CN108251392A - 提高比活和热稳定性的葡萄糖氧化酶突变体及其编码基因和应用 - Google Patents

提高比活和热稳定性的葡萄糖氧化酶突变体及其编码基因和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了提高比活和热稳定性的葡萄糖氧化酶突变体及其编码基因，涉及基因工程领域。针对毕赤酵母密码子偏好性对黑曲霉Aspergillus niger GIM 3.452(CICC 2377)的葡萄糖氧化酶(GOD)进行基因优化；采用定点突变技术将优化后的基因进行定点突变，所述突变位点包括：第2位、第10位、第20位、第34位、第70位、第90位、第106位、第110位、第167位、第305位、和第509位；本发明获得的突变体的耐热性能和比活比原始菌株高，能很好的满足食品、医药、饲料以及纺织工业等领域中应用的需求，有着非常广阔的应用前景。

Description

提高比活和热稳定性的葡萄糖氧化酶突变体及其编码基因和 应用
技术领域
本发明涉及提高比活和热稳定性的葡萄糖氧化酶突变体及其编码基因和应用，涉及基因工程技术领域。
背景技术
萄糖氧化酶(glucose oxidase，GOD)在有氧条件下能专一性地催化β-D-葡糖生成葡萄糖酸和过氧化氢。GOD广泛分布于动植物和微生物体内。由于微生物生长繁殖快、来源广，是生产GOD的主要来源，主要生产菌株为黑曲霉和青霉。
相对青霉GOD而言，黑曲霉产的GOD热稳定性较好，但是野生型黑曲霉GOD比活力低，热稳定性差，限制了其产业化应用。CN 103981159A公开了一种葡萄糖氧化酶突变体及其应用，通过将第172位氨基酸由Asn变为Arg，第525位氨基酸由Cys变为Asn，提高了突变酶的耐热性。
发明内容
本发明对来源于黑曲霉的葡萄糖氧化酶进行分子改造，通过定点突变技术和易错PCR方法提高了黑曲霉Aspergillus niger GIM 3.452(CICC 2377)的葡萄糖氧化酶的比活和热稳定性，降低生产成本，为葡萄糖氧化酶的工业化应用奠定基础。
黑曲霉Aspergillus niger GIM 3.452的葡萄糖氧化酶基因的氨基酸序列如SEQID NO.1所示；其核苷酸序列如下所示：
agcaatggcatcgaagccagcctcctgactgaccccaaggaggttgccggccgcactgtcgactacatcatcgctggtggaggtctgactggactcaccactgctgcccgtctgacggagaaccccgatatcactgtgcttgtcatcgaaagtggctcctacgagtctgacagaggtcctatcattgaggacctgaacgcttacggtgacatttttggcagcagtgtggaccacgcctacgagactgtcgagctcgccaccaacaatcagactgcgctgatccgctccggaaatggtctcggtggctctaccctcgtcaacggtggcacctggactcgcccccacaaggcacaagttgactcatgggagaccgtcttcggaaatgagggctggaactgggacagcgtggccgcctactccctccaggctgagcgtgctcgcgcaccaaatgccaaacagattgctgctggccactactttaatgcatcctgccatggtatcaatggtactgtccacgccggaccccgcgataccggtgatgactactcccccatcgtcaaggctctcatgagcgctgtcgaagacaggggcgttcccaccaagaaggacttgggatgcggtgacccccatggtgtgtccatgttccccaacaccttgcacgaagaccaagtgcgctctgatgccgctcgcgaatggctcctccccaactaccagcgtcccaacctgcaagtcctcactggacagtatgttggaaaggtcctgctcagccagaacgctaccacacctcgtgccgttggcgtggaattcggcacccacaagggcaacacccacaacgtctacgctaagcacgaggtcctcctggccgctggatccgctgtctctcccaccatcctcgaatattccggtatcggaatgaagtccattctagagcctcttggaattgacaccgtcgttgacctgcccgttggtctcaaccttcaggaccagaccacctctaccgtccgctcacgcattacctccgccggtgccggacagggacaggccgcttggttcgctaccttcaacgagacctttggcgactacgccgaaaaggctcacgagctgctcaacaccaagctggagcagtgggccgaagaggccgtcgcccgtggcggattccacaacaccaccgctttgctcatccagtacgagaactaccgcgactggatcgtcaaggacaatgtcgcatactcggaactcttcctcgacacggccggagtggccagtttcgatgtgtgggatcttctgcccttcactagaggatacgtacacatcctcgacaaggacccctacctccgccatttcgcatacgaccctcagtactttctcaacgagcttgacctgctcggccaggctgccgccactcagctggcccgcaacatctccaactccggtgccatgcaaacttatttcgctggagagactattcccggtgacaacctcgcgtatgatgccgacttgagcgcctgggttgagtatatcccgtacaacttccgccctaactaccatggtgtgggtacttgctccatgatgccgaaggagatgggcggtgttgtcgacaatgctgcccgtgtgtatggtgtgcagggactgcgagtcatcgatggttctattccccctacgcaaatgtcgtcccatgttatgacggtcttttatgccatggccttgaagattgcggatgccatcttggcggattatgcttccatgcagtga。针对毕赤酵母密码子偏好性，在上述核苷酸序列基础上优化后的核苷酸序列(由苏州金维智生物科技有限公司合成得到)如下所示：
tctaatggtattgaggcttccttgttgaccgacccaaaagaggtcgccggtagaaccgtcgactacatcattgccggtggtggtttgaccggtttgaccaccgctgctagattgaccgagaatcctgacatcactgttttggttattgagtccggttcctacgagtctgaccgtggtccaattattgaggatttgaatgcctacggtgacatcttcggatcttctgtcgaccacgcctatgagaccgttgagttggctactaacaatcaaactgctttgatccgttccggtaacggtttgggaggatccactttggttaacggtggaacctggactagaccacataaagcccaagtcgactcctgggagactgtcttcggaaacgaaggttggaactgggactctgttgctgcttactcccttcaggctgaaagagctcgtgccccaaatgctaagcagatcgccgctggtcactactttaacgcctcttgccacggtattaacggtactgttcacgctggaccacgtgatactggtgatgactactctccaatcgtcaaggccttgatgtctgctgtcgaagatcgtggagtccctaccaagaaggacttgggttgcggagaccctcatggtgtctccatgttcccaaacaccttgcacgaggaccaagttcgttccgacgctgccagagaatggttgcttcctaactaccagagaccaaacttgcaggtcttgactggtcagtacgtcggtaaggtcttgttgtctcagaacgctaccaccccaagagctgttggtgtcgagttcggtactcacaagggtaacacccacaacgtctacgctaagcatgaggtccttttggccgccggttctgccgtttccccaaccatcttggagtattctggaattggtatgaaatctattttggagcctttgggaatcgacaccgttgttgaccttccagttggtttgaacttgcaggaccagaccacctccactgtccgttctcgtattacttccgctggtgctggacaaggtcaagctgcctggttcgctaccttcaatgagacctttggtgattacgccgagaaggcccacgagttgttgaacaccaagttggagcaatgggctgaagaggctgtcgctagaggtggattccataataccaccgccttgttgatccaatacgaaaattatagagattggattgttaaggacaatgttgcttactccgagttgtttttggataccgccggagtcgcttcctttgacgtctgggacttgttgcctttcacccgtggttacgttcacattttggacaaagatccttacttgcgtcacttcgcctacgacccacagtacttcttgaacgagttggacttgttgggtcaagctgctgctactcagttggcccgtaacatttctaactctggtgccatgcaaacctacttcgctggagagaccattccaggagacaacttggcctacgatgccgacttgtctgcctgggtcgagtacatcccttacaacttccgtccaaactatcacggtgtcggaacctgctccatgatgccaaaggaaatgggtggagtcgtcgacaatgccgctcgtgtttacggagtccagggtttgagagtcatcgacggttctatcccaccaacccaaatgtcctcccacgtcatgactgtcttctacgctatggccttgaagatcgctgacgctattcttgctgactacgcttctatgcagtaa。
本发明的目的是提供提高比活和热稳定性的葡萄糖氧化酶突变体，由氨基酸序列如SEQID NO.1所示的葡萄糖氧化酶突变得到，突变位点包括如下位点中的一个或多个：第2位由N突变为Y、第10位由T突变为K、第20位由V变为Y、第34位由T突变为V、第70位由D突变为Q、第90位由Q突变为R、第106位由V突变为I、第110位由T突变为N、第167位由I突变为L、第305位由M突变为L和第509位由Y突变为E。
优选地，所述突变位点为N2Y，V20Y，T34V，D70Q，Q90R，V106I和M305L；或所述突变位点为T10K，V20Y，T34V，D70Q，Q90R，V106I，T110N和Y509E；或所述突变位点为T10K，V20Y，T34V，D70Q，V106I，M305L和Y509E；或所述突变位点为N2Y，T10K，V20Y，T34V，D70Q，V106I，T110N，M305L和Y509E；或所述突变位点为V20Y，T34V，D70Q，Q90R，V106I，I167L和M305L。
更优选地，所述突变位点为N2Y，T10K，V20Y，T34V，D70Q，V106I，T110N，M305L和Y509E。
本发明的再一目的是提供提高比活和热稳定性的葡萄糖氧化酶突变体的编码基因，为编码上述的葡萄糖氧化酶突变体的基因。优选地，提供提高比活和热稳定性的葡萄糖氧化酶突变体的核苷酸序列为：
tcttatggtattgaggcttccttgttgaccgacccaaaagaggtcgccggtagaacctacgactacatcattgccggtggtggtttgaccggtttgaccgtcgctgctagattgaccgagaatcctgacatcactgttttggttattgagtccggttcctacgagtctgaccgtggtccaattattgaggatttgaatgcctacggtcaaatcttcggatcttctgtcgaccacgcctatgagaccgttgagttggctactaacaatagaactgctttgatccgttccggtaacggtttgggaggatccactttgattaacggtggaacctggactagaccacataaagcccaagtcgactcctgggagactgtcttcggaaacgaaggttggaactgggactctgttgctgcttactcccttcaggctgaaagagctcgtgccccaaatgctaagcagatcgccgctggtcactactttaacgcctcttgccacggtattaacggtactgttcacgctggaccacgtgatactggtgatgactactctccaatcgtcaaggccttgatgtctgctgtcgaagatcgtggagtccctaccaagaaggacttgggttgcggagaccctcatggtgtctccatgttcccaaacaccttgcacgaggaccaagttcgttccgacgctgccagagaatggttgcttcctaactaccagagaccaaacttgcaggtcttgactggtcagtacgtcggtaaggtcttgttgtctcagaacgctaccaccccaagagctgttggtgtcgagttcggtactcacaagggtaacacccacaacgtctacgctaagcatgaggtccttttggccgccggttctgccgtttccccaaccatcttggagtattctggaattggtctgaaatctattttggagcctttgggaatcgacaccgttgttgaccttccagttggtttgaacttgcaggaccagaccacctccactgtccgttctcgtattacttccgctggtgctggacaaggtcaagctgcctggttcgctaccttcaatgagacctttggtgattacgccgagaaggcccacgagttgttgaacaccaagttggagcaatgggctgaagaggctgtcgctagaggtggattccataataccaccgccttgttgatccaatacgaaaattatagagattggattgttaaggacaatgttgcttactccgagttgtttttggataccgccggagtcgcttcctttgacgtctgggacttgttgcctttcacccgtggttacgttcacattttggacaaagatccttacttgcgtcacttcgcctacgacccacagtacttcttgaacgagttggacttgttgggtcaagctgctgctactcagttggcccgtaacatttctaactctggtgccatgcaaacctacttcgctggagagaccattccaggagacaacttggcctacgatgccgacttgtctgcctgggtcgagtacatcccttacaacttccgtccaaactatcacggtgtcggaacctgctccatgatgccaaaggaaatgggtggagtcgtcgacaatgccgctcgtgtttacggagtccagggtttgagagtcatcgacggttctatcccaccaacccaaatgtcctcccacgtcatgactgtcttctacgctatggccttgaagatcgctgacgctattcttgctgactacgcttctatgcagtaa；或
tctaatggtattgaggcttccttgttgaaggacccaaaagaggtcgccggtagaacctacgactacatcattgccggtggtggtttgaccggtttgaccgtcgctgctagattgaccgagaatcctgacatcactgttttggttattgagtccggttcctacgagtctgaccgtggtccaattattgaggatttgaatgcctacggtcaaatcttcggatcttctgtcgaccacgcctatgagaccgttgagttggctactaacaatagaactgctttgatccgttccggtaacggtttgggaggatccactttgattaacggtggaaactggactagaccacataaagcccaagtcgactcctgggagactgtcttcggaaacgaaggttggaactgggactctgttgctgcttactcccttcaggctgaaagagctcgtgccccaaatgctaagcagatcgccgctggtcactactttaacgcctcttgccacggtattaacggtactgttcacgctggaccacgtgatactggtgatgactactctccaatcgtcaaggccttgatgtctgctgtcgaagatcgtggagtccctaccaagaaggacttgggttgcggagaccctcatggtgtctccatgttcccaaacaccttgcacgaggaccaagttcgttccgacgctgccagagaatggttgcttcctaactaccagagaccaaacttgcaggtcttgactggtcagtacgtcggtaaggtcttgttgtctcagaacgctaccaccccaagagctgttggtgtcgagttcggtactcacaagggtaacacccacaacgtctacgctaagcatgaggtccttttggccgccggttctgccgtttccccaaccatcttggagtattctggaattggtatgaaatctattttggagcctttgggaatcgacaccgttgttgaccttccagttggtttgaacttgcaggaccagaccacctccactgtccgttctcgtattacttccgctggtgctggacaaggtcaagctgcctggttcgctaccttcaatgagacctttggtgattacgccgagaaggcccacgagttgttgaacaccaagttggagcaatgggctgaagaggctgtcgctagaggtggattccataataccaccgccttgttgatccaatacgaaaattatagagattggattgttaaggacaatgttgcttactccgagttgtttttggataccgccggagtcgcttcctttgacgtctgggacttgttgcctttcacccgtggttacgttcacattttggacaaagatccttacttgcgtcacttcgcctacgacccacagtacttcttgaacgagttggacttgttgggtcaagctgctgctactcagttggcccgtaacatttctaactctggtgccatgcaaacctacttcgctggagagaccattccaggagacaacttggcctacgatgccgacttgtctgcctgggtcgagtacatccctgaaaacttccgtccaaactatcacggtgtcggaacctgctccatgatgccaaaggaaatgggtggagtcgtcgacaatgccgctcgtgtttacggagtccagggtttgagagtcatcgacggttctatcccaccaacccaaatgtcctcccacgtcatgactgtcttctacgctatggccttgaagatcgctgacgctattcttgctgactacgcttctatgcagtaa；或
tctaatggtattgaggcttccttgttgaaggacccaaaagaggtcgccggtagaacctacgactacatcattgccggtggtggtttgaccggtttgaccgtcgctgctagattgaccgagaatcctgacatcactgttttggttattgagtccggttcctacgagtctgaccgtggtccaattattgaggatttgaatgcctacggtcaaatcttcggatcttctgtcgaccacgcctatgagaccgttgagttggctactaacaatcaaactgctttgatccgttccggtaacggtttgggaggatccactttgattaacggtggaacctggactagaccacataaagcccaagtcgactcctgggagactgtcttcggaaacgaaggttggaactgggactctgttgctgcttactcccttcaggctgaaagagctcgtgccccaaatgctaagcagatcgccgctggtcactactttaacgcctcttgccacggtattaacggtactgttcacgctggaccacgtgatactggtgatgactactctccaatcgtcaaggccttgatgtctgctgtcgaagatcgtggagtccctaccaagaaggacttgggttgcggagaccctcatggtgtctccatgttcccaaacaccttgcacgaggaccaagttcgttccgacgctgccagagaatggttgcttcctaactaccagagaccaaacttgcaggtcttgactggtcagtacgtcggtaaggtcttgttgtctcagaacgctaccaccccaagagctgttggtgtcgagttcggtactcacaagggtaacacccacaacgtctacgctaagcatgaggtccttttggccgccggttctgccgtttccccaaccatcttggagtattctggaattggtctgaaatctattttggagcctttgggaatcgacaccgttgttgaccttccagttggtttgaacttgcaggaccagaccacctccactgtccgttctcgtattacttccgctggtgctggacaaggtcaagctgcctggttcgctaccttcaatgagacctttggtgattacgccgagaaggcccacgagttgttgaacaccaagttggagcaatgggctgaagaggctgtcgctagaggtggattccataataccaccgccttgttgatccaatacgaaaattatagagattggattgttaaggacaatgttgcttactccgagttgtttttggataccgccggagtcgcttcctttgacgtctgggacttgttgcctttcacccgtggttacgttcacattttggacaaagatccttacttgcgtcacttcgcctacgacccacagtacttcttgaacgagttggacttgttgggtcaagctgctgctactcagttggcccgtaacatttctaactctggtgccatgcaaacctacttcgctggagagaccattccaggagacaacttggcctacgatgccgacttgtctgcctgggtcgagtacatccctgaaaacttccgtccaaactatcacggtgtcggaacctgctccatgatgccaaaggaaatgggtggagtcgtcgacaatgccgctcgtgtttacggagtccagggtttgagagtcatcgacggttctatcccaccaacccaaatgtcctcccacgtcatgactgtcttctacgctatggccttgaagatcgctgacgctattcttgctgactacgcttctatgcagtaa，即SEQ ID NO.5；或
tcttatggtattgaggcttccttgttgaaggacccaaaagaggtcgccggtagaacctacgactacatcattgccggtggtggtttgaccggtttgaccgtcgctgctagattgaccgagaatcctgacatcactgttttggttattgagtccggttcctacgagtctgaccgtggtccaattattgaggatttgaatgcctacggtcaaatcttcggatcttctgtcgaccacgcctatgagaccgttgagttggctactaacaatcaaactgctttgatccgttccggtaacggtttgggaggatccactttgattaacggtggaaactggactagaccacataaagcccaagtcgactcctgggagactgtcttcggaaacgaaggttggaactgggactctgttgctgcttactcccttcaggctgaaagagctcgtgccccaaatgctaagcagatcgccgctggtcactactttaacgcctcttgccacggtattaacggtactgttcacgctggaccacgtgatactggtgatgactactctccaatcgtcaaggccttgatgtctgctgtcgaagatcgtggagtccctaccaagaaggacttgggttgcggagaccctcatggtgtctccatgttcccaaacaccttgcacgaggaccaagttcgttccgacgctgccagagaatggttgcttcctaactaccagagaccaaacttgcaggtcttgactggtcagtacgtcggtaaggtcttgttgtctcagaacgctaccaccccaagagctgttggtgtcgagttcggtactcacaagggtaacacccacaacgtctacgctaagcatgaggtccttttggccgccggttctgccgtttccccaaccatcttggagtattctggaattggtctgaaatctattttggagcctttgggaatcgacaccgttgttgaccttccagttggtttgaacttgcaggaccagaccacctccactgtccgttctcgtattacttccgctggtgctggacaaggtcaagctgcctggttcgctaccttcaatgagacctttggtgattacgccgagaaggcccacgagttgttgaacaccaagttggagcaatgggctgaagaggctgtcgctagaggtggattccataataccaccgccttgttgatccaatacgaaaattatagagattggattgttaaggacaatgttgcttactccgagttgtttttggataccgccggagtcgcttcctttgacgtctgggacttgttgcctttcacccgtggttacgttcacattttggacaaagatccttacttgcgtcacttcgcctacgacccacagtacttcttgaacgagttggacttgttgggtcaagctgctgctactcagttggcccgtaacatttctaactctggtgccatgcaaacctacttcgctggagagaccattccaggagacaacttggcctacgatgccgacttgtctgcctgggtcgagtacatccctgaaaacttccgtccaaactatcacggtgtcggaacctgctccatgatgccaaaggaaatgggtggagtcgtcgacaatgccgctcgtgtttacggagtccagggtttgagagtcatcgacggttctatcccaccaacccaaatgtcctcccacgtcatgactgtcttctacgctatggccttgaagatcgctgacgctattcttgctgactacgcttctatgcagtaa。
更优选地，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；或为与SEQ ID NO.5所示序列具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白质的序列。
本发明采用定点饱和突变的方法对SEQ ID NO.1所示的葡萄糖氧化酶的第20位、第34位、第70位、第90位、第106位、和第509位进行分子改造，经过高通量筛选确定了第20位、第34位、第70位、第90位、第106位、和第509位这6个位点的最优突变氨基酸，具体包括：第20位由V突变为Y，第34位则是T突变为V，第70位则是D突变为Q，第90位则是Q突变为R，第106位则是V突变为I，第509位则是Y突变为E。
同时采用易错PCR技术对上述优化后的核苷酸序列进行改造，从而获得一系列的突变位点。经过高通量筛选获得了5个有效突变体，分别为N2Y(即第2位由N突变为Y)，T10K，T110N，I167L和M305L。
在上述有效突变位点的基础上，进一步进行组合和筛选，最终得到了五个提高比活和热稳定性的葡萄糖氧化酶突变体分别命名为GOX-1、GOX-2、GOX-3、GOX-4和GOX-5。五个变体的相对比活分别是GOD的142％，169％、186％、223％和208％，且耐热性能较GOD均有明显提高。GOX-1包含的突变位点为N2Y，V20Y，T34V，D70Q，Q90R，V106I，M305L；GOX-2包含的突变位点为T10K，V20Y，T34V，D70Q，Q90R，V106I，T110N，Y509E；GOX-3包含的突变位点为T10K，V20Y，T34V，D70Q，V106I，M305L，Y509E；GOX-4包含的突变位点为N2Y，T10K，V20Y，T34V，D70Q，V106I，T110N，M305L，Y509E；GOX-5包含的突变位点为V20Y，T34V，D70Q，Q90R，V106I，I167L，M305L。更优选地，提高比活和热稳定性的葡萄糖氧化酶突变体为GOX-3、GOX-4或GOX-5，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2至SEQ ID NO.4所示。
本发明还提供提高葡萄糖氧化酶比活和热稳定性的方法，将氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的葡萄糖氧化酶突变，突变位点包括如下位点中的一个或多个：第2位由N突变为Y、第10位由T突变为K、第20位由V变为Y、第34位由T突变为V、第70位由D突变为Q、第90位由Q突变为R、第106位由V突变为I、第110位由T突变为N、第167位由I突变为L、第305位由M突变为L和第509位由Y突变为E。
本发明还提供包含上述葡萄糖氧化酶突变体基因的重组载体。本发明还提供包含上述葡萄糖氧化酶突变体基因的宿主细胞。此外，本发明还提供提高比活和热稳定性的葡萄糖氧化酶突变体在饲料添加剂、食品添加剂、葡萄糖酸钠或葡萄糖酸钙的生产中的应用。
与现有技术相比，本发明带来的有益效果包括：本发明通过基因优化、蛋白理性改造和高通量筛选技术对来源于黑曲霉的葡萄糖氧化酶进行分子改造，得到系列位点突变的突变体，在针对毕赤酵母密码子偏好性的基础上，进一步结合定点饱和突变和易错PCR两种突变技术，筛选得到了五个耐热性能和比活提高的突变体GOX-1至GOX-5。为黑曲霉的葡萄糖氧化酶的工业化应用奠定基础。
附图说明
图1为GOX-1和GOX-2的部分测序结果图。
图2为GOX-3、GOX-4和GOX-5的部分测序结果图。
图3原始葡萄糖氧化酶和突变体GOX-1至GOX-5的最适反应温度。
图4原始葡萄糖氧化酶和突变体GOX-1至GOX-5的热稳定性。
具体实施方式
以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
黑曲霉Aspergillus niger GIM 3.452(CICC 2377)购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，大肠杆菌菌株Top10、毕赤酵母X33、载体pPICZαA、载体pGAPzαA、抗生素Zeocin购自Invitrogen公司。PCR酶、质粒提取试剂盒、胶纯化试剂盒购于上海生工公司，限制性内切酶购于NEB公司。葡萄糖氧化酶标准品、邻联茴香胺盐酸盐及辣根过氧化物购于Sigma公司，葡萄糖购于OXIOD公司，其他试剂购于广州化学试剂厂。
大肠杆菌培养基为LB(1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCL，pH7.0)。LB-Amp为LB培养基加100μg/ml氨苄青霉素。LB-Zeocin为LB培养基加25μg/ml Zeocin。酵母培养基为YPD(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖)。酵母筛选培养基为YPDZ(YPD+100μg/mlZeocin)。酵母诱导培养基BMGY(1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，0.00004％Biotin，1％甘油(v/v))和BMMY(除以0.5％甲醇代替甘油，其余成分与BMGY相同)。重组酵母发酵基本盐培养基：磷酸氢二铵5％、磷酸二氢钾0.5％、七水硫酸镁1.5％、硫酸钾1.95％、硫酸钙0.1％、消泡剂0.03％。高压后每升加4.35mlPTM1。PTM1(微量盐溶液)：硫酸铜0.6％、碘化钾0.018％。一水硫酸锰0.3％、二水钼酸钠0.02％、硼酸0.002％、流水氯化钴0.05％、氯化锌2％、七水硫酸铁6.5％、浓硫酸0.5％、生物素0.02％
葡萄糖氧化酶活性测定采用邻—联茴香胺分光光度法。在葡萄糖氧化酶的作用下，葡萄糖和氧反应，生成葡萄糖酸和过氧化氢，过氧化氢和无色的还原型邻联茴香胺在过氧化物酶的作用下，生成水和红色的氧化型邻联茴香胺。在540nm下测定反应液吸光值，依据标准曲线计算葡萄糖氧化酶的酶活。
实施例1、黑曲霉(Aspergillus niger)葡萄糖氧化酶(GOD)基因的优化与基因合成
黑曲霉Aspergillus niger GIM 3.452的葡萄糖氧化酶基因(Genebank:FJ979866.1)针对毕赤酵母密码子偏好性进行优化，由苏州金维智生物科技有限公司合成得到优化后的核苷酸序列，分别在葡萄糖氧化酶优化基因(GOX)的5’端和3’端引入EcoRI和XbaI酶切位点，并连接至Puc57-amp载体上，将GOX-Puc57接种至LBA培养基，培养24小时候，提取质粒，用EcoRI和XbaI酶切，切胶回收目的基因片段，产物纯化回收，分别连接到表达载体pPICzαA和pPGAPzαA，得到表达载体pPICzαA-GOX和pGAPzαA-GOX。
实施例2、定点饱和突变
以上述pPICzαA-GOX为模板，以表中的引物进行PCR扩增，具体地扩增反应体系如下：
Q5高保真Taq酶MIX 23uL
对应突变体引物1(50uM) 1uL
对应突变体引物1(50uM) 1uL
pPICzαA-GOX(20ng) 2uL
加水至 50uL
突变位点为V20Y时，对应突变体引物1：5'-cgccggtagaacctacgactacatcattgc-3'；对应突变体引物2：5'-gcaatgatgtagtcgtaggttctaccggcg-3'。突变位点为T34V时，对应突变体引物1：5'-gaccggtttgaccgttgctgctagattga-3'；对应突变体引物2：5'-tcaatctagcagcaacggtcaaaccggtc-3'。突变位点为D70Q时，对应突变体引物1：5'-ggatttgaatgcctacggtcagatcttcggatcttctgtcg-3'；对应突变体引物2：5'-cgacagaagatccgaagatctgaccgtaggcattcaaatcc-3'。突变位点为Q90R时，对应突变体引物1：5'-ccgttgagttggctactaacaatagaactgctttgatc-3'；对应突变体引物2：5'-gatcaaagcagttctattgttagtagccaactcaacgg-3'。突变位点为V106I时，对应突变体引物1：5'-ggaggatccactttgattaacggtggaacctgg-3'；对应突变体引物2：5'-ccaggttccaccgttaatcaaagtggatcctcc-3'。突变位点为Y509E时，对应突变体引物1：5'-cgagtacatccctgaaaacttccgtccaa-3'；对应突变体引物2：5'-ttggacggaagttttcagggatgtactcg-3'。反应程序如下：
琼脂糖电泳检测PCR扩增结果，纯化回收PCR产物。用限制性内切酶DpnI将原始质粒分解，将分解完的产物再用热激法转入大肠杆菌Top10，通过菌液PCR验证重组转化子，提取验证正确的转化子的质粒进行测序，从而确定相应的突变体。将测序正确的突变体，用PmeI线性化，转入毕赤酵母X33。
实施例3、高通量筛选高比活突变菌株
将实施例2得到的酵母重组转化子用牙签逐个挑至24孔板，每个孔中加入1mL含有BMGY培养基，30℃，220rpm培养24h左右，离心去上清。再分别加入1.6mL BMMY培养基进行诱导培养。培养24h后，离心取上清，将上述上清液分别取出200μL至96孔板，进行葡萄糖氧化酶酶活测定。经过高通量筛选得到6个有效突变位点分别为V20Y，T34V，D70Q，Q90R，V106I，Y509E。这6个突变体的相对比活如表1所示。
表1原始葡萄糖氧化酶和突变体葡萄糖氧化酶相对比活
编号 相对比活(％)
原始葡萄糖氧化酶 100
V20Y 123
T34V 118
D70Q 128
Q90R 119
V106I 127
Y509E 125
从表1可知，V20Y，T34V，D70Q，Q90R，V106I，Y509E这6个突变位点均能提高比活，其中以D70Q的提高幅度最大。
实施例4、易错PCR非理性改造
以上述pGAPzαA-GOD为模板，进行易错PCR随机突变扩增，具体地扩增方法是：
第一轮扩增：以载体启动子引物1(AOX5-F)：5'-gactggttccaattgacaagc-3'和引物2(AOX3-R)：5'-ggcaaatggcattctgacat-3'为引物进行PCR扩增，反应体系如下：
Buffer taq(10X) 10uL
易错dNTPs(2mM dATP，2mM dGTP，10mM dTTP,10mM dCTP) 10uL
引物1(AOX5-F,50uM) 1uL
引物2(AOX3-R,50uM) 1uL
pGAPzαA-GOD(20ng) 1uL
MgCl2(25mM) 22uL
MnSO4(12.5mM) 4uL
Taq酶 1uL
加水至 100uL
反应程序如下：
回收第一轮PCR产物，取1μL稀释50-100倍用作第二轮PCR的模板；第二、第三轮易错PCR以葡萄糖氧化酶特异性引物F及R分别替代引物AOX5-F和AOX3-R作为反应引物，第二轮易错PCR的引物为：PCR2F：5'-gaattctctaatggtattgaggcttc-3'；PCR2R：5'-tctagattactgcatagaagcgtagtc-3'；第三轮易错PCR的引物为：PCR3F：5'-gaattctctaatggtattgaggcttc-3'；PCR3R：5'-tctagattactgcatagaagcgtagtc-3'；重复PCR反应。取第二、三轮的PCR产物用XbaI和EcoRI进行酶切，连接至pGAPzαA载体上的EcoRI和XbaI位点之间。连接产物转化毕赤酵母X33，在YPDZ平板培养筛选突变菌株。经过高通量筛选获得了5个有效突变体分别为T10K，T110N，I167L，M305L和A362T。这5个突变体的相对比活如表2所示。
表2原始葡萄糖氧化酶和突变体葡萄糖氧化酶相对比活
编号 相对比活(％)
原始葡萄糖氧化酶 100
N2Y 128
T10K 121
T110N 130
I167L 126
M305L 131
从表2可知，N2Y，T10K，T110N，I167L，M305L这5个突变位点均能提高比活，其中以M305L的提高幅度最大。
实施例5、组合突变及比活检测分析
在表1和表2结果的基础上，进行组合突变，分别将原始葡萄糖氧化酶和突变体葡萄糖氧化酶进行纯化，纯化方法为镍离子柱纯化。将纯化好的葡萄糖氧化酶和突变体葡萄糖氧化酶分别测定相应的酶活性并计算出比活。以突变体比活除以原始葡萄糖氧化酶比活，来计算突变体的相对比活。通过实验最终得到五个组合突变分别命名为GOX-1、GOX-2、GOX-3、，GOX-4和GOX-5，相对比活分别为142％，169％、186％、223％和208％。GOX-1和GOX-2的部分测序结果图如图1所示。GOX-3、GOX-4和GOX-5的部分测序结果图如图2所示。
GOX-6(与GOX-4相比，2位不突变)包含的突变位点为T10K，V20Y，T34V，D70Q，V106I，T110N，M305L，Y509E，相对比活为162％。
实施例6原始葡萄糖氧化酶及突变体GOX-1至GOX-5的最适反应温度及热稳定性
在pH5.5的条件下，分别在30℃、40℃和75℃等温度下，测定葡萄糖氧化酶的酶活力，结果如图3所示。从图3可知，葡萄糖氧化酶的最适反应温度范围是35℃-40℃。
为了研究葡萄糖氧化酶和突变体GOX-1至GOX-5在不同温度下的稳定性，分别将上清液在30℃、40℃和75℃等温度下，静置5min，然后在37℃、pH5.5的条件下测定酶活，以未热处理的样品的相对酶活性为100％，结果如图4所示。从图4可知，突变体GOX-4和突变体5耐热性能较好，70℃处理5min后，酶活保留率分别为85％和67％。
序列表
<110> 广东溢多利生物科技股份有限公司
<120> 提高比活和热稳定性的葡萄糖氧化酶突变体及其编码基因和应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 583
<212> PRT
<213> Aspergillus niger GIM 3.452
<400> 1
Ser Asn Gly Ile Glu Ala Ser Leu Leu Thr Asp Pro Lys Glu Val Ala
1 5 10 15
Gly Arg Thr Val Asp Tyr Ile Ile Ala Gly Gly Gly Leu Thr Gly Leu
20 25 30
Thr Thr Ala Ala Arg Leu Thr Glu Asn Pro Asp Ile Thr Val Leu Val
35 40 45
Ile Glu Ser Gly Ser Tyr Glu Ser Asp Arg Gly Pro Ile Ile Glu Asp
50 55 60
Leu Asn Ala Tyr Gly Asp Ile Phe Gly Ser Ser Val Asp His Ala Tyr
65 70 75 80
Glu Thr Val Glu Leu Ala Thr Asn Asn Gln Thr Ala Leu Ile Arg Ser
85 90 95
Gly Asn Gly Leu Gly Gly Ser Thr Leu Val Asn Gly Gly Thr Trp Thr
100 105 110
Arg Pro His Lys Ala Gln Val Asp Ser Trp Glu Thr Val Phe Gly Asn
115 120 125
Glu Gly Trp Asn Trp Asp Ser Val Ala Ala Tyr Ser Leu Gln Ala Glu
130 135 140
Arg Ala Arg Ala Pro Asn Ala Lys Gln Ile Ala Ala Gly His Tyr Phe
145 150 155 160
Asn Ala Ser Cys His Gly Ile Asn Gly Thr Val His Ala Gly Pro Arg
165 170 175
Asp Thr Gly Asp Asp Tyr Ser Pro Ile Val Lys Ala Leu Met Ser Ala
180 185 190
Val Glu Asp Arg Gly Val Pro Thr Lys Lys Asp Leu Gly Cys Gly Asp
195 200 205
Pro His Gly Val Ser Met Phe Pro Asn Thr Leu His Glu Asp Gln Val
210 215 220
Arg Ser Asp Ala Ala Arg Glu Trp Leu Leu Pro Asn Tyr Gln Arg Pro
225 230 235 240
Asn Leu Gln Val Leu Thr Gly Gln Tyr Val Gly Lys Val Leu Leu Ser
245 250 255
Gln Asn Ala Thr Thr Pro Arg Ala Val Gly Val Glu Phe Gly Thr His
260 265 270
Lys Gly Asn Thr His Asn Val Tyr Ala Lys His Glu Val Leu Leu Ala
275 280 285
Ala Gly Ser Ala Val Ser Pro Thr Ile Leu Glu Tyr Ser Gly Ile Gly
290 295 300
Met Lys Ser Ile Leu Glu Pro Leu Gly Ile Asp Thr Val Val Asp Leu
305 310 315 320
Pro Val Gly Leu Asn Leu Gln Asp Gln Thr Thr Ser Thr Val Arg Ser
325 330 335
Arg Ile Thr Ser Ala Gly Ala Gly Gln Gly Gln Ala Ala Trp Phe Ala
340 345 350
Thr Phe Asn Glu Thr Phe Gly Asp Tyr Ala Glu Lys Ala His Glu Leu
355 360 365
Leu Asn Thr Lys Leu Glu Gln Trp Ala Glu Glu Ala Val Ala Arg Gly
370 375 380
Gly Phe His Asn Thr Thr Ala Leu Leu Ile Gln Tyr Glu Asn Tyr Arg
385 390 395 400
Asp Trp Ile Val Lys Asp Asn Val Ala Tyr Ser Glu Leu Phe Leu Asp
405 410 415
Thr Ala Gly Val Ala Ser Phe Asp Val Trp Asp Leu Leu Pro Phe Thr
420 425 430
Arg Gly Tyr Val His Ile Leu Asp Lys Asp Pro Tyr Leu Arg His Phe
435 440 445
Ala Tyr Asp Pro Gln Tyr Phe Leu Asn Glu Leu Asp Leu Leu Gly Gln
450 455 460
Ala Ala Ala Thr Gln Leu Ala Arg Asn Ile Ser Asn Ser Gly Ala Met
465 470 475 480
Gln Thr Tyr Phe Ala Gly Glu Thr Ile Pro Gly Asp Asn Leu Ala Tyr
485 490 495
Asp Ala Asp Leu Ser Ala Trp Val Glu Tyr Ile Pro Tyr Asn Phe Arg
500 505 510
Pro Asn Tyr His Gly Val Gly Thr Cys Ser Met Met Pro Lys Glu Met
515 520 525
Gly Gly Val Val Asp Asn Ala Ala Arg Val Tyr Gly Val Gln Gly Leu
530 535 540
Arg Val Ile Asp Gly Ser Ile Pro Pro Thr Gln Met Ser Ser His Val
545 550 555 560
Met Thr Val Phe Tyr Ala Met Ala Leu Lys Ile Ala Asp Ala Ile Leu
565 570 575
Ala Asp Tyr Ala Ser Met Gln
580
<210> 2
<211> 583
<212> PRT
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 2
Ser Asn Gly Ile Glu Ala Ser Leu Leu Lys Asp Pro Lys Glu Val Ala
1 5 10 15
Gly Arg Thr Tyr Asp Tyr Ile Ile Ala Gly Gly Gly Leu Thr Gly Leu
20 25 30
Thr Val Ala Ala Arg Leu Thr Glu Asn Pro Asp Ile Thr Val Leu Val
35 40 45
Ile Glu Ser Gly Ser Tyr Glu Ser Asp Arg Gly Pro Ile Ile Glu Asp
50 55 60
Leu Asn Ala Tyr Gly Gln Ile Phe Gly Ser Ser Val Asp His Ala Tyr
65 70 75 80
Glu Thr Val Glu Leu Ala Thr Asn Asn Gln Thr Ala Leu Ile Arg Ser
85 90 95
Gly Asn Gly Leu Gly Gly Ser Thr Leu Ile Asn Gly Gly Thr Trp Thr
100 105 110
Arg Pro His Lys Ala Gln Val Asp Ser Trp Glu Thr Val Phe Gly Asn
115 120 125
Glu Gly Trp Asn Trp Asp Ser Val Ala Ala Tyr Ser Leu Gln Ala Glu
130 135 140
Arg Ala Arg Ala Pro Asn Ala Lys Gln Ile Ala Ala Gly His Tyr Phe
145 150 155 160
Asn Ala Ser Cys His Gly Ile Asn Gly Thr Val His Ala Gly Pro Arg
165 170 175
Asp Thr Gly Asp Asp Tyr Ser Pro Ile Val Lys Ala Leu Met Ser Ala
180 185 190
Val Glu Asp Arg Gly Val Pro Thr Lys Lys Asp Leu Gly Cys Gly Asp
195 200 205
Pro His Gly Val Ser Met Phe Pro Asn Thr Leu His Glu Asp Gln Val
210 215 220
Arg Ser Asp Ala Ala Arg Glu Trp Leu Leu Pro Asn Tyr Gln Arg Pro
225 230 235 240
Asn Leu Gln Val Leu Thr Gly Gln Tyr Val Gly Lys Val Leu Leu Ser
245 250 255
Gln Asn Ala Thr Thr Pro Arg Ala Val Gly Val Glu Phe Gly Thr His
260 265 270
Lys Gly Asn Thr His Asn Val Tyr Ala Lys His Glu Val Leu Leu Ala
275 280 285
Ala Gly Ser Ala Val Ser Pro Thr Ile Leu Glu Tyr Ser Gly Ile Gly
290 295 300
Leu Lys Ser Ile Leu Glu Pro Leu Gly Ile Asp Thr Val Val Asp Leu
305 310 315 320
Pro Val Gly Leu Asn Leu Gln Asp Gln Thr Thr Ser Thr Val Arg Ser
325 330 335
Arg Ile Thr Ser Ala Gly Ala Gly Gln Gly Gln Ala Ala Trp Phe Ala
340 345 350
Thr Phe Asn Glu Thr Phe Gly Asp Tyr Ala Glu Lys Ala His Glu Leu
355 360 365
Leu Asn Thr Lys Leu Glu Gln Trp Ala Glu Glu Ala Val Ala Arg Gly
370 375 380
Gly Phe His Asn Thr Thr Ala Leu Leu Ile Gln Tyr Glu Asn Tyr Arg
385 390 395 400
Asp Trp Ile Val Lys Asp Asn Val Ala Tyr Ser Glu Leu Phe Leu Asp
405 410 415
Thr Ala Gly Val Ala Ser Phe Asp Val Trp Asp Leu Leu Pro Phe Thr
420 425 430
Arg Gly Tyr Val His Ile Leu Asp Lys Asp Pro Tyr Leu Arg His Phe
435 440 445
Ala Tyr Asp Pro Gln Tyr Phe Leu Asn Glu Leu Asp Leu Leu Gly Gln
450 455 460
Ala Ala Ala Thr Gln Leu Ala Arg Asn Ile Ser Asn Ser Gly Ala Met
465 470 475 480
Gln Thr Tyr Phe Ala Gly Glu Thr Ile Pro Gly Asp Asn Leu Ala Tyr
485 490 495
Asp Ala Asp Leu Ser Ala Trp Val Glu Tyr Ile Pro Glu Asn Phe Arg
500 505 510
Pro Asn Tyr His Gly Val Gly Thr Cys Ser Met Met Pro Lys Glu Met
515 520 525
Gly Gly Val Val Asp Asn Ala Ala Arg Val Tyr Gly Val Gln Gly Leu
530 535 540
Arg Val Ile Asp Gly Ser Ile Pro Pro Thr Gln Met Ser Ser His Val
545 550 555 560
Met Thr Val Phe Tyr Ala Met Ala Leu Lys Ile Ala Asp Ala Ile Leu
565 570 575
Ala Asp Tyr Ala Ser Met Gln
580
<210> 3
<211> 583
<212> PRT
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 3
Ser Tyr Gly Ile Glu Ala Ser Leu Leu Lys Asp Pro Lys Glu Val Ala
1 5 10 15
Gly Arg Thr Tyr Asp Tyr Ile Ile Ala Gly Gly Gly Leu Thr Gly Leu
20 25 30
Thr Val Ala Ala Arg Leu Thr Glu Asn Pro Asp Ile Thr Val Leu Val
35 40 45
Ile Glu Ser Gly Ser Tyr Glu Ser Asp Arg Gly Pro Ile Ile Glu Asp
50 55 60
Leu Asn Ala Tyr Gly Gln Ile Phe Gly Ser Ser Val Asp His Ala Tyr
65 70 75 80
Glu Thr Val Glu Leu Ala Thr Asn Asn Gln Thr Ala Leu Ile Arg Ser
85 90 95
Gly Asn Gly Leu Gly Gly Ser Thr Leu Ile Asn Gly Gly Asn Trp Thr
100 105 110
Arg Pro His Lys Ala Gln Val Asp Ser Trp Glu Thr Val Phe Gly Asn
115 120 125
Glu Gly Trp Asn Trp Asp Ser Val Ala Ala Tyr Ser Leu Gln Ala Glu
130 135 140
Arg Ala Arg Ala Pro Asn Ala Lys Gln Ile Ala Ala Gly His Tyr Phe
145 150 155 160
Asn Ala Ser Cys His Gly Ile Asn Gly Thr Val His Ala Gly Pro Arg
165 170 175
Asp Thr Gly Asp Asp Tyr Ser Pro Ile Val Lys Ala Leu Met Ser Ala
180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Arg Ser Asp Ala Ala Arg Glu Trp Leu Leu Pro Asn Tyr Gln Arg Pro
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Asn Leu Gln Val Leu Thr Gly Gln Tyr Val Gly Lys Val Leu Leu Ser
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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485 490 495
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500 505 510
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Gly Gly Val Val Asp Asn Ala Ala Arg Val Tyr Gly Val Gln Gly Leu
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Arg Val Ile Asp Gly Ser Ile Pro Pro Thr Gln Met Ser Ser His Val
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<211> 583
<212> PRT
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 4
Ser Asn Gly Ile Glu Ala Ser Leu Leu Thr Asp Pro Lys Glu Val Ala
1 5 10 15
Gly Arg Thr Tyr Asp Tyr Ile Ile Ala Gly Gly Gly Leu Thr Gly Leu
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
Leu Asn Ala Tyr Gly Gln Ile Phe Gly Ser Ser Val Asp His Ala Tyr
65 70 75 80
Glu Thr Val Glu Leu Ala Thr Asn Asn Arg Thr Ala Leu Ile Arg Ser
85 90 95
Gly Asn Gly Leu Gly Gly Ser Thr Leu Ile Asn Gly Gly Thr Trp Thr
100 105 110
Arg Pro His Lys Ala Gln Val Asp Ser Trp Glu Thr Val Phe Gly Asn
115 120 125
Glu Gly Trp Asn Trp Asp Ser Val Ala Ala Tyr Ser Leu Gln Ala Glu
130 135 140
Arg Ala Arg Ala Pro Asn Ala Lys Gln Ile Ala Ala Gly His Tyr Phe
145 150 155 160
Asn Ala Ser Cys His Gly Val Asn Gly Thr Val His Ala Gly Pro Arg
165 170 175
Asp Thr Gly Asp Asp Tyr Ser Pro Ile Val Lys Ala Leu Met Ser Ala
180 185 190
Val Glu Asp Arg Gly Val Pro Thr Lys Lys Asp Leu Gly Cys Gly Asp
195 200 205
Pro His Gly Val Ser Met Phe Pro Asn Thr Leu His Glu Asp Gln Val
210 215 220
Arg Ser Asp Ala Ala Arg Glu Trp Leu Leu Pro Asn Tyr Gln Arg Pro
225 230 235 240
Asn Leu Gln Val Leu Thr Gly Gln Tyr Val Gly Lys Val Leu Leu Ser
245 250 255
Gln Asn Ala Thr Thr Pro Arg Ala Val Gly Val Glu Phe Gly Thr His
260 265 270
Lys Gly Asn Thr His Asn Val Tyr Ala Lys His Glu Val Leu Leu Ala
275 280 285
Ala Gly Ser Ala Val Ser Pro Thr Ile Leu Glu Tyr Ser Gly Ile Gly
290 295 300
Leu Lys Ser Ile Leu Glu Pro Leu Gly Ile Asp Thr Val Val Asp Leu
305 310 315 320
Pro Val Gly Leu Asn Leu Gln Asp Gln Thr Thr Ser Thr Val Arg Ser
325 330 335
Arg Ile Thr Ser Ala Gly Ala Gly Gln Gly Gln Ala Ala Trp Phe Ala
340 345 350
Thr Phe Asn Glu Thr Phe Gly Asp Tyr Ala Glu Lys Ala His Glu Leu
355 360 365
Leu Asn Thr Lys Leu Glu Gln Trp Ala Glu Glu Ala Val Ala Arg Gly
370 375 380
Gly Phe His Asn Thr Thr Ala Leu Leu Ile Gln Tyr Glu Asn Tyr Arg
385 390 395 400
Asp Trp Ile Val Lys Asp Asn Val Ala Tyr Ser Glu Leu Phe Leu Asp
405 410 415
Thr Ala Gly Val Ala Ser Phe Asp Val Trp Asp Leu Leu Pro Phe Thr
420 425 430
Arg Gly Tyr Val His Ile Leu Asp Lys Asp Pro Tyr Leu Arg His Phe
435 440 445
Ala Tyr Asp Pro Gln Tyr Phe Leu Asn Glu Leu Asp Leu Leu Gly Gln
450 455 460
Ala Ala Ala Thr Gln Leu Ala Arg Asn Ile Ser Asn Ser Gly Ala Met
465 470 475 480
Gln Thr Tyr Phe Ala Gly Glu Thr Ile Pro Gly Asp Asn Leu Ala Tyr
485 490 495
Asp Ala Asp Leu Ser Ala Trp Val Glu Tyr Ile Pro Tyr Asn Phe Arg
500 505 510
Pro Asn Tyr His Gly Val Gly Thr Cys Ser Met Met Pro Lys Glu Met
515 520 525
Gly Gly Val Val Asp Asn Ala Ala Arg Val Tyr Gly Val Gln Gly Leu
530 535 540
Arg Val Ile Asp Gly Ser Ile Pro Pro Thr Gln Met Ser Ser His Val
545 550 555 560
Met Thr Val Phe Tyr Ala Met Ala Leu Lys Ile Ala Asp Ala Ile Leu
565 570 575
Ala Asp Tyr Ala Ser Met Gln
580
<210> 5
<211> 1752
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> 5
tcttatggta ttgaggcttc cttgttgaag gacccaaaag aggtcgccgg tagaacctac 60
gactacatca ttgccggtgg tggtttgacc ggtttgaccg tcgctgctag attgaccgag 120
aatcctgaca tcactgtttt ggttattgag tccggttcct acgagtctga ccgtggtcca 180
attattgagg atttgaatgc ctacggtcaa atcttcggat cttctgtcga ccacgcctat 240
gagaccgttg agttggctac taacaatcaa actgctttga tccgttccgg taacggtttg 300
ggaggatcca ctttgattaa cggtggaaac tggactagac cacataaagc ccaagtcgac 360
tcctgggaga ctgtcttcgg aaacgaaggt tggaactggg actctgttgc tgcttactcc 420
cttcaggctg aaagagctcg tgccccaaat gctaagcaga tcgccgctgg tcactacttt 480
aacgcctctt gccacggtat taacggtact gttcacgctg gaccacgtga tactggtgat 540
gactactctc caatcgtcaa ggccttgatg tctgctgtcg aagatcgtgg agtccctacc 600
aagaaggact tgggttgcgg agaccctcat ggtgtctcca tgttcccaaa caccttgcac 660
gaggaccaag ttcgttccga cgctgccaga gaatggttgc ttcctaacta ccagagacca 720
aacttgcagg tcttgactgg tcagtacgtc ggtaaggtct tgttgtctca gaacgctacc 780
accccaagag ctgttggtgt cgagttcggt actcacaagg gtaacaccca caacgtctac 840
gctaagcatg aggtcctttt ggccgccggt tctgccgttt ccccaaccat cttggagtat 900
tctggaattg gtctgaaatc tattttggag cctttgggaa tcgacaccgt tgttgacctt 960
ccagttggtt tgaacttgca ggaccagacc acctccactg tccgttctcg tattacttcc 1020
gctggtgctg gacaaggtca agctgcctgg ttcgctacct tcaatgagac ctttggtgat 1080
tacgccgaga aggcccacga gttgttgaac accaagttgg agcaatgggc tgaagaggct 1140
gtcgctagag gtggattcca taataccacc gccttgttga tccaatacga aaattataga 1200
gattggattg ttaaggacaa tgttgcttac tccgagttgt ttttggatac cgccggagtc 1260
gcttcctttg acgtctggga cttgttgcct ttcacccgtg gttacgttca cattttggac 1320
aaagatcctt acttgcgtca cttcgcctac gacccacagt acttcttgaa cgagttggac 1380
ttgttgggtc aagctgctgc tactcagttg gcccgtaaca tttctaactc tggtgccatg 1440
caaacctact tcgctggaga gaccattcca ggagacaact tggcctacga tgccgacttg 1500
tctgcctggg tcgagtacat ccctgaaaac ttccgtccaa actatcacgg tgtcggaacc 1560
tgctccatga tgccaaagga aatgggtgga gtcgtcgaca atgccgctcg tgtttacgga 1620
gtccagggtt tgagagtcat cgacggttct atcccaccaa cccaaatgtc ctcccacgtc 1680
atgactgtct tctacgctat ggccttgaag atcgctgacg ctattcttgc tgactacgct 1740
tctatgcagt aa 1752

Claims (9)

1.提高比活和热稳定性的葡萄糖氧化酶突变体，其特征在于，由氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的葡萄糖氧化酶突变得到，突变位点包括如下位点中的一个或多个：第2位由N突变为Y、第10位由T突变为K、第20位由V变为Y、第34位由T突变为V、第70位由D突变为Q、第90位由Q突变为R、第106位由V突变为I、第110位由T突变为N、第167位由I突变为L、第305位由M突变为L和第509位由Y突变为E。
2.根据权利要求1所述的提高比活和热稳定性的葡萄糖氧化酶突变体，其特征在于，所述突变位点为N2Y，V20Y，T34V，D70Q，Q90R，V106I和M305L；或所述突变位点为T10K，V20Y，T34V，D70Q，Q90R，V106I，T110N和Y509E；或所述突变位点为T10K，V20Y，T34V，D70Q，V106I，M305L和Y509E；或所述突变位点为N2Y，T10K，V20Y，T34V，D70Q，V106I，T110N，M305L和Y509E；或所述突变位点为V20Y，T34V，D70Q，Q90R，V106I，I167L和M305L。
3.根据权利要求2所述的提高比活和热稳定性的葡萄糖氧化酶突变体，其特征在于，所述突变位点为N2Y，T10K，V20Y，T34V，D70Q，V106I，T110N，M305L和Y509E。
4.提高比活和热稳定性的葡萄糖氧化酶突变体基因，其特征在于，编码权利要求1至3中任一项所述的葡萄糖氧化酶突变体的基因。
5.根据权利要求4所述的提高比活和热稳定性的葡萄糖氧化酶突变体基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；或为与SEQ ID NO.5所示序列具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白质的序列。
6.提高葡萄糖氧化酶比活和热稳定性的方法，其特征在于，将氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的葡萄糖氧化酶突变，突变位点包括如下位点中的一个或多个：第2位由N突变为Y、第10位由T突变为K、第20位由V变为Y、第34位由T突变为V、第70位由D突变为Q、第90位由Q突变为R、第106位由V突变为I、第110位由T突变为N、第167位由I突变为L、第305位由M突变为L和第509位由Y突变为E。
7.包含权利要求4或5所述葡萄糖氧化酶突变体基因的重组载体。
8.包含权利要求4或5所述葡萄糖氧化酶突变体基因的宿主细胞。
9.根据权利要求1至3所述的提高比活和热稳定性的葡萄糖氧化酶突变体在饲料添加剂、食品添加剂、葡萄糖酸钠或葡萄糖酸钙的生产中的应用。
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