CN113151213B - 一种高忠实性dna聚合酶及其制备方法和pcr应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种高忠实性DNA聚合酶及其制备方法和PCR应用，属于生物工程技术领域，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明DNA聚合酶来源于嗜热微生物Pyrococcus yayanosii，具有热稳定性高，扩增忠实性高，扩增能力强等特征。DNA聚合酶通过重组表达载体在大肠杆菌中诱导表达，经固定化镍离子亲和纯化和阳离子交换树脂纯化制备。

Description

一种高忠实性DNA聚合酶及其制备方法和PCR应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种高忠实性DNA聚合酶及其制备方法和PCR应用。
背景技术
DNA聚合酶利用dNTP作为底物，以DNA单链作为模板，催化DNA聚合物合成。除了聚合酶活性DNA聚合酶还具有3’-5’外切酶活性和5’-3’外切酶活性，前者在DNA复制中对新合成链进行校对，消除错误掺入的核苷酸，后者参与DNA合成中RNA引物链的去除，完成基因组DNA子链DNA合成，同时5’-3’外切酶活性还参与DNA修复。
不同的DNA聚合酶的结构和功能上有所差异。各种DNA聚合酶在生命科学中应用广泛，其中耐热DNA聚合酶多应用于PCR(聚合酶链式反应)技术，尤其是高忠实性的DNA聚合酶在生命科学研究及相关领域发挥重要作用。其它DNA聚合酶，例如Bst DNA聚合酶和phi29DNA聚合酶在等温核酸扩增和二代测序中应用广泛。
Pyrococcus yayanosii分离自海底热液口，是一株严格厌氧嗜压超嗜热古菌。该古菌的温度生长范围是80～114℃，最佳生长温度为99℃，是研究开发具有热稳定的极端耐热酶的重要菌株资源。
目前商业化的DNA聚合酶仍然存在忠实性低，延伸效率差，污染物或抑制剂耐受能力差等问题。因此，有必要开发一种高忠实性的DNA聚合酶体系，用于PCR扩增目的DNA。
CN 108795900 B公开了一种DNA聚合酶及其制备方法，为如下A1)-A3)中的任一种：A1)对9°N DNA聚合酶的氨基酸序列进行氨基酸残基的置换和/或缺失和/或添加得到的具有DNA聚合酶活性的突变蛋白质；A2)对9°N DNA聚合酶的氨基酸序列进行氨基酸残基的修饰得到的具有DNA聚合酶活性的突变蛋白质；A3)在A1)或A2)的中间或/和N端或/和C端连接标签得到的具有DNA聚合酶活性的融合蛋白质；A1)或A2)所述突变蛋白质与9°N DNA聚合酶相比，与模板DNA的亲和力降低，而DNA聚合酶活性并未降低，该DNA聚合酶制备方法复杂且不具有高忠实性。
CN 112029744 A公开了一种DNA聚合酶及其编码基因、制备方法和PCR应用，源于嗜热微生物Thermococcus eurythermalis，具有热稳定性高、扩增能力强，DNA扩增产量高，扩增忠实性高等特征，可应用于PCR扩增目的DNA。DNA聚合酶通过重组表达载体在大肠杆菌中诱导表达，经固定化镍离子亲和纯化和阳离子交换树脂纯化制备。但该DNA聚合酶纯化较难，制备工艺复杂。
发明内容
本发明的目的在于提出一种高忠实性DNA聚合酶及其制备方法和PCR应用，具有热稳定性高，扩增忠实性高，扩增能力强等特征。DNA聚合酶通过重组表达载体在大肠杆菌中诱导表达，经固定化镍离子亲和纯化和阳离子交换树脂纯化制备。
本发明的技术方案是这样实现的：
本发明提供一种高忠实性DNA聚合酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明进一步保护一种编码上述高忠实性DNA聚合酶的基因，其核苷酸序列表如SEQ ID NO.2所示。
本发明进一步保护含上述高忠实性DNA聚合酶的重组表达菌。
作为本发明的进一步改进，所述重组表达菌为大肠杆菌。
本发明进一步保护一种上述高忠实性DNA聚合酶的基因的制备方法，包括以下步骤：
(2)对权利要求3所述重组表达菌进行扩大培养、诱导表达；
(2)收集诱导培养后的菌体，进行细胞破碎、离心，得到细胞裂解液上清；
(3)对上清液进行镍离子亲和纯化和离子交换纯化，得到所述DNA聚合酶。
本发明进一步保护一种上述高忠实性DNA聚合酶在PCR中的应用。
作为本发明的进一步改进，所述PCR应用中包含PCR反应缓冲液。
作为本发明的进一步改进，所述PCR反应缓冲液含20mM Tris-HCl或Tricine-NaOH(pH8.2)，3mM MgCl2，40mM KCl，4mM(NH4)2SO4，0.01％Triton X-100和0.005％BSA。
本发明具有如下有益效果：本发明DNA聚合酶来源于嗜热微生物Pyrococcusyayanosii，具有热稳定性高，扩增忠实性高，扩增能力强等特征。DNA聚合酶通过重组表达载体在大肠杆菌中诱导表达，经固定化镍离子亲和纯化和阳离子交换树脂纯化制备。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为Pyrococcus yayanosii的B型DNA聚合酶的纯化结果图；
图2为Pyrococcus yayanosii的B型DNA聚合酶PCR反应缓冲液的pH优化图；
图3为Pyrococcus yayanosii的B型DNA聚合酶PCR反应缓冲液的氯化镁浓度优化图；
图4为Pyrococcus yayanosii的B型DNA聚合酶PCR反应缓冲液的氯化钾浓度优化图；
图5为Pyrococcus yayanosii的B型DNA聚合酶PCR反应缓冲液的硫酸铵优化图；
图6为Pyrococcus yayanosii的B型DNA聚合酶PCR反应缓冲液的Triton X-100浓度优化图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1Pyrococcus yayanosii的B型DNA聚合酶的制备与PCR应用
1、重组表达载体的构建
基于Pyrococcus yayanosii的基因组序列获得B型DNA聚合酶基因原始序列，在原始序列基础上，去除Intein序列，获得成熟的基因序列，并对重要残基进行突变，提高聚合酶活性。最后通过基因合成法获得修改后的B型DNA聚合酶基因，，并优化密码子，得到去除了intein序列的适合于再大肠杆菌中表达的Pyrococcus yayanosii的B型DNA聚合酶成熟基因，如SEQ ID NO.2所示。
使用BamHI和NdeⅠ双酶切pET-28a载体，并用DNA产物纯化试剂盒回收酶切产物。
使用BamHI和NdeⅠ双酶切PCR扩增的Pyrococcus yayanosii的B型DNA聚合酶成熟基因片段，PCR回收试剂盒回收，利用T4 DNA连接酶将NdeI与BamHI酶切的pET28a质粒与Pyrococcus yayanosii的B型DNA聚合酶成熟基因连接在一起，构建成功Pyrococcusyayanosii的B型DNA聚合酶的重组表达载体，将其转化到DH5α感受态细胞中，挑取卡那霉素抗性筛选为阳性的菌落，进行菌液PCR验证，验证阳性的重组克隆进行DNA序列测定，验证Pyrococcus yayanosii的B型DNA聚合酶基因序列的正确性。
2.Pyrococcus yayanosii的B型DNA聚合酶的诱导表达
将Pyrococcus yayanosii的B型DNA聚合酶的原核重组表达载体转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中。转化培养后的菌液均匀涂布于含有50mg/ml卡那霉素的固体LB平板上，37℃静置培养过夜。挑取单菌落至50ml添加有50mg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃×200r/min条件下培养过夜。将50ml过夜培养物稀释接种至500ml新鲜培养基中，37℃×200r/min条件下继续培养，待OD600测定值达到1.0-1.2，加入终浓度为1mM的IPTG，在20℃×200r/min条件下继续培养16-20h，诱导Pyrococcus yayanosii的B型DNA聚合酶表达。
3.Pyrococcus yayanosii的B型DNA聚合酶的亲和纯化
将诱导后的大肠杆菌细胞，在6000r/min下离心5分钟，收集菌体细胞。用50ml裂解缓冲液(20mM Tris-HCl，pH8.0，300mM NaCl，10％甘油)重悬菌体细胞，进行超声波破碎细胞。超声破碎条件为800W功率下超声3s，间歇3s，总共超声30min。超声破碎后于75℃水浴锅中加热20min，失活大肠杆菌自身蛋白。然后在4℃条件下12000r/min离心30分钟，收集上清液获得Pyrococcus yayanosii的B型DNA聚合酶粗液。
将上清液加入到装有2ml Ni-NTA纯化树脂的色谱柱，并让缓冲液流经色谱柱，以使Pyrococcus yayanosii的B型DNA聚合酶所带的6个连续组氨酸亲和标签与Ni-NTA树脂上固定的镍离子特异性结合。然后用含有20mM咪唑的裂解缓冲液洗涤树脂，除去树脂上非特异性结合的杂蛋白。接着用10ml洗脱缓冲液洗脱Ni-NTA树脂，收集洗脱液，洗脱液含有Pyrococcus yayanosii的B型DNA聚合酶。
离子交换层析进一步纯化Pyrococcus yayanosii的B型DNA聚合酶：
将上一步亲和纯化得到的Pyrococcus yayanosii的B型DNA聚合酶洗脱液透析到低盐缓冲液A中(25mM Tris-HCl，pH7.0，50mM NaCl)，然后通过阳离子交换柱(Source 15Q阳离子树脂)进一步纯化Pyrococcus yayanosii的B型DNA聚合酶。用缓冲液A预先平衡柱子，Pyrococcus yayanosii的B型DNA聚合酶上样后通过缓冲液B(25mM Tris-HCl，pH7.0，1MNaCl)梯度提高洗脱液的盐离子浓度，利用离子结合能力的差别将Pyrococcus yayanosii的B型DNA聚合酶与各种杂蛋分离，分管收集洗脱液，经SDS-PAGE凝胶电泳分析后，收集纯化的Pyrococcus yayanosii的B型DNA聚合酶。
将Pyrococcus yayanosii的B型DNA聚合酶置换到储存溶液中：20mM Tris-HCl(pH8.0)，1mM DTT，0.1mM EDTA，100mM KCl，0.5％(v/v)Nonidet P40，0.5％(v/v)Tween 20，50％(v/v)glycerol，于-20℃保存。
SDS-PAGE电泳分析鉴定蛋白纯度，鉴定结果如图1所示。图1结果表明Pyrococcusyayanosii的B型DNA聚合酶先后经亲和纯化和离子交换两步纯化，纯度最终达到电泳纯(纯度90％以上)。
4.PCR应用
将步骤3经亲和纯化(Ni-NTA树脂)和离子交换(阳离子树脂Source 15Q)两步纯化的Pyrococcus yayanosii的B型DNA聚合酶进行PCR扩增。主要实验参数包括对反应缓冲液的pH值，离子强度，镁离子浓度等，具体结果见图2-6。优化实验的目的DNA扩增片段为lambda噬菌体的长度1kb的DNA片段。图2结果表明Pyrococcus yayanosii的B型DNA聚合酶在Tris-HCl中的扩增效果好于Tricine-KOH，在pH7.8-8.4范围内活性较高，最优pH值为8.2。图3结果表明在MgCl2浓度在2-5mM范围内Pyrococcus yayanosii的B型DNA聚合酶活性最高。图4结果表明过低或过高浓度的KCl都不能使Pyrococcus yayanosii的B型DNA聚合酶的活性最高，在40-50mM KCl范围内酶活性最高。图5结果表明高浓度硫酸铵一直Pyrococcus yayanosii的B型DNA聚合酶活性，酶活性的最佳硫酸铵浓度范围为0-5mM。图6结果表明Triton X-100对Pyrococcus yayanosii的B型DNA聚合酶具有一定促进作用，但高浓度Triton X-100会抑制酶活性，酶活性的最佳Triton X-100浓度范围为0.01-0.03％。
与现有技术相比，本发明DNA聚合酶来源于嗜热微生物Pyrococcus yayanosii，具有热稳定性高，扩增忠实性高，扩增能力强等特征。DNA聚合酶通过重组表达载体在大肠杆菌中诱导表达，经固定化镍离子亲和纯化和阳离子交换树脂纯化制备。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 上海交通大学
<120> 一种高忠实性DNA聚合酶及其制备方法和PCR应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 788
<212> PRT
<213> 嗜热微生物(Pyrococcus yayanosii)
<400> 1
Ala Cys Asp Glu Phe Gly His Ile Lys Asx Xaa Glx Met Ile Leu Asp
1 5 10 15
Ala Asp Ala Ile Thr Glu Asn Gly Lys Pro Val Val Arg Ile Phe Lys
20 25 30
Lys Glu Asn Gly Glu Phe Lys Val Glu Tyr Asp Arg Ser Phe Arg Pro
35 40 45
Tyr Ile Tyr Ala Leu Leu Arg Asp Asp Ser Lys Ile Glu Asp Ile Lys
50 55 60
Lys Ile Thr Ala Glu Arg His Gly Lys Val Val Arg Val Val Glu Ala
65 70 75 80
Glu Lys Val Arg Lys Lys Phe Leu Gly Arg Pro Ile Ser Val Trp Lys
85 90 95
Leu Tyr Ile Glu His Pro Gln Asp Gln Pro Ala Ile Arg Glu Lys Ile
100 105 110
Arg Glu His Pro Ala Val Ile Asp Ile Phe Glu Tyr Asp Ile Pro Phe
115 120 125
Ala Lys Arg Tyr Leu Ile Asp Lys Gly Leu Ile Pro Met Glu Gly Asn
130 135 140
Glu Glu Leu Lys Leu Leu Ala Phe Asp Ile Glu Thr Leu Tyr His Glu
145 150 155 160
Gly Asp Glu Phe Gly Ser Gly Pro Ile Ile Met Ile Ser Tyr Ala Asp
165 170 175
Glu Lys Gly Ala Lys Val Ile Thr Trp Lys Gln Val Asp Leu Pro Tyr
180 185 190
Val Glu Val Val Ser Ser Glu Arg Glu Met Ile Lys Arg Phe Leu Arg
195 200 205
Val Ile Arg Glu Lys Asp Pro Asp Ile Leu Val Thr Tyr Asn Gly Asp
210 215 220
Asn Phe Asp Phe Pro Tyr Leu Leu Lys Arg Ala Glu Lys Leu Gly Met
225 230 235 240
Lys Leu Pro Ile Gly Arg Asp Gly Ser Glu Pro Lys Met Gln Arg Met
245 250 255
Gly Asp Ala Thr Ala Val Glu Val Lys Gly Arg Ile His Phe Asp Ile
260 265 270
Tyr Pro Val Ile Ser Arg Thr Ile Asn Leu Pro Thr Tyr Thr Leu Glu
275 280 285
Ala Val Tyr Glu Ala Val Phe Gly Arg Pro Lys Glu Lys Val Tyr Gly
290 295 300
Asn Glu Ile Ala Arg Ala Trp Glu Asn Cys Lys Gly Leu Glu Arg Val
305 310 315 320
Ala Lys Tyr Ser Met Glu Asp Ala Lys Val Thr Tyr Glu Leu Gly Arg
325 330 335
Glu Phe Phe Pro Met Glu Ala Gln Leu Ala Arg Leu Val Gly Gln Pro
340 345 350
Val Trp Asp Val Ser Arg Ser Ser Thr Gly Asn Leu Val Glu Trp Phe
355 360 365
Leu Leu Arg Lys Ala Tyr Glu Arg Asn Glu Leu Ala Pro Asn Arg Pro
370 375 380
Asp Glu Arg Glu Tyr Glu Arg Arg Leu Arg Glu Ser Tyr Glu Gly Gly
385 390 395 400
Tyr Val Lys Glu Pro Glu Lys Gly Leu Trp Glu Gly Ile Ile Tyr Leu
405 410 415
Asp Phe Arg Ser Leu Tyr Pro Ser Ile Ile Ile Thr His Asn Ile Ser
420 425 430
Pro Asp Thr Leu Asn Lys Glu Gly Cys Asn Ser Tyr Asp Val Ala Pro
435 440 445
Lys Val Gly His Arg Phe Cys Lys Asp Phe Pro Gly Phe Ile Pro Ser
450 455 460
Leu Leu Gly Gln Leu Leu Asp Glu Arg Gln Lys Ile Lys Arg Lys Met
465 470 475 480
Lys Ala Thr Ile Asp Pro Ile Glu Arg Lys Leu Leu Asp Tyr Arg Gln
485 490 495
Arg Ala Ile Lys Ile Leu Ala Asn Ser Tyr Tyr Gly Tyr Tyr Gly Tyr
500 505 510
Ala Arg Ala Arg Trp Tyr Cys Arg Asp Cys Ala Glu Ser Val Thr Ala
515 520 525
Trp Gly Arg Asp Tyr Ile Glu Ile Val Ser Arg Glu Leu Glu Lys Arg
530 535 540
Gly Phe Lys Val Leu Tyr Ile Asp Thr Asp Gly Leu Tyr Ala Thr Ile
545 550 555 560
Pro Gly Ser Ala Ala Tyr Glu Arg Ile Lys Glu Arg Ala Leu Glu Phe
565 570 575
Val Lys Tyr Ile Asn Ala Arg Leu Pro Gly Leu Leu Glu Leu Glu Tyr
580 585 590
Glu Gly Phe Tyr Lys Arg Gly Phe Phe Val Thr Lys Lys Lys Tyr Ala
595 600 605
Leu Ile Asp Glu Glu Gly Lys Ile Ile Thr Arg Gly Leu Glu Ile Val
610 615 620
Arg Arg Asp Trp Ser Glu Ile Ala Lys Glu Thr Gln Ala Arg Val Leu
625 630 635 640
Glu Ala Ile Leu Lys Glu Gly Asn Leu Glu Lys Ala Val Lys Ile Val
645 650 655
Lys Glu Val Thr Glu Lys Leu Ser Lys Tyr Glu Val Pro Pro Glu Lys
660 665 670
Leu Val Ile Tyr Glu Gln Ile Thr Arg Asp Leu Lys Asp Tyr Lys Ala
675 680 685
Val Gly Pro His Val Ala Val Ala Lys Arg Leu Ala Ala Arg Gly Ile
690 695 700
Lys Val Arg Pro Gly Met Val Ile Gly Tyr Leu Val Leu Arg Gly Asp
705 710 715 720
Gly Pro Ile Ser Arg Arg Ala Ile Pro Ala Glu Glu Phe Asp Pro Ser
725 730 735
Arg His Lys Tyr Asp Ala Glu Tyr Tyr Ile Glu Asn Gln Val Leu Pro
740 745 750
Ala Val Leu Arg Ile Leu Glu Ala Phe Gly Tyr Lys Arg Asp Glu Leu
755 760 765
Arg Tyr Gln Lys Thr Arg Gln Gly Gly Ala Asp Ala Trp Leu Lys Arg
770 775 780
Lys Ala Ser Leu
785
<210> 2
<211> 2328
<212> DNA
<213> 嗜热微生物(Pyrococcus yayanosii)
<400> 2
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aaagaaaacg gcgaatttaa agtggaatat gatcgcagct ttcgcccgta tatttatgcg 120
ctgctgcgcg atgatagcaa aattgaagat attaaaaaaa ttaccgcgga acgccatggc 180
aaagtggtgc gcgtggtgga agcggaaaaa gtgcgcaaaa aatttctggg ccgcccgatt 240
agcgtgtgga aactgtatat tgaacatccg caggatcagc cggcgattcg cgaaaaaatt 300
cgcgaacatc cggcggtgat tgatattttt gaatatgata ttccgtttgc gaaacgctat 360
ctgattgata aaggcctgat tccgatggaa ggcaacgaag aactgaaact gctggcgttt 420
gatattgaaa ccctgtatca tgaaggcgat gaatttggca gcggcccgat tattatgatt 480
agctatgcgg atgaaaaagg cgcgaaagtg attacctgga aacaggtgga tctgccgtat 540
gtggaagtgg tgagcagcga acgcgaaatg attaaacgct ttctgcgcgt gattcgcgaa 600
aaagatccgg atattctggt gacctataac ggcgataact ttgattttcc gtatctgctg 660
aaacgcgcgg aaaaactggg catgaaactg ccgattggcc gcgatggcag cgaaccgaaa 720
atgcagcgca tgggcgatgc gaccgcggtg gaagtgaaag gccgcattca ttttgatatt 780
tatccggtga ttagccgcac cattaacctg ccgacctata ccctggaagc ggtgtatgaa 840
gcggtgtttg gccgcccgaa agaaaaagtg tatggcaacg aaattgcgcg cgcgtgggaa 900
aactgcaaag gcctggaacg cgtggcgaaa tatagcatgg aagatgcgaa agtgacctat 960
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gtgtgggatg tgagccgcag cagcaccggc aacctggtgg aatggtttct gctgcgcaaa 1080
gcgtatgaac gcaacgaact ggcgccgaac cgcccggatg aacgcgaata tgaacgccgc 1140
ctgcgcgaaa gctatgaagg cggctatgtg aaagaaccgg aaaaaggcct gtgggaaggc 1200
attatttatc tggattttcg cagcctgtat ccgagcatta ttattaccca taacattagc 1260
ccggataccc tgaacaaaga aggctgcaac agctatgatg tggcgccgaa agtgggccat 1320
cgcttttgca aagattttcc gggctttatt ccgagcctgc tgggccagct gctggatgaa 1380
cgccagaaaa ttaaacgcaa aatgaaagcg accattgatc cgattgaacg caaactgctg 1440
gattatcgcc agcgcgcgat taaaattctg gcgaacagct attatggcta ttatggctat 1500
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tatattgaaa ttgtgagccg cgaactggaa aaacgcggct ttaaagtgct gtatattgat 1620
accgatggcc tgtatgcgac cattccgggc agcgcggcgt atgaacgcat taaagaacgc 1680
gcgctggaat ttgtgaaata tattaacgcg cgcctgccgg gcctgctgga actggaatat 1740
gaaggctttt ataaacgcgg cttttttgtg accaaaaaaa aatatgcgct gattgatgaa 1800
gaaggcaaaa ttattacccg cggcctggaa attgtgcgcc gcgattggag cgaaattgcg 1860
aaagaaaccc aggcgcgcgt gctggaagcg attctgaaag aaggcaacct ggaaaaagcg 1920
gtgaaaattg tgaaagaagt gaccgaaaaa ctgagcaaat atgaagtgcc gccggaaaaa 1980
ctggtgattt atgaacagat tacccgcgat ctgaaagatt ataaagcggt gggcccgcat 2040
gtggcggtgg cgaaacgcct ggcggcgcgc ggcattaaag tgcgcccggg catggtgatt 2100
ggctatctgg tgctgcgcgg cgatggcccg attagccgcc gcgcgattcc ggcggaagaa 2160
tttgatccga gccgccataa atatgatgcg gaatattata ttgaaaacca ggtgctgccg 2220
gcggtgctgc gcattctgga agcgtttggc tataaacgcg atgaactgcg ctatcagaaa 2280
acccgccagg gcggcgcgga tgcgtggctg aaacgcaaag cgagcctg 2328

Claims (8)

1.一种高忠实性DNA聚合酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种编码权利要求1所述高忠实性DNA聚合酶的基因，其特征在于，其核苷酸序列表如SEQ ID NO.2所示。
3.含权利要求1所述高忠实性DNA聚合酶的重组表达菌。
4.根据权利要求3所述的重组表达菌，其特征在于，所述重组表达菌为大肠杆菌。
5.一种如权利要求1所述高忠实性DNA聚合酶的基因的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)对权利要求3所述重组表达菌进行扩大培养、诱导表达；
(2)收集诱导培养后的菌体，进行细胞破碎、离心，得到细胞裂解液上清；
(3)对上清液进行镍离子亲和纯化和离子交换纯化，得到所述DNA聚合酶。
6.一种如权利要求1所述高忠实性DNA聚合酶在PCR中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述PCR应用中包含PCR反应缓冲液。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述PCR反应缓冲液含20mM Tris-HCl或pH值为8.2的Tricine-NaOH，3mM MgCl2，40mM KCl，4mM(NH4)2SO4，0.01％Triton X-100和0.005％BSA。
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