CN111826360B - 一种催化活力提高的亮氨酸脱氢酶突变体及其应用 - Google Patents

一种催化活力提高的亮氨酸脱氢酶突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种催化活力提高的亮氨酸脱氢酶突变体及其应用，属于酶工程和微生物工程技术领域。本发明提供了一种亮氨酸脱氢酶突变体，所述亮氨酸脱氢酶突变体与氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的亮氨酸脱氢酶相比，进行了C端改造，切除C端残基364位精氨酸至374位甘氨酸，本发明首次对亮氨酸脱氢酶底物进出的通道进行改造，C端切除突变体可能扩大了底物的进出通道使得底物更易与蛋白结合，获得了更加高效制备L‑2‑氨基丁酸的亮氨酸脱氢酶。本发明提供的亮氨酸脱氢酶突变体△364‑374的比酶活为201U/mg，相对于野生酶提高了20％。

Description

一种催化活力提高的亮氨酸脱氢酶突变体及其应用
技术领域
本发明涉及一种催化活力提高的亮氨酸脱氢酶突变体及其应用，属于酶工程和微生物工程技术领域。
背景技术
L-2-氨基丁酸在食品、农业、生物医药等方面有着很大的应用价值，如它是用于治疗抗癫痫药物左已拉西坦、布瓦西坦的直接前体，也是用于合成治疗结核病的药物盐酸乙胺丁醇的重要手性前体。亮氨酸脱氢酶(leucine dehydrogenase,LeuDH，EC 1.4.1.9)属于氧化还原酶家族，已被广泛用于非天然氨基酸的制备，如L-2-氨基丁酸(Tao,R.,Jiang,Y.,Zhu,F.et al.A one-pot system for production of L-2-aminobutyric acid from L-threonine by L-threonine deaminase and a NADH-regeneration system based on L-leucine dehydrogenase and formate dehydrogenase.Biotechnol Lett 36,835–841(2014))，L-叔亮氨酸(Li J,Pan J,Zhang J,et al.Stereoselective synthesis of L-tert-leucine by a newly cloned leucine dehydrogenase from Exiguobacteriumsibiricum[J].Journal of Molecular Catalysis B Enzymatic,2014,105(7):11-17)等；并且已有较多文献对亮氨酸脱氢酶偶联辅酶循环及苏氨酸脱氨酶的一锅法制备进行研究优化，但是，在其制备非天然氨基酸如L-2-氨基丁酸的过程中由于亮氨酸脱氢酶催化活力低于苏氨酸脱氨酶，导致中间产物不断积累不断抑制亮氨酸脱氢酶的活性，致使亮氨酸脱氢酶不足以催化不断产生的中间产物2-酮丁酸，因此急需一种催化活力高的亮氨酸脱氢酶。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种亮氨酸脱氢酶突变体，所述亮氨酸脱氢酶突变体与氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的亮氨酸脱氢酶相比，切除了C端残基364位精氨酸至374位甘氨酸。
在本发明的一种实施方式中，编码所述亮氨酸脱氢酶突变体的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。
在本发明的一种实施方式中，所述亮氨酸脱氢酶来源于Exiguobacteriumsibiricum。
本发明还提供了携带上述基因的载体。
在本发明的一种实施方式中，所述载体包括质粒、噬菌体或病毒载体。
在本发明的一种实施方式中，所述载体为pET-28a质粒。
本发明还提供了携带上述基因或上述载体的宿主细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为细菌或真菌。
在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为E.coli BL21(DE3)、E.coli JM109、E.coli DH5α。
本发明还提供了上述亮氨酸脱氢酶突变体的制备方法，所述方法为将上述宿主细胞接入到培养基中进行发酵，发酵结束后，收集菌液，将菌液离心后收集菌体，将菌体重悬后进行破碎，将细胞破碎液离心后收集上清，从上清液中分离得到亮氨酸脱氢酶突变体。
在本发明的一种实施方式中，将上述宿主细胞的种子液按照1-5％接种量接入到LB液体培养基中，于35-39℃，200-220r/min培养至菌密度OD达到0.5-0.8后，加入IPTG诱导剂于16-25℃，诱导10-14h后收集菌液，将菌液离心后收集菌体，将菌体重悬后破碎菌体，将细胞破碎液离心后收集上清，从上清液中分离得到亮氨酸脱氢酶突变体。
本发明还提供了应用上述方法制备得到的亮氨酸脱氢酶突变体。
本发明还提供了上述亮氨酸脱氢酶突变体或上述基因或上述载体或上述宿主细胞或上述制备方法在制备L-2-氨基丁酸或含L-2-氨基丁酸的产品中的应用。
本发明还提供了一种制备L-2-氨基丁酸的方法，以上述亮氨酸脱氢酶突变体或上述宿主细胞为催化剂，以2-酮丁酸为底物，催化制备L-2-氨基丁酸。
[有益效果]
(1)本发明提供了一种催化活力提高的亮氨酸脱氢酶突变体，本发明通过对C端进行了改造，切除C端残基364位精氨酸至374位甘氨酸，得到了亮氨酸脱氢酶突变体△364-374，亮氨酸脱氢酶突变体△364-374的比酶活为201U/mg，相对于野生酶提高了20％。
(2)本发明首次对亮氨酸脱氢酶底物进出的通道进行改造，C端切除突变体可能扩大了底物的进出通道使得底物更易与蛋白结合，获得了更加高效制备L-2-氨基丁酸的亮氨酸脱氢酶。
附图说明
图1：△364-374、△369-374、△373-374突变体SDS-PAGE分析；其中M：marker；C:BL21/28a破碎上清对照；1：BL21/28a-EsLDH-△364-374上清；2：BL21/28a-EsLDH-△364-374沉淀；3：BL21/28a-EsLDH-△369-374上清；4：BL21/28a-EsLDH-△369-374沉淀；5：BL21/28a-EsLDH-△373-374上清；6：BL21/28a-EsLDH-△373-374沉淀。
图2：突变体△364-374、△369-374、△373-374纯化样品SDS-PAGE分析；其中，M：marker；1：BL21/28a-EsLDH-△373-374样品1；2：BL21/28a-EsLDH-△373-374样品2；3：BL21/28a-EsLDH-△369-374样品1；4：BL21/28a-EsLDH-△369-374样品2；5：BL21/28a-EsLDH-△364-374样品1；6：BL21/28a-EsLDH-△364-374样品2。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明进行进一步的阐述。
下述实施例中涉及的大肠杆菌E.coli BL21(DE3)购自北纳生物，pET-28a(+)质粒购自Novagen公司；下述实施例中涉及的PBS缓冲液粉末、2-酮丁酸、L-2-氨基丁酸、β-NADH购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
下述实施例中涉及的培养基如下：
LB液体培养基：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 10g/L。
LB固体培养基：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 10g/L、琼脂粉1.5％(m/v)。
下述实施例中涉及的检测方法如下：
亮氨酸脱氢酶酶活的测定方法：
在浓度为900mM氯化铵-氨水缓冲液(pH 9.5)中加入0.3mg/mL NADH、0.75mg/mL底物2-酮丁酸，获得反应体系；在1600μl反应体系中加入2μL酶液启动反应，30℃反应3分钟，每隔30s测定340nm吸光度的值并记录数据，根据1min内反应液在340nm吸光值差值，计算出亮氨酸脱氢酶酶活；
其中，亮氨酸脱氢酶酶活(U/mL)＝吸光度变化值反应总体系(μL)/(酶液量(μL)×摩尔消光系数(6.22×10-3mol/(L.cm-2)×比色光径)。
酶活单位(U)的定义为：每分钟氧化1μmol NADH得到1μmol NAD+所需的酶量为1U。
亮氨酸脱氢酶比酶活的测定方法：
测定纯化后的亮氨酸脱氢酶的酶活(U/mL)，并且，采用Bradford法测定纯化后的亮氨酸脱氢酶的蛋白含量(mg/mL)，以计算亮氨酸脱氢酶的比酶活；
其中，亮氨酸脱氢酶比酶活的计算公式如下：
亮氨酸脱氢酶比酶活(U/mg)＝纯化后的亮氨酸脱氢酶的酶活(U/mL)/纯化后的亮氨酸脱氢酶的蛋白含量(mg/mL)(Bradford法记载于参考文献“Bradford,M.M.1976.Arapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities ofprotein utilizing the principle of protein-dyebinding.Anal.Biochem.72:248–254”中)。
比酶活定义：每毫克蛋白所具有的酶活(U/mg)。
实施例1：亮氨酸脱氢酶野生酶的表达
(1)合成得到编码核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的亮氨酸脱氢酶。
(2)基因表达载体的构建及转化
将编码核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的亮氨酸脱氢酶和pET-28a载体用限制性内切酶BamH I和Hind III双酶切，酶切后产物用Solution I连接并将连接产物转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，挑取4个转化子提质粒BamH I和Hind III进行酶切验证，得到重组大肠杆菌BL21/pET-28a-LeuDH。
实施例2：亮氨酸脱氢酶突变体的制备
具体步骤如下：
(1)亮氨酸脱氢酶突变体的制备
采用全质粒反向PCR方法，C端切除不同数目氨基酸的寡核苷酸片段为同源臂设计上下游引物，以实施例1获得的重组质粒pET-28a-LeuDH为模板进行C端切除改造，获得携带编码亮氨酸脱氢酶突变体△364-374、△369-374、△373-374基因的重组质粒pET-28a-LeuDH1～pET-28a-LeuDH3；
其中，突变体△364-374是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的亮氨酸脱氢酶切除C端残基364位精氨酸至374位甘氨酸得到的，所用引物如下：
△364-374-F：5’-GACAGCAAATGGGTCGCGGATCCATGGTGGAAACCAATGTGGAAG-3’(SEQ IDNO.9)；
△364-374-R：5’-GTGGTGCTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTCAGAAACTGACTGCGGGC-3’(SEQ IDNO.10)；
突变体△369-374是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的亮氨酸脱氢酶切除C端残基369位异亮氨酸至374位甘氨酸得到的，所用引物如下：
△369-374-F：5’-GATAAGAACTAAAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCA-3’(SEQ ID NO.11)；
△369-374-R：5’-GCAAGCTTTTAGTTCTTATCGCGACGCAGAAACTGACTG-3’(SEQ IDNO.12)；
突变体△373-374是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的亮氨酸脱氢酶切除C端残基373位精氨酸至374位甘氨酸得到的，所用引物如下：
△373-374-F：5’-CTGGGCAGTTAAAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCA-3’(SEQ ID NO.13)；
△373-374-R：5’-GCAAGCTTTTAACTGCCCAGAATGTTCTTATCGCGACGCAG-3’(SEQ IDNO.14)；
PCR扩增体系：模板1μL，上下游引物各0.5μL，2×Phanta Max Master Mix聚合酶10μL，灭菌ddH2O 8μL，总反应体系20μL。PCR反应条件：95℃预变性，5min；95℃变性，30s，58℃退火，30s，72℃延伸，1min，30个循环；72℃充分延伸，10min。
PCR产物经过凝胶电泳检验，然后在15μL的PCR产物中加入1μL的Dpn I限制性内切酶对模板质粒进行消化，于25℃过夜或者37℃下温育3-4h。
将上述经过消化处理的PCR产物转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，得到相应的重组大肠杆菌BL21/pET-28a-LeuDH1～pET-28a-LeuDH3，涂布于含卡那霉素的平板上，37℃下培养过夜，随机挑取克隆进行菌落PCR鉴定和测序验证，结果表明含有亮氨酸脱氢酶突变体基因的重组表达载体成功转化至表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)中。经测序验证，在突变成功的菌液种加入无菌甘油并于-40℃冰箱保藏。
最终获得亮氨酸脱氢酶突变体△364-374、△369-374、△373-374，核苷酸序列测序结果分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7所示，相应编码的蛋白质氨基酸序列如SEQID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8所示。
实施例3：亮氨酸脱氢酶突变体的表达
将实施例1和实施例2制备的重组大肠杆菌BL21/pET-28a-LeuDH以及重组大肠杆菌BL21/pET-28a-LeuDH1～pET-28a-LeuDH3分别接种在含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、180r/min培养过夜后，按1％接种量接入到转接于50mL的LB培养基中，培养温度37℃，转速180r/min，培养至OD600达到0.5-0.8后加入终浓度为0.5mM的IPTG进行诱导，诱导温度降低为25℃，诱导8-10h后，4℃，8000rpm离心10min收集菌体，取收集的湿菌体细胞，用5mL的pH 7.5的50mM PBS缓冲液洗涤二次，重悬于5mL的pH 7.5的50mM PBS缓冲液中，振荡摇匀后置超声波下破碎，破1s，停3s，总时长15min。细胞破碎液于12000rpm离心20min去除细胞碎片，收集上清即获得野生型亮氨酸脱氢酶以及亮氨酸脱氢酶突变体△364-374、△369-374、△373-374的粗酶液。
将得到的含有亮氨酸脱氢酶突变体△364-374、△369-374、△373-374的粗酶液进行SDS-PAGE凝胶电泳分析，分析结果见图1。
由图1可知，突变体△364-374、△369-374、△373-374在41kDa附近均有很明显的条带，表明这些突变体蛋白均正常表达。
实施例4：不同亮氨酸脱氢酶突变体的分离纯化
具体步骤如下：
分别将实施例3获得的野生型亮氨酸脱氢酶及亮氨酸脱氢酶突变体△364-374、△369-374、△373-374的粗酶液利用0.22μm滤膜过滤后用于酶的后续分离纯化；纯化柱为Ni-NTA柱，装柱体积为5mL，先用上样平衡缓冲液M0(20mM Tris，500mM NaCl，pH 7.4)平衡Ni-NTA柱，以0.5mL/min的速率上样粗酶液，用上样平衡缓冲液M0除去未吸附的蛋白，最后用洗脱缓冲液M700(20mM Tris，500mM NaCl和700mM咪唑，pH 7.4)洗脱收集目标蛋白，所得的纯酶液于-40℃贮存备用。纯化后的酶液用SDS-PAGE进行分析(图2)，结果表明得到电泳纯的重组亮氨酸脱氢酶及其突变体。
实施例4：不同亮氨酸脱氢酶突变体的酶学性质
具体步骤如下：
对实施例3获得的野生型、突变体△364-374、突变体△369-374、突变体△373-374进行比酶活的检测，检测结果为：野生型的比酶活为168Umg-1，突变体△364-374的比酶活为201Umg-1，突变体△369-374的比酶活为120Umg-1，突变体△373-374的比酶活为100.1Umg-1。
突变体△369-374的比酶活为原始的71％、突变体△373-374的比酶活仅为原始的59％；可见，突变体△364-374的比酶活较野生型有了明显的改善。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种催化活力提高的亮氨酸脱氢酶突变体及其应用
<130> BAA200451A
<160> 14
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 374
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Val Glu Thr Asn Val Glu Ala Arg Phe Ser Ile Phe Glu Thr Met
1 5 10 15
Ala Met Glu Asp Tyr Glu Gln Val Val Phe Cys His Asp Lys Val Ser
20 25 30
Gly Leu Lys Ala Ile Ile Ala Ile His Asp Thr Thr Leu Gly Pro Ala
35 40 45
Leu Gly Gly Leu Arg Met Trp Asn Tyr Ala Ser Asp Glu Glu Ala Leu
50 55 60
Ile Asp Ala Leu Arg Leu Ala Lys Gly Met Thr Tyr Lys Asn Ala Ala
65 70 75 80
Ala Gly Leu Asn Leu Gly Gly Gly Lys Ala Val Ile Ile Gly Asp Ala
85 90 95
Lys Thr Gln Lys Ser Glu Ala Leu Phe Arg Ala Phe Gly Arg Tyr Val
100 105 110
Gln Ser Leu Asn Gly Arg Tyr Ile Thr Ala Glu Asp Val Asn Thr Thr
115 120 125
Val Ala Asp Met Asp Tyr Ile His Met Glu Thr Asp Phe Val Thr Gly
130 135 140
Val Ser Pro Ala Phe Gly Ser Ser Gly Asn Pro Ser Pro Val Thr Ala
145 150 155 160
Tyr Gly Val Tyr Arg Gly Met Lys Ala Ala Ala Lys Glu Val Tyr Gly
165 170 175
Thr Asp Ser Leu Gly Gly Lys Thr Val Ala Ile Gln Gly Val Gly Asn
180 185 190
Val Ala Phe Asn Leu Cys Arg His Leu His Glu Glu Gly Ala Lys Leu
195 200 205
Ile Val Thr Asp Ile Asn Gln Asp Ala Leu Arg Arg Ala Glu Glu Ala
210 215 220
Phe Gly Ala Leu Val Val Gly Pro Asp Glu Ile Tyr Ser Val Asp Ala
225 230 235 240
Asp Ile Phe Ala Pro Cys Ala Leu Gly Ala Thr Leu Asn Asp Glu Thr
245 250 255
Ile Pro Gln Leu Lys Val Lys Ile Ile Ala Gly Ala Ala Asn Asn Gln
260 265 270
Leu Lys Glu Asp Arg His Gly Asp Met Leu Gln Glu Arg Gly Ile Leu
275 280 285
Tyr Thr Pro Asp Phe Val Ile Asn Ala Gly Gly Val Ile Asn Val Ala
290 295 300
Asp Glu Leu Asp Gly Tyr Asn Arg Glu Arg Ala Met Lys Lys Val Glu
305 310 315 320
Leu Val Tyr Asp Ala Val Ala Lys Val Ile Glu Ile Ala Lys Arg Asp
325 330 335
His Leu Pro Thr Tyr Arg Ala Ala Glu Lys Met Ala Glu Glu Arg Ile
340 345 350
Ala Thr Met Gly Ser Ala Arg Ser Gln Phe Leu Arg Arg Asp Lys Asn
355 360 365
Ile Leu Gly Ser Arg Gly
370
<210> 2
<211> 1089
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atggtggaaa ccaatgtgga agcgcgcttc agcatctttg agaccatggc gatggaggac 60
tacgagcaag ttgtgttctg ccatgacaaa gttagcggtc tgaaagccat catcgcgatc 120
cacgatacga ccctcggtcc agcgctgggt ggcctccgca tgtggaacta cgcgagtgat 180
gaagaggcgc tgattgacgc gctccgtctg gcgaaaggca tgacctacaa gaatgccgcg 240
gccggcctca atctcggtgg cggtaaagcc gtgattatcg gcgatgccaa gacccagaag 300
agcgaagcgc tgttccgcgc ctttggtcgc tacgtgcaga gtctgaacgg ccgttacatc 360
accgccgagg acgtgaacac gacggtggcc gacatggact acatccacat ggaaaccgac 420
ttcgtgaccg gcgttagccc agcctttggc agcagcggca acccgagccc agttaccgcg 480
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gacatttttg cgccatgcgc gctgggtgcc acgctgaatg atgaaaccat cccgcagctc 780
aaggtgaaga tcatcgcggg cgccgcgaac aaccagctca aagaggatcg tcatggcgac 840
atgctgcaag aacgcggcat tctctacacg ccggacttcg ttatcaacgc gggcggcgtg 900
atcaatgttg cggacgaact ggacggttac aaccgcgaac gcgccatgaa gaaagtggaa 960
ctggtttacg acgccgtggc caaggttatc gaaattgcga agcgtgacca cctcccaacc 1020
tatcgcgcgg ccgagaaaat ggcggaggaa cgcattgcca cgatgggtag cgcccgcagt 1080
cagtttctg 1089
<210> 3
<211> 1125
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atggtggaaa ccaatgtgga agcgcgcttc agcatctttg agaccatggc gatggaggac 60
tacgagcaag ttgtgttctg ccatgacaaa gttagcggtc tgaaagccat catcgcgatc 120
cacgatacga ccctcggtcc agcgctgggt ggcctccgca tgtggaacta cgcgagtgat 180
gaagaggcgc tgattgacgc gctccgtctg gcgaaaggca tgacctacaa gaatgccgcg 240
gccggcctca atctcggtgg cggtaaagcc gtgattatcg gcgatgccaa gacccagaag 300
agcgaagcgc tgttccgcgc ctttggtcgc tacgtgcaga gtctgaacgg ccgttacatc 360
accgccgagg acgtgaacac gacggtggcc gacatggact acatccacat ggaaaccgac 420
ttcgtgaccg gcgttagccc agcctttggc agcagcggca acccgagccc agttaccgcg 480
tacggcgtgt accgcggtat gaaagcggcc gccaaagaag tttacggcac ggatagtctg 540
ggcggtaaaa ccgtggcgat ccaaggcgtt ggcaatgttg cgttcaatct gtgccgccat 600
ctgcatgaag aaggcgcgaa gctgattgtg accgacatta accaagatgc gctgcgtcgc 660
gccgaagaag cctttggtgc cctcgtggtt ggcccggacg agatttacag cgtggacgcc 720
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<210> 4
<211> 374
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
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1 5 10 15
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20 25 30
Gly Leu Lys Ala Ile Ile Ala Ile His Asp Thr Thr Leu Gly Pro Ala
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225 230 235 240
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245 250 255
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<211> 1104
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
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<211> 374
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
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1 5 10 15
Ala Met Glu Asp Tyr Glu Gln Val Val Phe Cys His Asp Lys Val Ser
20 25 30
Gly Leu Lys Ala Ile Ile Ala Ile His Asp Thr Thr Leu Gly Pro Ala
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370
<210> 7
<211> 1116
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
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<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 8
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<212> DNA
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<400> 9
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<210> 10
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<212> DNA
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<400> 11
gataagaact aaaagcttgc ggccgcactc gagca 35
<210> 12
<211> 39
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<400> 12
gcaagctttt agttcttatc gcgacgcaga aactgactg 39
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<400> 13
ctgggcagtt aaaagcttgc ggccgcactc gagca 35
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<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
gcaagctttt aactgcccag aatgttctta tcgcgacgca g 41

Claims (10)

1.一种亮氨酸脱氢酶突变体，所述亮氨酸脱氢酶突变体与氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的亮氨酸脱氢酶相比，切除了C端残基364位精氨酸至374位甘氨酸。
2.如权利要求1所述的一种亮氨酸脱氢酶突变体，其特征在于，编码所述亮氨酸脱氢酶突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.编码权利要求1所述的亮氨酸脱氢酶突变体的基因。
4.携带权利要求3所述基因的重组载体。
5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于，其出发载体为pET-28a质粒。
6.携带权利要求3所述的基因，或权利要求4或5所述重组载体的工程化细胞。
7.如权利要求6所述的工程化细胞，其特征在于，其宿主细胞为细菌或真菌。
8.权利要求1所述的亮氨酸脱氢酶突变体的制备方法，其特征在于，所述方法为将权利要求6或7所述的工程化细胞接入到培养基中进行发酵，发酵结束后，收集菌液，将菌液离心后收集菌体，将菌体重悬后进行破碎，将细胞破碎液离心后收集上清，从上清液中分离得到亮氨酸脱氢酶突变体。
9.权利要求1所述亮氨酸脱氢酶突变体，或权利要求3所述基因，或权利要求4或5所述的重组载体，或权利要求6或7所述工程化细胞，或权利要求8所述制备方法在制备L-2-氨基丁酸或含L-2-氨基丁酸的产品中的应用。
10.一种制备L-2-氨基丁酸的方法，其特征在于，以权利要求1所述亮氨酸脱氢酶突变体或权利要求6或7所述工程化细胞为催化剂，以2-酮丁酸为底物，催化制备L-2-氨基丁酸。
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