CN110117583B - 热稳定和比活提高的植酸酶ecappa突变体及其基因和应用 - Google Patents

热稳定和比活提高的植酸酶ecappa突变体及其基因和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及热稳定和比活提高的植酸酶ECAPPA突变体及其基因和应用，氨基酸序列如SEQ ID NO.1的植酸酶的第74，82，97，159，179，376，389，402位氨基酸被突变。相对于原始植酸酶ECAPPA的21％的保留率，突变后植酸酶在80℃处理5分钟，酶活保留率提高到34％‑89％。

Description

热稳定和比活提高的植酸酶ECAPPA突变体及其基因和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及热稳定和比活提高的植酸酶ECAPPA突变体及其基因和应用。
背景技术
植酸(Phytate，Phytic acid，IP6)又称肌醇六磷酸脂，含有6个磷酸基团，带有丰富的磷，是饲料中磷的重要贮存形式。磷是动物体内必须的矿物元素，由于单胃动物体内缺乏分解植酸酶，植酸不能直接被单胃动物利用吸收。植酸酶(Phytase)能够催化植酸及植酸盐水解成肌醇与磷酸(或磷酸盐)。饲料中添加植酸酶，不仅可以提高动物对饲料中植酸磷的利用率，减少磷对环境的污染，还可以降低植酸磷的抗营养作用。
植酸酶广泛存在于动物、植物和微生物中，目前市场上商品化的植酸酶均来源与微生物。研究表明来源于大肠杆菌的植酸酶(ECAPPA)是迄今所知的分解植酸能力最强的植酸酶，其pH特性较好，但其热稳定性较差，在制粒高温过程中其活性损失大，使得大肠杆菌植酸酶ECAPPA在颗粒饲料应用受到抑制。颗粒饲料生产过程中有一段短暂的80℃-90℃的喷粉过程，植酸酶的热稳定性使其在颗粒饲料的应用受到抑制。因此怎样提高植酸酶热稳定性是企业提高产品质量的关注焦点。
发明内容
本发明的目的是通过对来源于大肠杆菌的植酸酶(ECAPPA)进行分子改造，使改造后的植酸酶具有更高的比活，降低生产成本。
本发明的目的是提供提高比活的植酸酶ECAPPA突变体及其基因。
本发明采用定点饱和突变的方法对SEQ ID NO.1所示的ECAPPA的植酸酶的第74位，第82位，第97位，第159位，第179位，第376位，第389位和第402位进行分子改造，经过高通量筛选得到一系列提高比活的植酸酶突变体。
根据本发明的热稳定性提高的植酸酶突变体为氨基酸例如SEQ ID NO.1所示的植酸酶在以下突变位点发生突变而得，
所述突变位点为：
(1)G74A，H82S，K97D，N159C，G179Q，F376W，S389Y，G402P；
(2)G74C，H82D，K97C，N159Q，G179S，F376W，S389Y，G402P；
(3)G74Y，H82Q，K97D，N159Q，G179P，F376Y，S389D，G402Y；
(4)G74C，H82Q，K97P，N159P，G179R，F376A，S389Y，G402P；
(5)G74A，H82S，K97E，N159P，G179S，F376N，S389Y，G402A；
(6)G74C，H82Q，K97Q，N159P，G179Q，F376W，S389Y，G402P；
(7)G74Y，H82D，K97E，N159C，G179Q，F376Y，S389D，G402Y；或
(8)G74A，H82S，K97P，N159C，G179Q，F376W，S389Y，G402P。
本发明还提供了编码上述热稳定性提高的植酸酶突变体的基因。
本发明还提供了一种饲料添加剂，其包含上述热稳定性提高的植酸酶突变体。
本发明还提供了包含上述突变体基因的重组载体，根据本发明的具体实施方式，用于表达所述植酸酶突变体的表达载体是pPICZαA和pPIC9K。
本发明还提供了包含上述突变体基因的重组菌株，根据本发明的具体实施方式，用于所述表达载体的宿主细胞是毕赤酵母X33和GS115。
本发明还提供了制备上述高热稳定性植酸酶的方法，包括以下步骤：
1)用上述重组载体转化宿主细胞，获得重组菌株；
2)对重组菌株进行发酵，诱导重组植酸酶的表达。
本发明植酸酶的氨基酸进行定点饱和突变，再将突变点组合从而得到更优的酶蛋白，一共筛选到8中热稳定性比原始植酸酶高的突变体。相对于原始植酸酶ECAPPA的21％的保留率，突变后植酸酶在80℃处理5分钟，酶活保留率提高到34％-89％。
具体实施方式
以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实验材料和试剂：
1、菌株与载体
大肠杆菌菌株Topl0、大肠杆菌菌株OrigamiB、pET-22b(+)。
2、酶与试剂盒
Q5高保真PCR扩增酶、限制性内切酶购自NEB(北京)有限公司；质粒提取、DNA胶回收纯化试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。
3、培养基
大肠杆菌培养基为LB(1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，pH7.0)。LB-Amp为LB培养基加100ug/mL氨苄青霉素。
实施例1、植酸酶基因的合成及克隆
以大肠杆菌来源的植酸酶EcAPPA的氨基酸序列作为参考(如SEQ ID NO.1所示)，人工合成该基因。
根据基因5'端设计PCR引物含有NdeI内切酶位点，3'端设计PCR引物含EcoRI内切酶位点，引物序列如下：
5'端引物NdeI-PHd-F1：GGATTACCATATGATGTCAGATATGAAAAGCGGAAACA
3'端引物EcoRI-PHd-R1：CGGAATTCTTATTTGTCTTGATGGAGAGCGCAC
以合成基因ECECAPPA为模板，用上述引物进行PCR扩增，将扩增得到的片段切胶回收，用NdeI和EcoRI双酶切，连接到pET-22b(+)载体的NdeI和EcoRI位点，转化Top10大肠杆菌，LB-Amp平板培养获得pET-22b-PHd阳性菌落。
实施例2、基因定点饱和突变
对植酸酶ECAPPA的氨基酸进行定点饱和突变，分别为第47位，第74位，第82位，第97位，第159位，第179位，第201位，第225位，第253位，第298位，第299位，第376位，第389位和第402位。针对性的设计了14对饱和突变引物，目的基因突变位点统一为NNS，NNS左右各取15个碱基构成正向引物；反向引物与正向引物完全互补，其中，N代表A,T,C,G等四种碱基，S代表C,G两种碱基。
以重组载体pET-22b-ECAPPA为模板，加入突变位点的正反向引物，Q5高保真PCR酶进行PCR扩增，产物经DpnI酶切处理后电击转化OrigamiB大肠杆菌感受态细胞，在LB-Amp平板筛选阳性突变重组克隆。每个突变位点挑取186个单克隆接种到96孔深孔板。每个平板挑选3个未突变的克隆为对照。每孔含500uL培养基LB-Amp。37℃摇床200rpm培养5小时，转移50uL菌液到新的96孔平板保种后，平板每孔剩余菌液添加含有IPTG的50uL LB-Amp培养基，并使每孔的IPTG终浓度为0.5mM，37℃摇床200rpm过夜诱导表达植酸酶。含有过夜培养诱导表达植酸酶的酶液在80℃水浴锅加热处理5分钟后，检测培养液中存留植酸酶活性。植酸酶初步耐热活性检测根据中华人民共和国国家标准《GB/T 18634-2002》进行。
根据植酸酶活性检测结果，植酸酶耐温性高于对照克隆组挑选为阳性克隆。从保种板上挑选阳性克隆集中到96孔平板重复上述的培养、诱导表达、酶活测定筛选试验。确定耐温性提高的为阳性突变克隆，提取阳性克隆质粒DNA进行基因测序。
实施例3、组合突变
第74位：G74A，G74C，G74Y；
第82位：H82D，H82Q，H82S；
第97位：K97D，K97C，K97Q，K97E，K97P；
第159位：N159C，N159Q，N159P；
第179位：G179S，G179Q，G179R，G179P；
第376位：F376W，F376Y，F376A，F376N
第389位：S389Y，S389D；
第402位：G402P，G402A，G402Y；
最终得到8个组合突变分别命名为ECAPPA-1、ECAPPA-2、ECAPPA-3、ECAPPA-4、ECAPPA-5、ECAPPA-6、ECAPPA-7、ECAPPA-8。
其中，
EcECAPPA-1包含的突变位点为：G74A，H82S，K97D，N159C，G179Q，F376W，S389Y，G402P。
EcECAPPA-2包含的突变位点为：G74C，H82D，K97C，N159Q，G179S，F376W，S389Y，G402P。
EcECAPPA-3包含的突变位点为：G74Y，H82Q，K97D，N159Q，G179P，F376Y，S389D，G402Y。
EcECAPPA-4包含的突变位点为：G74C，H82Q，K97P，N159P，G179R，F376A，S389Y，G402P。
EcECAPPA-5包含的突变位点为：G74A，H82S，K97E，N159P，G179S，F376N，S389Y，G402A。
EcECAPPA-6包含的突变位点为：G74C，H82Q，K97Q，N159P，G179Q，F376W，S389Y，G402P。
EcECAPPA-7包含的突变位点为：G74Y，H82D，K97E，N159C，G179Q，F376Y，S389D，G402Y。
EcECAPPA-8包含的突变位点为：G74A，H82S，K97P，N159C，G179Q，F376W，S389Y，G402P。
实施例4、植酸酶EcAPPA毕赤酵母表达载体的构建
根据植酸酶EcAPPA基因，5'端设计PCR引物含有EcoRI内切酶位点，3'端设计PCR引物含NotI内切酶位点，引物序列如下：5'端引物EcoRI-EcAPPA-F1：GTAGAATTCCAGAGTGAGCCTGAGTTG3'端引物NotI-EcAPPA-R1：ATTGCGGCCGCTTACTACAAGGAACAAGCTGG
以合成基因APPA为模板，用上述引物进行PCR扩增，将扩增得到的片段，用限制性内切酶EcoRI和NotI双酶切，纯化，连接到pPICZαA载体EcoRI和NotI位点，使植酸酶APPA基因插入到上述表达载体的信号肽序列的下游。连接产物转化Top10大肠杆菌，LB-Zeo平板培养获得pPICZαA-EcAPPA阳性菌落，提取pPICZαA-EcAPPA阳性菌落质粒。
实施例5、植酸酶的活性测定
按照中华人民共和国国家标准《GB/T 18634-2002》进行。植酸酶活性定义是指样品在植酸钠浓度为5.0mmol/L、温度37℃、pH值5.5的条件下，每min从植酸钠中释放l pmol无机磷，即为一个植酸酶活性单位，以U表示。
U＝FxC/(Vx30)
式中：U-试样中植酸酶的活性，U/mL；C-根据实际样液的吸光值由直线回归方程计算出的酶活性，U；F-试样溶液反应前的总稀释倍数；V-试样体积，mL；30-反应时间，min。
标准曲线的制定如表1：
磷浓度(mmol/L) 0 1.5625 3.125 6.25 12.5 25
OD值 0 0.054 0.109 0.212 0.437 0.942
实施例6、原始植酸酶及突变植酸酶的比活分析
采用镍亲和层析分别对原始植酸酶APPA和突变植酸酶进行纯化，测定纯化的原始植酸酶和突变植酸酶的酶活和蛋白含量，计算出它们的比活。以突变体提高的比活与原始植酸酶比活之比表示突变体比活的提高幅度。(具体结果见表1)。
表1原始植酸酶和植酸酶突变体的相对比活
编号 相对比活(％)
原始植酸酶APPA 100
ECAPPA-1 66
ECAPPA-2 132
ECAPPA-3 74
ECAPPA-4 146
ECAPPA-5 88
ECAPPA-6 104
ECAPPA-7 125
ECAPPA-8 95
实施例7、原始植酸酶及突变植酸酶的热稳定性比较
将植酸酶酶液置于玻璃试管中，在80℃温度下热处理5min，测定残留植酸酶活力，以未处理的酶活力为对照，热处理后的酶活与之相比，即得到该温度下剩余的相对酶活。
8个提高植酸酶酶活的突变体，相对于原始植酸酶ECAPPA的21％的保留率，突变后植酸酶在80℃处理5分钟，酶活保留率提高到34％-89％。
表2原始植酸酶和8个突变体植酸酶耐热结果
编号 80℃处理酶活保留率
原始植酸酶 21％
ECAPPA-1 42％
ECAPPA-2 34％
ECAPPA-3 46％
ECAPPA-4 36％
ECAPPA-5 89％
ECAPPA-6 56％
ECAPPA-7 39％
ECAPPA-8 55％
实施例8、综合分析8个突变体植酸酶
本发明采用定点饱和突变的方法对SEQ ID NO.10所示的ECAPPA的植酸酶的第74位，第82位，第97位，第159位，第179位，第376位，第389位和第402位进行分子改造，经过高通量筛选得到一系列性能提高的植酸酶突变体。综合分析8个突变体植酸酶的比活和热稳定性分析，筛选到了比活和耐热都提高的突变体有4个，分别是ECAPPA-2突变体，ECAPPA-4突变体，ECAPPA-6突变体，ECAPPA-7突变体。(具体结果见表3)。
表3原始植酸酶和植酸酶突变体的相对比活
编号 相对比活(％) 80℃处理酶活保留率
原始植酸酶APPA 100 21％
ECAPPA-2 132 34％
ECAPPA-4 146 36％
ECAPPA-6 104 56％
ECAPPA-7 125 39％
ECAPPA-2突变体，ECAPPA-4突变体，ECAPPA-6突变体，ECAPPA-7突变体比活分别提高32％，46％，4％，25％，其中比活提高最多的为ECAPPA-4突变体。相对于原始植酸酶ECAPPA的21％的保留率，ECAPPA-2突变体，ECAPPA-4突变体，ECAPPA-6突变体，ECAPPA-7突变体在80℃处理5分钟，酶活保留率提高到34％，36％，56％，39％，提高幅度最高的突变体是ECAPPA-6突变体。综合分析ECAPPA-2突变体，ECAPPA-4突变体，ECAPPA-6突变体，ECAPPA-7突变体性能在比活和耐热都有较大提升，在实际生产中具有重要应用效果。
ECAPPA-1突变体，ECAPPA-3突变体，ECAPPA-5突变体，ECAPPA-8突变体比活下降，相对原始植酸酶比活分别下降33％，26％，12％，5％。但在80℃热处理条件下热稳定性大幅度提升，分别提高1倍，1.2倍，3.2倍和1.6倍，提升效果显著，在实际应用同样具有重要价值。
表4原始植酸酶和植酸酶突变体的相对比活
编号 相对比活(％) 80℃处理酶活保留率
原始植酸酶APPA 100 21％
ECAPPA-1 66 42％
ECAPPA-3 74 46％
ECAPPA-5 88 89％
ECAPPA-8 95 55％
序列表
<110> 广东溢多利生物科技股份有限公司
<120> 热稳定和比活提高的植酸酶ECAPPA突变体及其基因和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 433
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 1
Met Lys Ala Ile Leu Ile Pro Phe Leu Ser Leu Leu Ile Pro Leu Thr
1 5 10 15
Pro Gln Ser Ala Phe Ala Gln Ser Glu Pro Glu Leu Lys Leu Glu Ser
20 25 30
Val Val Ile Val Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Ala Thr
35 40 45
Gln Leu Met Gln Asp Val Thr Pro Asp Ala Trp Pro Thr Trp Pro Val
50 55 60
Lys Leu Gly Trp Leu Thr Pro Arg Gly Gly Glu Leu Ile Ala Tyr Leu
65 70 75 80
Gly His Tyr Gln Arg Gln Arg Leu Val Ala Asp Gly Leu Leu Ala Lys
85 90 95
Lys Gly Cys Pro Gln Pro Gly Gln Val Ala Ile Ile Ala Asp Val Asp
100 105 110
Glu Arg Thr Arg Lys Thr Gly Glu Ala Phe Ala Ala Gly Leu Ala Pro
115 120 125
Asp Cys Ala Ile Thr Val His Thr Gln Ala Asp Thr Ser Ser Pro Asp
130 135 140
Pro Leu Phe Asn Pro Leu Lys Thr Gly Val Cys Gln Leu Asp Asn Ala
145 150 155 160
Asn Val Thr Asp Ala Ile Leu Ser Arg Ala Gly Gly Ser Ile Ala Asp
165 170 175
Phe Thr Gly His Arg Gln Thr Ala Phe Arg Glu Leu Glu Arg Val Leu
180 185 190
Asn Phe Pro Gln Ser Asn Leu Cys Leu Asn Arg Glu Lys Gln Asp Glu
195 200 205
Ser Cys Ser Leu Thr Gln Ala Leu Pro Ser Glu Leu Lys Val Ser Ala
210 215 220
Asp Asn Val Ser Leu Thr Gly Ala Val Ser Leu Ala Ser Met Leu Thr
225 230 235 240
Glu Ile Phe Leu Leu Gln Gln Ala Gln Gly Met Pro Glu Pro Gly Trp
245 250 255
Gly Arg Ile Thr Asp Ser His Gln Trp Asn Thr Leu Leu Ser Leu His
260 265 270
Asn Ala Gln Phe Tyr Leu Leu Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser
275 280 285
Arg Ala Thr Pro Leu Leu Asp Leu Ile Met Ala Ala Leu Thr Pro His
290 295 300
Pro Pro Gln Lys Gln Ala Tyr Gly Val Thr Leu Pro Thr Ser Val Leu
305 310 315 320
Phe Ile Ala Gly His Asp Thr Asn Leu Ala Asn Leu Gly Gly Ala Leu
325 330 335
Glu Leu Asn Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly
340 345 350
Gly Glu Leu Val Phe Glu Arg Trp Arg Arg Leu Ser Asp Asn Ser Gln
355 360 365
Trp Ile Gln Val Ser Leu Val Phe Gln Thr Leu Gln Gln Met Arg Asp
370 375 380
Lys Thr Pro Leu Ser Leu Asn Thr Pro Pro Gly Glu Val Lys Leu Thr
385 390 395 400
Leu Gly Gly Cys Glu Glu Arg Asn Ala Gln Gly Met Cys Ser Leu Ala
405 410 415
Gly Phe Thr Gln Ile Ala Asn Glu Ala Arg Ile Pro Ala Cys Ala Leu
420 425 430
His

Claims (8)

1.热稳定性提高的植酸酶突变体，其特征在于，所述突变体为氨基酸例如SEQ ID NO.1所示的植酸酶在以下突变位点发生突变而得，所述突变位点为：G74A，H82S，K97P，N159C，G179Q，F376W，S389Y，G402P。
2.热稳定性提高的植酸酶突变体基因，其特征在于，编码权利要求1所述的热稳定性提高的植酸酶突变体。
3.包含权利要求2所述热稳定性提高的植酸酶突变体基因的重组载体。
4.包含权利要求2所述热稳定性提高的植酸酶突变体基因的重组细胞。
5.根据权利要求4所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞为重组酵母细胞。
6.权利要求1所述的热稳定性提高的植酸酶突变体用于水解植酸的应用。
7.一种饲料添加剂，其特征在于，包含权利要求1所述的热稳定性提高的植酸酶突变体。
8.一种制备权利要求1所述的热稳定性提高的植酸酶突变体的方法，其特征在于，所述方法包括在宿主细胞中表达权利要求2所述热稳定性提高的植酸酶突变体基因的步骤。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110724676B (zh) * 2019-10-21 2021-09-07 广东溢多利生物科技股份有限公司 一种植酸酶突变体及其载体与应用
CN113862237B (zh) * 2021-12-02 2022-03-25 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 提高植酸酶的热稳定性的方法及突变体、基因和应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102559632A (zh) * 2010-12-22 2012-07-11 武汉新华扬生物股份有限公司 一种在酸性范围内催化活性提高的优化改良的大肠杆菌植酸酶appa-m及其基因和应用
CN104313041A (zh) * 2000-05-25 2015-01-28 维莱尼姆公司 重组细菌肌醇六磷酸酶及其用途
CN105219749A (zh) * 2015-11-04 2016-01-06 广东溢多利生物科技股份有限公司 优化改良的植酸酶突变体及其编码基因和应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6841370B1 (en) * 1999-11-18 2005-01-11 Cornell Research Foundation, Inc. Site-directed mutagenesis of Escherichia coli phytase
EP2069486A2 (en) * 2006-08-03 2009-06-17 Cornell Research Foundation, Inc. Phytases with improved thermal stability

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104313041A (zh) * 2000-05-25 2015-01-28 维莱尼姆公司 重组细菌肌醇六磷酸酶及其用途
CN102559632A (zh) * 2010-12-22 2012-07-11 武汉新华扬生物股份有限公司 一种在酸性范围内催化活性提高的优化改良的大肠杆菌植酸酶appa-m及其基因和应用
CN105219749A (zh) * 2015-11-04 2016-01-06 广东溢多利生物科技股份有限公司 优化改良的植酸酶突变体及其编码基因和应用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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