发明内容
本发明的目的是提供一种葡萄糖氧化酶突变体,其耐热性得到显著提高,有利于其在饲料领域的广泛应用。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
本发明提供了一种葡萄糖氧化酶突变体,其具有(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)所示的氨基酸序列中任意一个:
(Ⅰ) 与葡萄糖氧化酶的氨基酸序列SEQ ID NO:1具有至少95%同源性的序列;
(Ⅱ) 具有所述(Ⅰ)中所述的葡萄糖氧化酶的至少一个免疫表位,且所述葡萄糖氧化酶的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列;
(Ⅲ)由如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列或其互补序列或因遗传密码的简并性而与如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列或其互补序列的核苷酸序列不同的序列编码的氨基酸序列;
在本发明的另一些实施例中,所述取代为取代1个氨基酸。
在本发明的另一些实施例中,所述取代包括氨基酸序列为SEQ ID NO:1的葡萄糖氧化酶的第13,15,17,31,51,81,83,116,121,126,131,133,134,135,145,148,159,160,164,167,168,170,175,184,188位氨基酸中任意一个发生了取代。
在本发明的另一些实施例中,所述取代包括第13位氨基酸由S变为A,或D。
在本发明的另一些实施例中,所述取代包括第15位氨基酸由R变为D。
在本发明的另一些实施例中,所述取代包括第17位氨基酸由V变为F,或Y。
在本发明的另一些实施例中,所述取代包括第31位氨基酸由T变为I,或L,或M,或V。
在本发明的另一些实施例中,所述取代包括第51位氨基酸由Y变为F。
在本发明的另一些实施例中,所述取代包括第81位氨基酸由E变为P。
在本发明的另一些实施例中,所述取代包括第83位氨基酸由A变为P。
在本发明的另一些实施例中,所述取代包括第116位氨基酸由V变为I。
在本发明的另一些实施例中,所述取代包括第121位氨基酸由T变为K,或R。
在本发明的另一些实施例中,所述取代包括第126位氨基酸由E变为P。
在本发明的另一些实施例中,所述取代包括第131位氨基酸由D变为K。
在本发明的另一些实施例中,所述取代包括第133位氨基酸由V变为L。
在本发明的另一些实施例中,所述取代包括第134位氨基酸由A变为L。
在本发明的另一些实施例中,所述取代包括第135位氨基酸由A变为P。
在本发明的另一些实施例中,所述取代包括第145位氨基酸由A变为E,或P。
在本发明的另一些实施例中,所述取代包括第148位氨基酸由A变为D。
在本发明的另一些实施例中,所述取代包括第159位氨基酸由A变为P。
在本发明的另一些实施例中,所述取代包括第160位氨基酸由S变为E。
在本发明的另一些实施例中,所述取代包括第164位氨基酸由V变为K,或R。
在本发明的另一些实施例中,所述取代包括第167位氨基酸由T变为P。
在本发明的另一些实施例中,所述取代包括第168位氨基酸由V变为I。
在本发明的另一些实施例中,所述取代包括第170位氨基酸由A变为V。
在本发明的另一些实施例中,所述取代包括第175位氨基酸由T变为R。
在本发明的另一些实施例中,所述取代包括第184位氨基酸由K变为A,或D,或E。
在本发明的另一些实施例中,所述取代包括第188位氨基酸由S变为E,或R。
本发明还提供了上述葡萄糖氧化酶突变体在饲料中的应用。
本发明还提供了具有上述DNA分子的重组表达载体。
本发明还提供了一种宿主细胞,包含上述重组表达载体。
在本发明的一些实施例中,宿主细胞为毕赤酵母。
本发明提供的葡萄糖氧化酶单点突变体的耐热性普遍高于野生型,60℃处理10min后残余酶活提高了17.5-72.7%,65℃处理5 min后残余酶活提高了23.8-100.4%。从而说明上述单点突变导致葡萄糖氧化酶的耐热性得到大幅提升,比野生型更适合用作饲料添加剂,有利于葡萄糖氧化酶在饲料中的广泛应用,因而市场前景广阔。
实施例1 葡萄糖氧化酶耐热单点突变体的获得
1.1葡萄糖氧化酶基因的扩增
以黑曲霉(Aspergillus niger)基因组为模板进行PCR扩增,PCR引物GOD-F1、GOD-R1如下:
GOD-F1:GGTATTGAGGCATCTTTGTTGAC
GOD-R1:TTATTGCATAGAAGCGTAATC
胶回收PCR产物,连接pEASY-T载体,转化至大肠杆菌DH5α中,挑取正确的转化子进行测序。测序结果显示,扩增得到的基因片段的核苷酸序列为SEQ ID NO:2,其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。通过NCBI BLAST比对发现,SEQ ID NO:1与来源于黑曲霉的葡萄糖氧化酶序列相似性高达100%,从而确定通过PCR获得的基因为葡萄糖氧化酶基因,命名为GOD。
葡萄糖氧化酶突变体基因的扩增及合成
为了提高上述葡萄糖氧化酶GOD的耐热性,申请人通过定向进化技术对该酶进行了大量突变的筛选,设计PCR引物GOD-F2、GOD-R2如下:
GOD-F2:GGCGAATTCGGTATTGAGGCATCTTTGTTGAC(下划线为限制性内切酶EcoRI识别位点)
GOD-R2:ATAGCGGCCGCTTATTGCATAGAAGCGTAATC(下划线为限制性内切酶Not I识别位点)
以GOD基因为模板,以上述引物用GeneMorph II随机突变PCR试剂盒(Stratagene)进行PCR扩增,胶回收PCR产物,EcoRI、Not I进行酶切处理后与经同样酶切后的pET21a载体连接,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,涂布于LB+Amp平板,37℃倒置培养,待转化子出现后,用牙签逐个挑至96孔板,每个孔中加入150 ul含有0.1mM IPTG的LB+Amp培养基,37℃ 220rpm培养6 h左右,离心弃上清,菌体用缓冲液重悬,反复冻融破壁,获得含有葡萄糖氧化酶的大肠杆菌细胞裂解液。
分别取出10µL裂解液至两块新的96孔板,其中一块于70℃处理5min后,两块96孔板都加入40µL底物,于30℃反应30 min后,DNS法测定生成的还原糖,计算高温处理的酶液相比于未处理酶液的相对酶活。实验结果表明,有些突变对葡萄糖氧化酶GOD的耐热性没有影响,有些突变甚至使其耐热性或酶活变得更差了;另外还有些突变,虽然能提高葡萄糖氧化酶对温度的耐受性,但突变后其酶学性质发生了显著的变化,这些均不符合要求。最终,申请人筛选到既能显著提高葡萄糖氧化酶GOD的耐热性,又不会影响其酶活及原有酶学性质的突变位点:S13A/D,R15D,V17F/Y,T31I/L/M/V,Y51F,E81P,A83P,V116I,T121K/R,E126P,D131K,V133L,A134L,A135P,A145E/P,A148D,A159P,S160E,V164K/R,T167P,V168I,A170V,T175R,K184A/D/E,S188E/R/Y。
用引物GOD-F2、GOD-R2对上述突变体分别进行PCR扩增,引物两端引入EcoRI、NotI位点。PCR反应条件为:94℃变性5min;然后94℃变性30s,56℃复性30s,72℃延伸1min,30个循环后,72℃保温10min。琼脂糖凝胶电泳结果显示,扩增得到的突变体基因均为大小1800bp左右的片段。
通过上述同样的PCR方法扩增得到野生型葡萄糖氧化酶GOD的基因片段。
毕赤酵母工程菌株的构建
将上述克隆得到的葡萄糖氧化酶突变体基因通过EcoRI和NotI位点与表达载体pPIC9K相连接,构建表达载体。
将表达载体用Sal I进行线性化,表达载体线性化片段通过电穿孔法转化毕赤酵母GS115,在MD平板上分别筛选得到毕赤酵母重组菌株,然后分别在含不同浓度遗传霉素的YPD平板上筛选多拷贝的转化子。
将筛选得到的含上述单点突变体的转化子转接于BMGY培养基中,30℃、250 rpm振荡培养1 d;再转入BMMY培养基中,30℃、250 rpm振荡培养;每天添加0.5%的甲醇,诱导表达4 d;离心去除菌体,得到含葡萄糖氧化酶突变体的发酵上清液;将其进行SDS-PAGE电泳检测分析。结果显示,发酵上清液中葡萄糖氧化酶突变体的分子量大小约为64 kDa,与理论分子量大小相同。
通过上述同样的方法构建得到重组表达野生型葡萄糖氧化酶的毕赤酵母工程菌。摇瓶水平发酵,30℃、250 rpm振荡培养;每天添加0.5%的甲醇,诱导表达4 d;离心去除菌体,得到含野生型葡萄糖氧化酶GOD的发酵上清液。
(1)葡萄糖氧化酶酶活单位的定义
在pH6.0,30℃条件下,每分钟能把1µmol的β-D-葡萄糖氧化为D-葡萄糖酸和过氧化氢所需要的酶量,定义为1个酶活力单位(IU)。
(2)酶活测定方法
将粗酶液直接用缓冲液稀释至约10U/mL。取4支150*15的试管,加入2ml缓冲液、0.3ml葡萄糖、0.4ml苯酚、0.1ml 4-氨基安替吡啉、0.1ml 辣根过氧化物酶,30℃预热5min。向其中一管加入0.1ml蒸馏水,作为空白调零。水浴锅放在分光光度计旁以方便操作,向样品管中加入0.1ml样品溶液,此时开始计时,涡旋混匀后立即在500nm波长处用1cm比色杯比色。读取0.5 min时吸光度值为A0,再反应1min后,读取吸光度值A1,得出ΔA500=A1-A0。
酶活计算公式:
试样中酶活力X1(U/mL或U/g)按照如下公式计算:
X1=ΔA500×f×B ×1000/(887×t×A×d)=33.82×ΔA500×f
式中:
f--------------------- 酶液稀释倍数
B-------------------- 反应液体积(3 ml)
1000----------------消光系数单位转换系数
887----------------- 消光系数(L·mol-1·cm-1)
t--------------------- 反应时间(min),即读数A1与A0之间的时间差值1min。
A-------------------- 加入样品体积(0.1 ml)
d-------------------- 比色皿的厚度(cm)
(3)酶活测定结果
按照上述方法进行发酵上清液的酶活测定,结果显示:重组表达野生型葡萄糖氧化酶的毕赤酵母发酵上清液的酶活为105 U/ml,而重组表达葡萄糖氧化酶突变体的毕赤酵母发酵上清液的酶活约为100-178 U/mL。
发酵验证
在10升发酵罐上分别进行上述构建得到的毕赤酵母工程菌的发酵,发酵使用的培养基配方为:硫酸钙1.1 g/L、磷酸二氢钾5.5 g/L、磷酸二氢铵55 g/L、硫酸钾20.3 g/L、硫酸镁16.4 g/L、氢氧化钾1.65 g/L、消泡剂0.05%。
发酵工艺:pH值5.0、温度30℃、搅拌速率300 rpm、通风量1.0-1.5(v/v)、溶氧控制在20%以上。
整个发酵过程分为三个阶段:第一阶段为菌体培养阶段,按7%比例接入种子,30℃培养24-26 h,以补完葡萄糖为标志;第二阶段为饥饿阶段,当葡萄糖补完之后,不流加任何碳源,当溶氧上升至80%以上表明该阶段结束,为期约30-60 min;第三阶段为诱导表达阶段,流加甲醇诱导,并且保持溶氧在20%以上,培养时间在150-180 h之间。发酵结束后,发酵液通过板框过滤机处理后获得粗酶液。
采用实施例1中1.3所述葡萄糖氧化酶酶活测定方法对粗酶液进行酶活检测,结果显示,重组表达野生型葡萄糖氧化酶的毕赤酵母最终的发酵酶活为3050 U/ml,而重组表达葡萄糖氧化酶突变体的毕赤酵母最终的发酵酶活达到3087-3631 U/ml。
葡萄糖氧化酶酶学性质测定
1、最适作用pH
采用pH值分别为2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液,在30℃条件下对实施例1中1.4所述发酵粗酶液进行葡萄糖氧化酶活力测定,以最高酶活为100%,计算相对酶活,结果显示野生型葡萄糖氧化酶GOD与突变体的最适作用pH值都为6.0,且在不同 pH条件下的相对酶活水平差别不大。
2、热稳定性分析
将上述粗酶液用pH 6.0的乙酸-乙酸钠缓冲液稀释后,在60℃处理10min、65℃处理5min后,分别测定酶活,以未处理样品的酶活为100%,计算残余酶活。结果如下表所示。
从表中的数据可以看出,与野生型相比,本发明提供的37个单点突变体的耐热性均有显著提高,60℃处理10 min后残余酶活提高了17.5-72.7%,65℃处理5 min后残余酶活提高了23.8-100.4%。从而说明上述单点突变导致葡萄糖氧化酶的耐热性得到大幅提升,比野生型更适合用作饲料添加剂,有利于葡萄糖氧化酶在饲料中的广泛应用,市场前景广阔。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 青岛蔚蓝生物集团有限公司
<120> 新型葡萄糖氧化酶突变体
<130>
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 581
<212> PRT
<213> 1
<400> 1
Gly Ile Glu Ala Ser Leu Leu Thr Asp Pro Lys Asp Val Ser Gly Arg
1 5 10 15
Thr Val Asp Tyr Ile Ile Ala Gly Gly Gly Leu Thr Gly Leu Thr Thr
20 25 30
Ala Ala Arg Leu Thr Glu Asn Pro Asn Ile Ser Val Leu Val Ile Glu
35 40 45
Ser Gly Ser Tyr Glu Ser Asp Arg Gly Pro Ile Ile Glu Asp Leu Asn
50 55 60
Ala Tyr Gly Asp Ile Phe Gly Ser Ser Val Asp His Ala Tyr Glu Thr
65 70 75 80
Val Glu Leu Ala Thr Asn Asn Gln Thr Ala Leu Ile Arg Ser Gly Asn
85 90 95
Gly Leu Gly Gly Ser Thr Leu Val Asn Gly Gly Thr Trp Thr Arg Pro
100 105 110
His Lys Ala Gln Val Asp Ser Trp Glu Thr Val Phe Gly Asn Glu Gly
115 120 125
Trp Asn Trp Asp Asn Val Ala Ala Tyr Ser Leu Gln Ala Glu Arg Ala
130 135 140
Arg Ala Pro Asn Ala Lys Gln Ile Ala Ala Gly His Tyr Phe Asn Ala
145 150 155 160
Ser Cys His Gly Val Asn Gly Thr Val His Ala Gly Pro Arg Asp Thr
165 170 175
Gly Asp Asp Tyr Ser Pro Ile Val Lys Ala Leu Met Ser Ala Val Glu
180 185 190
Asp Arg Gly Val Pro Thr Lys Lys Asp Phe Gly Cys Gly Asp Pro His
195 200 205
Gly Val Ser Met Phe Pro Asn Thr Leu His Glu Asp Gln Val Arg Ser
210 215 220
Asp Ala Ala Arg Glu Trp Leu Leu Pro Asn Tyr Gln Arg Pro Asn Leu
225 230 235 240
Gln Val Leu Thr Gly Gln Tyr Val Gly Lys Val Leu Leu Ser Gln Asn
245 250 255
Gly Thr Thr Pro Arg Ala Val Gly Val Glu Phe Gly Thr His Lys Gly
260 265 270
Asn Thr His Asn Val Tyr Ala Lys His Glu Val Leu Leu Ala Ala Gly
275 280 285
Ser Ala Val Ser Pro Thr Ile Leu Glu Tyr Ser Gly Ile Gly Met Lys
290 295 300
Ser Ile Leu Glu Pro Leu Gly Ile Asp Thr Val Val Asp Leu Pro Val
305 310 315 320
Gly Leu Asn Leu Gln Asp Gln Thr Thr Ala Thr Val Arg Ser Arg Ile
325 330 335
Thr Ser Ala Gly Ala Gly Gln Gly Gln Ala Ala Trp Phe Ala Thr Phe
340 345 350
Asn Glu Thr Phe Gly Asp Tyr Ser Glu Lys Ala His Glu Leu Leu Asn
355 360 365
Thr Lys Leu Glu Gln Trp Ala Glu Glu Ala Val Ala Arg Gly Gly Phe
370 375 380
His Asn Thr Thr Ala Leu Leu Ile Gln Tyr Glu Asn Tyr Arg Asp Trp
385 390 395 400
Ile Val Asn His Asn Val Ala Tyr Ser Glu Leu Phe Leu Asp Thr Ala
405 410 415
Gly Val Ala Ser Phe Asp Val Trp Asp Leu Leu Pro Phe Thr Arg Gly
420 425 430
Tyr Val His Ile Leu Asp Lys Asp Pro Tyr Leu His His Phe Ala Tyr
435 440 445
Asp Pro Gln Tyr Phe Leu Asn Glu Leu Asp Leu Leu Gly Gln Ala Ala
450 455 460
Ala Thr Gln Leu Ala Arg Asn Ile Ser Asn Ser Gly Ala Met Gln Thr
465 470 475 480
Tyr Phe Ala Gly Glu Thr Ile Pro Gly Asp Asn Leu Ala Tyr Asp Ala
485 490 495
Asp Leu Ser Ala Trp Thr Glu Tyr Ile Pro Tyr His Phe Arg Pro Asn
500 505 510
Tyr His Gly Val Gly Thr Cys Ser Met Met Pro Lys Glu Met Gly Gly
515 520 525
Val Val Asp Asn Ala Ala Arg Val Tyr Gly Val Gln Gly Leu Arg Val
530 535 540
Ile Asp Gly Ser Ile Pro Pro Thr Gln Met Ser Ser His Val Met Thr
545 550 555 560
Val Phe Tyr Ala Met Ala Leu Lys Ile Ser Asp Ala Ile Leu Glu Asp
565 570 575
Tyr Ala Ser Met Gln
580
<210> 2
<211> 1746
<212> DNA
<213> 2
<400> 2
ggtattgagg catctttgtt gacagaccct aaggatgttt ctggaagaac cgttgactac 60
attattgctg gtggtggttt gaccggattg accactgccg caagattgac tgaaaatcca 120
aacatctctg ttttggtcat cgagtctggt tcttacgaat ctgacagagg acctattatc 180
gaagacttga acgcttacgg tgatattttc ggatcttctg ttgatcatgc ctacgagaca 240
gttgagttgg ctactaacaa tcagactgct ttgattaggt ctggaaatgg tttgggtgga 300
tctactttgg ttaatggagg tacttggact agaccacata aggctcaggt tgattcttgg 360
gaaactgttt ttggtaacga aggttggaac tgggataacg ttgcagctta ctctttgcaa 420
gcagaaagag ctagggctcc aaacgctaag caaattgctg ctggtcatta ctttaacgct 480
tcttgtcacg gtgttaacgg aactgtccac gccggaccta gagacactgg agatgattac 540
tctccaattg tcaaggcatt gatgtctgct gttgaagata gaggagtccc aaccaagaag 600
gatttcggtt gtggtgatcc acatggtgtt tctatgttcc caaatacatt gcacgaagat 660
caagttaggt ctgacgctgc tagagaatgg ttgttgccaa attatcaaag accaaacttg 720
caggtcttga ctggtcagta cgtcggtaag gttttgttgt ctcaaaacgg tactactcca 780
agagctgtcg gtgtcgagtt cggtactcat aagggtaata ctcacaacgt ttacgctaag 840
catgaagttt tgttggctgc tggttctgct gtttctccaa ccatcttgga gtattctgga 900
attggtatga agtctatttt ggaaccattg ggtattgata ctgtcgttga tttgccagtt 960
ggtttgaact tgcaggatca gactacagcc actgtcagat ccagaattac ttctgctggt 1020
gctggtcaag gtcaggctgc atggtttgct acttttaacg aaacttttgg tgattactct 1080
gaaaaggctc atgaattgtt gaacactaag ttggaacaat gggctgaaga agctgttgct 1140
agaggtggtt ttcataatac tactgctttg ttgattcaat acgaaaacta cagagactgg 1200
attgttaacc ataacgttgc ctattctgag ttgtttttgg acaccgctgg tgttgcttct 1260
tttgatgttt gggatttgtt gccatttaca agaggttacg ttcacatttt ggataaagat 1320
ccatacttgc atcactttgc atacgatcca caatactttt tgaacgaatt ggacttgttg 1380
ggtcaagctg ctgctactca attggctaga aacatttcta actctggtgc aatgcaaact 1440
tactttgccg gtgaaactat cccaggagat aacttggctt acgatgctga tttgtctgct 1500
tggactgaat acattccata ccatttcaga ccaaactacc acggtgtcgg tacttgttct 1560
atgatgccaa aggaaatggg aggtgttgtc gataacgctg caagagtcta cggagttcaa 1620
ggtttgagag ttattgatgg ttctattcca ccaactcaaa tgtcttctca tgttatgact 1680
gttttttacg ctatggcttt gaagatttct gatgctatct tggaagatta cgcttctatg 1740
caataa 1746