CN112143717B - 比活力提高的葡萄糖氧化酶突变体 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的是提供一种比活力提高的葡萄糖氧化酶突变体及其应用。所述突变体包含R37K，A86P，Q90R，A162P，I167L，E221P，Q248R，S340P，A362T，S501R，M556L，I575V中任意一个或多个突变位点。所述突变体的比活力得到显著提高，从而有利于降低葡萄糖氧化酶的生产成本，促进葡萄糖氧化酶在饲料中的广泛应用。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程和蛋白质改造技术领域，具体涉及一种比活力提高的葡萄糖氧化酶突变体。
背景技术
随着抗生素在动物生产中被限制及逐步减少使用，养殖业原有的生产效益受到冲击，在养殖业走向“无抗”的发展过程中，抗生素替代品的发现及发展显得尤为重要。目前，常见抗生素替代品有酶制剂、酸化剂、益生素、寡聚糖、抗菌肽及中草药等。其中，酶制剂被认为是使用最安全的一种饲料添加剂，不同酶制剂添加于饲料中发挥不同的功效，有直接作用于大分子物质促进机体吸收的酶类，如淀粉酶、蛋白酶、植酸酶等；还有多功能酶类，不仅能促进饲料营养吸收，还具有其他生理功能，如葡萄糖氧化酶。
葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase，GOD）也叫做β-D-葡萄糖-1-氧化还原酶，是一类含有黄素腺嘌呤二核苷酸的二聚体蛋白酶，能够以分子氧为电子受体，特异性催化β-D-葡萄糖转化为葡萄糖酸，并产生H2O2。GOD消耗氧可营造厌氧环境，产生葡萄糖酸可降低胃肠道内酸性，一定量的过氧化氢既可广谱杀菌又具有抗氧化作用，具有消除肠道病原菌、解除肠道霉菌毒素中毒、改善肠道酸性消化环境、保护肠道上皮完整，并促进动物生产，从而达到代替抗生素的目的。张晓云研究表明，GOD具有促进乳酸杆菌增殖、抑制大肠杆菌增殖和提高血清白蛋白水平等功效，在日料中添加0.3%、0.4%的GOD，可显著提高产蛋鸡的生产性能和经济效益，有降低料肉比、提高饲料利用效率的作用。徐海燕等研究表明，日粮中添加GOD，可提高种鸡产蛋期产量4.4%，经济效益可观。
葡萄糖氧化酶作为第三代饲料酶的代表，广泛存在于微生物、动物和植物体内。微生物生长繁殖快、来源便捷，已经成为获取 GOD 的主要来源，包括曲霉（Aspergillus sp.）、青霉（Penicillium sp.）、酵母、细菌等。但目前国内外报道的GOD酶活普遍较低，不利于工业化生产。研究人员也在不断努力优化发酵过程和纯化步骤，提高GOD的产量，降低生产成本。此外，随着生物和其他学科技术的发展，提高GOD的异源表达水平，对酶进行修饰改善活性，扩大GOD的应用领域，也是今后的发展方向。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种葡萄糖氧化酶突变体，获得突变体蛋白，提高其比活力，从而有利于葡萄糖氧化酶在饲料领域的广泛应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明涉及一种葡萄糖氧化酶突变体，其包含与SEQ ID NO:1具有至少90%同一性的氨基酸序列，且与SEQ ID NO:1相比在选自下组中的至少一个位置上包含氨基酸的取代：37，86，90，162，167，221，248，340，362，501，556，575。
在本发明的一些实施例中，所述突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:1相比具有至少91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，或至少99%的同一性。
在一些更具体的实施例中，所述突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:1相比具有至少99.1%，99.2%，99.3%，99.4%，99.5%，99.6%，99.7%，99.8%，或至少99.9%的同一性。
在本发明的一些实施例中，所述突变体包含下组中至少一个氨基酸的取代：R37K，A86P，Q90R，A162P，I167L，E221P，Q248R，S340P，A362T，S501R，M556L，I575V。
在本发明的一些实施例中，所述突变体包含的取代或取代的组合选自下述取代和取代的组合：
R37K；
R37K / A86P；
R37K / Q90R；
R37K / A162P；
R37K / I167L；
R37K / E221P；
R37K / Q248R；
R37K / S340P；
R37K / A362T；
R37K / S501R；
R37K / M556L；
R37K / I575V；
R37K / A86P/ Q90R；
R37K / Q90R/ A162P；
R37K / Q90R/ I167L；
R37K / A162P/ E221P；
R37K / E221P/ Q248R；
R37K / Q248R/ S340P；
R37K / Q90R/ A362T；
R37K / I167L/ A362T；
R37K / A362T/ S501R；
R37K / M556L/ I575V；
R37K / A86P/ Q90R/ A162P；
R37K / Q90R/ A162P/ I167L；
R37K / Q90R/ I167L/ Q248R；
R37K / Q90R/ I167L/ A362T；
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R37K / A362T / M556L/ I575V；
R37K / A86P/ Q90R/ I167L/ A362T；
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R37K / E221P/ Q248R/ S340P / A362T / S501R/ M556L/ I575V；
A86P；
A86P / Q90R；
A86P / A162P；
A86P / I167L；
A86P / E221P；
A86P / Q248R；
A86P / S340P；
A86P / A362T；
A86P / S501R；
A86P / M556L；
A86P / I575V；
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A86P / Q90R/ I167L；
A86P / A162P / I167L；
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A86P / E221P / S340P；
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A86P / I167L/ A362T；
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A86P / A162P / I167L/ Q248R；
A86P / A162P/ E221P/ Q248R；
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A86P / Q248R/ A362T/ S501R；
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A86P / A362T/ S501R/ M556L；
A86P / S340P / M556L / I575V；
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A86P / Q248R/ S340P / A362T / S501R/ M556L/ I575V；
Q90R / A162P；
Q90R / I167L；
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Q90R / Q248R；
Q90R / S340P；
Q90R / A362T；
Q90R / S501R；
Q90R / M556L；
Q90R / I575V；
Q90R / A162P / I167L；
Q90R / I167L / Q248R；
Q90R / E221P / A362T；
Q90R / I167L/ A362T；
Q90R / A362T/ S501R；
Q90R / M556L / I575V；
Q90R / A162P / I167L/ Q248R；
Q90R / A162P/ E221P/ Q248R；
Q90R / Q248R/ A362T/ S501R；
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Q90R / A362T/ S501R/ M556L；
Q90R / S340P / M556L / I575V；
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Q90R / I167L/ A362T/ M556L/ I575V；
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Q90R / E221P/ Q248R/ S340P/ A362T/ S501R/ I575V；
A162P；
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E221P / S340P / M556L / I575V；
E221P / A362T/ S501R/ I575V；
E221P / Q248R / S501R/ M556L；
E221P / A362T/ M556L/ I575V；
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S340P；
S340P / A362T；
S340P / S501R；
S340P / M556L；
S340P / I575V；
S340P / A362T/ S501R；
S340P / M556L / I575V；
S340P / A362T/ S501R/ M556L；
S340P / A362T/ S501R/ I575V；
S340P/ S501R/ M556L/ I575V；
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Q248R/ S340P/ A362T/ S501R/ M556L；
Q248R/ S340P/A362T/ S501R/ I575V；
Q248R/ S340P/ A362T/ S501R/ I575V；
Q248R/ S340P / A362T / S501R/ M556L/ I575V；
S501R；
S501R / M556L；
S501R / I575V；
S501R/ M556L/ I575V；
A362T；
A362T/S501R / M556L；
A362T/S501R / I575V；
A362T/S501R/ M556L/ I575V；
M556L
I575V；
M556L/ I575V；
R37K/A86P/Q90R/A162P/I167L/E221P/Q248R/ S340P/ M556L；
R37K/A86P/ A162P/ E221P/Q248R/ S340P/S501R/M556L/I575V；
A86P/Q90R/A162P/I167L/E221P/Q248R/S340P/S501R/M556L；
R37K/A86P/Q90R/A162P/I167L/E221P/Q248R/S340P/A362T/S501R；
R37K/A86P/A162P/I167L/E221P/Q248R/S340P /S501R/M556L/I575V；
R37K/A86P/Q90R/A162P/I167L/E221P/Q248R/S340P/A362T/S501R/M556L；
R37K/A86P/A162P/I167L/E221P/Q248R/S340P/A362T/S501R/M556L/I575V；
A86P/Q90R/A162P/I167L/E221P/Q248R/S340P/A362T/S501R/M556L/I575V；
R37K/A86P/Q90R/A162P/I167L/E221P/Q248R/S340P/A362T/S501R/M556L/I575V。
本发明还涉及编码上述葡萄糖氧化酶突变体的DNA分子。
本发明还涉及包含上述DNA分子的重组表达载体。
本发明还涉及一种宿主细胞，包含上述重组表达载体。
将上述的质粒转入宿主细胞中，重组表达的葡萄糖氧化酶突变体的比活力得到显著提高。
在本发明的一些实施例中，宿主细胞为毕赤酵母（Pichia pastoris）。
在本发明的一些实施例中，宿主细胞为里氏木霉（Trichoderma reesei）。
本发明还提供了上述葡萄糖氧化酶突变体在饲料中的应用。
本发明还提供了上述葡萄糖氧化酶突变体的制备方法，包括：
步骤1：获取编码葡萄糖氧化酶突变体的DNA分子，所述葡萄糖氧化酶突变体包含与SEQ ID NO:1具有至少90%同一性的氨基酸序列，且与SEQ ID NO:1相比在选自下组中的至少一个位置上包含至少一种氨基酸的取代：37，86，90，162，167，221，248，340，362，501，556，575；
步骤2：将步骤1获得的所述DNA分子与表达载体融合，构建重组表达载体，转化宿主细胞；
步骤3：诱导含重组表达载体的宿主细胞表达融合蛋白，分离纯化表达的融合蛋白。
在本发明的一些实施例中，步骤1所述的葡萄糖氧化酶突变体包含下组中至少一个氨基酸的取代：R37K，A86P，Q90R，A162P，I167L，E221P，Q248R，S340P，A362T，S501R，M556L，I575V。
在本发明的一些实施例中，步骤2所述的宿主细胞为毕赤酵母（Pichia pastoris）。
在本发明的一些实施例中，步骤2所述的宿主细胞为里氏木霉（Trichoderma reesei）。
本发明以葡萄糖氧化酶GOD为基础，提供的分别含R37K、A86P、Q90R、A162P、I167L、E221P、Q248R、S340P、A362T、S501R、M556L、I575V中任意一个突变位点的单点突变体比活力普遍提高了15.3%-32.3%%；含两个或两个以上突变位点的组合突变体的比活力普遍提高了62.0%-106.4%，均显著高于上述单点突变体的比活力，取得了意料不到的技术效果。所述葡萄糖氧化酶突变体有利于降低生产成本，促进葡萄糖氧化酶在饲料中的广泛应用。
具体实施方式
本发明公开了一种葡萄糖氧化酶突变体、其制备方法及应用、编码该葡萄糖氧化酶突变体的DNA分子、载体、宿主细胞，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed. (Sambrook, 2001)和CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel, 2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本发明所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本发明具体实施例的限定。例如，本发明可选用如下实验材料和试剂：
菌株与载体：大肠杆菌DH5α、毕赤酵母GS115、载体pPIC9k、Amp、G418购自Invitrogen公司。
酶与试剂盒：PCR酶及连接酶购买自Takara公司，限制性内切酶购自Fermentas公司，质粒提取试剂盒及胶纯化回收试剂盒购自Omega公司，GeneMorph II随机诱变试剂盒购自北京博迈斯生物科技有限公司。
培养基配方：
大肠杆菌培养基（LB培养基）：0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，1%NaCL，pH7.0)；
酵母培养基（YPD培养基）：1%酵母提取物、2%蛋白胨2%葡萄糖；
酵母筛选培养基（MD培养基）：2%蛋白胨、2%琼脂糖；
BMGY培养基：2%蛋白胨，1%酵母提取物，100 mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34% YNB，4×10-5 生物素，1%甘油；
BMMY培养基：2%蛋白胨，1%酵母提取物，100 mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34% YNB，4×10-5 生物素，0.5%甲醇；
LB+Amp培养基：0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，1%NaCL，100μg/mL氨苄青霉素，pH7.0；
LB+Amp平板：0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，1%NaCL，1.5%琼脂，100μg/mL氨苄青霉素，pH7.0；
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1 高比活力葡萄糖氧化酶突变体的筛选
来源于黑曲霉（Aspergillus niger）的葡萄糖氧化酶GOD的氨基酸序列为SEQ IDNO:1，其编码核苷酸序列为SEQ ID NO:2。为了提高葡萄糖氧化酶GOD的比活力，申请人通过定向进化技术对该酶进行了大量突变的筛选，设计PCR引物GOD-F2、GOD-R2如下：
GOD-F2：GGCGAATTCGGTATTGAGGCATCTTTGTTGAC（下划线为限制性内切酶EcoRI识别位点）；
GOD-R2：ATAGCGGCCGCTTATTGCATAGAAGCGTAATC（下划线为限制性内切酶Not I识别位点）。
以GOD基因（SEQ ID NO：2）为模板，利用上述引物用GeneMorph II随机突变PCR试剂盒（Stratagene）进行PCR扩增，胶回收PCR产物，EcoRI、NotI进行酶切处理后与经同样酶切后的pET21a载体连接，转化至大肠杆菌BL21（DE3）中，涂布于LB+Amp平板，37℃倒置培养，待转化子出现后，用牙签逐个挑至96孔板，每个孔中加入150ul含有0.1mM IPTG的LB+Amp培养基，37℃ 220rpm培养6 h左右，离心弃上清，菌体用缓冲液重悬，反复冻融破壁，获得含有葡萄糖氧化酶的大肠杆菌细胞裂解液。
分别取出30 ul裂解液至两块新的96孔板；将其中一块板96孔板都加入30μL底物，于37℃反应30 min后，DNS法测定生成的还原糖，另一块板加入150μL考马斯亮蓝溶液，静置10min，考马斯亮蓝（Bradford）结合法测定蛋白质含量，分别计算不同突变子酶活水平及蛋白含量。最终，申请人从两万多个转化子中筛选出能显著提高GOD比活力，又不会影响其原有酶学性质的突变位点：R37K，A86P，Q90R，A162P，I167L，E221P，Q248R，S340P，A362T，S501R，M556L，I575V。
在上述葡萄糖氧化酶GOD的基础上，本发明提供了包含R37K，A86P，Q90R，A162P，I167L，E221P，Q248R，S340P，A362T，S501R，M556L，I575V中任意一个突变位点的单点突变体。
本发明还提供了包含R37K，A86P，Q90R，A162P，I167L，E221P，Q248R，S340P，A362T，S501R，M556L，I575V中至少2个，至少3个，至少4个，至少5个，至少6个突变位点，至少7个，至少8个，至少9个，至少10个，至少11个，至少12个突变位点的葡萄糖氧化酶突变体。
例如，R37K/A162P、R37K/S501R、A86P/E221P、A86P/Q248R、Q90R/ A362T、E221P/S501R、R37K/I167L、M556L/I575V两点突变体；R37K/M556L/I575V、A86P/A162P/E221P、A86P/S501R/I575V、E221P/S340P/A362T、Q90R/I167L/A362T、A162P/E221P/S501R、E221P/S340P/A362T三点突变体；R37K/A86P/Q90R/A162P、A86P/A162P/I167L/Q248R、A86P/Q248R/A362T/S501R、A86P/S340P/M556L/I575V、Q90R/A162P/E221P/Q248R、Q90R/I167L/S340P/A362T四点突变体；R37K/Q90R/A162P/I167L/E221P、R37K / Q90R/I167L/Q248R/S340P、Q90R/A162P/I167L/E221P/S340P、Q90R/A162P/I167L/S340P/I575V、Q90R/I167L/Q248R/S501R/M556L、A162P/E221P/S340P/S501R/M556L、A162P/E221P/A362T/S501R/M556L五点突变体；R37K/Q90R/A162P/I167L/E221P/Q248R、R37K/Q90R/I167L/A362T/M556L/I575V、A86P/A162P/I167L/E221P/Q248R/S340P、A86P/Q248R/S340P/A362T/S501R/I575V、Q90R/A162P/I167L/E221P/ Q248R/A362T、A162P/I167L/S340P/S501R/ M556L/I575V、E221P/Q248R/ S340P/ S501R/M556L/I575V六点突变体；R37K/Q90R/A162P/I167L/E221P/Q248R/S340P、R37K/I167L/Q248R/S340P/A362T/S501R/I575V、A86P/Q90R/I167L/S340P/ S501R/M556L/I575V、Q90R/I167L/E221P/Q248R/S340P/A362T/S501R、A162P/I167L/E221P/Q248R/S340P/A362T/S501R七点突变体；A162P/E221P/Q248R/S340P/A362T/S501R/M556L/I575V、R37K/Q90R/A162P/ E221P/Q248R/A362T/S501R/M556L、R37K/ I167L/E221P/Q248R/S340P/A362T/S501R/I575V八点突变体；R37K/A86P/A162P/E221P/Q248R/S340P/S501R/M556L/I575V、A86P/Q90R/A162P/I167L/E221P/Q248R/S340P/S501R/M556L九点突变体；R37K/A86P/A162P/I167L/E221P/Q248R/S340P/S501R/M556L/I575V、R37K/A86P/Q90R/A162P/I167L/E221P/Q248R/S340P/A362T/S501R十点突变体；R37K/A86P/Q90R/A162P/I167L/E221P/Q248R/S340P/A362T/S501R/M556L、R37K/A86P/A162P/I167L/E221P/Q248R/S340P/A362T/S501R/M556L/I575V、A86P/Q90R/A162P/I167L/E221P/Q248R/S340P/A362T/S501R/M556L/I575V十一点突变体；R37K/A86P/Q90R/A162P/I167L/E221P/Q248R/S340P/A362T/S501R/M556L/ I575V十二点突变体。
实施例2 葡萄糖氧化酶突变体在毕赤酵母中的表达
依照毕赤酵母的密码偏爱性分别对GOD的基因序列SEQ ID NO:2，以及上述突变体的基因序列进行优化合成，并且在合成序列5’和3’两端分别加上EcoRI和NotI两个酶切位点。
2.1表达载体的构建
将合成的GOD及其突变体的基因序列分别进行EcoRI和NotI双酶切，然后与经同样酶切后的pPIC-9K载体16℃过夜连接，并转化大肠杆菌DH5a，涂布于LB+Amp平板，37℃倒置培养，待转化子出现后，菌落PCR（反应体系：模板挑取的单克隆，rTaqDNA聚合酶 0.5μL，10×Buffer 2.0μL，dNTPs(2.5mM) 2.0μL，5’AOX引物（10M）：0.5μL，3’AOX引物：0.5μL，ddH2O14.5μL，反应程序：95℃预变性5min，30 cycles：94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 2min，72℃10min）。验证阳性克隆子，经测序验证后获得了正确的重组表达质粒。
2.2毕赤酵母工程菌株的构建
2.2.1酵母感受态制备
将毕赤酵母GS115菌株进行YPD平板活化，30℃培养48 h后接种活化的GS115单克隆于6 mL YPD液体培养基中，30℃、220 rpm，培养约12 h后转接菌液于装有30mL YPD液体培养基的三角瓶中，30℃、220 rpm培养约5h，经紫外分光光度计检测其菌体密度，待其OD600值在1.1–1.3范围后，4℃ 9000 rpm离心2 min分别收集4mL菌体至灭菌EP管中，轻轻弃上清，用灭菌的滤纸吸干残留的上清后用预冷的1 mL灭菌水重悬菌体，4℃、9000 rpm离心2 min，轻轻弃上清，重复用1mL灭菌水洗一遍后，4℃、9000 rpm离心2 min，轻轻弃上清，预冷的1mL山梨醇(1 mol/L)重悬菌体；4℃、9000 rpm离心2 min，轻轻弃上清，预冷的100-150μl山梨醇(1 mol/L)轻柔重悬菌体。
2.2.2转化和筛选
分别将2.1构建得到的表达质粒用Sac I进行线性化，线性化片段纯化回收后通过电穿孔法分别转化毕赤酵母GS115，在MD平板上筛选得到毕赤酵母重组菌株，然后在含不同浓度遗传霉素的YPD平板（0.5mg/mL-8mg/mL）上筛选多拷贝的转化子。
将获得的转化子分别转接于BMGY培养基中，30℃、250rpm振荡培养1d；再转入BMMY培养基中，30℃、250rpm振荡培养；每天添加0.5%的甲醇，诱导表达4 d；9000rpm离心10min去除菌体，即得到分别含葡萄糖氧化酶GOD和葡萄糖氧化酶突变体的发酵上清液。
按照上述方法，申请人分别构建得到重组表达葡萄糖氧化酶GOD和上述葡萄糖氧化酶突变体的毕赤酵母工程菌株。
2.3 葡萄糖氧化酶酶活测定
（1）酶活单位定义
在pH6.0，30℃条件下，每分钟能把1µmol的β-D-葡萄糖氧化为D-葡萄糖酸和过氧化氢所需要的酶量，定义为1个酶活力单位（IU）。
（2）酶活测定方法
将粗酶液直接用缓冲液稀释至约10U/mL。取4支150×15的试管，加入2ml缓冲液、0.3ml葡萄糖、0.4ml苯酚、0.1ml 4-氨基安替吡啉、0.1ml 辣根过氧化物酶，30℃预热5min。向其中一管加入0.1ml蒸馏水，作为空白调零。水浴锅放在分光光度计旁以方便操作，向样品管中加入0.1ml样品溶液，此时开始计时，涡旋混匀后立即在500nm波长处用1cm比色杯比色。读取0.5 min时吸光度值为A0，再反应1min后，读取吸光度值A1，得出ΔA500=A1-A0。
酶活计算公式：
试样中酶活力X1（U/mL或U/g）按照如下公式计算：
X1=ΔA500×f×B ×1000/（887×t×A×d）=33.82×ΔA500×f
式中：
f--------------------- 酶液稀释倍数；
B-------------------- 反应液体积（3 ml）；
1000----------------消光系数单位转换系数；
887----------------- 消光系数(L·mol-1·cm-1）；
t--------------------- 反应时间（min），即读数A1与A0之间的时间差值1min；
A-------------------- 加入样品体积（0.1 ml）；
d-------------------- 比色皿的厚度（cm）。
（3）酶活测定结果
按照上述方法分别检测上述毕赤酵母工程菌的发酵上清液中葡萄糖氧化酶酶活。
2.4 蛋白含量测定
（1）测定方法：
考马斯亮蓝（Bradford）结合法测定蛋白质含量是比色法与色素法结合的复合方法。考马斯亮兰G-250在酸性溶液时呈棕红色，当与蛋白质结合后变为蓝色，且在蛋白质一定浓度范围内符合比尔定律，可在595nm处比色测定。在3～5分钟即成大量吸收，至少稳定1小时。在10～1000μg/mL范围内，吸光值与蛋白质浓度成正比。
按照酶液和考马斯亮蓝溶液体积比1：5的比例进行混合，静置10mim，考马斯亮蓝（Bradford）结合法测定蛋白质含量。
（2）蛋白含量测定结果
按照上述方法分别检测上述毕赤酵母工程菌发酵上清液的蛋白含量。
2.5比活力的计算
“比活力 (Specific Activity)”是指：单位重量的蛋白质中所具有酶的活力单位数，一般用U/mg蛋白质来表示。一般来说，酶的比活力越高，酶越纯。
比活力计算公式：比活力（U/mg）=酶活（U/mL）/ 蛋白含量（mg/mL）
以葡萄糖氧化酶GOD的比活力计100%，计算各单点突变体的相对比活力。
相对比活力（%）=突变体比活力/葡萄糖氧化酶GOD比活力×100%。
具体结果见表1。
表1 葡萄糖氧化酶突变体相对比活力比较
| 葡萄糖氧化酶 | 相对比活力 |
| GOD | 100% |
| R37K | 125.4% |
| A86P | 127.2% |
| Q90R | 115.1% |
| A162P | 128.5% |
| I167L | 116.2% |
| E221P | 132.3% |
| Q248R | 129.5% |
| S340P | 120.8% |
| A362T | 120.1% |
| S501R | 133.1% |
| M556L | 115.3% |
| I575V | 117.8% |
从表1的数据可以看出，与葡萄糖氧化酶GOD相比，本发明提供的分别含R37K、A86P、Q90R、A162P、I167L、E221P、Q248R、S340P、A362T、S501R、M556L、I575V单个突变位点的葡萄糖氧化酶突变体比活力普遍提高了15.3%-32.3%%，效果显著。
此外，与葡萄糖氧化酶GOD相比，本发明提供的包含R37K、A86P、Q90R、A162P、I167L、E221P、Q248R、S340P、A362T、S501R、M556L、I575V中任意2个或2个以上突变位点组合的葡萄糖氧化酶突变体，例如，R37K/A162P、R37K/S501R、A86P/E221P、A86P/Q248R、Q90R/A362T、E221P/S501R、R37K/I167L、M556L/I575V两点突变体；R37K/M556L/I575V、A86P/A162P/E221P、A86P/S501R/I575V、E221P/S340P/A362T、Q90R/I167L/A362T、A162P/E221P/S501R、E221P/S340P/A362T三点突变体；R37K/A86P/Q90R/A162P、A86P/A162P/I167L/Q248R、A86P/Q248R/A362T/S501R、A86P/S340P/M556L/I575V、Q90R/A162P/E221P/Q248R、Q90R/I167L/S340P/A362T四点突变体；R37K/Q90R/A162P/I167L/E221P、R37K/Q90R/I167L/Q248R/S340P、Q90R/A162P/I167L/E221P/S340P、Q90R/A162P/I167L/S340P/I575V、Q90R/I167L/Q248R/S501R/M556L、A162P/E221P/S340P/S501R/M556L、A162P/E221P/A362T/S501R/M556L五点突变体；R37K/Q90R/A162P/I167L/E221P/Q248R、R37K/Q90R/I167L/A362T/M556L/I575V、A86P/A162P/I167L/E221P/Q248R/S340P、A86P/Q248R/S340P/A362T/S501R/I575V、Q90R/A162P/I167L/E221P/Q248R/A362T、A162P/I167L/S340P/S501R/M556L/I575V、E221P/Q248R/ S340P/ S501R/M556L/I575V六点突变体；R37K/Q90R/A162P/I167L/E221P/Q248R/S340P、R37K/I167L/Q248R/S340P/A362T/S501R/I575V、A86P/Q90R/I167L/S340P/ S501R/M556L/I575V、Q90R/I167L/E221P/Q248R/S340P/A362T/S501R、A162P/I167L/E221P/Q248R/S340P/A362T/S501R七点突变体；A162P/E221P/Q248R/S340P/A362T/S501R/M556L/I575V、R37K/Q90R/A162P/ E221P/Q248R/A362T/S501R/M556L、R37K/I167L/E221P/Q248R/S340P/A362T/S501R/I575V八点突变体；R37K/A86P/A162P/E221P/Q248R/S340P/S501R/M556L/I575V、A86P/Q90R/A162P/I167L/E221P/Q248R/S340P/S501R/M556L九点突变体；R37K/A86P/A162P/I167L/E221P/Q248R/S340P/S501R/M556L/I575V、R37K/A86P/Q90R/A162P/I167L/E221P/Q248R/S340P/A362T/S501R十点突变体；R37K/A86P/Q90R/A162P/I167L/E221P/Q248R/S340P/A362T/S501R/M556L、R37K/A86P/A162P/I167L/E221P/Q248R/S340P/A362T/S501R/M556L/I575V、A86P/Q90R/A162P/I167L/E221P/Q248R/S340P/A362T/S501R/M556L/I575V十一点突变体；R37K/A86P/Q90R/A162P/I167L/E221P/Q248R/S340P/A362T/S501R/M556L/ I575V十二点突变体，其比活力普遍提高了62.0%-106.4%，均显著高于上述单点突变体的比活力水平，取得了意料不到的技术效果。
上述结果表明，本发明提供的突变位点R37K、A86P、Q90R、A162P、I167L、E221P、Q248R、S340P、A362T、S501R、M556L、I575V可以使葡萄糖氧化酶GOD的比活力得到显著提高，有利于降低该酶的生产成本，促进其在饲料领域的广泛应用。
序列表
<110> 青岛蔚蓝生物集团有限公司
<120> 比活力提高的葡萄糖氧化酶突变体
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 583
<212> PRT
<213> 黑曲霉(Aspergillus niger)
<400> 1
Ser Asn Gly Ile Glu Ala Ser Leu Leu Lys Asp Pro Lys Glu Val Ala
1 5 10 15
Gly Arg Thr Tyr Asp Tyr Ile Ile Ala Gly Gly Gly Leu Thr Gly Leu
20 25 30
Thr Val Ala Ala Arg Leu Thr Glu Asn Pro Asn Ile Thr Val Leu Val
35 40 45
Ile Glu Ser Gly Ser Tyr Glu Ser Asp Arg Gly Pro Ile Ile Glu Asp
50 55 60
Leu Asn Ala Tyr Gly Asp Ile Phe Gly Ser Ser Val Asp His Ala Tyr
65 70 75 80
Glu Thr Val Glu Leu Ala Thr Asn Asn Gln Thr Ala Leu Ile Arg Ser
85 90 95
Gly Asn Gly Leu Gly Gly Ser Thr Leu Ile Asn Gly Gly Thr Trp Thr
100 105 110
Arg Pro His Lys Ala Gln Val Asp Ser Trp Glu Thr Val Phe Gly Asn
115 120 125
Glu Gly Trp Asn Trp Asp Ser Val Ala Ala Tyr Ser Leu Gln Ala Glu
130 135 140
Arg Ala Arg Ala Pro Asn Ala Lys Gln Ile Ala Ala Gly His Tyr Phe
145 150 155 160
Asn Ala Ser Cys His Gly Ile Asn Gly Thr Val His Ala Gly Pro Arg
165 170 175
Asp Thr Gly Asp Asp Tyr Ser Pro Ile Val Lys Ala Leu Met Ser Ala
180 185 190
Val Glu Asp Arg Gly Val Pro Thr Lys Lys Asp Leu Gly Cys Gly Asp
195 200 205
Pro His Gly Val Ser Met Phe Pro Asn Thr Leu His Glu Asp Gln Val
210 215 220
Arg Ser Asp Ala Ala Arg Glu Trp Leu Leu Pro Asn Tyr Gln Arg Pro
225 230 235 240
Asn Leu Gln Val Leu Thr Gly Gln Tyr Val Gly Lys Val Leu Leu Ser
245 250 255
Gln Asn Ala Thr Thr Pro Arg Ala Val Gly Val Glu Phe Gly Thr His
260 265 270
Lys Gly Asn Thr His Asn Val Tyr Ala Lys His Glu Val Leu Leu Ala
275 280 285
Ala Gly Ser Ala Val Ser Pro Thr Ile Leu Glu Tyr Ser Gly Ile Gly
290 295 300
Met Lys Ser Ile Leu Glu Pro Leu Gly Ile Asp Thr Val Val Asp Leu
305 310 315 320
Pro Val Gly Leu Asn Leu Gln Asp Gln Thr Thr Ser Thr Val Arg Ser
325 330 335
Arg Ile Thr Ser Ala Gly Ala Gly Gln Gly Gln Ala Ala Trp Phe Ala
340 345 350
Thr Phe Asn Glu Thr Phe Gly Asp Tyr Ala Glu Lys Ala His Glu Leu
355 360 365
Leu Asn Thr Lys Leu Glu Gln Trp Ala Glu Glu Ala Val Ala Arg Gly
370 375 380
Gly Phe His Asn Thr Thr Ala Leu Leu Ile Gln Tyr Glu Asn Tyr Arg
385 390 395 400
Asp Trp Ile Val Lys Asp Asn Val Ala Tyr Ser Glu Leu Phe Leu Asp
405 410 415
Thr Ala Gly Val Ala Ser Phe Asp Val Trp Asp Leu Leu Pro Phe Thr
420 425 430
Arg Gly Tyr Val His Ile Leu Asp Lys Asp Pro Tyr Leu Arg His Phe
435 440 445
Ala Tyr Asp Pro Gln Tyr Phe Leu Asn Glu Leu Asp Leu Leu Gly Gln
450 455 460
Ala Ala Ala Thr Gln Leu Ala Arg Asn Ile Ser Asn Ser Gly Ala Met
465 470 475 480
Gln Thr Tyr Phe Ala Gly Glu Thr Ile Pro Gly Asp Asn Leu Ala Tyr
485 490 495
Asp Ala Asp Leu Ser Ala Trp Val Glu Tyr Ile Pro Glu Asn Phe Arg
500 505 510
Pro Asn Tyr His Gly Val Gly Thr Cys Ser Met Met Pro Lys Glu Met
515 520 525
Gly Gly Val Val Asp Asn Ala Ala Arg Val Tyr Gly Val Gln Gly Leu
530 535 540
Arg Val Ile Asp Gly Ser Ile Pro Pro Thr Gln Met Ser Ser His Val
545 550 555 560
Met Thr Val Phe Tyr Ala Met Ala Leu Lys Ile Ala Asp Ala Ile Leu
565 570 575
Ala Asp Tyr Ala Ser Met Gln
580
<210> 2
<211> 1752
<212> DNA
<213> 黑曲霉(Aspergillus niger)
<400> 2
tctaatggta ttgaggcttc cttgttgaag gacccaaaag aggtcgccgg tagaacctac 60
gactacatca ttgccggtgg tggtttgacc ggtttgaccg tcgctgctag attgaccgag 120
aatcctaata tcactgtttt ggttattgag tccggttcct acgagtctga ccgtggtcca 180
attattgagg atttgaatgc ctacggtgac atcttcggat cttctgtcga ccacgcctat 240
gagaccgttg agttggctac taacaatcaa actgctttga tccgttccgg taacggtttg 300
ggaggatcca ctttgattaa cggtggaacc tggactagac cacataaagc ccaagtcgac 360
tcctgggaga ctgtcttcgg aaacgaaggt tggaactggg actctgttgc tgcttactcc 420
cttcaggctg aaagagctcg tgccccaaat gctaagcaga tcgccgctgg tcactacttt 480
aacgcctctt gccacggtat taacggtact gttcacgctg gaccacgtga tactggtgat 540
gactactctc caatcgtcaa ggccttgatg tctgctgtcg aagatcgtgg agtccctacc 600
aagaaggact tgggttgcgg agaccctcat ggtgtctcca tgttcccaaa caccttgcac 660
gaggaccaag ttcgttccga cgctgccaga gaatggttgc ttcctaacta ccagagacca 720
aacttgcagg tcttgactgg tcagtacgtc ggtaaggtct tgttgtctca gaacgctacc 780
accccaagag ctgttggtgt cgagttcggt actcacaagg gtaacaccca caacgtctac 840
gctaagcatg aggtcctttt ggccgccggt tctgccgttt ccccaaccat cttggagtat 900
tctggaattg gtatgaaatc tattttggag cctttgggaa tcgacaccgt tgttgacctt 960
ccagttggtt tgaacttgca ggaccagacc acctccactg tccgttctcg tattacttcc 1020
gctggtgctg gacaaggtca agctgcctgg ttcgctacct tcaatgagac ctttggtgat 1080
tacgccgaga aggcccacga gttgttgaac accaagttgg agcaatgggc tgaagaggct 1140
gtcgctagag gtggattcca taataccacc gccttgttga tccaatacga aaattataga 1200
gattggattg ttaaggacaa tgttgcttac tccgagttgt ttttggatac cgccggagtc 1260
gcttcctttg acgtctggga cttgttgcct ttcacccgtg gttacgttca cattttggac 1320
aaagatcctt acttgcgtca cttcgcctac gacccacagt acttcttgaa cgagttggac 1380
ttgttgggtc aagctgctgc tactcagttg gcccgtaaca tttctaactc tggtgccatg 1440
caaacctact tcgctggaga gaccattcca ggagacaact tggcctacga tgccgacttg 1500
tctgcctggg tcgagtacat ccctgaaaac ttccgtccaa actatcacgg tgtcggaacc 1560
tgctccatga tgccaaagga aatgggtgga gtcgtcgaca atgccgctcg tgtttacgga 1620
gtccagggtt tgagagtcat cgacggttct atcccaccaa cccaaatgtc ctcccacgtc 1680
atgactgtct tctacgctat ggccttgaag atcgctgacg ctattcttgc tgactacgct 1740
tctatgcagt aa 1752
Claims (7)
1.一种葡萄糖氧化酶突变体，其特征在于，所述突变体是氨基酸序列为SEQ ID NO:1的葡萄糖氧化酶的第37位氨基酸由Arg变为Lys，和第167位氨基酸由Ile变为Leu。
2.如权利要求1所述的葡萄糖氧化酶突变体，其特征在于，所述突变体中氨基酸的取代组合为：
R37K/Q90R/I167L；
R37K/I167L/A362T；
R37K/Q90R/A162P/I167L；
R37K/Q90R/I167L/Q248R；
R37K/Q90R/I167L/A362T；
R37K/I167L/A362T/M556L；
R37K/A86P/Q90R/I167L/A362T；
R37K/Q90R/A162P/I167L/E221P；
R37K/Q90R/I167L/Q248R/S340P；
R37K/Q90R/I167L/A362T/M556L；
R37K/I167L/A362T/M556L/I575V；
R37K/Q90R/A162P/I167L/E221P/Q248R；
R37K/A86P/Q90R/A162P/I167L/S340P；
R37K/A86P/Q90R/I167L/A362T/S501R；
R37K/A86P/Q90R/I167L/S501R/M556L；
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A86P/Q90R/A162P/I167L/E221P/Q248R/S340P/S501R/M556L；
R37K/A86P/Q90R/A162P/I167L/E221P/Q248R/S340P/A362T/S501R；
R37K/A86P/A162P/I167L/E221P/Q248R/S340P/S501R/M556L/I575V；
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3.编码权利要求1或2所述葡萄糖氧化酶突变体的DNA分子。
4.一种重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体中包含有权利要求3所述的DNA分子。
5.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞转入有权利要求4所述的重组表达载体；所述的宿主细胞为非植物细胞。
6.如权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞为毕赤酵母（Pichia pastoris）或里氏木霉（Trichoderma reesei）。
7.权利要求1或2所述的葡萄糖氧化酶突变体在饲料领域中的应用。
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