CN107988177B

CN107988177B - 葡萄糖氧化酶突变体

Info

Publication number: CN107988177B
Application number: CN201610949305.6A
Authority: CN
Inventors: 吴秀秀; 唐波; 邵弨
Original assignee: Wuxi Weilan Biotechnology Co ltd; Weifang Kdn Biotech Co ltd; Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Current assignee: WEIFANG KDN BIOTECH Co.,Ltd.; Wuxi Weilan Biotechnology Co.,Ltd.; Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Priority date: 2016-10-26
Filing date: 2016-10-26
Publication date: 2021-08-20
Anticipated expiration: 2036-10-26
Also published as: CN107988177A

Abstract

本发明的目的是提供一种葡萄糖氧化酶突变体，其具有：(Ⅰ)与葡萄糖氧化酶的氨基酸序列SEQ ID NO:1具有至少70％同源性的序列；(Ⅱ)具有所述(Ⅰ)中所述的葡萄糖氧化酶的至少一个免疫表位，且所述葡萄糖氧化酶的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列；所述取代为取代1个或2个氨基酸。本发明提供的葡萄糖氧化酶单点突变体的耐热性普遍高于野生型，而且两点突变体，与对应单点突变体相比，其耐热性又得到进一步提升，在60℃处理10min后残余酶活达到71.19％～82.92％，在65℃处理5min后残余酶活达到63.03％～72.58％，70℃处理2.5min后残余酶活达到49.91％～58.96％，75℃处理2.5min后残余酶活达到24.78％～32.05％。

Description

葡萄糖氧化酶突变体

技术领域

本发明属于基因改造技术领域，具体涉及一种葡萄糖氧化酶突变体及其应用。

背景技术

葡萄糖氧化酶是一种需氧脱氢酶，能专一地氧化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢。葡萄糖氧化酶通常与过氧化氢酶组成一个氧化还原系统，在分子氧存在下氧化β-D-葡萄糖生成D-葡萄糖酸内酯，同时消耗氧生成过氧化氢。过氧化氢酶将过氧化氢分解生成水和1/2氧，而后水又与葡萄糖酸内酯结合产生葡萄糖酸。葡萄糖氧化酶对β-D-吡喃葡萄糖表现出强烈的特异性，葡萄糖分子C1上的羟基对酶的催化活性至关重要，且羟基处于β位时要比在α位时高160倍。葡萄糖氧化酶对L-葡萄糖和2-O-甲基-D-葡萄糖完全没有活性。

由于葡萄糖氧化酶的除氧和抗氧化作用，使其在食品、医药、饲料等方面应用非常广泛。在食品工业中，葡萄糖氧化酶作为一种食品保鲜剂，在防止啤酒老化、保持产品原有风味、延长保质期方面有显著效果，还可作为面粉改良剂和面包品质改良剂提高食品质量。在医药领域，我国医院普遍采用葡萄糖氧化酶电极法、葡萄糖氧化酶-过氧化物酶偶联法等检测血液、血清中葡萄糖含量。作为一种新型的饲料添加剂，葡萄糖氧化酶能够改善动物肠道环境，调节饲粮消化，促进动物生长。

葡萄糖氧化酶广泛分布于动物、植物及微生物体内，工业上主要利用黑曲霉菌或青霉菌进行生产，但是常出现酶活力不高、稳定性差、杂蛋白污染以及分离纯化繁琐等问题。因为目前在颗粒生产过程中有一个短暂的80～90℃的高温阶段。而黑曲霉来源的葡萄糖氧化酶热稳定性较差，其水溶液在65℃下保温5分钟剩余酶活性低于40％，使该酶在颗粒饲料的应用受到限制。目前采用饲料制粒后将葡萄糖氧化酶液体喷涂到饲料上的方法不仅增加设备投入，而且无法保证酶制剂的稳定性以及酶制剂在饲料中的分布均一性。因此，提高葡萄糖氧化酶热稳定性对目前饲料用葡萄糖氧化酶具有重要的现实意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种葡萄糖氧化酶突变体，其耐热性得到显著提高，有利于其在饲料领域的广泛应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种葡萄糖氧化酶突变体，其具有(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)所示的氨基酸序列中任意一个：

(Ⅰ)与葡萄糖氧化酶的氨基酸序列SEQ ID NO:1具有至少70％同源性的序列；

(Ⅱ)具有所述(Ⅰ)中所述的葡萄糖氧化酶的至少一个免疫表位，且所述葡萄糖氧化酶的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列；

(Ⅲ)由如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列或其互补序列或因遗传密码的简并性而与如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列或其互补序列的核苷酸序列不同的序列编码的氨基酸序列；

在本发明的另一些实施例中，所述取代为取代1个或2个氨基酸。

在本发明的一些实施例中，所述的葡萄糖氧化酶突变体为与序列为SEQ ID NO:1的葡萄糖氧化酶具有75％以上同源性的酶；

在本发明的另一些实施例中，所述的葡萄糖氧化酶突变体为与序列为SEQ ID NO:1的葡萄糖氧化酶具有80％以上同源性的酶；

在本发明的另一些实施例中，所述的葡萄糖氧化酶突变体为与序列为SEQ ID NO:1的葡萄糖氧化酶具有85％以上同源性的酶；

在本发明的另一些实施例中，所述的葡萄糖氧化酶突变体为与序列为SEQ ID NO:1的葡萄糖氧化酶具有90％以上同源性的酶；

在本发明的另一些实施例中，所述的葡萄糖氧化酶突变体为与序列为SEQ ID NO:1的葡萄糖氧化酶具有95％以上同源性的酶；

在本发明的一些实施例中，所述修饰包括酰胺化、磷酸化、甲基化、乙酰化、泛素化、糖基化或羰基化。

在本发明的一些实施例中，所述葡萄糖氧化酶具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，编码所述葡萄糖氧化酶的核苷酸序列之一如SEQ ID NO:2所示。

在本发明的另一些实施例中，所述取代包括氨基酸序列为SEQ ID NO:1的葡萄糖氧化酶的第65位氨基酸发生了取代。

在本发明的另一些实施例中，所述取代包括第65位氨基酸由A变为R，或由A变为L，或由A变为K，或由A变为M，或由A变为F，或由A变为N，或由A变为Q。

编码上述第65位氨基酸发生了取代的葡萄糖氧化酶突变体的DNA分子，其具有如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列。

在本发明的另一些实施例中，所述取代包括氨基酸序列为SEQ ID NO:1的葡萄糖氧化酶的第416位氨基酸发生了取代。

在本发明的另一些实施例中，所述取代包括第416位氨基酸由A变为K，或由A变为R，或由A变为N。

编码上述第416位氨基酸发生了取代的葡萄糖氧化酶突变体的DNA分子，其具有如SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列。

在本发明的另一些实施例中，所述取代包括氨基酸序列为SEQ ID NO:1的葡萄糖氧化酶的第65位和第416位氨基酸同时发生了取代。

在本发明的另一些实施例中，所述取代包括第65位氨基酸由A变为R,第416位氨基酸由A变为K；或是第65位氨基酸由A变为R，第416位氨基酸由A变为R；或是第65位氨基酸由A变为R，第416位氨基酸由A变为N；或是第65位氨基酸由A变为L，第416位氨基酸由A变为K；或是第65位氨基酸由A变为L，第416位氨基酸由A变为R；或是第65位氨基酸由A变为L，第416位氨基酸由A变为N；或是第65位氨基酸由A变为K，第416位氨基酸由A变为K；或是第65位氨基酸由A变为K，第416位氨基酸由A变为R；或是第65位氨基酸由A变为K，第416位氨基酸由A变为N；或是第65位氨基酸由A变为M，第416位氨基酸由A变为K；或是第65位氨基酸由A变为M，第416位氨基酸由A变为R；或是第65位氨基酸由A变为M，第416位氨基酸由A变为N；或是第65位氨基酸由A变为F，第416位氨基酸由A变为K；或是第65位氨基酸由A变为F，第416位氨基酸由A变为R；或是第65位氨基酸由A变为F，第416位氨基酸由A变为N；或是第65位氨基酸由A变为N，第416位氨基酸由A变为K；或是第65位氨基酸由A变为N，第416位氨基酸由A变为R；或是第65位氨基酸由A变为N，第416位氨基酸由A变为N；或是第65位氨基酸由A变为Q，第416位氨基酸由A变为K；或是第65位氨基酸由A变为Q，第416位氨基酸由A变为R；或是第65位氨基酸由A变为Q，第416位氨基酸由A变为N。

在本发明的进一步优选实施例中，所述取代包括第65位氨基酸由A变为R，第416位氨基酸由A变为K；或是第65位氨基酸由A变为R，第416位氨基酸由A变为R；或是第65位氨基酸由A变为L，第416位氨基酸由A变为K；或是第65位氨基酸由A变为L，第416位氨基酸由A变为R。

编码上述第65位和第416位氨基酸同时发生了取代的葡萄糖氧化酶突变体的DNA分子，其具有如SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16所示的核苷酸序列。

本发明还提供了上述葡萄糖氧化酶突变体在饲料中的应用。

本发明还提供了具有上述DNA分子的重组表达载体。

本发明还提供了一种宿主细胞，包含上述重组表达载体。

在本发明的一些实施例中，宿主细胞为毕赤酵母。

本发明提供的葡萄糖氧化酶单点突变体的耐热性普遍高于野生型，在60℃处理10min后残余酶活达到51.79％～67.64％，在65℃处理5min后残余酶活达到35.63％～53.90％，70℃处理2.5min后残余酶活达到17.6％～34.96％。本发明提供的葡萄糖氧化酶两点突变体，与对应单点突变体相比，其耐热性又得到进一步提升，在60℃处理10min后残余酶活达到71.19％～82.92％，在65℃处理5min后残余酶活达到63.03％～72.58％，70℃处理2.5min后残余酶活达到49.91％～58.96％，75℃处理2.5min后残余酶活达到24.78％～32.05％。从以上结果可以说明突变导致葡萄糖氧化酶的耐热性得到大幅提升，比野生型更适合在工业生产中的应用，因而市场前景广阔。

具体实施方式：

本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,3nd Ed.(Sambrook,2001)和CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(Ausubel,2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本发明所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本发明具体实施例的限定。

其中A、R、L、K、M、F、N、Q分别是氨基酸Ala，Arg，Leu，Lys，Met，Phe，Asn，Gln的缩写。

本发明具体实施例所使用的实验材料和试剂如下：

菌株与载体：大肠杆菌DH5α、毕赤酵母GS115、载体pPIC9K、Amp、G418购自Invitrogen公司。

酶与试剂盒：PCR酶及连接酶购买自Takara公司，限制性内切酶购自Fermentas公司，质粒提取试剂盒及胶纯化回收试剂盒购自Omega公司，GeneMorph II随机诱变试剂盒购自北京博迈斯生物科技有限公司。

培养基配方：

大肠杆菌培养基(LB培养基)：0.5％酵母提取物，1％蛋白胨，1％NaCl，pH7.0)；

LB-AMP培养基：LB培养基加100μg/mL氨苄青霉素；

酵母培养基(YPD培养基)：1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖；

酵母筛选培养基(MD培养基)：2％葡萄糖，2％琼脂糖，1.34％YNB，4×10^-5生物素；

BMGY培养基：2％蛋白胨，1％酵母提取物，100mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34％YNB，4×10^-5生物素，1％甘油；

BMMY培养基：2％蛋白胨，1％酵母提取物，100mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34％YNB，4×10^-5生物素，0.5％甲醇。

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1葡萄糖氧化酶耐热单点突变体的获得

1.1葡萄糖氧化酶基因的扩增

以黑曲霉(Aspergillus niger)基因组为模板进行PCR扩增，PCR引物GOD-F1、GOD-R1如下：

GOD-F1：GGTATTGAGGCATCTTTGTTGAC

GOD-R1：TTATTGCATAGAAGCGTAATC

胶回收PCR产物，连接pEASY-T载体，转化至大肠杆菌DH5α中，挑取正确的转化子进行测序。测序结果显示，扩增得到的基因片段的核苷酸序列为SEQ ID NO：2，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。通过NCBI BLAST比对发现，SEQ ID NO：1与来源于黑曲霉的葡萄糖氧化酶序列相似性高达100％，从而确定通过PCR获得的基因为葡萄糖氧化酶基因，命名为GOD。

1.2葡萄糖氧化酶突变体基因的扩增及合成

为了提高上述葡萄糖氧化酶GOD的耐热性，申请人通过定向进化技术对该酶进行了大量突变的筛选，设计PCR引物GOD-F2、GOD-R2如下：

GOD-F2：GGCGAATTCGGTATTGAGGCATCTTTGTTGAC(下划线为限制性内切酶EcoRI识别位点)

GOD-R2：ATAGCGGCCGCTTATTGCATAGAAGCGTAATC(下划线为限制性内切酶Not I识别位点)

以GOD基因为模板，以上述引物用GeneMorph II随机突变PCR试剂盒(Stratagene)进行PCR扩增，胶回收PCR产物，EcoRI、Not I进行酶切处理后与经同样酶切后的pET21a载体连接，转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布于LB+Amp平板，37℃倒置培养，待转化子出现后，用牙签逐个挑至96孔板，每个孔中加入150ul含有0.1mM IPTG的LB+Amp培养基，37℃220rpm培养6h左右，离心弃上清，菌体用缓冲液重悬，反复冻融破壁，获得含有葡萄糖氧化酶的大肠杆菌细胞裂解液。

分别取出10μL裂解液至两块新的96孔板，其中一块于70℃处理5min后，两块96孔板都加入40μL底物，于30℃反应30min后，DNS法测定生成的还原糖，计算高温处理的酶液相比于未处理酶液的相对酶活。实验结果表明，有些突变对葡萄糖氧化酶GOD的耐热性没有影响，有些突变甚至使其耐热性或酶活变得更差了；另外还有些突变，虽然能提高葡萄糖氧化酶对温度的耐受性，但突变后其酶学性质发生了显著的变化，这些均不符合要求。最终，申请人筛选到既能显著提高葡萄糖氧化酶GOD的耐热性，又不会影响其酶活及原有酶学性质的突变位点及位点的组合：A65R单点突变，A416K单点突变。

将含A65R单点突变的葡萄糖氧化酶突变体命名为GOD1，其编码核苷酸序列为SEQID NO：3；含A416K单点突变的葡萄糖氧化酶突变体命名为为GOD2，其编码核苷酸序列为SEQID NO：4。

用引物GOD-F2、GOD-R2对上述两个突变体分别进行PCR扩增，引物两端引入EcoRI、Not I位点。PCR反应条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸1min，30个循环后，72℃保温10min。琼脂糖凝胶电泳结果显示，GOD1、GOD2基因均为大小1800bp左右的片段。

通过上述同样的PCR方法扩增得到野生型葡萄糖氧化酶GOD的基因片段。

1.3毕赤酵母工程菌株的构建

将上述克隆得到的葡萄糖氧化酶突变体基因GOD1和GOD2，通过EcoRI和NotI位点与表达载体pPIC9K相连接，构建表达载体pPIC9K-GOD1和pPIC9K-GOD2。

将表达载体pPIC9K-GOD1和pPIC9K-GOD2用Sal I进行线性化，表达载体线性化片段通过电穿孔法转化毕赤酵母GS115，在MD平板上分别筛选得到毕赤酵母重组菌株GS115/pPIC9K-GOD1和GS115/pPIC9K-GOD2，然后分别在含不同浓度遗传霉素的YPD平板上筛选多拷贝的转化子。

将筛选得到的单点突变体的转化子分别命名为毕赤酵母GOD1(Pichia pastorisGOD1)和毕赤酵母GOD2(Pichia pastoris GOD2)，分别转接于BMGY培养基中，30℃、250rpm振荡培养1d；再转入BMMY培养基中，30℃、250rpm振荡培养；每天添加0.5％的甲醇，诱导表达4d；离心去除菌体，分别得到含葡萄糖氧化酶GOD1和GOD2的发酵上清液；将其进行SDS-PAGE电泳检测分析。结果显示，发酵上清液中葡萄糖氧化酶突变体GOD1和GOD2的分子量大小约为64kDa，与理论分子量大小相同。

通过上述同样的酶切连接方法将野生型葡萄糖氧化酶基因GOD克隆到毕赤酵母GS115宿主中，构建得到重组表达野生型葡萄糖氧化酶的毕赤酵母工程菌，命名为毕赤酵母GOD(Pichia pastoris GOD)。摇瓶水平发酵毕赤酵母GOD，30℃、250rpm振荡培养；每天添加0.5％的甲醇，诱导表达4d；离心去除菌体，得到含野生型葡萄糖氧化酶GOD的发酵上清液。

(1)葡萄糖氧化酶酶活单位的定义

在pH6.0，30℃条件下，每分钟能把1μmol的β-D-葡萄糖氧化为D-葡萄糖酸和过氧化氢所需要的酶量，定义为1个酶活力单位(IU)。

(2)酶活测定方法

将粗酶液直接用缓冲液稀释至约10U/mL。取4支150*15的试管，加入2ml缓冲液、0.3ml葡萄糖、0.4ml苯酚、0.1ml 4-氨基安替吡啉、0.1ml辣根过氧化物酶，30℃预热5min。向其中一管加入0.1ml蒸馏水，作为空白调零。水浴锅放在分光光度计旁以方便操作，向样品管中加入0.1ml样品溶液，此时开始计时，涡旋混匀后立即在500nm波长处用1cm比色杯比色。读取0.5min时吸光度值为A0，再反应1min后，读取吸光度值A1，得出ΔA500＝A1-A0。

酶活计算公式：

试样中酶活力X1(U/mL或U/g)按照如下公式计算：

X1＝ΔA500×f×B×1000/(887×t×A×d)＝33.82×ΔA500×f

式中：

f---------------------酶液稀释倍数

B--------------------反应液体积(3ml)

1000----------------消光系数单位转换系数

887-----------------消光系数(L·mol-1·cm-1)

t---------------------反应时间(min)，即读数A1与A0之间的时间差值1min。

A--------------------加入样品体积(0.1ml)

d--------------------比色皿的厚度(cm)

(3)酶活测定结果

按照上述方法进行发酵上清液的酶活测定，结果显示：重组表达野生型葡萄糖氧化酶的毕赤酵母GOD发酵上清液的酶活为105U/ml，而重组表达葡萄糖氧化酶突变体的毕赤酵母GOD1和毕赤酵母GOD2发酵上清液的酶活分别达到100U/mL和121U/mL。

1.4发酵验证

在10升发酵罐上分别进行毕赤酵母GOD、毕赤酵母GOD1和毕赤酵母GOD2的发酵，发酵使用的培养基配方为：硫酸钙1.1g/L、磷酸二氢钾5.5g/L、磷酸二氢铵55g/L、硫酸钾20.3g/L、硫酸镁16.4g/L、氢氧化钾1.65g/L、消泡剂0.05％。

发酵工艺：pH值5.0、温度30℃、搅拌速率300rpm、通风量1.0-1.5(v/v)、溶氧控制在20％以上。

整个发酵过程分为三个阶段：第一阶段为菌体培养阶段，按7％比例接入种子，30℃培养24-26h，以补完葡萄糖为标志；第二阶段为饥饿阶段，当葡萄糖补完之后，不流加任何碳源，当溶氧上升至80％以上表明该阶段结束，为期约30-60min；第三阶段为诱导表达阶段，流加甲醇诱导，并且保持溶氧在20％以上，培养时间在150-180h之间。发酵结束后，发酵液通过板框过滤机处理后获得粗酶液。

采用实施例1中1.3所述葡萄糖氧化酶酶活测定方法对粗酶液进行酶活检测，结果显示，重组表达野生型葡萄糖氧化酶的毕赤酵母GOD最终的发酵酶活为3050U/ml，而重组表达葡萄糖氧化酶突变体的毕赤酵母GOD1和毕赤酵母GOD2最终的发酵酶活分别达到3011U/ml，3340U/ml。

1.5葡萄糖氧化酶酶学性质测定

1、最适作用pH

采用pH值分别为2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，在30℃条件下对实施例1中1.4所述发酵粗酶液进行葡萄糖氧化酶活力测定，以最高酶活为100％，计算相对酶活，结果显示野生型葡萄糖氧化酶GOD与突变体GOD1和GOD2的最适作用pH值都为6.0，且在不同pH条件下的相对酶活水平差别不大。

2、最适反应温度

分别在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃，pH5.0条件下，对实施例1中1.4中所述粗酶液进行葡萄糖氧化酶酶活测定，以最高酶活为100％，计算相对酶活，结果显示，野生型葡萄糖氧化酶GOD1的最适作用温度为30℃；而葡萄糖氧化酶突变体GOD1和GOD2的最适作用温度为35℃。

3、热稳定性分析

将上述粗酶液用pH 6.0的乙酸-乙酸钠缓冲液稀释后，在60℃处理10min、65℃处理5min、70℃处理2.5min后，测定酶活，以未处理样品的酶活为100％，计算残余酶活。结果所示，葡萄糖氧化酶突变体GOD1和GOD2的残余酶活均显著高于野生型。其中，野生型葡萄糖氧化酶GOD在60℃处理10min后残余酶活为40.19％，在65℃处理5min后残余酶活剩22.04％，70℃处理2.5min后酶活仅剩9.89％；而葡萄糖氧化酶突变体GOD1在60℃处理10min后残余酶活为69.32％，在65℃处理5min后残余酶活为58.86％，70℃处理2.5min后残余酶活为39.96％；葡萄糖氧化酶突变体GOD2在60℃处理10min后残余酶活为60.04％，在65℃处理5min后残余酶活为39.34％，70℃处理2.5min后残余酶活为27.67％，从以上结果可以说明突变导致葡萄糖氧化酶的耐热性得到大幅提升，比野生型更适合在工业生产中的应用，因而市场前景广阔。

实施例2葡萄糖氧化酶耐热单点突变体的饱和突变筛选

采用实施例1中所述筛选并获得耐热突变体的方法，对葡萄糖氧化酶GOD的第65位和第416位氨基酸分别进行饱和位点突变。进一步，对获得的突变体分别进行热稳定性实验。

结果显示：当葡萄糖氧化酶GOD的第65位氨基酸由A突变为L，或K，或M，或F，或N，或Q时，均表现出比野生型更好的耐热性,将上述突变体分别命名为GOD3，GOD4，GOD5，GOD6，GOD7，GOD8，其编码核苷酸序列分别为SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ IDNO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10；

当葡萄糖氧化酶GOD的第416位氨基酸由A突变为R或N时，均表现出比野生型更好的耐热性，将上述突变体分别命名为GOD9和GOD10，其编码核苷酸序列分别为SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12。

上述葡萄糖氧化酶突变体具体的耐热性能见表1。

表1葡萄糖氧化酶突变体耐热性分析

实施例3葡萄糖氧化酶耐热两点组合突变体的获得

采用实施例1中所述筛选并获得突变体的方法，对葡萄糖氧化酶GOD的第65位和第416位耐热位点进行突变组合筛选。进一步，对获得的突变体分别进行热稳定性实验。

结果显示：耐热性比上述单点突变体更好的两点突变组合包括：A65R+A416K，或A65R+A416R，或A65R+A416N，或A65L+A416K，或A65L+A416R，或A65L+A416N，或A65K+A416K，或A65K+A416R，或A65K+A416N，或A65M+A416K，或A65M+A416R，或A65M+A416N，或A65F+A416K，或A65F+A416R，或A65F+A416N，或A65N+A416K，或A65N+A416R，或A65N+A416N，或A65Q+A416K，或A65Q+A416R，或A65Q+A416N。

所述两点突变体的葡萄糖氧化酶酶活残留率比上述单点突变体普遍提高了30％～235％。而其中耐热性最强的两点突变组合包括：A65R+A416K，或A65R+A416R，或A65L+A416K，或A65L+A416R。将所述四个两点突变体分别命名为GOD11，GOD12，GOD13，GOD14，其编码核苷酸序列分别为SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16。

所述葡萄糖氧化酶突变体具体的耐热性能见表2。

表2葡萄糖氧化酶突变体耐热性分析

综上所述，与野生型相比，本发明筛选获得的葡萄糖氧化酶突变体具有更强的耐热性，更适合用作饲料添加剂，有利于葡萄糖氧化酶在饲料中的广泛应用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 青岛蔚蓝生物集团有限公司

<120> 葡萄糖氧化酶突变体

<130>

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 581

<212> PRT

<213> 1

<400> 1

Gly Ile Glu Ala Ser Leu Leu Thr Asp Pro Lys Asp Val Ser Gly Arg

1 5 10 15

Thr Val Asp Tyr Ile Ile Ala Gly Gly Gly Leu Thr Gly Leu Thr Thr

20 25 30

Ala Ala Arg Leu Thr Glu Asn Pro Asn Ile Ser Val Leu Val Ile Glu

35 40 45

Ser Gly Ser Tyr Glu Ser Asp Arg Gly Pro Ile Ile Glu Asp Leu Asn

50 55 60

Ala Tyr Gly Asp Ile Phe Gly Ser Ser Val Asp His Ala Tyr Glu Thr

65 70 75 80

Val Glu Leu Ala Thr Asn Asn Gln Thr Ala Leu Ile Arg Ser Gly Asn

85 90 95

Gly Leu Gly Gly Ser Thr Leu Val Asn Gly Gly Thr Trp Thr Arg Pro

100 105 110

His Lys Ala Gln Val Asp Ser Trp Glu Thr Val Phe Gly Asn Glu Gly

115 120 125

Trp Asn Trp Asp Asn Val Ala Ala Tyr Ser Leu Gln Ala Glu Arg Ala

130 135 140

Arg Ala Pro Asn Ala Lys Gln Ile Ala Ala Gly His Tyr Phe Asn Ala

145 150 155 160

Ser Cys His Gly Val Asn Gly Thr Val His Ala Gly Pro Arg Asp Thr

165 170 175

Gly Asp Asp Tyr Ser Pro Ile Val Lys Ala Leu Met Ser Ala Val Glu

180 185 190

Asp Arg Gly Val Pro Thr Lys Lys Asp Phe Gly Cys Gly Asp Pro His

195 200 205

Gly Val Ser Met Phe Pro Asn Thr Leu His Glu Asp Gln Val Arg Ser

210 215 220

Asp Ala Ala Arg Glu Trp Leu Leu Pro Asn Tyr Gln Arg Pro Asn Leu

225 230 235 240

Gln Val Leu Thr Gly Gln Tyr Val Gly Lys Val Leu Leu Ser Gln Asn

245 250 255

Gly Thr Thr Pro Arg Ala Val Gly Val Glu Phe Gly Thr His Lys Gly

260 265 270

Asn Thr His Asn Val Tyr Ala Lys His Glu Val Leu Leu Ala Ala Gly

275 280 285

Ser Ala Val Ser Pro Thr Ile Leu Glu Tyr Ser Gly Ile Gly Met Lys

290 295 300

Ser Ile Leu Glu Pro Leu Gly Ile Asp Thr Val Val Asp Leu Pro Val

305 310 315 320

Gly Leu Asn Leu Gln Asp Gln Thr Thr Ala Thr Val Arg Ser Arg Ile

325 330 335

Thr Ser Ala Gly Ala Gly Gln Gly Gln Ala Ala Trp Phe Ala Thr Phe

340 345 350

Asn Glu Thr Phe Gly Asp Tyr Ser Glu Lys Ala His Glu Leu Leu Asn

355 360 365

Thr Lys Leu Glu Gln Trp Ala Glu Glu Ala Val Ala Arg Gly Gly Phe

370 375 380

His Asn Thr Thr Ala Leu Leu Ile Gln Tyr Glu Asn Tyr Arg Asp Trp

385 390 395 400

Ile Val Asn His Asn Val Ala Tyr Ser Glu Leu Phe Leu Asp Thr Ala

405 410 415

Gly Val Ala Ser Phe Asp Val Trp Asp Leu Leu Pro Phe Thr Arg Gly

420 425 430

Tyr Val His Ile Leu Asp Lys Asp Pro Tyr Leu His His Phe Ala Tyr

435 440 445

Asp Pro Gln Tyr Phe Leu Asn Glu Leu Asp Leu Leu Gly Gln Ala Ala

450 455 460

Ala Thr Gln Leu Ala Arg Asn Ile Ser Asn Ser Gly Ala Met Gln Thr

465 470 475 480

Tyr Phe Ala Gly Glu Thr Ile Pro Gly Asp Asn Leu Ala Tyr Asp Ala

485 490 495

Asp Leu Ser Ala Trp Thr Glu Tyr Ile Pro Tyr His Phe Arg Pro Asn

500 505 510

Tyr His Gly Val Gly Thr Cys Ser Met Met Pro Lys Glu Met Gly Gly

515 520 525

Val Val Asp Asn Ala Ala Arg Val Tyr Gly Val Gln Gly Leu Arg Val

530 535 540

Ile Asp Gly Ser Ile Pro Pro Thr Gln Met Ser Ser His Val Met Thr

545 550 555 560

Val Phe Tyr Ala Met Ala Leu Lys Ile Ser Asp Ala Ile Leu Glu Asp

565 570 575

Tyr Ala Ser Met Gln

580

<210> 2

<211> 1746

<212> DNA

<213> 2

<400> 2

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caataa 1746

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<212> DNA

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caataa 1746

<210> 4

<211> 1746

<212> DNA

<213> 4

<400> 4

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gaaaaggctc atgaattgtt gaacactaag ttggaacaat gggctgaaga agctgttgct 1140

agaggtggtt ttcataatac tactgctttg ttgattcaat acgaaaacta cagagactgg 1200

attgttaacc ataacgttgc ctattctgag ttgtttttgg acaccagagg tgttgcttct 1260

tttgatgttt gggatttgtt gccatttaca agaggttacg ttcacatttt ggataaagat 1320

ccatacttgc atcactttgc atacgatcca caatactttt tgaacgaatt ggacttgttg 1380

ggtcaagctg ctgctactca attggctaga aacatttcta actctggtgc aatgcaaact 1440

tactttgccg gtgaaactat cccaggagat aacttggctt acgatgctga tttgtctgct 1500

tggactgaat acattccata ccatttcaga ccaaactacc acggtgtcgg tacttgttct 1560

atgatgccaa aggaaatggg aggtgttgtc gataacgctg caagagtcta cggagttcaa 1620

ggtttgagag ttattgatgg ttctattcca ccaactcaaa tgtcttctca tgttatgact 1680

gttttttacg ctatggcttt gaagatttct gatgctatct tggaagatta cgcttctatg 1740

caataa 1746

Claims

1.一种葡萄糖氧化酶突变体，其特征在于，所述的葡萄糖氧化酶突变体是氨基酸序列为SEQ ID NO:1的葡萄糖氧化酶的第65位的氨基酸被取代；所述的取代为第65位氨基酸由A变为R，或由A变为L，或由A变为K，或由A变为M，或由A变为F，或由A变为N，或由A变为Q。

2.如权利要求1所述的葡萄糖氧化酶突变体，其特征在于，所述的葡萄糖氧化酶突变体是氨基酸序列为SEQ ID NO:1的葡萄糖氧化酶的第416位氨基酸发生了取代；所述的取代为第416位氨基酸由A变为K，或由A变为R，或由A变为N。

3.如权利要求1所述的葡萄糖氧化酶突变体，其特征在于，所述的葡萄糖氧化酶突变体是氨基酸序列为SEQ ID NO:1的葡萄糖氧化酶的第65位和第416位的氨基酸被取代；所述的取代为第65位氨基酸由A变为R,第416位氨基酸由A变为K；或是第65位氨基酸由A变为R，第416位氨基酸由A变为R；或是第65位氨基酸由A变为R，第416位氨基酸由A变为N；或是第65位氨基酸由A变为L，第416位氨基酸由A变为K；或是第65位氨基酸由A变为L，第416位氨基酸由A变为R；或是第65位氨基酸由A变为L，第416位氨基酸由A变为N；或是第65位氨基酸由A变为K，第416位氨基酸由A变为K；或是第65位氨基酸由A变为K，第416位氨基酸由A变为R；或是第65位氨基酸由A变为K，第416位氨基酸由A变为N；或是第65位氨基酸由A变为M，第416位氨基酸由A变为K；或是第65位氨基酸由A变为M，第416位氨基酸由A变为R；或是第65位氨基酸由A变为M，第416位氨基酸由A变为N；或是第65位氨基酸由A变为F，第416位氨基酸由A变为K；或是第65位氨基酸由A变为F，第416位氨基酸由A变为R；或是第65位氨基酸由A变为F，第416位氨基酸由A变为N；或是第65位氨基酸由A变为N，第416位氨基酸由A变为K；或是第65位氨基酸由A变为N，第416位氨基酸由A变为R；或是第65位氨基酸由A变为N，第416位氨基酸由A变为N；或是第65位氨基酸由A变为Q，第416位氨基酸由A变为K；或是第65位氨基酸由A变为Q，第416位氨基酸由A变为R；或是第65位氨基酸由A变为Q，第416位氨基酸由A变为N。

4.如权利要求3所述的葡萄糖氧化酶突变体，其特征在于，所述的取代为第65位氨基酸由A变为R，第416位氨基酸由A变为K；或是第65位氨基酸由A变为R，第416位氨基酸由A变为R；或是第65位氨基酸由A变为L，第416位氨基酸由A变为K；或是第65位氨基酸由A变为L，第416位氨基酸由A变为R。

5.编码权利要求1-4任一项所述的葡萄糖氧化酶突变体的DNA分子。

6.一种重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体携带有权利要求5所述的DNA分子。

7.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞包含有权利要求6所述的重组表达载体。

8.权利要求1-4任一项所述的葡萄糖氧化酶突变体在饲料制备中的应用。