKKFTDRAYGRVSEWTVCTVGERIIKFKNKEKNNSYDDKVIDLTNSLK ELFDSYKVTYESEVDLKDAILAIDDPAFYRDLTRRLQQTLQMRNSSCDGSRDYIISPVKNSK GEFFCSDNNDDTTPNDADANGAFNIARKGLWVLNEIRNSEEGSKINLAMSNAQWLEYAQD NTI；

(2)真核细胞中：

PKKKRKVYYESLTKLYPIKKTIRNELVPIGKTLENIKKNNILEADEDRKIAYIRVKAIMDDYH KRLINEALSGFALIDLDKAANLYLSRSKSADDIESFSRFQDKLRKAIAKRLREHENFGKIGN KDIIPLLQKLSENEDDYNALESFKNFYTYFESYNDVRLNLYSDKEKSSTVAYRLINENLPRF LDNIRAYDAVQKAGITSEELSSEAQDGLFLVNTFNNVLIQDGINTYNEDIGKLNVAINLYNQ KNASVQGFRKVPKMKVLYKQILSDREESFIDEFESDTELLDSLESHYANLAKYFGSNKVQL LFTALRESKGVNVYVKNDIAKTSFSNVVFGSWSRIDELINGEYDDNNNRKKDEKYYDKRQ KELKKNKSYTIEKIITLSTEDVDVIGKYIEKLESDIDDIRFKGKNFYEAVLCGHDRSKKLSKN KGAVEAIKGYLDSVKDFERDLKLINGSGQELEKNLVVYGEQEAVLSELSGIDSLYNMTRNY LTKKPFSTEKIKLNFNKPTFLDGWDYGNEEAYLGFFMIKEGNYFLAVMDANWNKEFRNIPS VDKSDCYKKVIYKQISSPEKSIQNLMVIDGKTVKKNGRKEKEGIHSGENLILEELKNTYLPK KINDIRKRRSYLNGDTFSKKDLTEFIGYYKQRVIEYYNGYSFYFKSDDDYASFKEFQEDVG RQAYQISYVDVPVSFVDDLINSGKLYLFRVYNKDFSEYSKGRLNLHTLYFKMLFDERNLKN VVYKLNGQAEVFYRPSSIKKEELIVHRAGEEIKNKNPKRAAQKPTRRLDYDIVKDRRYSQD KFMLHTSIIMNFGAEENVSFNDIVNGVLRNEDKVNVIGIDRGERNLLYVVVIDPEGKILEQR SLNCITDSNLDIETDYHRLLDEKESDRKIARRDWTTIENIKELKAGYLSQVVHIVAELVLKY NAIICLEDLNFGFKRGRQKVEKQVYQKFEKMLIDKLNYLVMDKSREQLSPEKISGALNALQ LTPDFKSFKVLGKQTGIIYYVPAYLTSKIDPMTGFANLFYVKYENVDKAKEFFSKFDSIKYN KDGKNWNTKGYFEFAFDYKKFTDRAYGRVSEWTVCTVGERIIKFKNKEKNNSYDDKVIDL TNSLKELFDSYKVTYESEVDLKDAILAIDDPAFYRDLTRRLQQTLQMRNSSCDGSRDYIISP VKNSKGEFFCSDNNDDTTPNDADANGAFNIARKGLWVLNEIRNSEEGSKINLAMSNAQW LEYAQDNTIKRPAATKKAGQAKKKKGSYPYDVPDYA YPYDVPDYAYPYDVPDYA

其中在BfCas12a蛋白氨基酸序列的N端加入PKKKRKV序列(该序列为N端NLS入核序列)，在BfCas12a蛋白氨基酸序列的C端加入KRPAATKKAGQAKKKK序列(该序列为C 端NLS入核序列)，随后用GS序列连接YPYDVPDYAYPYDVPDYAYPYDVPDYA序列(该序列为3HA序列)。

编码本发明所述蛋白BfCas12a的核苷酸序列如下：

tactacgagagcctgaccaagctgtaccccatcaagaagaccatccgcaacgagctggtgcccatcggcaagaccctggagaacatcaagaagaacaacatcctg gaggccgacgaggaccgcaagatcgcctacatccgcgtgaaggccatcatggacgactaccacaagcgcctgatcaacgaggccctgagcggcttcgccctgat cgacctggacaaggccgccaacctgtacctgagccgcagcaagagcgccgacgacatcgagagcttcagccgcttccaggacaagctgcgcaaggccatcgcc aagcgcctgcgcgagcacgagaacttcggcaagatcggcaacaaggacatcatccccctgctgcagaagctgagcgagaacgaggacgactacaacgccctgg agagcttcaagaacttctacacctacttcgagagctacaacgacgtgcgcctgaacctgtacagcgacaaggagaagagcagcaccgtggcctaccgcctgatcaacgagaacctgccccgcttcctggacaacatccgcgcctacgacgccgtgcagaaggccggcatcaccagcgaggagctgagcagcgaggcccaggacggcc tgttcctggtgaacaccttcaacaacgtgctgatccaggacggcatcaacacctacaacgaggacatcggcaagctgaacgtggccatcaacctgtacaaccagaa gaacgccagcgtgcagggcttccgcaaggtgcccaagatgaaggtgctgtacaagcagatcctgagcgaccgcgaggagagcttcatcgacgagttcgagagc gacaccgagctgctggacagcctggagagccactacgccaacctggccaagtacttcggcagcaacaaggtgcagctgctgttcaccgccctgcgcgagagcaa gggcgtgaacgtgtacgtgaagaacgacatcgccaagaccagcttcagcaacgtggtgttcggcagctggagccgcatcgacgagctgatcaacggcgagtacg acgacaacaacaaccgcaagaaggacgagaagtactacgacaagcgccagaaggagctgaagaagaacaagagctacaccatcgagaagatcatcaccctga gcaccgaggacgtggacgtgatcggcaagtacatcgagaagctggagagcgacatcgacgacatccgcttcaagggcaagaacttctacgaggccgtgctgtgc ggccacgaccgcagcaagaagctgagcaagaacaagggcgccgtggaggccatcaagggctacctggacagcgtgaaggacttcgagcgcgacctgaagct gatcaacggcagcggccaggagctggagaagaacctggtggtgtacggcgagcaggaggccgtgctgagcgagctgagcggcatcgacagcctgtacaacat gacccgcaactacctgaccaagaagcccttcagcaccgagaagatcaagctgaacttcaacaagcccaccttcctggacggctgggactacggcaacgaggagg cctacctgggcttcttcatgatcaaggagggcaactacttcctggccgtgatggacgccaactggaacaaggagttccgcaacatccccagcgtggacaagagcga ctgctacaagaaggtgatctacaagcagatcagcagccccgagaagagcatccagaacctgatggtgatcgacggcaagaccgtgaagaagaacggccgcaag gagaaggagggcatccacagcggcgagaacctgatcctggaggagctgaagaacacctacctgcccaagaagatcaacgacatccgcaagcgccgcagctac ctgaacggcgacaccttcagcaagaaggacctgaccgagttcatcggctactacaagcagcgcgtgatcgagtactacaacggctacagcttctacttcaagagcg acgacgactacgccagcttcaaggagttccaggaggacgtgggccgccaggcctaccagatcagctacgtggacgtgcccgtgagcttcgtggacgacctgatc aacagcggcaagctgtacctgttccgcgtgtacaacaaggacttcagcgagtacagcaagggccgcctgaacctgcacaccctgtacttcaagatgctgttcgacg agcgcaacctgaagaacgtggtgtacaagctgaacggccaggccgaggtgttctaccgccccagcagcatcaagaaggaggagctgatcgtgcaccgcgccgg cgaggagatcaagaacaagaaccccaagcgcgccgcccagaagcccacccgccgcctggactacgacatcgtgaaggaccgccgctacagccaggacaagtt catgctgcacaccagcatcatcatgaacttcggcgccgaggagaacgtgagcttcaacgacatcgtgaacggcgtgctgcgcaacgaggacaaggtgaacgtgat cggcatcgaccgcggcgagcgcaacctgctgtacgtggtggtgatcgaccccgagggcaagatcctggagcagcgcagcctgaactgcatcaccgacagcaac ctggacatcgagaccgactaccaccgcctgctggacgagaaggagagcgaccgcaagatcgcccgccgcgactggaccaccatcgagaacatcaaggagctg aaggccggctacctgagccaggtggtgcacatcgtggccgagctggtgctgaagtacaacgccatcatctgcctggaggacctgaacttcggcttcaagcgcggc cgccagaaggtggagaagcaggtgtaccagaagttcgagaagatgctgatcgacaagctgaactacctggtgatggacaagagccgcgagcagctgagccccg agaagatcagcggcgccctgaacgccctgcagctgacccccgacttcaagagcttcaaggtgctgggcaagcagaccggcatcatctactacgtgcccgcctacc tgaccagcaagatcgaccccatgaccggcttcgccaacctgttctacgtgaagtacgagaacgtggacaaggccaaggagttcttcagcaagttcgacagcatcaa gtacaacaaggacggcaagaactggaacaccaagggctacttcgagttcgccttcgactacaagaagttcaccgaccgcgcctacggccgcgtgagcgagtgga ccgtgtgcaccgtgggcgagcgcatcatcaagttcaagaacaaggagaagaacaacagctacgacgacaaggtgatcgacctgaccaacagcctgaaggagct gttcgacagctacaaggtgacctacgagagcgaggtggacctgaaggacgccatcctggccatcgacgaccccgccttctaccgcgacctgacccgccgcctgc agcagaccctgcagatgcgcaacagcagctgcgacggcagccgcgactacatcatcagccccgtgaagaacagcaagggcgagttcttctgcagcgacaacaa cgacgacaccacccccaacgacgccgacgccaacggcgccttcaacatcgcccgcaagggcctgtgggtgctgaacgagatccgcaacagcgaggagggca gcaagatcaacctggccatgagcaacgcccagtggctggagtacgcccaggacaacaccatc

本发明中Butyrivibrio fibrisolvens MD2001细菌基因组中部分CRISPR array如图2所示，基因组中黑体显示CRISPR array序列为“ATCTACAACAGTAGAAATTATCTATAGGTTCTT GG”，因此，使用的crRNA direct repeat序列为5’-AATTTCTACTGTTGTAGAT-3’。

本发明的有益效果：本发明首次在Butyrivibrio fibrisolvens MD2001菌株中鉴定出具有基因编辑效应的II类V型CRISPR蛋白，命名为BfCas12a；所述BfCas12a能够在crRNA的介导下定点对原核生物和真核生物基因组进行基因编辑，BfCas12a的发现进一步扩大了基因编辑工具的种类，同时也为后续各种不同情况的基因编辑提供了重要的备选工具，对基础科研和临床治疗具有十分重要的作用。

附图说明

图1为Butyrivibrio fibrisolvens MD2001 CRISPR array及crRNA directrepeat图示。

图2为Butyrivibrio fibrisolvens MD2001菌株基因组中存在的部分CRISPRarray示意图。

图3为体外切割EGFP片段靶点示意图。

图4为原核表达BfCas12a之后，体外切割实验，S表示substrate；P表示product。

图5为体外实验验证BfCas12a的PAM，S表示substrate；P表示product。

图6为体内验证BfCas12a基因编辑，S表示substrate；P表示product。

图7为体内验证BfCas12a在相同基因不同靶点的基因编辑效率。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

实施例1

BfCas12a体外不同时间梯度切割实验，包括以下实验步骤：

(1)BfCas12a蛋白的表达与纯化：将BfCas12a基因序列合成到pet28a表达载体上，且在C末端加上6His标签，随后将合成好的质粒转化到E.Coli Rosseta 2(DE3)表达菌株中，挑取单克隆，小量表达检测确定蛋白表达后进行蛋白的大量表达与纯化；重组蛋白依次经过 Ni柱亲和层析，heparin柱层析，superdex 200分子筛纯化后，保存在buffer(10mMTris-HCl， 200mM NaCl，1mM MgCl)中，并冻存于-80℃备用；

(2)使用crRNA direct repeat序列为：5’-AATTTCTACTGTTGTAGAT-3’，在体外转录获得crRNA；将步骤(1)所得BfCas12a蛋白与crRNA混合得到BfCas12a-crRNA复合物；

(3)取100nM BfCas12a-crRNA所得复合物与300ng线性化的底物(图4所示)混匀，37℃孵育分别孵育0,1,2,5,10min后，加入适量蛋白酶K，58℃消化60min，跑2％琼脂糖胶，结果如图4所示，BfCas12a具有良好的体外切割能力。

实施例2

BfCas12a识别PAM的确定

(1)设计NNNN四个位置随机组合的上下游引物(N表示A、G、C、T)，以EGFP片段作为模板，采用overlap PCR方法进行PCR，得到256种带有不同PAM序列，但spacer 序列一样的1.1kb的线性化底物；

(2)取100nM BfCas12a-crRNA复合物与300ng线性化的底物混匀，37℃孵育分别孵育10min后，加入适量蛋白酶K，58℃消化60min，跑2％琼脂糖胶，部分结果如图5所示，BfCas12a能够识别不同的PAM：TTTA、TCTA、TTCA、TCCA、CTTA、CCTA，但最优PAM 为TTTV(V表示A,C,G)。

实施例3

BfCas12a在哺乳动物细胞内不同基因的编辑：

(1)构建BfCas12a真核表达质粒：将BfCas12a基因序列合成到pet28a表达载体上构建BfCas12a真核表达质粒；

(2)在哺乳动物细胞中，以293T细胞为例选择TRAC、TRBC、B2M、CTLA4、PD1五个基因，分别以这五个基因为目标，构建5个U6-crRNA spacer真核表达质粒；

(3)分别针对这五个基因的切割靶点附近设计surveyor primer，并验证PCR引物的特异性；

(4)消化293T细胞，适当浓度铺24孔板，每孔500ul；

(5)24孔板共转BfCas12a真核表达质粒(700ng)和U6-crRNA spacer真核表达质粒(300ng)，48h后裂解细胞，取1ul裂解液作为模板、以步骤(3)设计的surveyor primer引物进行PCR，纯化PCR产物；

(6)取300ng PCR产物与1ul 10XT7EI buffer混匀，按以下PCR程序进行复性95℃10min，95℃至85℃-2℃/S，85℃到25℃-0.25℃/S，25℃持续1min，复性之后产物加入 1ulT7EI，37℃酶切20min，跑2％琼脂糖胶，结果如图6所示在B2M、PD1能够进行基因编辑，(本案例中的基因只是作为代表进行列举,并不说明在其他基因上没有基因编辑的能力)。

实施例4

BfCas12a在哺乳动物细胞内相同基因不同靶点的基因编辑：

(1)选取并设计VEGFA基因上3个不同的靶点(VEGFA Site 1、VEGFA Site 2、VEGFASite 3)的crRNA；

(2)切割靶点附近设计surveyor primer，并验证PCR引物的特异性；

(3)消化293T细胞，适当浓度铺24孔板，每孔500ul；

(4)24孔板共转BfCas12a真核表达质粒(700ng)和U6-crRNA spacer真核表达质粒(300ng)，48h后裂解细胞，取1ul裂解液作为模板、以步骤(3)设计的surveyor primer引物进行PCR，纯化PCR产物；

(5)取300ngPCR产物与1ul 10XT7EI buffer混匀，按以下PCR程序进行复性95℃10min，95℃至85℃-2℃/S，85℃到25℃-0.25℃/S，25℃持续1min。

(6)复性之后产物加入1ul T7EI，37℃酶切20min，跑2％琼脂糖胶，结果如图7所示，采用灰度分析可得在各个靶点切割效率分别为20％、34％、6％。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。

序列表

<110>武汉大学

<120>II类V型CRISPR 蛋白BfCas12a及其用于基因编辑的应用

<160>2

<210> 1

<211> 1230

<212> PRT

<213>Butyrivibrio fibrisolvens MD2001 细菌

<400>1

Tyr Tyr Glu Ser Leu Thr Lys Leu Tyr Pro Ile Lys Lys Thr Ile Arg

1 5 10 15

Asn Glu Leu Val Pro Ile Gly Lys Thr Leu Glu Asn Ile Lys Lys Asn

20 25 30

Asn Ile Leu Glu Ala Asp Glu Asp Arg Lys Ile Ala Tyr Ile Arg Val

35 40 45

Lys Ala Ile Met Asp Asp Tyr His Lys Arg Leu Ile Asn Glu Ala Leu

50 55 60

Ser Gly Phe Ala Leu Ile Asp Leu Asp Lys Ala Ala Asn Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Ser Arg Ser Lys Ser Ala Asp Asp Ile Glu Ser Phe Ser Arg Phe Gln

85 90 95

Asp Lys Leu Arg Lys Ala Ile Ala Lys Arg Leu Arg Glu His Glu Asn

100 105 110

Phe Gly Lys Ile Gly Asn Lys Asp Ile Ile Pro Leu Leu Gln Lys Leu

115 120 125

Ser Glu Asn Glu Asp Asp Tyr Asn Ala Leu Glu Ser Phe Lys Asn Phe

130 135 140

Tyr Thr Tyr Phe Glu Ser Tyr Asn Asp Val Arg Leu Asn Leu Tyr Ser

145 150 155 160

Asp Lys Glu Lys Ser Ser Thr Val Ala Tyr Arg Leu Ile Asn Glu Asn

165 170 175

Leu Pro Arg Phe Leu Asp Asn Ile Arg Ala Tyr Asp Ala Val Gln Lys

180 185 190

Ala Gly Ile Thr Ser Glu Glu Leu Ser Ser Glu Ala Gln Asp Gly Leu

195 200 205

Phe Leu Val Asn Thr Phe Asn Asn Val Leu Ile Gln Asp Gly Ile Asn

210 215 220

Thr Tyr Asn Glu Asp Ile Gly Lys Leu Asn Val Ala Ile Asn Leu Tyr

225 230 235 240

Asn Gln Lys Asn Ala Ser Val Gln Gly Phe Arg Lys Val Pro Lys Met

245 250 255

Lys Val Leu Tyr Lys Gln Ile Leu Ser Asp Arg Glu Glu Ser Phe Ile

260 265 270

Asp Glu Phe Glu Ser Asp Thr Glu Leu Leu Asp Ser Leu Glu Ser His

275 280 285

Tyr Ala Asn Leu Ala Lys Tyr Phe Gly Ser Asn Lys Val Gln Leu Leu

290 295 300

Phe Thr Ala Leu Arg Glu Ser Lys Gly Val Asn Val Tyr Val Lys Asn

305 310 315 320

Asp Ile Ala Lys Thr Ser Phe Ser Asn Val Val Phe Gly Ser Trp Ser

325 330 335

Arg Ile Asp Glu Leu Ile Asn Gly Glu Tyr Asp Asp Asn Asn Asn Arg

340 345 350

Lys Lys Asp Glu Lys Tyr Tyr Asp Lys Arg Gln Lys Glu Leu Lys Lys

355 360 365

Asn Lys Ser Tyr Thr Ile Glu Lys Ile Ile Thr Leu Ser Thr Glu Asp

370 375 380

Val Asp Val Ile Gly Lys Tyr Ile Glu Lys Leu Glu Ser Asp Ile Asp

385 390 395 400

Asp Ile Arg Phe Lys Gly Lys Asn Phe Tyr Glu Ala Val Leu Cys Gly

405 410 415

His Asp Arg Ser Lys Lys Leu Ser Lys Asn Lys Gly Ala Val Glu Ala

420 425 430

Ile Lys Gly Tyr Leu Asp Ser Val Lys Asp Phe Glu Arg Asp Leu Lys

435 440 445

Leu Ile Asn Gly Ser Gly Gln Glu Leu Glu Lys Asn Leu Val Val Tyr

450 455 460

Gly Glu Gln Glu Ala Val Leu Ser Glu Leu Ser Gly Ile Asp Ser Leu

465 470 475 480

Tyr Asn Met Thr Arg Asn Tyr Leu Thr Lys Lys Pro Phe Ser Thr Glu

485 490 495

Lys Ile Lys Leu Asn Phe Asn Lys Pro Thr Phe Leu Asp Gly Trp Asp

500 505 510

Tyr Gly Asn Glu Glu Ala Tyr Leu Gly Phe Phe Met Ile Lys Glu Gly

515 520 525

Asn Tyr Phe Leu Ala Val Met Asp Ala Asn Trp Asn Lys Glu Phe Arg

530 535 540

Asn Ile Pro Ser Val Asp Lys Ser Asp Cys Tyr Lys Lys Val Ile Tyr

545 550 555 560

Lys Gln Ile Ser Ser Pro Glu Lys Ser Ile Gln Asn Leu Met Val Ile

565 570 575

Asp Gly Lys Thr Val Lys Lys Asn Gly Arg Lys Glu Lys Glu Gly Ile

580 585 590

His Ser Gly Glu Asn Leu Ile Leu Glu Glu Leu Lys Asn Thr Tyr Leu

595 600 605

Pro Lys Lys Ile Asn Asp Ile Arg Lys Arg Arg Ser Tyr Leu Asn Gly

610 615 620

Asp Thr Phe Ser Lys Lys Asp Leu Thr Glu Phe Ile Gly Tyr Tyr Lys

625 630 635 640

Gln Arg Val Ile Glu Tyr Tyr Asn Gly Tyr Ser Phe Tyr Phe Lys Ser

645 650 655

Asp Asp Asp Tyr Ala Ser Phe Lys Glu Phe Gln Glu Asp Val Gly Arg

660 665 670

Gln Ala Tyr Gln Ile Ser Tyr Val Asp Val Pro Val Ser Phe Val Asp

675 680 685

Asp Leu Ile Asn Ser Gly Lys Leu Tyr Leu Phe Arg Val Tyr Asn Lys

690 695 700

Asp Phe Ser Glu Tyr Ser Lys Gly Arg Leu Asn Leu His Thr Leu Tyr

705 710 715 720

Phe Lys Met Leu Phe Asp Glu Arg Asn Leu Lys Asn Val Val Tyr Lys

725 730 735

Leu Asn Gly Gln Ala Glu Val Phe Tyr Arg Pro Ser Ser Ile Lys Lys

740 745 750

Glu Glu Leu Ile Val His Arg Ala Gly Glu Glu Ile Lys Asn Lys Asn

755 760 765

Pro Lys Arg Ala Ala Gln Lys Pro Thr Arg Arg Leu Asp Tyr Asp Ile

770 775 780

Val Lys Asp Arg Arg Tyr Ser Gln Asp Lys Phe Met Leu His Thr Ser

785 790 795 800

Ile Ile Met Asn Phe Gly Ala Glu Glu Asn Val Ser Phe Asn Asp Ile

805 810 815

Val Asn Gly Val Leu Arg Asn Glu Asp Lys Val Asn Val Ile Gly Ile

820 825 830

Asp Arg Gly Glu Arg Asn Leu Leu Tyr Val Val Val Ile Asp Pro Glu

835 840 845

Gly Lys Ile Leu Glu Gln Arg Ser Leu Asn Cys Ile Thr Asp Ser Asn

850 855 860

Leu Asp Ile Glu Thr Asp Tyr His Arg Leu Leu Asp Glu Lys Glu Ser

865 870 875 880

Asp Arg Lys Ile Ala Arg Arg Asp Trp Thr Thr Ile Glu Asn Ile Lys

885 890 895

Glu Leu Lys Ala Gly Tyr Leu Ser Gln Val Val His Ile Val Ala Glu

900 905 910

Leu Val Leu Lys Tyr Asn Ala Ile Ile Cys Leu Glu Asp Leu Asn Phe

915 920 925

Gly Phe Lys Arg Gly Arg Gln Lys Val Glu Lys Gln Val Tyr Gln Lys

930 935 940

Phe Glu Lys Met Leu Ile Asp Lys Leu Asn Tyr Leu Val Met Asp Lys

945 950 955 960

Ser Arg Glu Gln Leu Ser Pro Glu Lys Ile Ser Gly Ala Leu Asn Ala

965 970 975

Leu Gln Leu Thr Pro Asp Phe Lys Ser Phe Lys Val Leu Gly Lys Gln

980 985 990

Thr Gly Ile Ile Tyr Tyr Val Pro Ala Tyr Leu Thr Ser Lys Ile Asp

995 1000 1005

Pro Met Thr Gly Phe Ala Asn Leu Phe Tyr Val Lys Tyr Glu Asn Val

1010 1015 1020

Asp Lys Ala Lys Glu Phe Phe Ser Lys Phe Asp Ser Ile Lys Tyr Asn

1025 1030 1035 1040

Lys Asp Gly Lys Asn Trp Asn Thr Lys Gly Tyr Phe Glu Phe Ala Phe

1045 1050 1055

Asp Tyr Lys Lys Phe Thr Asp Arg Ala Tyr Gly Arg Val Ser Glu Trp

1060 1065 1070

Thr Val Cys Thr Val Gly Glu Arg Ile Ile Lys Phe Lys Asn Lys Glu

1075 1080 1085

Lys Asn Asn Ser Tyr Asp Asp Lys Val Ile Asp Leu Thr Asn Ser Leu

1090 1095 1100

Lys Glu Leu Phe Asp Ser Tyr Lys Val Thr Tyr Glu Ser Glu Val Asp

1105 1110 1115 1120

Leu Lys Asp Ala Ile Leu Ala Ile Asp Asp Pro Ala Phe Tyr Arg Asp

1125 1130 1135

Leu Thr Arg Arg Leu Gln Gln Thr Leu Gln Met Arg Asn Ser Ser Cys

1140 1145 1150

Asp Gly Ser Arg Asp Tyr Ile Ile Ser Pro Val Lys Asn Ser Lys Gly

1155 1160 1165

Glu Phe Phe Cys Ser Asp Asn Asn Asp Asp Thr Thr Pro Asn Asp Ala

1170 1175 1180

Asp Ala Asn Gly Ala Phe Asn Ile Ala Arg Lys Gly Leu Trp Val Leu

1185 1190 1195 1200

Asn Glu Ile Arg Asn Ser Glu Glu Gly Ser Lys Ile Asn Leu Ala Met

1205 1210 1215

Ser Asn Ala Gln Trp Leu Glu Tyr Ala Gln Asp Asn Thr Ile

1220 1225 1230

<210> 2

<211> 3690bp

<212> DNA

<213>Butyrivibrio fibrisolvens MD2001 细菌

<400>2

tactacgaga gcctgaccaa gctgtacccc atcaagaaga ccatccgcaa cgagctggtg 60

cccatcggca agaccctgga gaacatcaag aagaacaaca tcctggaggc cgacgaggac 120

cgcaagatcg cctacatccg cgtgaaggcc atcatggacg actaccacaa gcgcctgatc 180

aacgaggccc tgagcggctt cgccctgatc gacctggaca aggccgccaa cctgtacctg 240

agccgcagca agagcgccga cgacatcgag agcttcagcc gcttccagga caagctgcgc 300

aaggccatcg ccaagcgcct gcgcgagcac gagaacttcg gcaagatcgg caacaaggac 360

atcatccccc tgctgcagaa gctgagcgag aacgaggacg actacaacgc cctggagagc 420

ttcaagaact tctacaccta cttcgagagc tacaacgacg tgcgcctgaa cctgtacagc 480

gacaaggaga agagcagcac cgtggcctac cgcctgatca acgagaacct gccccgcttc 540

ctggacaaca tccgcgccta cgacgccgtg cagaaggccg gcatcaccag cgaggagctg 600

agcagcgagg cccaggacgg cctgttcctg gtgaacacct tcaacaacgt gctgatccag 660

gacggcatca acacctacaa cgaggacatc ggcaagctga acgtggccat caacctgtac 720

aaccagaaga acgccagcgt gcagggcttc cgcaaggtgc ccaagatgaa ggtgctgtac 780

aagcagatcc tgagcgaccg cgaggagagc ttcatcgacg agttcgagag cgacaccgag 840

ctgctggaca gcctggagag ccactacgcc aacctggcca agtacttcgg cagcaacaag 900

gtgcagctgc tgttcaccgc cctgcgcgag agcaagggcg tgaacgtgta cgtgaagaac 960

gacatcgcca agaccagctt cagcaacgtg gtgttcggca gctggagccg catcgacgag 1020

ctgatcaacg gcgagtacga cgacaacaac aaccgcaaga aggacgagaa gtactacgac 1080

aagcgccaga aggagctgaa gaagaacaag agctacacca tcgagaagat catcaccctg 1140

agcaccgagg acgtggacgt gatcggcaag tacatcgaga agctggagag cgacatcgac 1200

gacatccgct tcaagggcaa gaacttctac gaggccgtgc tgtgcggcca cgaccgcagc 1260

aagaagctga gcaagaacaa gggcgccgtg gaggccatca agggctacct ggacagcgtg 1320

aaggacttcg agcgcgacct gaagctgatc aacggcagcg gccaggagct ggagaagaac 1380

ctggtggtgt acggcgagca ggaggccgtg ctgagcgagc tgagcggcat cgacagcctg 1440

tacaacatga cccgcaacta cctgaccaag aagcccttca gcaccgagaa gatcaagctg 1500

aacttcaaca agcccacctt cctggacggc tgggactacg gcaacgagga ggcctacctg 1560

ggcttcttca tgatcaagga gggcaactac ttcctggccg tgatggacgc caactggaac 1620

aaggagttcc gcaacatccc cagcgtggac aagagcgact gctacaagaa ggtgatctac 1680

aagcagatca gcagccccga gaagagcatc cagaacctga tggtgatcga cggcaagacc 1740

gtgaagaaga acggccgcaa ggagaaggag ggcatccaca gcggcgagaa cctgatcctg 1800

gaggagctga agaacaccta cctgcccaag aagatcaacg acatccgcaa gcgccgcagc 1860

tacctgaacg gcgacacctt cagcaagaag gacctgaccg agttcatcgg ctactacaag 1920

cagcgcgtga tcgagtacta caacggctac agcttctact tcaagagcga cgacgactac 1980

gccagcttca aggagttcca ggaggacgtg ggccgccagg cctaccagat cagctacgtg 2040

gacgtgcccg tgagcttcgt ggacgacctg atcaacagcg gcaagctgta cctgttccgc 2100

gtgtacaaca aggacttcag cgagtacagc aagggccgcc tgaacctgca caccctgtac 2160

ttcaagatgc tgttcgacga gcgcaacctg aagaacgtgg tgtacaagct gaacggccag 2220

gccgaggtgt tctaccgccc cagcagcatc aagaaggagg agctgatcgt gcaccgcgcc 2280

ggcgaggaga tcaagaacaa gaaccccaag cgcgccgccc agaagcccac ccgccgcctg 2340

gactacgaca tcgtgaagga ccgccgctac agccaggaca agttcatgct gcacaccagc 2400

atcatcatga acttcggcgc cgaggagaac gtgagcttca acgacatcgt gaacggcgtg 2460

ctgcgcaacg aggacaaggt gaacgtgatc ggcatcgacc gcggcgagcg caacctgctg 2520

tacgtggtgg tgatcgaccc cgagggcaag atcctggagc agcgcagcct gaactgcatc 2580

accgacagca acctggacat cgagaccgac taccaccgcc tgctggacga gaaggagagc 2640

gaccgcaaga tcgcccgccg cgactggacc accatcgaga acatcaagga gctgaaggcc 2700

ggctacctga gccaggtggt gcacatcgtg gccgagctgg tgctgaagta caacgccatc 2760

atctgcctgg aggacctgaa cttcggcttc aagcgcggcc gccagaaggt ggagaagcag 2820

gtgtaccaga agttcgagaa gatgctgatc gacaagctga actacctggt gatggacaag 2880

agccgcgagc agctgagccc cgagaagatc agcggcgccc tgaacgccct gcagctgacc 2940

cccgacttca agagcttcaa ggtgctgggc aagcagaccg gcatcatcta ctacgtgccc 3000

gcctacctga ccagcaagat cgaccccatg accggcttcg ccaacctgtt ctacgtgaag 3060

tacgagaacg tggacaaggc caaggagttc ttcagcaagt tcgacagcat caagtacaac 3120

aaggacggca agaactggaa caccaagggc tacttcgagt tcgccttcga ctacaagaag 3180

ttcaccgacc gcgcctacgg ccgcgtgagc gagtggaccg tgtgcaccgt gggcgagcgc 3240

atcatcaagt tcaagaacaa ggagaagaac aacagctacg acgacaaggt gatcgacctg 3300

accaacagcc tgaaggagct gttcgacagc tacaaggtga cctacgagag cgaggtggac 3360

ctgaaggacg ccatcctggc catcgacgac cccgccttct accgcgacct gacccgccgc 3420

ctgcagcaga ccctgcagat gcgcaacagc agctgcgacg gcagccgcga ctacatcatc 3480

agccccgtga agaacagcaa gggcgagttc ttctgcagcg acaacaacga cgacaccacc 3540

cccaacgacg ccgacgccaa cggcgccttc aacatcgccc gcaagggcct gtgggtgctg 3600

aacgagatcc gcaacagcga ggagggcagc aagatcaacc tggccatgag caacgcccag 3660

tggctggagt acgcccagga caacaccatc 3690

Claims (1)

1.一种来自于Butyrivibrio fibrisolvens MD2001细菌中的II类V型CRISPR蛋白BfCas12a识别的PAM序列在BfCas12a蛋白进行真核生物基因编辑中的应用，所示BfCas12a氨基酸序列如SED ID NO.1所示；所述BfCas12a识别的PAM序列为TTTV、TCTA、TTCA、TCCA、CTTA、或CCTA，所述V表示A、C、或G。

Images