CN115896070A - 一种新型基因组编辑工具EbCas12a-D141R及其在基因编辑中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新型基因组编辑工具EbCas12a‑D141R及其在基因编辑中的应用，属于生物技术领域。所述EbCas12a‑D141R为II类V型CRISPR蛋白EbCas12a的变体，其氨基酸序列在原核细胞中如SED ID NO.1所示，在真核细胞中如SED ID NO.2所示。本发明首次在II类V型CRISPR蛋白EbCas12a(1158AA)的基础上获得效率更高的变体EbCas12a‑D141R，该变体在真核生物细胞内的基因编辑效率明显高于EbCas12a。EbCas12a‑D141R的发现进一步扩大了基因编辑工具的种类，对基础科研和临床治疗具有十分重要的作用。

Description

一种新型基因组编辑工具EbCas12a-D141R及其在基因编辑中的应用

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种II类V型CRISPR蛋白EbCas12a的变体EbCas12a-D141R及其在基因编辑中的应用。

背景技术

自2013年以来，基因编辑技术取得了突破性进展，此项技术已经在基础科学研究、医药、临床、生物技术等许多领域引起了新的变革。除了具有代表性的Cas9系统之外，Cas12，又名Cpf1，作为又一种被发现的具有基因编辑效应的CRISPR系统新成员，极大的扩大了基因编辑系统靶点的可编辑范围，相比于Cas9系统，Cas12a所具有的加工前体RNA的功能，为其介导多基因编辑提供了相比于Cas9系统更为便捷高效的编辑能力。除此之外，相比于Cas9的向导RNA，Cas12a的向导RNA组成更为简单，设计更为方便。

2015年，张峰团队首次发现了Cas9系统之外的另外一种具有基因编辑能力的新成员，Cas12a，又名Cpf1，将其划分到CRISPR系统2类V型中。相比于Cas9系统，Cas12a的编辑效率与Cas9的效率相当，在有些靶点低于Cas9。Cas12a的脱靶率极低，相比于Cas9脱靶率高的特性，Cas12a是一种安全的基因编辑工具。Cas12a在切割之后形成粘性末端，而Cas9形成平末端，已有研究表明，Cas12a切割之后的粘性末端相比于Cas9的平末端而言，更容易发生同源重组修复，这也为基因的定点插入和修复提供了更好的工具。在向导RNA的加工方面，Cas12a具有明显的优势，仅仅只需要Cas12a本身就能够完成对前体RNA的加工，而Cas9系统则需要RNaseIII的加工，这极大地促进Cas12a在多基因编辑上的应用。在PAM的识别上，Cas12a识别5’-TTTN-3’或5’-KYTV-3’，Cas9则识别5’-NGG-3’。

因此，Cas12a作为一种新型基因编辑工具，与Cas9系统一道，为科学研究和疾病的治疗提供了有力的工具。基于对目前已有的Cas12a的研究，为应对将来各种情况下的基因编辑事件，对更小更紧凑的Cas12a系统进行改造提高编辑效率是一件具有重要意义的事情。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，目的在于提供一种紧凑型编辑工具即更小的Cas12a同源蛋白EbCas12a的变体EbCas12a-D141R在基因编辑中的应用。

为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案为：

一种II类V型CRISPR蛋白EbCas12a的变体EbCas12a-D141R蛋白，其氨基酸序列如SED ID NO.1所示。其中，EbCas12a来自于Erysipelotrichia bacterium细菌，EbCas12a识别的PAM序列主要为TTTV，也能弱识别TCTA、TTCA或CTTA，所述V表示A、C、或G；EbCas12a具有DNA切割能力，能够定点对体外DNA和体内基因组进行基因编辑。而EbCas12a-D141R的基因编辑的效率明显高于EbCas12a。

EbCas12a-D141R在真核细胞中所用序列如SED ID NO.2所示。

上述EbCas12a-D141R具有DNA切割能力，能够定点对体外DNA和体内基因组进行基因编辑。

上述EbCas12a-D141R在基因剪辑中的应用。所述的基因编辑包括体外基因编辑、原核生物基因编辑、真核生物基因编辑。在原核生物基因剪辑中，EbCas12a-D141R的氨基酸序列如SED ID NO.1所示；在真核生物基因剪辑中，EbCas12a-D141R的氨基酸序列如SED IDNO.2所示。

本发明所述蛋白EbCas12a-D141R的氨基酸序列如下：

EbCas12a-D141R自身的蛋白序列(SED ID NO.1)：

EbCas12a-D141R在真核细胞中所用序列(SED ID NO.2)：

真核细胞中所用序列在EbCas12a-D141R蛋白氨基酸序列的C端加入KRPAATKKAGQAKKKK序列(该序列为C端NLS入核序列)，随后用GS序列连接YPYDVPDYAYPYDVPDYAYPYDVPDYA序列(该序列为3HA序列)。

本发明的有益效果：本发明在II类V型更小的CRISPR蛋EbCas12a(1158AA)的基础上获得编辑效率更高的变体EbCas12a-D141R；所述变体EbCas12a-D141R在真核生物细胞内的基因编辑效率明显高于EbCas12a。EbCas12a-D141R的发现进一步扩大了基因编辑工具的种类，同时也为后续各种不同情况的基因编辑提供了重要的备选工具，对基础科研和临床治疗具有十分重要的作用。

附图说明

图1为Erysipelotrichia bacterium菌株CRISPR array及crRNA direct repeat图示。

图2为原核表达EbCas12a之后，体外切割实验，S表示substrate，底物；P表示product，产物。

图3为体外实验验证EbCas12a的PAM。

图4为体内验证EbCas12a基因编辑。

图5为EbCas12a-D141R和EbCas12a在细胞外源基因EGFP上的编辑效率，图中con为对照组。

图6为EbCas12a-D141R和EbCas12a在细胞内源基因上的编辑效率。

图7为EbCas12a-D141R和EbCas12a在细胞内源基因编辑靶点编辑后的深度测序。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

实施例1

EbCas12a体外不同时间梯度及不同PAM切割实验，包括以下实验步骤：

(1)EbCas12a蛋白的表达与纯化：将EbCas12a基因序列(如下)合成到pet28a表达载体上(酶切位点NcoI和XhoI)，在C末端带有6His标签，随后将合成好的质粒转化到E.ColiRosseta 2(DE3)表达菌株中，挑取单克隆，小量表达检测确定蛋白表达后进行蛋白的大量表达与纯化；重组蛋白依次经过Ni柱亲和层析，heparin柱层析，superdex 200分子筛纯化后，保存在buffer(10mM Tris-HCl，200mM NaCl，1mM MgCl)中，并冻存于-80℃备用。

EbCas12a的基因序列(SED ID NO.3)：

>EbCas12a：ATGAGCAAGTTCCAGAACCTGTACACCATCAACAAGACCCTGCGCTTCGGCCTGAAGCCCTTCGGCAAGACCCTGGAGAACTTCAACAAGACCAACCTGCTGCAGCTGGACGAGTACAAGGCCAAGCACCGCAAGGAGGTGCAGCGCCTGTTCGACGAGAACTTCAAGCAGCTGATCGAGGAGCGCCTGCGCGGCCTGAGCCTGGACACCCAGGCCCTGGAGGAGGCCTTCGACATCAACAAGCGCGACGCCGCCCTGATCAGCCTGAAGAAGCAGGTGACCGGCATCTGCTACGACAGCGAGATGAAGAAGACCTACCTGCAGGCCGACAAGCACTTCCAGAAGCTGCTGGCCGCCGGCCCCAACCAGGCCATGGTGTGCACCTACGACAAGTTCAGCACCTACTTCGTGAACTTCTTCGACATCCGCACCCACATCTTCAAGGGCGACACCAGCGGCAGCATCGCCTACCGCCTGATCGACGAGAACCTGACCATCTTCAAGAAGAACGTGGACAAGATCGCCAAGCTGCCCGTGGGCCTGAAGGACGAGGTGGAGGAGCTGGCCGACATCGAGAGCCTGCAGAGCTACAACAGCTACCTGACCCAGAGCGGCATCACCGAGTACAACGAGCTGCTGGGCGGCATCGCCTACGAGGACGGCACCAAGCTGCAGGGCATCAACGAGAAGATCAACCTGTACGGCCAGAAGAACAAGCTGAAGCTGCCCCGCCTGGAGAGCCTGTACAAGATGATCCTGAGCGACCGCGAGACCCAGAGCTTCGTGCTGAGCATCATCGAGAACGACGCCGAGCTGATCGGCCAGATCAGCACCCTGCTGGAGGACGTGCTGCTGAGCAAGACCCTGGCCCTGAGCGACGTGGACGGCGTGTTCATCAAGTACACCCAGCTGGGCAACCTGCCCGGCGTGCCCTACACCGTGATCAACAGCAAGATCAACGAGGCCTTCGACGCCACCTACACCGGCAAGAAGGAGGGCGAGAAGTACAAGGTGACCAAGAAGAAGACCATCGAGAAGGACGTGTACAGCCTGAGCAAGATCGAGAAGCTGTTCCAGGACAGCGACATCAACGTGAGCGAGGCCCTGAAGAACAAGTACGGCGTGCTGATCGCCAGCTACGAGGAGGCCAAGGGCCTGTTCAACAGCATCGACTGGACCGAGATCAAGAACATCAAGCAGAGCGGCCACACCATCATCATCAAGGACGTGCTGGACGCCCTGAAGAACATCCAGTTCTTCTACAACCTGTTCGACGTGGTGGAGGAGAACCTGAACCCCAGCATCGAGTTCTACAACGAGCTGAGCCTGAACAAGAACCAGCTGGGCAACGAGTTCAACAGCACCTACAACAAGGCCCGCAACTACCTGACCAAGAAGGAGTACAGCGAGGAGAAGTTCAAGCTGAACTTCGACAGCCCCACCCTGGCCGACGGCTGGGACGTGAACAAGGAGACCGCCAACCTGACCATCCTGCTGCGCCGCTTCAACAGCGAGCGCAACAACTACGACTACTTCCTGGGCGTGTGGAAGAAGGCCGTGCCCAGCCGCGAGAAGAACCTGATCATCAACGCCGACGGCGAGTTCGAGAAGATGGACTACAAGCTGTACCCCGACCCCAGCAAGATGCTGCCCAAGCAGTTCGTGAGCGCCCAGAGCTGGTTCGACAAGTACCCCGCCAGCCCCGAGTTCATGGGCAAGTACGAGGCCGGCCTGCACAAGAAGGGCAACAACTTCGACATCGAGTTCCTGCACGAGCTGATCAACCGCTACAAGCACGGCCTGAAGCACCACGAGAACAAGTACGAGGAGACCTTCGACTTCGAGCTGAAGGAGACCGAGGAGTACAGCGAGTACAGCGAGTTCATCCAGGACGTGAGCAAGAGCAACTACAAGGTGAAGTTCAACCACGTGGCCGGCGTGGAGGAGCTGGTGGAGGAGGGCAAGCTGTACCTGTTCCAGATCTGGAGCAAGGACTTCAGCACCTTCAGCAAGGGCACCAAGAACCTGAACACCATCTACTTCGAGAGCCTGTTCAGCGAGGAGAACCTGGAGAAGCGCATCTTCAAGCTGAGCGGCGGCGCCGAGCTGTTCTACCGCCCCAAGAGCCTGACCTACACCAAGGAGCTGATGGAGAAGGGCCACCACTACAACGAGCTGAAGGACAGCTTCAACTACCCCATCATCAAGGACAAGCGCTACACCGAGGACAAGTTCATGTTCCACGTGCCCATCCAGATCAACTACGGCGCCGAGAACCTGGGCCCCGTGAAGCTGAACAACCGCATCAACGAGAACATCGACGGCTTCACCCACATCATCGGCATCGACCGCGGCGAGCGCCACCTGGTGTACATCAGCGTGGTGGACGTGAAGACCGGCAAGATCGTGGAGCAGAAGCACCTGGACGAGATCGTGAACATCGACAGCAAGGGCAAGAAGCACTGCACCCCCTACCTGCAGAAGCTGGACGAGCGCAGCAAGACCCGCGACCAGGAGCGCAAGAGCTGGGAGGCCATCGAGACCATCAAGGAGCTGAAGGACGGCTACATCAGCCAGGTGGTGAACGAGATCTGCACCCTGCAGCAGAAGTACAACGCCCTGATCGTGATGGAGAACCTGAACCTGGGCTTCAAGCGCAGCCGCTTCAAGGTGGAGAAGCAGATCTACCAGAAGTTCGAGACCGCCCTGATCAAGAAGTTCAACTACATCATCGACAAGAAGGACAACAGCACCTACCTGCACGGCCTGCAGCTGGCCAACCCCATCCAGACCCTGAACAGCATCGGCAAGCAGAGCGGCATCATCTTCTACATCCCCGCCTGGAACACCAGCAAGATCGACCCCACCACCGGCTTCGTGAACCTGCTGTACGGCGCCGACCTGCGCTACACCAACAAGGAGCAGGCCGAGGCCTTCATCAACAAGCTGGACAAGATCTACTTCGAGGACGGCGTGTTCAAGTTCGACATCGACTTCAAGAAGTGGAACCAGCGCTACGCCAAGAGCTGCACCAAGTGGACCCTGACCAGCTACGGCACCCGCGTGGAGACCAAGCGCGACGTGATCAAGAACAACATGTGGTGCAGCAACGAGATCGACCTGACCGCCGAGTTCGAGAAGATCCTGAACAAGCGCGACGGCAGCCTGAAGACCTGCGACGTGGAGACCTACAAGCGCTTCCTGTACCTGTTCAAGCTGCTGCTGCAGATCCGCAACAGCATCACCGGCACCGACACCGACTACATGATCAGCCCCGTGATCGCCGCCGACGGCCAGCAGTTCGACAGCCGCGTGGTGGGCATGAGCCTGCCCAACGGCCTGCCCAAGGACGCCGACGCCAACGGCGCCTACAACATCGCCCGCAAGGGCCTGATGGCCGTGCACAACATCAAGGCCGGCTTCAAGAAGCCCTTCGAGATCAGCAACGAGGAGTACCTGGAGTACCTGCAGAAG。

(2)使用crRNAdirect repeat序列为：5’-AATTTCTACTGTTGTAGAT-3’，在体外转录获得靶向EGFP基因的crRNA；将步骤(1)所得EbCas12a蛋白与crRNA按摩尔比1:1混合得到EbCas12a-crRNA复合物。

(3)取100nM EbCas12a-crRNA复合物与300ng线性化的底物(PAM为TTTA，片段是以ptriEx-EGFP质粒(将EGFP基因以ptriEx载体为骨架构建)作为模板，设计上下游引物进行PCR，扩增出长度为1.1kb的底物片段。该片段上有一段PAM序列为TTTA，spacer为CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAGG的靶点序列，Cas12a-crRNA二元复合物能识别这一靶点并将长度为1.1kb的底物切割为长度分别是0.4kb和0.7kb的产物。)混匀，37℃孵育分别孵育0、2.5、5、8、10、15min后，加入适量蛋白酶K，58℃消化60min，跑2％琼脂糖胶。另选取一些不同的PAM(PAM序列见图2，底物同上述一样，只有PAM处四个碱基不同)分别进行上述切割实验，结果如图2所示，EbCas12a具有良好的体外切割能力。

实施例2

EbCas12a识别PAM的确定

(1)设计NNNN四个位置随机组合的上下游引物(N表示A、G、C、T)，以ptriEx-EGFP质粒作为模板，采用overlap PCR方法进行PCR，得到256种带有不同PAM序列，但spacer序列一样的300bp的线性化底物。

(2)取100nM实施例1中的EbCas12a-crRNA复合物与300ng线性化的底物混匀，37℃分别孵育10min后，PCR扩增未切割的底物进行二代测序，结果如图3所示，EbCas12a能够识别不同的PAM：TTTV、TCTA、TTCA、CTTA，但最优PAM为TTTV(V表示A、C或G)。

实施例3

EbCas12a在哺乳动物细胞内不同基因的编辑：

(1)构建EbCas12a真核表达质粒：将真核细胞中用的EbCas12a基因序列构建到真核表达质粒pcDNA3.1上，真核细胞中用的EbCas12a基因序列如下(SED ID NO.4)：

标“_”的序列为C端入核序列NLS，标

的序列为GS link，标

的序列为3HA tag。

(2)在哺乳动物细胞中，以293T细胞为例选择CLIC-4、VEGFA-2、PD1、DNMT1-4、TRAC、TRBC、TAX1BP3七个基因靶点，分别以这七个基因为目标，构建7个由U6启动子启动转录的U6-crRNA spacer真核表达质粒(载体骨架为pU6-As-crRNA，Addgene：#78956)。七个基因靶点的crRNA转录序列(其中AATTTCTACTGTTGTAGAT为direct repeat)分别如下：

AATTTCTACTGTTGTAGATCCCTGGCTACCTCCCCTACC(靶向CLIC-4)，

AATTTCTACTGTTGTAGATGGAGGTCAGAAATAGGGGGTCCA(靶向VEGFA-2)，

AATTTCTACTGTTGTAGATGCACGAAGCTCTCCGATGTGTTG(靶向PD1)，

AATTTCTACTGTTGTAGATGCTCAGCAGGCACCTGCCTCAGC(靶向DNMT1-4)，

AATTTCTACTGTTGTAGATTTGCTCCAGGCCACAGCACTGTT(靶向TRAC)，

AATTTCTACTGTTGTAGATAGCCATCAGAAGCAGAGATCTCC(靶向TRBC)，

AATTTCTACTGTTGTAGATCACATAGGCCATTCAGAAAC(靶向TAX1BP3)。

(3)分别针对这七个基因的切割靶点附近设计surveyor primer，并验证PCR引物的特异性。

(4)消化293T细胞，适当浓度铺24孔板，每孔500μL。

(5)24孔板共转EbCas12a真核表达质粒(700ng)和U6-crRNA spacer真核表达质粒(300ng)，48h后裂解细胞，取1μL裂解液作为模板、以步骤(3)设计的surveyor primer引物进行PCR，纯化PCR产物。

(6)取300ng PCR产物与1μL 10×T7EI buffer混匀，按以下PCR程序进行复性95℃10min，95℃至85℃-2℃2S，85℃到25℃-0.25℃2S，25℃持续1min，复性之后产物加入1μLT7EI，37℃酶切20min，跑2％琼脂糖胶，结果如图4所示在CLIC-4、VEGFA-2、PD1、DNMT1-4、TRAC、TRBC、TAX1BP3能够进行基因编辑，编辑效率分别为9％、17％、32％、16％、8％、7％、6％(本实施例中的七个基因只是作为代表进行列举)。

实施例4

EbCas12a-D141R和EbCas12a在细胞外源基因EGFP上的切割，包括以下实验步骤：

细胞内切割外源基因选择EGFP基因，选择靶点序列为TTTACGTCGCCGTCCAGCTCGACCAGG，采用EGFP表达质粒(pcDNA3.1-EGFP)与Cas12a表达质粒pcDNA3.1-Cas12a(EbCas12a-D141R和EbCas12a)表达质粒共转的形式。在293T细胞中同时转染Cas12a表达质粒、crRNA表达质粒(载体骨架为pU6-As-crRNA，Addgene：#78956；转录序列为AATTTCTACTGTTGTAGATCGTCGCCGTCCAGCTCGACCAGG)和EGFP表达质粒(pcDNA3.1-EGFP)，培养皿选择96孔板，其中对照组只转染Cas12a表达质粒和EGFP表达质粒。细胞转染48h后，用胰蛋白酶消化并收集细胞，用200μL PBS将细胞重悬，进行流式分析，结果如图5所示，EbCas12a-D141R切割外源基因的效率明显高于EbCas12a。

其中，EbCas12a的基因序列同实施例3；EbCas12a-D141R与EbCas12a相比仅将141位的D突变为R，即将序列中编码D的GAC变为编码R的CGC。

实施例5

EbCas12a-D141R和EbCas12a在细胞内源基因上编辑效率的比较：

(1)EbCas12a-D141R和EbCas12a真核表达质粒同实施例4，载体为pcDNA3.1。

(2)在哺乳动物细胞中，以293T细胞为例选择TAX1BP3、site5、TRAC三个基因靶点，分别以这三个基因为目标，构建三个由U6启动子启动转录的U6-crRNA spacer真核表达质粒(载体骨架为pU6-As-crRNA，Addgene：#78956)。三个基因靶点的crRNA转录序列(其中AATTTCTACTGTTGTAGAT为direct repeat)分别如下：

AATTTCTACTGTTGTAGATCACATAGGCCATTCAGAAAC(靶向TAX1BP3)，

AATTTCTACTGTTGTAGATTGATGGTCCATACCTGTTAC(靶向site5)，

AATTTCTACTGTTGTAGATTTGCTCCAGGCCACAGCACTGTT(靶向TRAC)。

(3)分别针对这三个基因的切割靶点附近设计surveyor primer，并验证PCR引物的特异性。

(4)消化293T细胞，适当浓度铺24孔板，每孔500μL。

(5)24孔板分别共转EbCas12a-D141R及EbCas12a真核表达质粒(700ng)和U6-crRNA spacer真核表达质粒(300ng)，48h后裂解细胞，取1μL裂解液作为模板、以步骤(3)设计的surveyor primer引物进行PCR，纯化PCR产物。

(6)取300ng PCR产物与1μL 10×T7EI buffer混匀，按以下PCR程序进行复性95℃10min，95℃至85℃-2℃2S，85℃到25℃-0.25℃2S，25℃持续1min，复性之后产物加入1μLT7EI，37℃酶切20min，跑2％琼脂糖胶，结果如图6所示，在TAX1BP3、site5、TRAC三个基因靶点上EbCas12a-D141R编辑效率明显高于EbCas12a(本实施例中的三个基因只是作为代表进行列举)。

实施例6

EbCas12a-D141R和EbCas12a在细胞内源基因编辑靶点编辑后的深度测序：

Targeted deep sequencing(靶向深度测序)是目前验证基因编辑效率的主要方法之一。pcDNA3.1-Cas12a(EbCas12a-D141R和EbCas12a)表达质粒与U6-crRNA spacer真核表达质粒共转染293T细胞48h后，收集细胞提取基因组。采用PCR的方法在靶点(B2M、CTLA4)上下游扩增300bp以内的片段，然后将样品送至公司进行建库测序。通过分析靶点的插入缺失情况确定EbCas12a-D141R和EbCas12a靶点的编辑效率，结果如图7所示，EbCas12a-D141R在2个基因靶点的编辑效率明显高于EbCas12a(本实施例中的2个基因只是作为代表进行列举)。

Claims (5)

1.一种II类V型CRISPR蛋白EbCas12a的变体EbCas12a-D141R，其特征在于，所述EbCas12a-D141R的氨基酸序列如SED ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的变体EbCas12a-D141R，其特征在于，所述EbCas12a-D141R在真核细胞中所用序列如SED ID NO.2所示。

3.权利要求1或2所述变体EbCas12a-D141R在基因剪辑中的应用，其特征在于：所述的基因编辑包括体外基因剪辑、原核生物基因编辑、真核生物基因编辑。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：在原核生物基因剪辑中，EbCas12a-D141R的氨基酸序列如SED ID NO.1所示。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：在真核生物基因剪辑中，EbCas12a-D141R的氨基酸序列如SED ID NO.2所示。

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