CN112029744A

CN112029744A - Dna聚合酶及其编码基因、制备方法和pcr应用

Info

Publication number: CN112029744A
Application number: CN202010867696.3A
Authority: CN
Inventors: 刘喜朋; 翁妍
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2020-08-26
Filing date: 2020-08-26
Publication date: 2020-12-04

Abstract

本发明提供了一种DNA聚合酶及其编码基因、制备方法和PCR应用，所述DNA聚合酶来源于嗜热微生物Thermococcus eurythermalis，具有热稳定性高、扩增能力强，DNA扩增产量高，扩增忠实性高等特征，可应用于PCR扩增目的DNA。DNA聚合酶通过重组表达载体在大肠杆菌中诱导表达，经固定化镍离子亲和纯化和阳离子交换树脂纯化制备。该聚合酶的PCR反应缓冲液组成为50mM Tris‑HCl(pH8.0)，2mM MgCl₂，50mM KCl，2mM(NH4)2SO4，0.01％Triton X‑100和0.005％BSA。可用于扩增长达6kb的目的DNA片段。

Description

DNA聚合酶及其编码基因、制备方法和PCR应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种DNA聚合酶及其编码基因、制备方法和PCR应用。

背景技术

DNA聚合酶作为DNA复制体的核心组份，是遗传信息复制、加工和分配过程中的关键酶，存在于细菌、古菌和真核生物三界所有的生命形式中。DNA聚合酶的主要功能是DNA复制。它可以组装核苷酸并为现有DNA合成新的互补DNA；另外DNA聚合酶还会对新链进行校对(3’-5’外切酶活性)和修复(5’-3’外切酶活性)，以确保复制过程的保真度和准确性。

聚合酶的种类繁多，在结构和功能上均有自己的特性。其中耐热DNA聚合酶多应用于PCR(聚合酶链式反应)技术，在生命科学研究及相关领域发挥重要作用。

Thermococcus eurythermalis分离自瓜伊玛斯盆地2006.9m深处的一个黑烟囱热液口，是一株严格厌氧，条件嗜压的超嗜热古菌。该古菌的温度生长范围是65～114℃，压力生长范围是0.1～40Mpa，最佳生长温度和压力分别为85℃和20Mpa，是研究开发高稳定性的极端酶的良好来源。

目前商业化的DNA聚合酶仍然存在热稳定性不高，保真度低，延伸效率差，在污染物或抑制剂存在下会降低扩增效率等问题，不能完全满足科研的需要。因此，有必要开发一种高性能的DNA聚合酶体系及其表达纯化方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种DNA聚合酶及其制备方法，所述DNA聚合酶热稳定性好、扩增能力强，DNA扩增产量高，扩增忠实性高，可应用于PCR扩增目的DNA。

第一方面，本发明提供的DNA聚合酶，其氨基酸序列如序列表中序列4所示。

第二方面，本发明提供了一种编码上述DNA聚合酶的基因，其核苷酸序列如序列表中序列3所示。

第三方面，本发明提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体包含有所述的编码DNA聚合酶的基因。

第四方面，本发明提供了一种重组菌，其含有所述的重组表达载体。

优选地，所述重组菌为大肠杆菌。

第五方面，本发明提供了一种包含第二方面所述DNA聚合酶基因的重组表达载体的构建方法。

第六方面，本发明提供了一种如第一方面所述的DNA聚合酶的表达及纯化方法。

第七方面，本发明提供了一种PCR的反应缓冲液条件，反应体系中含50mM Tris-HCl(pH8.0)，2mM MgCl₂，50mM KCl，2mM(NH4)2SO4，0.01％Triton X-100和0.005％BSA。

第八方面，本发明提供了一种PCR反应试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的DNA聚合酶。

其中，所述试剂盒还包括0.2mM dNTPs和5×PCR缓冲液。所述5×PCR缓冲液包括：250mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM MgCl₂，250mM KCl，10mM(NH4)2SO4，0.05％Triton X-100，0.025％BSA。

本发明DNA聚合酶来源于嗜热微生物Thermococcus eurythermalis，具有热稳定性高、扩增能力强，DNA扩增产量高，扩增忠实性高等特征，可应用于PCR扩增目的DNA。DNA聚合酶通过重组表达载体在大肠杆菌中诱导表达，经固定化镍离子亲和纯化和阳离子交换树脂纯化制备。该聚合酶的PCR反应缓冲液组成为50mM Tris-HCl(pH8.0)，2mM MgCl₂，50mM KCl，2mM(NH4)2SO4，0.01％Triton X-100和0.005％BSA。可用于扩增长达6kb的目的DNA片段。

附图说明

图1显示Thermococcus eurythermalis的DNA聚合酶PolB基因的扩增片段。

图2显示Thermococcus eurythermalis的DNA聚合酶PolB基因中intein片段删除示意图。

图3显示Thermococcus eurythermalis的DNA聚合酶PolB纯化结果。

图4显示Thermococcus eurythermalis的DNA聚合酶PolB的PCR反应缓冲液优化结果，其中，(a)反应缓冲液的pH优化，(b)反应缓冲液的Mg²⁺浓度优化，(c)反应缓冲液的KCl浓度优化。

图5显示Thermococcus eurythermalis的DNA聚合酶PolB扩增6kb长DNA的PCR结果。

具体实施方式

Thermococcus eurythermalis编码DNA聚合酶的制备与PCR应用

1.原核重组表达载体的构建

利用测序获得的Thermococcus eurythermalis基因组序列，根据生物信息学分析确定了其编码的DNA聚合酶基因，获得了假定的Thermococcus eurythermalis耐热DNA聚合酶(PolB)序列，如序列表中序列1所示。

首先以Thermococcus eurythermalis基因组DNA为模板，使用F1和R1引物对将假定的PolB基因扩增出来。PCR扩增Thermococcus eurythermalis编码的全长polB基因的琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示，获得了3939bp的PolB基因。

引物序列如下：

F1:5’-TGCCGCGCGGCAGCCATATGATTCTCGATACCGACTAC-3’

R1:5’-TCGAGTGCGGCCGCAAGCTTTCACTTCTTTCCCTTCGGCT-3’

使用HindⅢ和NdeⅠ双酶切pET-28a载体，并用DNA产物纯化试剂盒回收酶切产物。

使用诺唯赞公司的ClonExpressⅡ一步克隆试剂盒，参照说明书将PolB基因与双酶切的pET-28a进行重组，构建成功polB蛋白的重组表达载体，将其转化到DH5α感受态细胞中，挑取卡那霉素抗性筛选为阳性的菌落，进行菌液PCR验证，验证阳性的重组克隆进行DNA序列测定，验证polB基因序列的正确性。

2.Intein蛋白删除

经试验验证，大肠杆菌表达假定的PolB基因时，polB产生了较多的降解蛋白，仅获得了少量的polB蛋白。为了提高polB的表达产量，对编码假定的PolB基因序列进行分析，发现该序列包含一段intein蛋白的编码DNA序列，其核苷酸序列如序列表中序列2所示。

因此，针对上述构建好的含有假定PolB基因的原核重组表达载体设计引物F2和R2，通过重叠引物PCR介导的定点突变删除Thermococcus eurythermalis中假定PolB基因内部的intein蛋白编码DNA序列(如图2)。将突变成功的菌株进行DNA序列测定，验证DNA序列准确性。去除内含子序列后的polB的编码序列如序列表中序列3所示，其编码的蛋白序列如序列表中序列4所示。

引物序列如下：

F2：5’-GCG AACAGTTACTACGGCTACTACGG-3’

R2：5’-GTAACTGTTCGCCAGGATTTTGATAG-3’

3.重组DNA聚合酶polB蛋白的原核表达及亲和纯化

将去除了intein蛋白，且基因测序正确的DNA聚合酶polB的原核重组表达载体转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中。转化培养后的菌液均匀涂布于含有50mg/ml卡那霉素的固体LB平板上，37℃静置培养12-16小时。挑取单菌落至20ml添加有50mg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃×200r/min条件下摇床温育8-10h。取10ml菌液扩大至500ml培养体系中，37℃×200r/min条件下继续培养，待OD₆₀₀测定值达到0.6-0.8，加入终浓度为0.5mM的IPTG，在20℃×200r/min条件下继续培养16-20h，诱导PolB蛋白表达。

4.重组DNA聚合酶polB蛋白的亲和纯化

将诱导后的大肠杆菌细胞，在8000r/min下离心5分钟，收集菌体细胞。用40ml裂解缓冲液(20mM Tris-HCl，pH8.0，300mM NaCl，10％甘油)重悬菌体细胞，进行超声波破碎细胞。超声破碎条件为600W功率下超声4s，间歇3s，总共超声30min。超声破碎后于75℃水浴锅中加热20min，失活大肠杆菌自身蛋白。然后在4℃条件下8000r/min离心40分钟，收集上清液获得重组蛋白粗液。

将上清液加入到装有2ml Ni-NTA纯化树脂的色谱柱，并让缓冲液流经色谱柱，以使polB蛋白所带的6个连续组氨酸亲和标签与Ni-NTA树脂上固定的镍离子特异性结合。然后用含有20mM咪唑的裂解缓冲液洗涤树脂，除去树脂上非特异性结合的杂蛋白。接着用10ml洗脱缓冲液洗脱Ni-NTA树脂，收集洗脱液，洗脱液含有目的蛋白DNA聚合酶polB。

离子交换层析进一步纯化目的蛋白：

将上一步亲和纯化得到的polB洗脱液透析到低盐缓冲液A中(25mM Tris-HCl，pH7.0，50mM NaCl)，然后通过阳离子交换柱(Source 15Q阳离子树脂)进行纯化。用缓冲液A预先平衡柱子，polB蛋白上样后通过缓冲液B(25mM Tris-HCl，pH7.0，1M NaCl)梯度提高洗脱液的盐离子浓度，利用离子结合能力的差别将目的蛋白与各种杂蛋分离，分管收集洗脱液，经SDS-PAGE凝胶电泳分析后，收集纯化的DNA聚合酶polB蛋白。

将目的蛋白置换到储存溶液中：20mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM DTT，0.1mM EDTA，100mMKCl，0.5％(v/v)Nonidet P40，0.5％(v/v)Tween 20，50％(v/v)glycerol，于-20℃保存。

SDS-PAGE电泳分析鉴定，鉴定结果如图3所示。

4.PCR应用结果

将步骤3经亲和纯化(Ni-NTA树脂)和离子交换(阳离子树脂Source 15Q)两步纯化的DNA聚合酶polB进行PCR扩增。首先对反应缓冲液进行优化，扩增DNA片段为lambda噬菌体的长度1kb的DNA片段，优化参数包括pH，离子强度，镁离子浓度等，具体结果见图4。在确定PCR反应缓冲液后，进行实际扩增反应，扩增DNA片段为lambda噬菌体基因组上长度为6kb的DNA片段。扩增结果见图5。

序列表

<110> 上海交通大学

<120> DNA聚合酶及其编码基因、制备方法和PCR应用

<130> 权利要求书、说明书

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3939

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

atgattctcg ataccgacta catcaccgag aacgggaagc ctgtgataag ggtcttcaag 60

aaggagaacg gcgagtttaa aatcgagtac gacagaacct tcgagcccta cttctacgcc 120

ctcctgaagg acgattcagc aatagaagac gtgaagaaag taaccgccaa aaggcatggg 180

acggtcgtga aggtgaagcg cgccgagaag gtgcagagga agttcctcgg caggccgata 240

gaggtctgga agctctactt cacgcaccct caggacgttc cagcgattcg agacaagatt 300

agggagcatc cggccgttgt ggacatctac gagtacgaca tacccttcgc caagcgctac 360

ctcatcgaca agggcctgat tccgatggag ggcgacgagg agctcacgat gctcgccttc 420

gacatcgaga cgctctacca tgagggtgag gagtttggaa ccggaccgat tctcatgata 480

agctacgccg acgagaacga ggcaagggtg ataacctgga agaggattga ccttccgtac 540

gttgaggtcg tttcgaccga gaaggagatg attaagcgct tcctccgcgt catcaaggag 600

aaggaccccg acgtgctcat cacctacaac ggcgacaact tcgacttcgc ttatctaaaa 660

aagcgctgtg agaaactcgg gataaagttc acgctcggga gagacggaag cgagccgaaa 720

atccagcgca tgggcgaccg ctttgccgtc gaggtaaagg gcaggattca cttcgacctc 780

tatccagtca taaggcgcac gataaacctc ccgacttaca cccttgaggc agtgtacgag 840

gccgtctttg gaaagcctaa ggagaaggtt tacgccgagg agataacaga ggcctgggag 900

agcggggagg gccttgaaag ggttgcccgc tactcgatgg aggacgcgaa ggtgacctac 960

gagctcggaa gggagttctt tccgatggag gcccagcttt caaggctcat aggtcagagc 1020

ctctgggacg tctcgcgctc gagcacgggc aacctcgtcg agtggttcct tctgcggaag 1080

gcctacgaga ggaacgaact ggccccaaac aagcccgacg agagggagct cgcgagacgg 1140

cgcgagagct acgcgggtgg gtacgttaag gagcccgagc gcgggctgtg ggagaacatt 1200

gtctacctag atttcatgag cctatacccc tcaatcatca taacccacaa cgtctcgccg 1260

gacaccctca accgcgaggg ctgtaaagag tacgacgtcg ccccagaggt tgggcaccgc 1320

ttttgtaagg actttccagg cttcatacca agtctcctcg gcgacctgct tgaggagaga 1380

cagaagataa agaaaaagat gaaggccaca atagacccgc tggagaagaa aatcctcgat 1440

tacaggcaga gggctatcaa aatcctggcg aacagcctcc tgccagagga atggattccg 1500

gtagttgaga acggaaaagt caagctcgtc aggattggcg agttcgtgga tggactcatg 1560

aaggacgaaa agggaagggc caaaagggac ggaaacactg aggttcttga agtcagcgga 1620

attcgcgcgg tctcctttga caggaagacg aagaaagccc gcttaatgcc cgtgaaggcc 1680

gtgataaggc accgctattc aggagatgtc tacaaaataa ccctgagttc aggaaggaag 1740

ataacagtaa ccaaaggcca cagccttttc gcgtacagaa atggagagct cgtcgaagtg 1800

cctggtgaag aaattaaggc tggagacctc ctcgcggttc caagacgcgt gcacctgccc 1860

gagaggtatg aacggctgga ccttgttgaa ctcctcctaa aactgcctga ggaagaaacg 1920

gaggacataa tccttacgat tccagcaaag ggcagaaaga atttcttcaa gggaatgctg 1980

agaacccttc gctggatttt tggggaggaa aagagaccga gaactgcgag gcgctacctg 2040

agacacctcg aaggcctcgg ctacgtaaag ctgagaaaaa tcggctatga gatcattgat 2100

agagaaggac tcaaaaggta caggaaactt tacgagcgct tagctgaggt cgttcgttac 2160

aatggcaaca aaagagaata ccttatagaa ttcaacgccg ttcgcgatgt tatttccctt 2220

atgccagagg aagaactcaa tgagtggcag gtggggacaa ggaacggctt cagaataaag 2280

tcactcattg aggttgacga agactttgca aagctcctcg gctactacgt gagcgagggc 2340

tacgcgggca agcagaggaa ccagaaaaac gggtggagct acaccgtgaa gctctacaac 2400

gaggacgaga gagttcttga tgacatggag aacctcgcga gggagttctt tggaaaggcc 2460

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atagaatggc ttatcagtgg ggacatcatc ctcgataagg tcgtggaagt caaaaagatg 3000

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tttggattcc tctacgcgca caacagttac tacggctact acggctacgc caaggcccgc 3120

tggtactgca gggagtgcgc cgagagcgtg accgcgtggg gaagggagta catagagacc 3180

acaattcatg aaatagagga aaagtttggc ttcaaagtgc tttacgcaga cactgatgga 3240

ttttttgcca caataccagg agcagatgca gaaactgtga aaaagaaggc caaggagttc 3300

ctcaagtaca tcaacgccaa actgcccggc ctgctcgaac ttgagtacga gggcttctac 3360

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gcgagggttc ttgaggcgat acttaagcac ggtgacgtcg aaaaagcagt caggatagtc 3540

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gagcagataa cacgcgattt gaaggattac aaagccacag gtccacacgt tgcagtagca 3660

aagcgcctcg cggcgagggg agtgaaaatc cgtcctggaa cggtgataag ctacatcgtc 3720

ctaaagggct ctggtaggat aggcgacagg gcgattccgg ctgacgagtt cgacccgacg 3780

aagcacaagt acgacgccga atactacatc gaaaaccagg ttcttcccgc cgttgagagg 3840

attctcaggg ccttcggcta caggaaggag gatttgcgct accagaagac gaagcaggtg 3900

ggtttgagcg cgtggctgaa gccgaaggga aagaagtga 3939

<210> 2

<211> 1611

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

agcctcctgc cagaggaatg gattccggta gttgagaacg gaaaagtcaa gctcgtcagg 60

attggcgagt tcgtggatgg actcatgaag gacgaaaagg gaagggccaa aagggacgga 120

aacactgagg ttcttgaagt cagcggaatt cgcgcggtct cctttgacag gaagacgaag 180

aaagcccgct taatgcccgt gaaggccgtg ataaggcacc gctattcagg agatgtctac 240

aaaataaccc tgagttcagg aaggaagata acagtaacca aaggccacag ccttttcgcg 300

tacagaaatg gagagctcgt cgaagtgcct ggtgaagaaa ttaaggctgg agacctcctc 360

gcggttccaa gacgcgtgca cctgcccgag aggtatgaac ggctggacct tgttgaactc 420

ctcctaaaac tgcctgagga agaaacggag gacataatcc ttacgattcc agcaaagggc 480

agaaagaatt tcttcaaggg aatgctgaga acccttcgct ggatttttgg ggaggaaaag 540

agaccgagaa ctgcgaggcg ctacctgaga cacctcgaag gcctcggcta cgtaaagctg 600

agaaaaatcg gctatgagat cattgataga gaaggactca aaaggtacag gaaactttac 660

gagcgcttag ctgaggtcgt tcgttacaat ggcaacaaaa gagaatacct tatagaattc 720

aacgccgttc gcgatgttat ttcccttatg ccagaggaag aactcaatga gtggcaggtg 780

gggacaagga acggcttcag aataaagtca ctcattgagg ttgacgaaga ctttgcaaag 840

ctcctcggct actacgtgag cgagggctac gcgggcaagc agaggaacca gaaaaacggg 900

tggagctaca ccgtgaagct ctacaacgag gacgagagag ttcttgatga catggagaac 960

ctcgcgaggg agttctttgg aaaggcccgg cgcggaagga actacgttga aatcccaagg 1020

aagatggctt atataatctt tgagagcctc tgcggcacct tggccgagaa caagagggtt 1080

ccagaggtaa ttttcacgtc gccggaagac gtcaggtggg cgttccttga ggggtacttc 1140

ataggagacg gggacgtcca cccgagcaag agggtcaggc tctcaacgaa aagcgagctc 1200

cttgcaaacg gtctcgtcct tctcctcaat tcgctcggcg tttcagcggt taagctcggg 1260

cacgacagcg gagtttacag ggtctacgtg aacgaggaac ttcctttcac ggggtacaaa 1320

aagaagaaaa acgcctacta ctcccacgtt attccaaagg aagtgcttga ggaaacgttc 1380

ggtaaggtct tccaaaggaa tatgagctac gaaaagttcc aagagctcgt tgagagtgaa 1440

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gaggaggacg agaactttct ggcgggcttt ggattcctct acgcgcacaa c 1611

<210> 3

<211> 2328

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

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gaggtctgga agctctactt cacgcaccct caggacgttc cagcgattcg agacaagatt 300

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ctcatcgaca agggcctgat tccgatggag ggcgacgagg agctcacgat gctcgccttc 420

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gttgaggtcg tttcgaccga gaaggagatg attaagcgct tcctccgcgt catcaaggag 600

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ctctgggacg tctcgcgctc gagcacgggc aacctcgtcg agtggttcct tctgcggaag 1080

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gacaccctca accgcgaggg ctgtaaagag tacgacgtcg ccccagaggt tgggcaccgc 1320

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gcagtagcaa agcgcctcgc ggcgagggga gtgaaaatcc gtcctggaac ggtgataagc 2100

tacatcgtcc taaagggctc tggtaggata ggcgacaggg cgattccggc tgacgagttc 2160

gacccgacga agcacaagta cgacgccgaa tactacatcg aaaaccaggt tcttcccgcc 2220

gttgagagga ttctcagggc cttcggctac aggaaggagg atttgcgcta ccagaagacg 2280

aagcaggtgg gtttgagcgc gtggctgaag ccgaagggaa agaagtga 2328

<210> 4

<211> 775

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 4

Met Ile Leu Asp Thr Asp Tyr Ile Thr Glu Asn Gly Lys Pro Val Ile

1 5 10 15

Arg Val Phe Lys Lys Glu Asn Gly Glu Phe Lys Ile Glu Tyr Asp Arg

20 25 30

Thr Phe Glu Pro Tyr Phe Tyr Ala Leu Leu Lys Asp Asp Ser Ala Ile

35 40 45

Glu Asp Val Lys Lys Val Thr Ala Lys Arg His Gly Thr Val Val Lys

50 55 60

Val Lys Arg Ala Glu Lys Val Gln Arg Lys Phe Leu Gly Arg Pro Ile

65 70 75 80

Glu Val Trp Lys Leu Tyr Phe Thr His Pro Gln Asp Val Pro Ala Ile

85 90 95

Arg Asp Lys Ile Arg Glu His Pro Ala Val Val Asp Ile Tyr Glu Tyr

100 105 110

Asp Ile Pro Phe Ala Lys Arg Tyr Leu Ile Asp Lys Gly Leu Ile Pro

115 120 125

Met Glu Gly Asp Glu Glu Leu Thr Met Leu Ala Phe Asp Ile Glu Thr

130 135 140

Leu Tyr His Glu Gly Glu Glu Phe Gly Thr Gly Pro Ile Leu Met Ile

145 150 155 160

Ser Tyr Ala Asp Glu Asn Glu Ala Arg Val Ile Thr Trp Lys Arg Ile

165 170 175

Asp Leu Pro Tyr Val Glu Val Val Ser Thr Glu Lys Glu Met Ile Lys

180 185 190

Arg Phe Leu Arg Val Ile Lys Glu Lys Asp Pro Asp Val Leu Ile Thr

195 200 205

Tyr Asn Gly Asp Asn Phe Asp Phe Ala Tyr Leu Lys Lys Arg Cys Glu

210 215 220

Lys Leu Gly Ile Lys Phe Thr Leu Gly Arg Asp Gly Ser Glu Pro Lys

225 230 235 240

Ile Gln Arg Met Gly Asp Arg Phe Ala Val Glu Val Lys Gly Arg Ile

245 250 255

His Phe Asp Leu Tyr Pro Val Ile Arg Arg Thr Ile Asn Leu Pro Thr

260 265 270

Tyr Thr Leu Glu Ala Val Tyr Glu Ala Val Phe Gly Lys Pro Lys Glu

275 280 285

Lys Val Tyr Ala Glu Glu Ile Thr Glu Ala Trp Glu Ser Gly Glu Gly

290 295 300

Leu Glu Arg Val Ala Arg Tyr Ser Met Glu Asp Ala Lys Val Thr Tyr

305 310 315 320

Glu Leu Gly Arg Glu Phe Phe Pro Met Glu Ala Gln Leu Ser Arg Leu

325 330 335

Ile Gly Gln Ser Leu Trp Asp Val Ser Arg Ser Ser Thr Gly Asn Leu

340 345 350

Val Glu Trp Phe Leu Leu Arg Lys Ala Tyr Glu Arg Asn Glu Leu Ala

355 360 365

Pro Asn Lys Pro Asp Glu Arg Glu Leu Ala Arg Arg Arg Glu Ser Tyr

370 375 380

Ala Gly Gly Tyr Val Lys Glu Pro Glu Arg Gly Leu Trp Glu Asn Ile

385 390 395 400

Val Tyr Leu Asp Phe Met Ser Leu Tyr Pro Ser Ile Ile Ile Thr His

405 410 415

Asn Val Ser Pro Asp Thr Leu Asn Arg Glu Gly Cys Lys Glu Tyr Asp

420 425 430

Val Ala Pro Glu Val Gly His Arg Phe Cys Lys Asp Phe Pro Gly Phe

435 440 445

Ile Pro Ser Leu Leu Gly Asp Leu Leu Glu Glu Arg Gln Lys Ile Lys

450 455 460

Lys Lys Met Lys Ala Thr Ile Asp Pro Leu Glu Lys Lys Ile Leu Asp

465 470 475 480

Tyr Arg Gln Arg Ala Ile Lys Ile Leu Ala Asn Ser Tyr Tyr Gly Tyr

485 490 495

Tyr Gly Tyr Ala Lys Ala Arg Trp Tyr Cys Arg Glu Cys Ala Glu Ser

500 505 510

Val Thr Ala Trp Gly Arg Glu Tyr Ile Glu Thr Thr Ile His Glu Ile

515 520 525

Glu Glu Lys Phe Gly Phe Lys Val Leu Tyr Ala Asp Thr Asp Gly Phe

530 535 540

Phe Ala Thr Ile Pro Gly Ala Asp Ala Glu Thr Val Lys Lys Lys Ala

545 550 555 560

Lys Glu Phe Leu Lys Tyr Ile Asn Ala Lys Leu Pro Gly Leu Leu Glu

565 570 575

Leu Glu Tyr Glu Gly Phe Tyr Val Arg Gly Phe Phe Val Thr Lys Lys

580 585 590

Lys Tyr Ala Val Ile Asp Glu Glu Gly Lys Ile Thr Thr Arg Gly Leu

595 600 605

Glu Ile Val Arg Arg Asp Trp Ser Glu Ile Ala Lys Glu Thr Gln Ala

610 615 620

Arg Val Leu Glu Ala Ile Leu Lys His Gly Asp Val Glu Lys Ala Val

625 630 635 640

Arg Ile Val Lys Glu Val Thr Glu Lys Leu Ser Lys Tyr Glu Val Pro

645 650 655

Pro Glu Lys Leu Val Ile His Glu Gln Ile Thr Arg Asp Leu Lys Asp

660 665 670

Tyr Lys Ala Thr Gly Pro His Val Ala Val Ala Lys Arg Leu Ala Ala

675 680 685

Arg Gly Val Lys Ile Arg Pro Gly Thr Val Ile Ser Tyr Ile Val Leu

690 695 700

Lys Gly Ser Gly Arg Ile Gly Asp Arg Ala Ile Pro Ala Asp Glu Phe

705 710 715 720

Asp Pro Thr Lys His Lys Tyr Asp Ala Glu Tyr Tyr Ile Glu Asn Gln

725 730 735

Val Leu Pro Ala Val Glu Arg Ile Leu Arg Ala Phe Gly Tyr Arg Lys

740 745 750

Glu Asp Leu Arg Tyr Gln Lys Thr Lys Gln Val Gly Leu Ser Ala Trp

755 760 765

Leu Lys Pro Lys Gly Lys Lys

770 775

<210> 5

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

tgccgcgcgg cagccatatg attctcgata ccgactac 38

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

tcgagtgcgg ccgcaagctt tcacttcttt cccttcggct 40

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

gcgaacagtt actacggcta ctacgg 26

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

gtaactgttc gccaggattt tgatag 26

Claims

1.一种DNA聚合酶，其氨基酸序列如序列表中序列4所示。

2.一种编码DNA聚合酶的基因，其核苷酸序列如序列表中序列3所示。

3.含权利要求2所述的基因的重组表达载体。

4.含有权利要求3所述的重组表达载体的重组菌。

5.根据权利要求4所述的重组菌,其特征在于所述重组菌为大肠杆菌。

6.一种权利要求1所述的DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)构建如权利要求3所述的重组表达载体；

(2)将重组表达载体转入宿主细胞，并对宿主细胞进行扩大培养、诱导表达；

(3)收集诱导培养后的菌体，进行破碎、加热、离心，得到上清液；

(4)对上清液进行纯化，得到所述DNA聚合酶。

7.权利要求1所述的DNA聚合酶在PCR中的应用。

8.权利要求7所述的应用，其特征在于:所述的PCR反应体系含50mM Tris-HCl(pH8.0)，2mM MgCl2，50mM KCl，2mM(NH4)2SO4，0.01％Triton X-100和0.005％BSA。