CN111394337A - II类V型CRISPR蛋白Lb2Cas12a及其在基因编辑的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种来自Lachnospiraceae bacterium MA2020菌株的II类V型CRISPR蛋白Lb2Cas12a及其应用。所述Lb2Cas12a的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；其编码核苷酸序列如SED ID NO.2所示。本发明首次在Lachnospiraceae bacterium MA2020菌株中鉴定出具有基因编辑效应的II类V型CRISPR蛋白Lb2Cas12a；所述Lb2Cas12a能够在crRNA的介导下定点对原核生物和真核生物基因组进行基因编辑，Lb2Cas12a的发现进一步扩大了基因编辑工具的种类，对基础科研和临床治疗具有十分重要的作用。

Description

II类V型CRISPR蛋白Lb2Cas12a及其在基因编辑的应用

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种来自于Lachnospiraceae bacteriumMA2020细菌中的II类V型CRISPR蛋白Cas12a，命名为Lb2Cas12a，在基因编辑中的应用。

背景技术

自2013年以来，基因编辑技术取得了突破性进展，此项技术已经在基础科学研究、医药、临床、生物技术等许多领域引起了新的变革。除了具有代表性的Cas9系统之外，Cas12，又名Cpf1，作为又一种被发现的具有基因编辑效应的CRISPR系统新成员，极大的扩大了基因编辑系统靶点的可编辑范围，相比于Cas9系统，Cas12a所具有的加工前提RNA的功能，为其介导多基因编辑提供了相比与Cas9系统更为便捷高效的编辑能力。除此之外，相比于 Cas9的向导RNA，Cas12a的向导RNA组成更为简单，设计更为方便。

2015年，张峰团队首次发现了Cas9系统之外的另外一种具有基因编辑能力的新成员， Cas12a，又名Cpf1，将其划分到CRISPR系统2类V型中。相比于Cas9系统，Cas12a的编辑效率与Cas9的效率相当，在有些靶点低于Cas9。Cas12a的脱靶率极低，相比于Cas9脱靶率高的特性，Cas12a是一种安全的基因编辑工具。Cas12a在切割之后形成粘性末端，而 Cas9形成平末端，已有研究表明，Cas12a切割之后的粘性末端相比于Cas9的平末端而言，更容易发生同源重组修复，这也为基因的定点插入和修复提供了更好的工具。在向导RNA 的加工方面，Cas12a具有明显的优势，仅仅只需要Cas12a本身就能够完成对前提RNA的加工，而Cas9系统则需要RNaseIII的加工，这极大地促进Cas12a在多基因编辑上的应用。在 PAM的识别上，Cas12a识别5—TTTN—3或5—KYTV—3，Cas9则识别5—NGG—3.

因此，Cas12a作为一种新型基因编辑工具，与Cas9系统一道，为科学研究和疾病的治疗提供了有力的工具。基于对目前已有的Cas12a的研究，为应对将来各种情况下的基因编辑事件，发现更多的具有一定特性的Cas12a是一件具有重要意义的事情。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，目的在于提供一种来自于Lachnospiraceaebacterium MA2020细菌中的II类V型CRISPR蛋白Lb2Cas12a及其在基因编辑中的应用。

为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案为：

一种来自于Lachnospiraceae bacterium MA2020细菌中的II类V型CRISPR蛋白Lb2Cas12a，其氨基酸序列如SED ID NO.1所示。

上述方案中，所述Lb2Cas12a识别的PAM序列为TTTV、TCTA、TTCA、TCCA、CTTA、CTCA、CCTA或CCCA，更为优选的PAM序列为TTTV，所述V表示A、C、或G。

用于编辑蛋白Lb2Cas12a氨基酸序列的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

上述Lb2Cas12a在基因编辑中的应用。

上述Lb2Cas12a在原核生物基因编辑中的应用。

上述Lb2Cas12a在真核生物基因编辑中的应用。

上述Lb2Cas12a在体外基因编辑中的应用。

本发明中所述蛋白Lb2Cas12a的氨基酸序列如下：

(1)在原核细胞中：

YYESLTKQYPVSKTIRNELIPIGKTLDNIRQNNILESDVKRKQNYEHVKGILDEYHKQLINE ALDNCTLPSLKIAAEIYLKNQKEVSDREDFNKTQDLLRKEVVEKLKAHENFTKIGKKDILD LLEKLPSISEDDYNALESFRNFYTYFTSYNKVRENLYSDKEKSSTVAYRLINENFPKFLDNV KSYRFVKTAGILADGLGEEEQDSLFIVETFNKTLTQDGIDTYNSQVGKINSSINLYNQKNQK ANGFRKIPKMKMLYKQILSDREESFIDEFQSDEVLIDNVESYGSVLIESLKSSKVSAFFDALR ESKGKNVYVKNDLAKTAMSNIVFENWRTFDDLLNQEYDLANENKKKDDKYFEKRQKELKKNKSYSLEHLCNLSEDSCNLIENYIHQISDDIENIIINNETFLRIVINEHDRSRKLAKNRKAV KAIKDFLDSIKVLERELKLINSSGQELEKDLIVYSAHEELLVELKQVDSLYNMTRNYLTKKP FSTEKVKLNFNRSTLLNGWDRNKETDNLGVLLLKDGKYYLGIMNTSANKAFVNPPVAKT EKVFKKVDYKLLPVPNQMLPKVFFAKSNIDFYNPSSEIYSNYKKGTHKKGNMFSLEDCHN LIDFFKESISKHEDWSKFGFKFSDTASYNDISEFYREVEKQGYKLTYTDIDETYINDLIERNE LYLFQIYNKDFSMYSKGKLNLHTLYFMMLFDQRNIDDVVYKLNGEAEVFYRPASISEDELII HKAGEEIKNKNPNRARTKETSTFSYDIVKDKRYSKDKFTLHIPITMNFGVDEVKRFNDAVN SAIRIDENVNVIGIDRGERNLLYVVVIDSKGNILEQISLNSIINKEYDIETDYHALLDEREGGR DKARKDWNTVENIRDLKAGYLSQVVNVVAKLVLKYNAIICLEDLNFGFKRGRQKVEKQV YQKFEKMLIDKLNYLVIDKSREQTSPKELGGALNALQLTSKFKSFKELGKQSGVIYYVPAY LTSKIDPTTGFANLFYMKCENVEKSKRFFDGFDFIRFNALENVFEFGFDYRSFTQRACGINS KWTVCTNGERIIKYRNPDKNNMFDEKVVVVTDEMKNLFEQYKIPYEDGRNVKDMIISNEE AEFYRRLYRLLQQTLQMRNSTSDGTRDYIISPVKNKREAYFNSELSDGSVPKDADANGAY NIARKGLWVLEQIRQKSEGEKINLAMTNAEWLEYAQTHLL；

(2)真核细胞中：

PKKKRKVYYESLTKQYPVSKTIRNELIPIGKTLDNIRQNNILESDVKRKQNYEHVKGILDEY HKQLINEALDNCTLPSLKIAAEIYLKNQKEVSDREDFNKTQDLLRKEVVEKLKAHENFTKI GKKDILDLLEKLPSISEDDYNALESFRNFYTYFTSYNKVRENLYSDKEKSSTVAYRLINENFP KFLDNVKSYRFVKTAGILADGLGEEEQDSLFIVETFNKTLTQDGIDTYNSQVGKINSSINLY NQKNQKANGFRKIPKMKMLYKQILSDREESFIDEFQSDEVLIDNVESYGSVLIESLKSSKVS AFFDALRESKGKNVYVKNDLAKTAMSNIVFENWRTFDDLLNQEYDLANENKKKDDKYFE KRQKELKKNKSYSLEHLCNLSEDSCNLIENYIHQISDDIENIIINNETFLRIVINEHDRSRKLA KNRKAVKAIKDFLDSIKVLERELKLINSSGQELEKDLIVYSAHEELLVELKQVDSLYNMTRN YLTKKPFSTEKVKLNFNRSTLLNGWDRNKETDNLGVLLLKDGKYYLGIMNTSANKAFVN PPVAKTEKVFKKVDYKLLPVPNQMLPKVFFAKSNIDFYNPSSEIYSNYKKGTHKKGNMFSL EDCHNLIDFFKESISKHEDWSKFGFKFSDTASYNDISEFYREVEKQGYKLTYTDIDETYIND LIERNELYLFQIYNKDFSMYSKGKLNLHTLYFMMLFDQRNIDDVVYKLNGEAEVFYRPASI SEDELIIHKAGEEIKNKNPNRARTKETSTFSYDIVKDKRYSKDKFTLHIPITMNFGVDEVKRF NDAVNSAIRIDENVNVIGIDRGERNLLYVVVIDSKGNILEQISLNSIINKEYDIETDYHALLDE REGGRDKARKDWNTVENIRDLKAGYLSQVVNVVAKLVLKYNAIICLEDLNFGFKRGRQK VEKQVYQKFEKMLIDKLNYLVIDKSREQTSPKELGGALNALQLTSKFKSFKELGKQSGVIY YVPAYLTSKIDPTTGFANLFYMKCENVEKSKRFFDGFDFIRFNALENVFEFGFDYRSFTQRA CGINSKWTVCTNGERIIKYRNPDKNNMFDEKVVVVTDEMKNLFEQYKIPYEDGRNVKDM IISNEEAEFYRRLYRLLQQTLQMRNSTSDGTRDYIISPVKNKREAYFNSELSDGSVPKDADA NGAYNIARKGLWVLEQIRQKSEGEKINLAMTNAEWLEYAQTHLLKRPAATKKAGQAKKKKGSYPYDVPDYAYPYDVPDYAYPYDVPDYA

其中在Lb2Cas12a蛋白氨基酸序列的N端加入PKKKRKV序列(该序列为N端NLS入核序列)，在Lb2Cas12a蛋白氨基酸序列的C端加入KRPAATKKAGQAKKKK序列(该序列为C 端NLS入核序列)，随后用GS序列连接YPYDVPDYAYPYDVPDYAYPYDVPDYA序列(该序列为3HA序列)。

编码本发明所述蛋白Lb2Cas12a的核苷酸序列如下：

tactatgagtccctgaccaagcagtaccccgtgtctaagacaatccggaatgagctgatccctatcggcaagacactggataacatccgccagaacaatatcctgga gagcgacgtgaagcggaagcagaactacgagcacgtgaagggcatcctggatgagtatcacaagcagctgatcaacgaggccctggacaattgcaccctgccat ccctgaagatcgccgccgagatctacctgaagaatcagaaggaggtgtctgacagagaggatttcaacaagacacaggacctgctgaggaaggaggtggtggag aagctgaaggcccacgagaactttaccaagatcggcaagaaggacatcctggatctgctggagaagctgccttccatctctgaggacgattacaatgccctggaga gcttccgcaacttttacacctatttcacatcctacaacaaggtgcgggagaatctgtattctgataaggagaagagctccacagtggcctacagactgatcaacgagaa tttcccaaagtttctggacaatgtgaagagctataggtttgtgaaaaccgcaggcatcctggcagatggcctgggagaggaggagcaggactccctgttcatcgtgg agacattcaacaagaccctgacacaggacggcatcgatacctacaattctcaagtgggcaagatcaactctagcatcaatctgtataaccagaagaatcagaaggcc aatggcttcagaaagatccccaagatgaagatgctgtataagcagatcctgtccgatagggaggagtctttcatcgacgagtttcagagcgatgaggtgctgatcgac aacgtggagtcttatggcagcgtgctgatcgagtctctgaagtcctctaaggtgagcgccttctttgatgccctgagagagtctaagggcaagaacgtgtacgtgaag aatgacctggccaagacagccatgagcaacatcgtgttcgagaattggaggacctttgacgatctgctgaaccaggagtacgacctggccaacgagaacaagaag aaggacgataagtatttcgagaagcgccagaaggagctgaagaagaataagagctactccctggagcacctgtgcaacctgtccgaggattcttgtaacctgatcg agaattatatccaccagatctccgacgatatcgagaatatcatcatcaacaatgagacattcctgcgcatcgtgatcaatgagcacgacaggtcccgcaagctggcca agaaccggaaggccgtgaaggccatcaaggactttctggattctatcaaggtgctggagcgggagctgaagctgatcaacagctccggccaggagctggagaag gatctgatcgtgtactctgcccacgaggagctgctggtggagctgaagcaggtggacagcctgtataacatgaccagaaattatctgacaaagaagcctttctctacc gagaaggtgaagctgaactttaatcgcagcacactgctgaacggctgggatcggaataaggagacagacaacctgggcgtgctgctgctgaaggacggcaagta ctatctgggcatcatgaacacaagcgccaataaggccttcgtgaatccccctgtggccaagaccgagaaggtgtttaagaaggtggattacaagctgctgccagtgc ccaaccagatgctgccaaaggtgttctttgccaagagcaatatcgacttctataacccctctagcgagatctactccaattataagaagggcacccacaagaagggca atatgttttccctggaggattgtcacaacctgatcgacttctttaaggagtctatcagcaagcacgaggactggagcaagttcggctttaagttcagcgatacagcctcct acaacgacatctccgagttctatcgcgaggtggagaagcagggctacaagctgacctatacagacatcgatgagacatacatcaatgatctgatcgagcggaacgagctgtacctgttccagatctataataaggactttagcatgtactccaagggcaagctgaacctgcacacactgtatttcatgatgctgtttgatcagcgcaatatcgacga cgtggtgtataagctgaacggagaggcagaggtgttctataggccagcctccatctctgaggacgagctgatcatccacaaggccggcgaggagatcaagaacaa gaatcctaaccgggccagaaccaaggagacaagcaccttcagctacgacatcgtgaaggataagcggtatagcaaggataagtttaccctgcacatccccatcaca atgaacttcggcgtggatgaggtgaagcggttcaacgacgccgtgaacagcgccatccggatcgatgagaatgtgaacgtgatcggcatcgaccggggcgagag aaatctgctgtacgtggtggtcatcgactctaagggcaacatcctggagcagatctccctgaactctatcatcaataaggagtacgacatcgagacagattatcacgca ctgctggatgagagggagggcggcagagataaggcccggaaggactggaacaccgtggagaatatcagggacctgaaggccggctacctgagccaggtggtg aacgtggtggccaagctggtgctgaagtataatgccatcatctgcctggaggacctgaactttggcttcaagaggggccgccagaaggtggagaagcaggtgtacc agaagttcgagaagatgctgatcgataagctgaattacctggtcatcgacaagagccgcgagcagacatcccctaaggagctgggaggcgccctgaacgcactgc agctgacctctaagttcaagagctttaaggagctgggcaagcagtccggcgtgatctactatgtgcctgcctacctgacctctaagatcgatccaaccacaggcttcg ccaatctgttttatatgaagtgtgagaacgtggagaagtccaagagattctttgacggctttgatttcatcaggttcaacgccctggagaacgtgttcgagttcggctttga ctaccggagcttcacccagagggcctgcggcatcaattccaagtggaccgtgtgcaccaacggcgagcgcatcatcaagtatcggaatccagataagaacaatatg ttcgacgagaaggtggtggtggtgaccgatgagatgaagaacctgtttgagcagtacaagatcccctatgaggatggcagaaatgtgaaggacatgatcatcagcaacgaggaggccgagttctaccggagactgtataggctgctgcagcagaccctgcagatgagaaacagcacctccgacggcacaagggattacatcatctcccctg tgaagaataagagagaggcctacttcaacagcgagctgtccgacggctctgtgccaaaggacgccgatgccaacggcgcctacaatatcgccagaaagggcctg tgggtgctggagcagatcaggcagaagagcgagggcgagaagatcaatctggccatgaccaacgccgagtggctggagtatgcccagacacacctgctg

本发明中所使用的crRNAdirect repeat序列为5’-AATTTCTACTATTGTAGAT-3’。

本发明的有益效果：本发明首次在Lachnospiraceae bacterium MA2020菌株中鉴定出具有基因编辑效应的II类V型CRISPR蛋白，命名为Lb2Cas12a；所述Lb2Cas12a能够在crRNA 的介导下定点对原核生物和真核生物基因组进行基因编辑，Lb2Cas12a的发现进一步扩大了基因编辑工具的种类，同时也为后续各种不同情况的基因编辑提供了重要的备选工具，对基础科研和临床治疗具有十分重要的作用。

附图说明

图1为Lachnospiraceae bacterium MA2020 CRISPR array及crRNAdirectrepeat图示。

图2为体外切割EGFP片段靶点示意图。

图3为原核表达Lb2Cas12a之后，体外切割实验，S表示substrate；P表示product。

图4为体外实验验证Lb2Cas12a的PAM，S表示substrate；P表示product。

图5为体内验证Lb2Cas12a基因编辑，S表示substrate；P表示product。

图6为体内验证Lb2Cas12a在相同基因不同靶点的基因编辑效率。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

实施例1

Lb2Cas12a体外不同时间梯度切割实验，包括以下实验步骤：

(1)Lb2Cas12a蛋白的表达与纯化：将Lb2Cas12a基因序列合成到pet28a表达载体上，且在C末端加上6His标签，随后将合成好的质粒转化到E.Coli Rosseta 2(DE3)表达菌株中，挑取单克隆，小量表达检测确定蛋白表达后进行蛋白的大量表达与纯化；重组蛋白依次经过Ni柱亲和层析，heparin柱层析，superdex 200分子筛纯化后，保存在 buffer(10mMTris-HCl，200mM NaCl，1mM MgCl)中，并冻存于-80℃备用；

(2)使用crRNA direct repeat序列为：5’-AATTTCTACTATTGTAGAT-3’，在体外转录获得crRNA；将步骤(1)所得Lb2Cas12a蛋白与crRNA混合得到Lb2Cas12a-crRNA复合物；

(3)取100nM Lb2Cas12a-crRNA所得复合物与300ng线性化的底物(图3所示)混匀，37℃孵育分别孵育0,1,2,5,10min后，加入适量蛋白酶K，58℃消化60min，跑2％琼脂糖胶，结果如图3所示，Lb2Cas12a具有良好的体外切割能力。

实施例2

Lb2Cas12a识别PAM的确定

(1)设计NNNN四个位置随机组合的上下游引物(N表示A、G、C、T)，以EGFP片段作为模板，采用overlap PCR方法进行PCR，得到256种带有不同PAM序列，但spacer 序列一样的1.1kb的线性化底物；

(2)取100nM Lb2Cas12a-crRNA复合物与300ng线性化的底物混匀，37℃孵育分别孵育10min后，加入适量蛋白酶K，58℃消化60min，跑2％琼脂糖胶，部分结果如图4所示，Lb2Cas12a能够识别不同的PAM：TTTA、TCTA、TTCA、TCCA、CTTA、CTCA、CCTA 或CCCA，但最优PAM为TTTV(V表示A,C,G)。

实施例3

Lb2Cas12a在哺乳动物细胞内不同基因的编辑：

(1)构建Lb2Cas12a真核表达质粒：将Lb2Cas12a基因序列合成到pet28a表达载体上构建Lb2Cas12a真核表达质粒；

(2)在哺乳动物细胞中，以293T细胞为例选择TRBC、PD1两个基因，分别以这2个基因为目标，构建2个U6-crRNA spacer真核表达质粒；

(3)分别针对这2个基因的切割靶点附近设计surveyor primer，并验证PCR引物的特异性；

(4)消化293T细胞，适当浓度铺24孔板，每孔500ul；

(5)24孔板共转Lb2Cas12a真核表达质粒(700ng)和U6-crRNA spacer真核表达质粒(300ng)，48h后裂解细胞，取1ul裂解液作为模板、以步骤(3)设计的surveyor primer引物进行PCR，纯化PCR产物；

(6)取300ng PCR产物与1ul 10XT7EI buffer混匀，按以下PCR程序进行复性95℃10min，95℃至85℃-2℃/S，85℃到25℃-0.25℃/S，25℃持续1min，复性之后产物加入 1ulT7EI，37℃酶切20min，跑2％琼脂糖胶，结果如图5所示在TRBC、PD1能够进行基因编辑，S表示PCR产物substrate，P表示T7EI切割后产物product(本案例中的基因只是作为代表进行列举,并不说明在其他基因上没有基因编辑的能力)。

实施例4

Lb2Cas12a在哺乳动物细胞内相同基因不同靶点的基因编辑：

(1)选取并设计VEGFA基因上3个不同的靶点(VEGFA Site 1、VEGFA Site 2、VEGFASite 3)的crRNA；

(2)切割靶点附近设计surveyor primer，并验证PCR引物的特异性；

(3)消化293T细胞，适当浓度铺24孔板，每孔500ul；

(4)24孔板共转Lb2Cas12a真核表达质粒(700ng)和U6-crRNAspacer真核表达质粒(300ng)，48h后裂解细胞，取1ul裂解液作为模板、以步骤(3)设计的surveyor primer引物进行PCR，纯化PCR产物；

(5)取300ngPCR产物与1ul 10XT7EI buffer混匀，按以下PCR程序进行复性95℃10min，95℃至85℃-2℃/S，85℃到25℃-0.25℃/S，25℃持续1min。

(6)复性之后产物加入1ul T7EI，37℃酶切20min，跑2％琼脂糖胶，结果如图6所示，采用灰度分析可得在各个靶点切割效率分别为51％，75％，39％。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。

序列表

<110>武汉大学

<120>II类V型CRISPR 蛋白Lb2Cas12a及其用于基因编辑的应用

<160>2

<210> 1

<211> 1205

<212> PRT

<213>Lachnospiraceae bacterium MA2020细菌

<400>1

Tyr Tyr Glu Ser Leu Thr Lys Gln Tyr Pro Val Ser Lys Thr Ile Arg

1 5 10 15

Asn Glu Leu Ile Pro Ile Gly Lys Thr Leu Asp Asn Ile Arg Gln Asn

20 25 30

Asn Ile Leu Glu Ser Asp Val Lys Arg Lys Gln Asn Tyr Glu His Val

35 40 45

Lys Gly Ile Leu Asp Glu Tyr His Lys Gln Leu Ile Asn Glu Ala Leu

50 55 60

Asp Asn Cys Thr Leu Pro Ser Leu Lys Ile Ala Ala Glu Ile Tyr Leu

65 70 75 80

Lys Asn Gln Lys Glu Val Ser Asp Arg Glu Asp Phe Asn Lys Thr Gln

85 90 95

Asp Leu Leu Arg Lys Glu Val Val Glu Lys Leu Lys Ala His Glu Asn

100 105 110

Phe Thr Lys Ile Gly Lys Lys Asp Ile Leu Asp Leu Leu Glu Lys Leu

115 120 125

Pro Ser Ile Ser Glu Asp Asp Tyr Asn Ala Leu Glu Ser Phe Arg Asn

130 135 140

Phe Tyr Thr Tyr Phe Thr Ser Tyr Asn Lys Val Arg Glu Asn Leu Tyr

145 150 155 160

Ser Asp Lys Glu Lys Ser Ser Thr Val Ala Tyr Arg Leu Ile Asn Glu

165 170 175

Asn Phe Pro Lys Phe Leu Asp Asn Val Lys Ser Tyr Arg Phe Val Lys

180 185 190

Thr Ala Gly Ile Leu Ala Asp Gly Leu Gly Glu Glu Glu Gln Asp Ser

195 200 205

Leu Phe Ile Val Glu Thr Phe Asn Lys Thr Leu Thr Gln Asp Gly Ile

210 215 220

Asp Thr Tyr Asn Ser Gln Val Gly Lys Ile Asn Ser Ser Ile Asn Leu

225 230 235 240

Tyr Asn Gln Lys Asn Gln Lys Ala Asn Gly Phe Arg Lys Ile Pro Lys

245 250 255

Met Lys Met Leu Tyr Lys Gln Ile Leu Ser Asp Arg Glu Glu Ser Phe

260 265 270

Ile Asp Glu Phe Gln Ser Asp Glu Val Leu Ile Asp Asn Val Glu Ser

275 280 285

Tyr Gly Ser Val Leu Ile Glu Ser Leu Lys Ser Ser Lys Val Ser Ala

290 295 300

Phe Phe Asp Ala Leu Arg Glu Ser Lys Gly Lys Asn Val Tyr Val Lys

305 310 315 320

Asn Asp Leu Ala Lys Thr Ala Met Ser Asn Ile Val Phe Glu Asn Trp

325 330 335

Arg Thr Phe Asp Asp Leu Leu Asn Gln Glu Tyr Asp Leu Ala Asn Glu

340 345 350

Asn Lys Lys Lys Asp Asp Lys Tyr Phe Glu Lys Arg Gln Lys Glu Leu

355 360 365

Lys Lys Asn Lys Ser Tyr Ser Leu Glu His Leu Cys Asn Leu Ser Glu

370 375 380

Asp Ser Cys Asn Leu Ile Glu Asn Tyr Ile His Gln Ile Ser Asp Asp

385 390 395 400

Ile Glu Asn Ile Ile Ile Asn Asn Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Ile

405 410 415

Asn Glu His Asp Arg Ser Arg Lys Leu Ala Lys Asn Arg Lys Ala Val

420 425 430

Lys Ala Ile Lys Asp Phe Leu Asp Ser Ile Lys Val Leu Glu Arg Glu

435 440 445

Leu Lys Leu Ile Asn Ser Ser Gly Gln Glu Leu Glu Lys Asp Leu Ile

450 455 460

Val Tyr Ser Ala His Glu Glu Leu Leu Val Glu Leu Lys Gln Val Asp

465 470 475 480

Ser Leu Tyr Asn Met Thr Arg Asn Tyr Leu Thr Lys Lys Pro Phe Ser

485 490 495

Thr Glu Lys Val Lys Leu Asn Phe Asn Arg Ser Thr Leu Leu Asn Gly

500 505 510

Trp Asp Arg Asn Lys Glu Thr Asp Asn Leu Gly Val Leu Leu Leu Lys

515 520 525

Asp Gly Lys Tyr Tyr Leu Gly Ile Met Asn Thr Ser Ala Asn Lys Ala

530 535 540

Phe Val Asn Pro Pro Val Ala Lys Thr Glu Lys Val Phe Lys Lys Val

545 550 555 560

Asp Tyr Lys Leu Leu Pro Val Pro Asn Gln Met Leu Pro Lys Val Phe

565 570 575

Phe Ala Lys Ser Asn Ile Asp Phe Tyr Asn Pro Ser Ser Glu Ile Tyr

580 585 590

Ser Asn Tyr Lys Lys Gly Thr His Lys Lys Gly Asn Met Phe Ser Leu

595 600 605

Glu Asp Cys His Asn Leu Ile Asp Phe Phe Lys Glu Ser Ile Ser Lys

610 615 620

His Glu Asp Trp Ser Lys Phe Gly Phe Lys Phe Ser Asp Thr Ala Ser

625 630 635 640

Tyr Asn Asp Ile Ser Glu Phe Tyr Arg Glu Val Glu Lys Gln Gly Tyr

645 650 655

Lys Leu Thr Tyr Thr Asp Ile Asp Glu Thr Tyr Ile Asn Asp Leu Ile

660 665 670

Glu Arg Asn Glu Leu Tyr Leu Phe Gln Ile Tyr Asn Lys Asp Phe Ser

675 680 685

Met Tyr Ser Lys Gly Lys Leu Asn Leu His Thr Leu Tyr Phe Met Met

690 695 700

Leu Phe Asp Gln Arg Asn Ile Asp Asp Val Val Tyr Lys Leu Asn Gly

705 710 715 720

Glu Ala Glu Val Phe Tyr Arg Pro Ala Ser Ile Ser Glu Asp Glu Leu

725 730 735

Ile Ile His Lys Ala Gly Glu Glu Ile Lys Asn Lys Asn Pro Asn Arg

740 745 750

Ala Arg Thr Lys Glu Thr Ser Thr Phe Ser Tyr Asp Ile Val Lys Asp

755 760 765

Lys Arg Tyr Ser Lys Asp Lys Phe Thr Leu His Ile Pro Ile Thr Met

770 775 780

Asn Phe Gly Val Asp Glu Val Lys Arg Phe Asn Asp Ala Val Asn Ser

785 790 795 800

Ala Ile Arg Ile Asp Glu Asn Val Asn Val Ile Gly Ile Asp Arg Gly

805 810 815

Glu Arg Asn Leu Leu Tyr Val Val Val Ile Asp Ser Lys Gly Asn Ile

820 825 830

Leu Glu Gln Ile Ser Leu Asn Ser Ile Ile Asn Lys Glu Tyr Asp Ile

835 840 845

Glu Thr Asp Tyr His Ala Leu Leu Asp Glu Arg Glu Gly Gly Arg Asp

850 855 860

Lys Ala Arg Lys Asp Trp Asn Thr Val Glu Asn Ile Arg Asp Leu Lys

865 870 875 880

Ala Gly Tyr Leu Ser Gln Val Val Asn Val Val Ala Lys Leu Val Leu

885 890 895

Lys Tyr Asn Ala Ile Ile Cys Leu Glu Asp Leu Asn Phe Gly Phe Lys

900 905 910

Arg Gly Arg Gln Lys Val Glu Lys Gln Val Tyr Gln Lys Phe Glu Lys

915 920 925

Met Leu Ile Asp Lys Leu Asn Tyr Leu Val Ile Asp Lys Ser Arg Glu

930 935 940

Gln Thr Ser Pro Lys Glu Leu Gly Gly Ala Leu Asn Ala Leu Gln Leu

945 950 955 960

Thr Ser Lys Phe Lys Ser Phe Lys Glu Leu Gly Lys Gln Ser Gly Val

965 970 975

Ile Tyr Tyr Val Pro Ala Tyr Leu Thr Ser Lys Ile Asp Pro Thr Thr

980 985 990

Gly Phe Ala Asn Leu Phe Tyr Met Lys Cys Glu Asn Val Glu Lys Ser

995 1000 1005

Lys Arg Phe Phe Asp Gly Phe Asp Phe Ile Arg Phe Asn Ala Leu Glu

1010 1015 1020

Asn Val Phe Glu Phe Gly Phe Asp Tyr Arg Ser Phe Thr Gln Arg Ala

1025 1030 1035 1040

Cys Gly Ile Asn Ser Lys Trp Thr Val Cys Thr Asn Gly Glu Arg Ile

1045 1050 1055

Ile Lys Tyr Arg Asn Pro Asp Lys Asn Asn Met Phe Asp Glu Lys Val

1060 1065 1070

Val Val Val Thr Asp Glu Met Lys Asn Leu Phe Glu Gln Tyr Lys Ile

1075 1080 1085

Pro Tyr Glu Asp Gly Arg Asn Val Lys Asp Met Ile Ile Ser Asn Glu

1090 1095 1100

Glu Ala Glu Phe Tyr Arg Arg Leu Tyr Arg Leu Leu Gln Gln Thr Leu

1105 1110 1115 1120

Gln Met Arg Asn Ser Thr Ser Asp Gly Thr Arg Asp Tyr Ile Ile Ser

1125 1130 1135

Pro Val Lys Asn Lys Arg Glu Ala Tyr Phe Asn Ser Glu Leu Ser Asp

1140 1145 1150

Gly Ser Val Pro Lys Asp Ala Asp Ala Asn Gly Ala Tyr Asn Ile Ala

1155 1160 1165

Arg Lys Gly Leu Trp Val Leu Glu Gln Ile Arg Gln Lys Ser Glu Gly

1170 1175 1180

Glu Lys Ile Asn Leu Ala Met Thr Asn Ala Glu Trp Leu Glu Tyr Ala

1185 1190 1195 1200

Gln Thr His Leu Leu

1205

<210> 2

<211> 3615bp

<212> DNA

<213>Lachnospiraceae bacterium MA2020

<400>2

tactatgagt ccctgaccaa gcagtacccc gtgtctaaga caatccggaa tgagctgatc 60

cctatcggca agacactgga taacatccgc cagaacaata tcctggagag cgacgtgaag 120

cggaagcaga actacgagca cgtgaagggc atcctggatg agtatcacaa gcagctgatc 180

aacgaggccc tggacaattg caccctgcca tccctgaaga tcgccgccga gatctacctg 240

aagaatcaga aggaggtgtc tgacagagag gatttcaaca agacacagga cctgctgagg 300

aaggaggtgg tggagaagct gaaggcccac gagaacttta ccaagatcgg caagaaggac 360

atcctggatc tgctggagaa gctgccttcc atctctgagg acgattacaa tgccctggag 420

agcttccgca acttttacac ctatttcaca tcctacaaca aggtgcggga gaatctgtat 480

tctgataagg agaagagctc cacagtggcc tacagactga tcaacgagaa tttcccaaag 540

tttctggaca atgtgaagag ctataggttt gtgaaaaccg caggcatcct ggcagatggc 600

ctgggagagg aggagcagga ctccctgttc atcgtggaga cattcaacaa gaccctgaca 660

caggacggca tcgataccta caattctcaa gtgggcaaga tcaactctag catcaatctg 720

tataaccaga agaatcagaa ggccaatggc ttcagaaaga tccccaagat gaagatgctg 780

tataagcaga tcctgtccga tagggaggag tctttcatcg acgagtttca gagcgatgag 840

gtgctgatcg acaacgtgga gtcttatggc agcgtgctga tcgagtctct gaagtcctct 900

aaggtgagcg ccttctttga tgccctgaga gagtctaagg gcaagaacgt gtacgtgaag 960

aatgacctgg ccaagacagc catgagcaac atcgtgttcg agaattggag gacctttgac 1020

gatctgctga accaggagta cgacctggcc aacgagaaca agaagaagga cgataagtat 1080

ttcgagaagc gccagaagga gctgaagaag aataagagct actccctgga gcacctgtgc 1140

aacctgtccg aggattcttg taacctgatc gagaattata tccaccagat ctccgacgat 1200

atcgagaata tcatcatcaa caatgagaca ttcctgcgca tcgtgatcaa tgagcacgac 1260

aggtcccgca agctggccaa gaaccggaag gccgtgaagg ccatcaagga ctttctggat 1320

tctatcaagg tgctggagcg ggagctgaag ctgatcaaca gctccggcca ggagctggag 1380

aaggatctga tcgtgtactc tgcccacgag gagctgctgg tggagctgaa gcaggtggac 1440

agcctgtata acatgaccag aaattatctg acaaagaagc ctttctctac cgagaaggtg 1500

aagctgaact ttaatcgcag cacactgctg aacggctggg atcggaataa ggagacagac 1560

aacctgggcg tgctgctgct gaaggacggc aagtactatc tgggcatcat gaacacaagc 1620

gccaataagg ccttcgtgaa tccccctgtg gccaagaccg agaaggtgtt taagaaggtg 1680

gattacaagc tgctgccagt gcccaaccag atgctgccaa aggtgttctt tgccaagagc 1740

aatatcgact tctataaccc ctctagcgag atctactcca attataagaa gggcacccac 1800

aagaagggca atatgttttc cctggaggat tgtcacaacc tgatcgactt ctttaaggag 1860

tctatcagca agcacgagga ctggagcaag ttcggcttta agttcagcga tacagcctcc 1920

tacaacgaca tctccgagtt ctatcgcgag gtggagaagc agggctacaa gctgacctat 1980

acagacatcg atgagacata catcaatgat ctgatcgagc ggaacgagct gtacctgttc 2040

cagatctata ataaggactt tagcatgtac tccaagggca agctgaacct gcacacactg 2100

tatttcatga tgctgtttga tcagcgcaat atcgacgacg tggtgtataa gctgaacgga 2160

gaggcagagg tgttctatag gccagcctcc atctctgagg acgagctgat catccacaag 2220

gccggcgagg agatcaagaa caagaatcct aaccgggcca gaaccaagga gacaagcacc 2280

ttcagctacg acatcgtgaa ggataagcgg tatagcaagg ataagtttac cctgcacatc 2340

cccatcacaa tgaacttcgg cgtggatgag gtgaagcggt tcaacgacgc cgtgaacagc 2400

gccatccgga tcgatgagaa tgtgaacgtg atcggcatcg accggggcga gagaaatctg 2460

ctgtacgtgg tggtcatcga ctctaagggc aacatcctgg agcagatctc cctgaactct 2520

atcatcaata aggagtacga catcgagaca gattatcacg cactgctgga tgagagggag 2580

ggcggcagag ataaggcccg gaaggactgg aacaccgtgg agaatatcag ggacctgaag 2640

gccggctacc tgagccaggt ggtgaacgtg gtggccaagc tggtgctgaa gtataatgcc 2700

atcatctgcc tggaggacct gaactttggc ttcaagaggg gccgccagaa ggtggagaag 2760

caggtgtacc agaagttcga gaagatgctg atcgataagc tgaattacct ggtcatcgac 2820

aagagccgcg agcagacatc ccctaaggag ctgggaggcg ccctgaacgc actgcagctg 2880

acctctaagt tcaagagctt taaggagctg ggcaagcagt ccggcgtgat ctactatgtg 2940

cctgcctacc tgacctctaa gatcgatcca accacaggct tcgccaatct gttttatatg 3000

aagtgtgaga acgtggagaa gtccaagaga ttctttgacg gctttgattt catcaggttc 3060

aacgccctgg agaacgtgtt cgagttcggc tttgactacc ggagcttcac ccagagggcc 3120

tgcggcatca attccaagtg gaccgtgtgc accaacggcg agcgcatcat caagtatcgg 3180

aatccagata agaacaatat gttcgacgag aaggtggtgg tggtgaccga tgagatgaag 3240

aacctgtttg agcagtacaa gatcccctat gaggatggca gaaatgtgaa ggacatgatc 3300

atcagcaacg aggaggccga gttctaccgg agactgtata ggctgctgca gcagaccctg 3360

cagatgagaa acagcacctc cgacggcaca agggattaca tcatctcccc tgtgaagaat 3420

aagagagagg cctacttcaa cagcgagctg tccgacggct ctgtgccaaa ggacgccgat 3480

gccaacggcg cctacaatat cgccagaaag ggcctgtggg tgctggagca gatcaggcag 3540

aagagcgagg gcgagaagat caatctggcc atgaccaacg ccgagtggct ggagtatgcc 3600

cagacacacc tgctg 3615

Claims (7)

1.一种来自于Lachnospiraceae bacterium MA2020菌株中的II类V型CRISPR蛋白Lb2Cas12a，其特征在于，所述Lb2Cas12a的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述CRISPR蛋白Lb2Cas12a，其特征在于，所述Lb2Cas12a识别的PAM序列为TTTV、TCTA、TTCA、TCCA、CTTA、CTCA、CCTA或CCCA，所述V表示A、C、或G。

3.用于编辑权利要求1所述蛋白Lb2Cas12a的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID NO.2所示。

4.权利要求1~2任一所述Lb2Cas12a在基因编辑中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述Lb2Cas12a在原核生物基因编辑中的应用。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述Lb2Cas12a在真核生物基因编辑中的应用。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述Lb2Cas12a在体外基因编辑中的应用。

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