CN113832126A

CN113832126A - 一种提高植酸酶热稳定性的方法及融合植酸酶

Info

Publication number: CN113832126A
Application number: CN202111425130.6A
Authority: CN
Inventors: 黄火清; 涂涛; 王倩; 姚斌; 罗会颖; 王苑; 柏映国; 苏小运; 王亚茹; 张�杰; 秦星; 王晓璐; 张红莲; 于会民
Original assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Current assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Priority date: 2021-11-27
Filing date: 2021-11-27
Publication date: 2021-12-24

Abstract

本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及一种提高植酸酶热稳定性的方法及融合植酸酶。所述融合植酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明主要是通过将野生型植酸酶Y4与肽标签SpyTag/SpyCatcher进行融合表达，从而获得所述环化融合蛋白Y4‑Spy，实现提高植酸酶热稳定性的目的。引入肽标签SpyTag/SpyCatcher后显著提高了植酸酶Y4的热稳定性。本发明提供了一种热稳定性提高的适合于在能源、食品和饲料等领域中应用的融合植酸酶，有着非常广阔的应用前景。

Description

一种提高植酸酶热稳定性的方法及融合植酸酶

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及一种提高植酸酶热稳定性的方法及融合植酸酶。

背景技术

植酸酶（Phytase），即肌醇六磷酸磷酸水解酶（myo-inositol hexakisphosphatephosphohydrolases）是一类能够催化植酸盐水解为肌醇、肌醇磷酸酯和无机磷酸盐的磷酸酶。用植酸酶对动物饲料进行预处理，可以提高无机磷的利用率，去除植酸的抗营养作用，从而改善食品/饲料的营养质量，减少磷污染。具有高热稳定性的植酸酶有着巨大的市场需求和商业价值。

SpyTag是一个多肽段，SpyCatcher是与之相对应的一个蛋白质，它们之间能够重组，并自发形成异肽键偶联，这就将蛋白质组装和化学反应结合在一起，产生稳定的分子自组装体。

发明内容

本发明的目的是提供一种热稳定性提高的融合植酸酶。

本发明的再一目的是提供一种提高植酸酶的热稳定的方法。

本发明的再一目的是提供上述融合植酸酶的编码基因。

本发明的再一目的是提供包含上述融合植酸酶编码基因的重组载体。

本发明的再一目的是提供包含上述融合植酸酶编码基因的重组菌株。

本发明的再一目的是提供制备热稳定性提高的植酸酶的方法。

根据本发明的具体实施方式，对来源于Yersinia intermedia的氨基酸序列如SEQID NO:1所示的野生型植酸酶Y4与肽标签SpyTag/SpyCatcher进行融合表达，从而获得所述植酸酶融合蛋白。

根据本发明的具体实施方式，将氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的野生型植酸酶通过linker（GSGGSG）与肽标签SpyTag/SpyCatcher进行融合表达，从而获得所述融合植酸酶。

根据本发明的具体实施方式，热稳定性提高的融合植酸酶具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，由560个氨基酸组成。

根据本发明的具体实施方式，还提供了编码上述热稳定性提高的融合植酸酶的基因，核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，共为1683 bp（包含终止密码子）。

根据本发明的具体实施方式，还提供了包含上述融合植酸酶编码基因的重组载体，所述重组表达载体的出发载体具体为pPICZαA，所述重组表达载体具体为pPICZαA-Y4-Spy。

根据本发明的具体实施方式，还提供了包含上述融合植酸酶编码基因的重组菌株，所述重组菌的出发菌株具体为毕赤酵母GS115(pPICZαA-Y4)，所述重组菌株具体为GS115(pPICZαA-Y4-Spy)。

根据本发明的具体实施方式，制备热稳定性提高的植酸酶的方法，包括以下步骤：

1）制备包含上述融合蛋白编码基因的重组载体；

2）以所述重组载体转化宿主，获得重组菌株；

3）发酵培养所述宿主，诱导表达并分离纯化植酸酶。

本发明的融合植酸酶与野生型植酸酶相比，融合植酸酶热稳定性增强，100℃处理5min仍保留42%左右的活性，而野生酶活性已基本消失。

本发明主要是通过将野生型植酸酶Y4与肽标签SpyTag/SpyCatcher进行融合表达，从而获得所述环化融合蛋白Y4-Spy，实现提高植酸酶热稳定性的目的。引入肽标签SpyTag/SpyCatcher后显著提高了植酸酶Y4的热稳定性。本发明提供了一种热稳定性提高的适合于在能源、食品和饲料等领域中应用的融合植酸酶，有着非常广阔的应用前景。

附图说明

图1显示野生型与融合植酸酶的比活；

图2显示野生型与融合植酸酶的最适温度；

图3显示野生型与融合植酸酶在100℃下处理的热稳定性；

图4显示木聚糖酶与融合木聚糖酶在60℃下处理10 min后的剩余酶活。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体：表达宿主为Pichia pastoris GS115，表达质粒载体为pPICZαA。

2、酶类及其它生化试剂：限制性内切酶购自TaKaRa公司和New England Biolabs(NEB) 公司，T4 DNA连接酶购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司。其它都为国产试剂（均可从普通生化试剂公司购买得到）。

3、大肠杆菌培养基LB（1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、1% NaCl，pH自然）。毕赤酵母培养基YPD（1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖，pH自然）；BMGY (1%酵母提取物，2%蛋白胨，1%甘油，1.34% YNB，0.00004%生物素，pH自然)；BMMY（1%酵母提取物，2%蛋白胨，0.5%甲醇，1.34% YNB，0.00004%生物素，pH自然）。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1、重组菌株GS115(pPICZαA-y4-spy)的制备

首先通过NCBI网站获得肽标签SpyTag/SpyCatcher的氨基酸序列，之后由北京六合华大基因科技有限公司进行基因合成。对合成的基因spy和质粒pPICZαA使用限制性内切酶Eco RI和Not I进行双酶切，通过T4 DNA连接酶将两者连接，获得重组质粒pPICZαA-spy。

之后采用PCR的方式扩增植酸酶基因y4和pPICZαA-spy，PCR所用引物如表1所示。

表1

其中，Y4-F及Y4-R用于扩增植酸酶野生型Y4的基因编码序列；Y4-SPYCAT-F和SPYTAG-Y4-R用于扩增质粒pPICZαA-spy。

扩增结束后，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，y4与pPICZαA-spy条带的理论大小分别为1254 bp、4020 bp，对大小正确的条带进行回收。

回收产物y4与pPICZαA-spy使用ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）进行重组以获得重组质粒pPICZαA-y4-spy，具体操作按说明书进行，重组产物转化大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞并测序验证。

待测序正确后，提取重组质粒pPICZαA-y4-spy，利用限制性内切酶Pme I进行线性化，产物纯化回收并电击转化毕赤酵母GS115感受态细胞，获得重组菌株毕赤酵母GS115(pPICZαA-y4-spy)。

实施例2、野生型植酸酶Y4及融合蛋白Y4-Spy的制备

1.蛋白的诱导表达

将得到的重组表达菌株接种至YPD培养基中进行种子培养，200 rpm，30℃培养48h后，以1%接种量转接至BMGY培养基中，200 rpm，30℃培养48 h。之后4500 rpm离心5 min，弃上清，收集菌体并加入含有0.5%甲醇的BMMY培养基进行诱导表达，每12 h补加0.5%甲醇，共诱导48 h。

2.蛋白的纯化

将诱导表达后的菌液12000 rpm离心10 min，收集上清进行浓缩，再用20 mM pH8.0 Tris-HCl进行透析。然后将透析后的酶液进行阴离子交换层析，A液为20 mM pH 8.0Tris-HCl，B液为A液加1 M NaCl，纯化蛋白，收集洗脱液，进行SDS-PAGE分析。

实施例3、野生型植酸酶Y4及融合蛋白Y4-Spy的性质测定

1. 植酸酶活性测定

将酶液用0.1 mol/L含有0.05% BSA和0.05% Triton X-100的pH 5.5 HAc-NaAc缓冲液进行稀释，将100 µL稀释后的酶液加入到900 µL植酸钠底物(用0.1 mol/L的pH 5.5的HAc-NaAc缓冲液配制)中，在37度反应10 min，加入1 mL 10%(W/V)TCA终止反应，最后加入1 mL显色液[1%(W/V)四水合钼酸铵，3.2%(V/V)浓硫酸，7.32%(W/V)硫酸亚铁]进行显色。对照则是在加酶液之前先加入TCA混匀使酶变性，其他相同。显色后，在700 nm光吸收下测定OD值，计算酶活。

将纯化后的野生型和融合蛋白在pH 5.5、37℃下进行酶促反应以测定其酶活性。如图1所示，野生型的酶比活为2077 U/mg，融合酶的酶比活为2045 U/mg，与野生型相当，表明对植酸酶Y4的改造并未影响其活性。

2. 最适温度测定

在0.1mol/L pH 5.5 HAc-NaAc缓冲液条件下，分别在不同温度（20、25、30、37、40、45、50、55、60、65和70℃）下对野生型和融合蛋白的酶活性进行测定来确定最适温度，最适温度对应活性定义为100%，依次计算其余温度下的剩余酶活。如图2所示，野生型和融合蛋白的最适温度都为55℃，肽标签SpyTag/SpyCatcher与植酸酶的融合表达并未影响植酸酶Y4的最适温度。

3. 热稳定性测定

将纯化所得蛋白用0.1 mol/L含有0.05% BSA和0.05% Triton X-100的pH 5.5HAc-NaAc缓冲液稀释至合适倍数后，取100 μL于1.5 mL EP管中，分别在100度下保温0、2、5、10、15和30 min，之后测定对应酶活，以保温0 min的活性为100%，计算不同保温时间下的剩余酶活。如图3所示，野生型在100℃下处理2 min后，酶活基本消失；而融合酶在100℃下处理2 min之后，剩余酶活相当于处理前的47%，处理5 min后，剩余酶活约为42%。

实施例4、木聚糖酶XynA及融合蛋白XynA-Spy的性质测定

根据本发明的具体实施方式，对从绵羊瘤胃中分离得到的氨基酸序列如SEQ IDNO:4所示的木聚糖酶XynA与肽标签SpyTag/SpyCatcher进行融合表达，从而获得所述融合木聚糖酶，氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。

1. 木聚糖酶活性测定

在0.9 mL pH 6.0的 1%（w/v）榉木木聚糖底物中加入100 μL适当稀释的酶液，50℃反应10 min后加入1.5 mL DNS，煮5 min终止反应，冰上放置10 min后，室温下测定OD₅₄₀的吸光值，每个反应重复测定三次。酶活单位（U）的定义：在最适条件下每分钟释放1 μmol还原糖所需要的酶量。

2. 热稳定性测定

将纯化后的酶用最适pH缓冲液稀释后，在60℃处理下处理10 min，然后在最适温度和pH条件下测定剩余酶活。如图4所示，木聚糖酶XynA和XynA-Spy在60℃处理10 min后，剩余酶活分别为39.8%和41.2%，酶活损失情况基本一致，表明肽标签SpyTag/SpyCatcher与木聚糖酶的融合表达并未提高木聚糖酶XynA的热稳定性。

以上实施例仅用于解释本申请的技术方案，不限定本申请的保护范围。

序列表

<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

<120> 一种提高植酸酶热稳定性的方法及融合植酸酶

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 418

<212> PRT

<213> 中间耶尔森氏菌 (Yersinia intermedia)

<400> 1

Ala Ala Pro Val Ala Ile Gln Pro Thr Gly Tyr Thr Leu Glu Arg Val

1 5 10 15

Val Ile Leu Ser Arg His Gly Val Arg Ser Pro Thr Lys Gln Thr Gln

20 25 30

Leu Met Asn Asp Val Thr Pro Asp Thr Trp Pro Gln Trp Pro Val Ala

35 40 45

Ala Gly Tyr Leu Thr Pro Arg Gly Ala Gln Leu Val Thr Leu Met Gly

50 55 60

Gly Phe Tyr Gly Asp Tyr Phe Arg Ser Gln Gly Leu Leu Ala Ala Gly

65 70 75 80

Cys Pro Thr Asp Ala Val Ile Tyr Ala Gln Ala Asp Val Asp Gln Arg

85 90 95

Thr Arg Leu Thr Gly Gln Ala Phe Leu Asp Gly Ile Ala Pro Gly Cys

100 105 110

Gly Leu Lys Val His Tyr Gln Ala Asp Leu Lys Lys Val Asp Pro Leu

115 120 125

Phe His Pro Val Asp Ala Gly Val Cys Lys Leu Asp Ser Thr Gln Thr

130 135 140

His Lys Ala Val Glu Glu Arg Leu Gly Gly Pro Leu Ser Glu Leu Ser

145 150 155 160

Lys Arg Tyr Ala Lys Pro Phe Ala Gln Met Gly Glu Ile Leu Asn Phe

165 170 175

Ala Ala Ser Pro Tyr Cys Lys Ser Leu Gln Gln Gln Gly Lys Thr Cys

180 185 190

Asp Phe Ala Asn Phe Ala Ala Asn Lys Ile Thr Val Asn Lys Pro Gly

195 200 205

Thr Lys Val Ser Leu Ser Gly Pro Leu Ala Leu Ser Ser Thr Leu Gly

210 215 220

Glu Ile Phe Leu Leu Gln Asn Ser Gln Ala Met Pro Asp Val Ala Trp

225 230 235 240

His Arg Leu Thr Gly Glu Asp Asn Trp Ile Ser Leu Leu Ser Leu His

245 250 255

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260 265 270

Lys Gly Thr Pro Leu Leu Gln Gln Ile Glu Thr Ala Leu Val Leu Gln

275 280 285

Arg Asp Ala Gln Gly Gln Thr Leu Pro Leu Ser Pro Gln Thr Lys Ile

290 295 300

Leu Phe Leu Gly Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Ala Gly Met

305 310 315 320

Leu Gly Ala Asn Trp Gln Leu Pro Gln Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro

325 330 335

Gly Gly Gly Leu Val Phe Glu Leu Trp Gln Asn Pro Asp Asn His Gln

340 345 350

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355 360 365

Asn Ala Glu Lys Leu Asp Leu Lys Asn Asn Pro Ala Gly Arg Val Pro

370 375 380

Val Ala Ile Asp Gly Cys Glu Asn Ser Gly Asp Asp Lys Leu Cys Gln

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Leu Asp Thr Phe Gln Lys Lys Val Ala Gln Ala Ile Glu Pro Ala Cys

405 410 415

His Ile

<210> 2

<211> 560

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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1 5 10 15

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Trp Pro Val Ala Ala Gly Tyr Leu Thr Pro Arg Gly Ala Gln Leu Val

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Leu Ala Ala Gly Cys Pro Thr Asp Ala Val Ile Tyr Ala Gln Ala Asp

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Val Asp Gln Arg Thr Arg Leu Thr Gly Gln Ala Phe Leu Asp Gly Ile

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Ile Leu Asn Phe Ala Ala Ser Pro Tyr Cys Lys Ser Leu Gln Gln Gln

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Leu Ser Leu His Asn Ala Gln Phe Asp Leu Met Ala Lys Thr Pro Tyr

275 280 285

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Leu Val Leu Gln Arg Asp Ala Gln Gly Gln Thr Leu Pro Leu Ser Pro

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Gln Thr Lys Ile Leu Phe Leu Gly Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn

325 330 335

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Gly Gln Leu Arg Asn Ala Glu Lys Leu Asp Leu Lys Asn Asn Pro Ala

385 390 395 400

Gly Arg Val Pro Val Ala Ile Asp Gly Cys Glu Asn Ser Gly Asp Asp

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Asp Thr Leu Ser Gly Leu Ser Ser Glu Gln Gly Gln Ser Gly Asp Met

450 455 460

Thr Ile Glu Glu Asp Ser Ala Thr His Ile Lys Phe Ser Lys Arg Asp

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Glu Asp Gly Lys Glu Leu Ala Gly Ala Thr Met Glu Leu Arg Asp Ser

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Ser Gly Lys Thr Ile Ser Thr Trp Ile Ser Asp Gly Gln Val Lys Asp

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<210> 3

<211> 1683

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

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agacatggtg ttagatcccc aactaagcag acccaattga tgaacgatgt gacacctgac 180

acgtggcctc aatggccagt tgcagctggt tacttgacac caagaggtgc tcagttggtt 240

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tatcagacta tgggacaatt gcgtaacgca gagaagttgg atttgaagaa caacccagcc 1200

ggtagggttc ctgtcgcaat tgacggttgt gagaactctg gagatgacaa gttgtgccag 1260

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gtaaacgaac aaggacaagt aacagtaaac ggaaaagcaa caaaaggaga cgcacacata 1680

tag 1683

<210> 4

<211> 407

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

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1 5 10 15

Met Ser Pro Ser Ser Ser Met Ala Gln Gly Leu Lys Asp Ile Tyr Lys

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Ala Glu Gln Ala Ala Leu Val Lys Gln Glu Phe Asn Ser Ile Thr Cys

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Ala Trp Asp Val Val Asn Glu Ala Met Thr Asp Asp Pro Lys Ala Glu

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Asp Pro Phe Arg Gln Ser Pro Leu Tyr Lys Ile Ala Gly Asp Glu Phe

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405

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

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115 120 125

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275 280 285

Met Gly Gly Gln Leu Gln Phe Ser Arg Glu Gly Val Ala Val Ser Asp

290 295 300

Ser Val Lys Gln His Leu Ala Asp Gln Tyr Ala Arg Val Phe Asn Val

305 310 315 320

Leu Arg Lys His Arg Asp Val Ile Asp Cys Val Thr Phe Trp Asn Leu

325 330 335

Ser Asp Arg Asp Ser Trp Leu Gly Gln Asn Asn Tyr Pro Leu Pro Phe

340 345 350

Asp Ala Asn Tyr Lys Pro Lys Met Ala Tyr Asp Tyr Ile Lys Gln Met

355 360 365

Lys Ala Ala Ala Trp Pro Ile Pro Glu Lys Pro Lys Pro Asn Pro Asn

370 375 380

Gln Gln Arg Gln Arg Arg Arg Gly Gly Phe Gly Gly Pro Gln Arg Pro

385 390 395 400

Pro Phe Asn Pro Ala Leu Ala Phe Ala Glu Gln Pro Gly Val Lys Glu

405 410 415

Asp Phe Val Pro Ser Glu Leu Asn Gln Pro Gly Gly Ser Gly Gly Ser

420 425 430

Gly Gly Ala Met Val Asp Thr Leu Ser Gly Leu Ser Ser Glu Gln Gly

435 440 445

Gln Ser Gly Asp Met Thr Ile Glu Glu Asp Ser Ala Thr His Ile Lys

450 455 460

Phe Ser Lys Arg Asp Glu Asp Gly Lys Glu Leu Ala Gly Ala Thr Met

465 470 475 480

Glu Leu Arg Asp Ser Ser Gly Lys Thr Ile Ser Thr Trp Ile Ser Asp

485 490 495

Gly Gln Val Lys Asp Phe Tyr Leu Tyr Pro Gly Lys Tyr Thr Phe Val

500 505 510

Glu Thr Ala Ala Pro Asp Gly Tyr Glu Val Ala Thr Ala Ile Thr Phe

515 520 525

Thr Val Asn Glu Gln Gly Gln Val Thr Val Asn Gly Lys Ala Thr Lys

530 535 540

Gly Asp Ala His Ile

545

Claims

1.热稳定性提高的融合植酸酶，其特征在于，所述融合植酸酶的氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示。

2.融合植酸酶编码基因，其特征在于，编码权利要求1所述的热稳定性提高的融合植酸酶。

3.根据权利要求2所述的融合植酸酶编码基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDNO:3所示。

4.包含权利要求2所述融合植酸酶编码基因的重组表达载体。

5.包含权利要求2所述融合植酸酶编码基因的重组菌株。

6.一种制备热稳定性提高的植酸酶的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1）制备包含权利要求2所述的融合植酸酶编码基因的重组载体；

2）以步骤1）所得重组载体转化宿主细胞；

3）发酵培养所述宿主细胞，并分离植酸酶。

7.一种提高植酸酶的热稳定的方法，其特征在于，所述方法包括将野生型植酸酶与肽标签SpyTag/SpyCatcher进行融合表达的步骤。

8.根据权利要求7所述的提高植酸酶的热稳定的方法，其特征在于，所述野生型植酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

9.根据权利要求7所述的提高植酸酶的热稳定的方法，其特征在于，将野生型植酸酶通过连接子与肽标签SpyTag/SpyCatcher进行融合表达。

10.根据权利要求9所述的提高植酸酶的热稳定的方法，其特征在于，所述连接子的氨基酸序列为GSGGSG。