CN101426907A - 一种新的植酸酶的克隆和表达 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种新的植酸酶、编码这个酶的基因以及具有植酸酶活性的新中间型耶尔森氏菌。具体地，本发明涉及具有以下性质的植酸酶：(a)理论分子量为45.5kDa，(b)高比活为3960±248U/mg，(c)高温下的良好热稳定性和宽的pH作用范围，(d)最适pH为4.0－5.0，(e)最适温度50－60℃，(f)强的胃蛋白酶和胰蛋白酶抗性。此植酸酶非常适合作为添加剂在单胃动物中使用。本发明也涉及含有所述基因的重组载体，含有所述重组载体的重组宿主细胞(例如，巴斯德毕赤酵母)，以及使用所述重组宿主细胞生产植酸酶的方法。而且，本发明还涉及包含所述植酸酶和/或表达作为有效成分的植酸酶的宿主细胞的饲料添加剂。此外，本发明还提供了一种全新的从靶生物体中分离植酸酶基因的方法。

Description

一种新的植酸酶的克隆和表达

技术领域

本发明涉及一种新型植酸酶基因、该基因编码的植酸酶蛋白，生产该植酸酶的中间型耶尔森菌，一种在宿主细胞(如毕赤酵母)表达植酸酶的方法，以及把该植酸酶作为一种有效成分的饲料添加剂。此外，本发明还提供了一种从目标生物体简单而快速的分离植酸酶基因方法。

背景技术

植酸磷的含量占动物日粮中总磷50-70％。然而，单胃动物如鸡和猪，缺乏从植酸分子水解释放无机磷的消化酶，以致磷的利用率非常低。没有被消化的植酸磷，通过消化道被排出体外。这导致对土地和水资源的增加的磷生态负担。此外，由于植酸螯合几个必要矿物质，抑制矿物质吸收。总之，在消化道中植酸降低食物的营养价值和饲料的利用率。

显然，磷(P)是一个必要的生长元素，所以无机磷(如磷酸氢钙，脱氟磷酸三钙)或动物产品(如肉骨粉，鱼粉)被添加到动物饲料中，以满足动物对磷的营养需要。但是这些添加的成分都很昂贵。

植酸(肌醇六磷酸)是谷类食品或饲料中磷的主要储存形式。植酸酶，是一类水解磷酸单脂键的磷酸酶，它能够从植酸中水解释放无机磷，植酸是P在谷物和饲料中的主要储存形式(E Graf et al.1987)。植酸酶广泛分布于植物、动物和微生物。基于不同来源的植酸酶的特征的分析，微生物植酸酶正越来越多的受到关注。并且，微生物来源的植酸酶作为饲料添加剂，添加到典型的单胃动物日粮中，已经明显的提高了植酸磷的营养利用率(Cromwell，et al，1993)。其结果是降低了动物饲料中无机磷的补充量，同时降低了排泄物中的磷的含量(Kornegay，et al，1996)。随着基因工程技术的发展，一方面，越来越多的微生物菌植酸酶已被分离和/或纯化。例如，“Purification and Characterization of a Phytase from Klebsiella terrigena”，(Greiner et al.Arch Biochem Biophys.1997 May 15；341(2)：201-6)，“Purification and properties of athermostable phytase from Bacillus sp.DS11”(Kim et al.Enzyme Microb Technol，1998Jan，22(1)，2-7)，“Isolation and characterization of a phytase with improved propertiesfrom Citrobacter braakii”(Kim et al.Biotechnol Lett.2003 Aug；25(15)：1231-4)，“Genecloning，expression and characterization of novel phytase from Obesumbacteriumproteus”(Zinin et al.FEMS Microbiol Lett.2004 Jul 15；236(2)：283-90)；另一方面，通过定点突变或基因改组，常规植酸酶的性能改良也取得了一定进展。例如；“植酸酶phyA-m基因结构延伸突变改善酶的热稳定性”(陈惠等，生物工程学报，2005年11月，21卷6期，983-987)，或者“Site-directed mutagenesis of Escherichia coliphytase”(US patent 6,841,370，Lei XG，2005)。这些取得的成果使得植酸酶的生产成本有了很大程度的降低。因为这些优势，一些已知的植酸酶在饲料工业上得到广泛应用。

但是，在这些已广泛使用的植酸酶中，仍然存在着一些缺陷。因为这些植酸酶作为饲添加剂，并不能发挥它的理想作用。例如，大部分植酸酶在饲料制粒加工的过程中就已经高温变性失活了，所以在肠道中不能发挥降解植酸的作用。其原因因酶不同而不同。主要是由于，这些酶的稳定性比较差(pH稳定性、热稳定性、抗蛋白酶降解的稳定性以及在储存运输过程中的稳定性)和在胃肠道环境中活性比较低的缘故。

由于目前使用的植酸酶存在的这些缺陷，因此，人们希望能够找到这样一种新的植酸酶：其具有非常好的稳定性，在动物胃肠道中有非常高的活性，并且该植酸酶还能够通过发酵技术大量生产，这样可以使其成本大幅度的降低，从而能够进一步推广该植酸酶的使用。

另外，现有技术中分离植酸酶的手段有限，主要是通过构建基因组文库，或直接从纯化蛋白入手。但是，这两种方式都比较耗费时间和劳力，效率非常的低，并且也非常昂贵。并且，在不同物种中植酸酶的相似性比较低，因此要获得一段序列比较困难，这也是一个种对于利用现有方法去获得一个新基因的挑战。

发明内容

为了解决现有技术中存在的缺陷，我们从中国一号冰川(新疆)的冻土中的数千种菌株中分离得到一株新型产植酸酶微生物。我们也确定了编码具有植酸酶活性蛋白的核苷酸序列。在如毕赤酵母的表达宿主细胞中，植酸酶的表达量达到了一个较高水平。因此，重组毕赤酵母表达系统适合于工业化生产。并且这个新的植酸酶具有多种非常优良的特性，这些优良特性适合提高饲料的利用效率。

因此，一方面，本发明提供了一种全新的生产植酸酶的中间耶尔森菌。

本发明也提供了一种新的编码具植酸酶活性的蛋白的新基因，其包含SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列或其衍生序列。

本发明还提供了具有如下性质的植酸酶，其理论分子量46kDa，最适pH在4-5之间，最适温度在50-60℃之间，理论pI值为7.7，比活在3000U/mg以上，且具有强的胃蛋白酶和胰蛋白酶抗性。所述植酸酶可分离自耶尔森氏菌属微生物，优选为中间型耶尔森氏菌。

因此本发明也涉及一种分离的蛋白，其选自：

a)包含SEQ ID NO.3所示氨基酸序列的多肽；

b)由SEQ ID NO.2所示的核酸分子或其简并序列所编码的多肽；

c)由在严谨条件下与SEQ ID NO.2所示核酸分子的互补链杂交的核酸编码且具有植酸酶活性的多肽；

d)由SEQ ID NO.2所示核酸分子的等位基因或天然变体所编码且具有植酸酶活性的多肽；

e)由SEQ ID NO.3所示核酸分子所编码被替换、删除和/或插入一个或多个氨基酸残基后具有植酸酶活性的多肽；

f)与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有至少60％，优选至少65％、70％、75％、80％、85％、或至少90％，更优选至少95％同源性且具有植酸酶活性的多肽。特别地，本发明还提供了一种简单有效的从基因组DNA中克隆分离植酸酶的基因的方法，所述方法包括：

a)基于植酸酶保守序列THGXRXP和HD设计一对简并引物；

b)利用所述引物通过PCR扩增部分植酸酶序列；和

c)进一步通过TAIL-PCR获取植酸酶的全序列。

另外，本发明提供了包括所述编码植酸酶的核酸的重组载体、已引入所述载体或所述核酸分子的重组宿主细胞(如毕赤酵母)、以及在宿主细胞中表达该酶的方法。

进一步地，本发明还涉及所述植酸酶或者该植酸酶的生产菌株在制备饲料添加剂中的应用，以及含有作为有效组分的蛋白和/或宿主细胞的饲料添加剂。本发明的饲料添加剂因其含有促进植酸水解的植酸酶，从而可以有效地用于制备动物饲料。

附图说明

图1显示利用纯化的植酸酶及其脱糖基化植酸酶的SDS电泳结果。泳道1为分子量标准，泳道2为纯化的植酸酶，泳道3为脱糖基化处理的植酸酶。

图2显示新酶的最适pH和pH稳定性。在使具有最大活性的pH条件下测定的活性为100％，在各pH值处的活性显示为相对活力(％)。

图3A显示新植酸酶的最适温度。在使具有最大活性的温度条件下测定的活性为100％，在各温度的活性显示为相对活力(％)。

图3B显示新植酸酶在80℃时的热稳定性。

图4显示新植酸酶的蛋白酶稳定性。

关于生物材料的保藏说明

由发明人分离的中间型耶尔森氏菌(Yersinia intermedi)H-27已于2006年4月25日保藏在位于中国北京市中国科学院微生物研究所内的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为：CGMCC 1702。

序列简述

SEQ ID No.1：中间型耶尔森氏菌(Yersinia intermedia)H-27的16S rDNA序列；

SEQ ID No.2：新植酸酶的核酸序列；

SEQ ID No.3：新植酸酶的氨基酸序列；

SEQ ID No.4：克隆植酸酶基因的正向简并引物序列；

SEQ ID No.5克隆植酸酶基因的：反向简并引物序列。

发明详述

为了实现上述目标，首先，本发明提供了具有植酸酶活性的菌株。该菌株从中国一号冰川土样(新疆)分离的。该菌株产生的植酸酶的活性通过硫酸亚铁钼蓝法被测定。并且通过16s rRNA序列分析鉴定了显示植酸酶活性的菌株。结果，16S rDNA的基本序列显示与Yersinia intermedia99.5％的一致性，以及与Yersinia aldovae和Yersinia mollaretii的序列的99％的一致性，所以可以确定本发明的菌株是一个新菌株。

该菌株为革兰氏阴性杆菌，具有与大肠杆菌相似的大小，其生长的最佳温度的菌株为30℃，在光显微镜下可被观察。从生理生化特性调查中，该菌株被证实为一种兼性好氧微生物，这就是说它可以在有养气或无氧气的条件下很好生长。

基于该菌株的形态、生理特性和16SrDNA的序列的研究结果，在本发明中分离到的菌株被命名为“Yersinia intermedia H-27”，已于2006年4月25日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为：CGMCC 1702。

本发明涉及具有如下性质的植酸酶，其理论分子量46kDa；最适pH在4-5之间，优选pH4.5；最适温度在50-60℃之间，优选55℃；理论pI值为7.7；高于3000U/mg的高比活，优选3300U/mg以上，如3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400或4500U/mg；此酶对胃蛋白酶、胰蛋白酶具有非常强的抗性。所述植酸酶可分离自耶尔森菌属微生物，优选为中间型耶尔森氏菌。

本发明也提供了一种包含SEQ ID NO.3所示氨基酸序列的分离蛋白。优选地，所述酶是由SEQ ID NO.2所示的多核苷酸或其简并序列所编码。在另一实施例中，本发明也提供了所述蛋白的衍生物，其可由SEQ ID NO.3所示的多肽序列经过一个或多个(例如，一个或几个，或者如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的选自1～10的值，或者介于上述值中间的范围)氨基酸残基的取代、缺失和/或插入获得，并仍然具有植酸酶活性。例如，一个常见的策略是保守氨基酸取代，即将氨基酸残基用具有相似侧链的氨基酸残基替换。具有相似侧链的氨基酸残基的家族在本领域已有明确定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，在植酸酶蛋白中用来自同一侧链类的另一氨基酸残基替换一个或几个位点，将不会在实质上影响其植酸酶活性。此外，本领域技术人员公知，在基因的克隆操作中，常常需要设计合适的酶切位点，这势必在所表达的蛋白末端引入了一个或多个不相干的残基，而这并不影响目的蛋白的活性。又如为了构建融合蛋白、促进重组蛋白的表达、获得自动分泌到宿主细胞外的重组蛋白、或利于重组蛋白的纯化，常常需要将一些氨基酸添加至重组蛋白的N-末端、C-末端或该蛋白内的其它合适区域内，例如，包括但不限于，适合的接头肽、信号肽、前导肽、末端延伸、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白、蛋白A、如6His或Flag的标签，或Xa因子或凝血酶或肠激酶的蛋白水解酶位点。

又在一个实施例中，本发明的具有植酸酶活性的蛋白包括由如在严谨条件下与序列表中的SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列编码的氨基酸序列。如此处所用，术语“在严谨条件下杂交”是用来描述典型地相互间至少60％同源的核苷酸序列仍可相互杂交的杂交和清洗条件。优选地，严谨条件为这样的条件，在此条件下相互间具有至少约65％、更优选地至少约70％、且甚至更优选地至少约75％或更高同源性的序列一般仍可相互杂交。此严谨条件为本领域普通技术人员所公知，可在Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中找到。严谨杂交条件的一个优选、非限制性实例为：在6×SSC中于约45℃杂交，然后在0.2×SSC、0.1％SDS中于50-65℃洗涤一次或多次。本领域技术人员能够理解，高度严谨条件可通过提高杂交温度，例如至50℃、55℃、60℃或65℃来实现。

另外，本领域普通技术人员将会理解：由于自然变异所致的遗传多态性可在群体中的个体间存在。此类自然变异一般可在植酸酶基因的核苷酸序列中导致1-5％的差异。植酸酶中任何以及所有这种自然变异产生的、并且不改变植酸酶功能活性的核苷酸突变和所得氨基酸多态性也在本发明的范围之内。因此，本发明也包括由SEQID NO.2所示多聚核苷酸分子的等位基因或天然变体所编码的具有植酸酶活性的多肽。

在另一优选的实施方案中，植酸酶蛋白为至少约60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％，或至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％，或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％，或者至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％，更优选地至少约98.1％、98.2％、98.3％、98.4％、98.5％、98.6％、98.7％、98.8％、98.9％，甚至更优选地至少约99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或更高地同源于本发明的SEQ ID NO.3所示的全长氨基酸序列的活性蛋白。介于上述值中间的范围和同一性值(例如，69-90％同源性或98.1-99.9％一致性)也包括在本发明中。例如，也包括使用任一上述值的组合作为上限和/或下限的同一性值范围。在两个序列间比较序列、并确定百分同源性为本领域公知的技术，可利用数学算法完成，如市售可得的软件，或整合在公共数据库中的软件，例如多序列比对程序CLUSTAL W BLOCKS或BLAST等。本领域普通技术人员应知道针对所分析的具体序列如何优化各程序中相应的参数设置(如分值、字长、缺口罚分、权重等等)。利用GenBank中BLAST的缺省参数设置，获得比对结果如下：

表1：本发明植酸酶蛋白与已知植酸酶蛋白的一致性比较结果

 

来源	Genbank登录号.	一致性
			Obesumbacterium proteus	AY378096	53％

 

Escherichia coli

AAN28334

45％

另一方面，本发明提供一种新的植酸酶基因SEQ ID NO.2。本发明进一步包括由于遗传密码的简并性而不同于本发明的SEQ ID NO.2所述核苷酸序列之一的核酸分子、及其编码的植酸酶蛋白。在一个实施方案中，本发明的分离的核酸分子为如在严谨条件下与SEQ ID NO.2所示核苷酸序列杂交的核苷酸序列，优选其等位基因或天然突变体。在另一实施例中，本发明的分离核酸分子具有编码具SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列。在再一实施例中，本发明的核酸分子编码与SEQ ID NO.3的氨基酸序列基本一致的全长植酸酶蛋白质，例如，通过取代、删除和/或插入一个或多个(如一个或几个，或者选自1～10的值)氨基酸残基而源自SEQ ID NO.3的蛋白，或者，与SEQ ID NO.3的氨基酸序列至少99％同源的蛋白。该核酸分子优选为至少约60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％，或至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％，或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％，更优选至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、97.7％、97.8％、97.9％，或至少约98％、98.1％、98.2％、98.3％、98.4％、98.5％、98.6％、98.7％、98.8％、98.9％，甚至更优选地至少约99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或更高地同源于SEQ ID NO.2的核苷酸序列，介于上述值的范围或同一性值(如76～97％同源或97.8～99.9％相同)也包括在本发明中。利用GenBank中BLAST的缺省参数设置，获得以下比对结果。

表2：比对结果

 

来源/编码的多肽	Genbank登录号	一致性
			变形肥杆菌(Obesumbacteriumproteus)/植酸酶	AY378096	56％
大肠杆菌(Escherichia coli)/phytase	AF537219	50％

又在一个方面，本发明涉及含有所述植酸酶基因的重组载体、已导入所述载体或所述基因的重组宿主细胞(例如，巴斯德毕赤酵母Pichia Pastoris)、以及在宿主细胞中表达酶的方法。术语“载体”指能运送已与其连接的另一核酸的核酸分子，例如其可以为质粒或病毒载体。本发明的重组表达载体包含以适于核酸在宿主细胞中表达的形式的本发明的核酸，这意味着重组表达载体包括一个或多个基于用于表达的宿主细胞而选择的调节序列，其与表达的核酸可操作地连接。在重组表达载体中，“可操作地连接”是指目的核苷酸序列与调节序列以允许该核苷酸序列表达(例如，在体外转录/翻译系统中，或当载体导入宿主细胞后在宿主细胞中)的方式连接。术语“调节序列”包括启动子、阻遏物结合位点、激活物结合位点、增强子和其它表达调控元件(例如，终止子、多聚腺苷酸化信号、或mRNA二级结构的其它元件)。本领域普通技术人员将理解表达载体的设计可取决于如欲转化的宿主细胞的选择、所需的蛋白质表达水平等因素。可以将本发明的表达载体导入宿主细胞，以产生包括融合蛋白的蛋白或肽。

本发明的重组表达载体可设计用于在原核或真核细胞中表达植酸酶蛋白。例如，植酸酶基因可在如大肠杆菌的细菌细胞、酵母(如毕赤酵母、黑曲霉)、昆虫细胞(如使用杆状病毒表达载体的Sf9细胞或家蚕细胞)或植物细胞(如脓杆菌介导的拟南芥、烟草、玉米等)中表达。从而，本发明涉及已导入本发明的重组表达载体的宿主细胞、优选毕赤酵母。宿主细胞可为任何原核或真核细胞，其包括但不限于上述的那些宿主细胞。优选毕赤酵母细胞。巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是一种甲醇酵母，能够以甲醇作为唯一碳源进行代谢。这个系统因为其表达高水平的异源蛋白的能力而闻名。作为有效的表达系统，许多植酸酶基因已成功地在毕赤酵母中表达。同样本发明提供的新的植酸酶基因也在毕赤酵母中表达，并具有高表达水平。在500ml烧瓶中，诱导48h后，细胞外植酸酶活性达到389U/mL。因此，通过发酵大规模生产植酸酶非常容易，并且成本比任何时候都低。

载体DNA可通过常规转化或转染技术导入原核或真核细胞中。如此处所用，术语“转化”和“转染”、“接合”和“转导”意指本领域内公知的各种将外源核酸(例如，线性DNA或RNA(例如，线性化载体或无载体的单独的基因构建体))或载体形式的核酸(例如，质粒、粘粒、噬菌体、噬粒、噬菌粒、转座子或其它DNA)导入宿主细胞的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖-介导的转染、脂转染、天然感受态、化学介导的转移或电穿孔。转化或转染宿主细胞的合适方法可在《分子克隆》实验室手册第二版，冷泉港实验室出版社，NY，1989，Sambrook等人，和其它实验室手册中找到。

本发明的宿主细胞(如培养的原核或真核宿主细胞)可用于产生(即表达)植酸酶蛋白。因此，本发明还提供了使用本发明的宿主细胞制备植酸酶蛋白的方法。在一个实施例中，该方法包括在合适的培养基中培养本发明的宿主细胞(其中已导入了编码植酸酶蛋白的重组表达载体，或其基因组中已导入了编码野生型或改变的植酸酶蛋白的基因)，直至产生植酸酶蛋白。在另一实施方案中，该方法还包括从培养基或宿主细胞分离植酸酶蛋白。

本发明的再一方面为在毕赤酵母中表达的植酸酶。为了测定植酸酶的性质，通过如硫酸铵沉淀，透析、超滤和层析的简单方法纯化植酸酶。经过简单的净化，植酸酶的纯度足以研究酶学性质的研究。纯化的重组植酸酶分子量为45kDa，并且当使用植酸作为底物时被活化。植酸酶为在50-60℃下时显示高酶活性的酸性酶，并且在55℃下观察到最佳活性。在pH1-10之间都具有非常稳定的酶活性，在pH4-5之间可以观察到最佳活性，并且最适pH为4.5。Fe²⁺、Zn²⁺和Cu²⁺强烈抑制酶活性，但其他金属离子对该酶没有明显的影响。同时，在较高温度下该酶具有较好的稳定性，当该酶在80℃放置一小时，仍有40％的酶活性保留。此外，该植酸酶对胃蛋白酶、胰蛋白酶也具有非常强的抗性。

此外，本发明还涉及所述植酸酶或生产植酸酶的宿主细胞在制备饲料添加剂中的应用，以及含有作为有效组分的所述蛋白和/或宿主细胞的饲料添加剂。本发明的饲料添加剂由于其含有增强饲料谷物中磷的利用的植酸酶，从而可以有效地用于动物饲料的生产。

所述饲料添加剂可制备为干粉或液体制剂，并且可额外地包括一种或多种酶制剂。所述额外的酶制剂也可以为干燥的或液体制剂形式，并且可以选自包括以下酶的组：角蛋白酶、脂解酶(如脂肪水解酶)、和产生葡萄糖的酶，如水解淀粉和糖原的α-1，4糖苷键的淀粉酶、水解有机磷酸的磷酸酶、降解纤维素的羧甲基纤维素酶、降解木糖的木聚糖酶、将麦芽糖水解为两种葡萄糖的麦芽糖酶、以及将蔗糖水解为葡萄糖-果糖混合物的转化酶。

除了植酸酶和/或产植酸酶微生物，本发明的饲料添加剂还可额外包括其它非致病性的有益微生物。所述附加微生物可以选自包括以下的组：可以产生蛋白酶、脂肪酶和转化酶的枯草杆菌、如双歧杆菌的益生菌、具有在厌氧条件下降解有机物能力和生理活性的乳酸菌、增加家畜重量、促进牛奶生产并有助于饲料的消化和吸收的如米曲霉菌的丝状真菌、以及如酿酒酵母的酵母。

本发明进一步提供了一种从基因组DNA中获取植酸酶基因的简便有效方法。具有两种获取新植酸酶基因的常规方法：一种方法是从基因组库中分离新植酸酶基因，另一种是以蛋白开始。但是，常规方法都比较耗费时间和劳力、困难、并且昂贵。为了解决上述问题，我们尝试发展一种通过结合各种现有技术能够容易地获得植酸酶基因的方法。具体而言，通过分析大量的为主要植酸酶主要种类的组氨酸酸性磷酸酶的氨基酸序列，利用BLOCKS[http://blocks.fhcrc.org/blocks/make_blocks.html]，我们在组氨酸酸性磷酸酶中找到了两个保守序列RHGXRXP和HD。基于这两个保守序列和在不同生物中的偏爱密码子，我们设计了简并引物：正向简并引物，FI(Forward Primer)：5’-GTKSTKAWWKTSAGYCGCCA-3’(20mer)(SEQ ID NO.4)和反向简并引物RI(Reverse Primer)：5’-TWKGCMAKRTTRGTATCRTG-3’(20mer)(SEQID NO.5)，通过PCR从染色体DNA中扩增部分植酸酶基因序列(其中，各缩写的含义如下表3所示)。这个部分序列在已知的组氨酸酸性磷酸酶中约为900bp，可以根据该部分序列的大小通过在琼脂糖凝胶上电泳筛选扩增的序列。然后，所获得的900bp的序列进行测序和BLAST分析。根据BLAST分析结果，我们可以判断所获的900bp序列是否为新的植酸酶基因。

如果分析显示该900bp的序列为部分的新植酸酶基因，则下一步为获得新植酸酶基因的全序列。为了获得可能的植酸酶基因的全序列，通过TAIL-PCR(Liu et al.，1995)分别克隆该部分序列的上下游区域。

与常规方法相比，新方法是非常方便、有效、价格低廉、易于获取新型植酸酶基因。通过这种方法，我们目前已经成功地获得了两个新植酸酶基因(一个来自本申请描述的中间型耶尔森氏菌H-27(Yersinia intermedi H-27)，另一来自本发明人的另一申请中描述的无丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacter amalonaticus))。

表3

具体实施方式

以下结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细的说明，而并不旨在以任何方式限制本发明。

实施例1：植酸酶产生菌的分离

植酸酶产生菌株是从中国一号冰川(新疆)的冻土样品中分离的。具体地，为了分离植酸酶产生菌种，于2005年4月采集了中国一号冰川(新疆)的冻土样品，并在冰柜中储存数日，直到其可以在实验室被加工操作。冰冻土壤被悬浮在无菌水中，并稀释，然后，不同样品的悬浮液接种无琼脂的LB培养基中，接着分别在4℃、10℃、15℃和30℃下培养1-2天。接着利用硫酸亚铁钼蓝法(详见下面的实施例4)测定在不同温度下、在不同样品的培养液和细胞破碎液中的植酸酶活性。在细胞破碎液中的植酸酶活性是可检测的，其显示这些菌株具有细胞内植酸酶活性。首先挑选植酸酶活性的样品，并且判定适当的培养温度为30℃。具有植酸酶的活性的样品被稀释，并涂覆于具1.5％琼脂的LB培养基上，在30℃的培养箱中培养一天。挑选具有各种形态的不同克隆，接种于5毫升LB培养基过夜培养。测量细胞破碎液中各菌落的植酸酶活性，最后在所选菌落中挑选显示最高植酸酶活性的菌株。该菌株的编号为H-27。

实施例2：分析植酸酶产生菌H-27的特征

通过革兰氏染色法，在实施例1中分离的H-27菌被确定为是革兰氏阴性菌。此菌是典型的杆菌，在显微镜下具有与大肠杆菌相似的大小。进一步研究了其部分生理生化特性。结果表明，该菌为革兰氏阴性、兼性、厌氧微生物，其可以在无氧或有氧的环境中生长。此菌的最适生长温度为30℃，我们也分析了该菌的16s rRNA序列。使用Promega Taq试剂盒，通过PCR扩增该菌的16SrDNA序列(SEQ ID NO.1)，并且，通过使用BLAST和多序列比对程序CLUSTAL W比对该菌的16SrDNA序列和在GenBank中的参考序列。结果16s rDNA的碱基序列显示了与中间型耶尔森氏菌之间具有99.5％的一致性，与阿氏耶尔森菌(Yersinia aldovae)和莫氏耶尔森菌(Yersinia mollaretii)的16s rDNA序列之间具有99％的一致性。基于所选菌株的形态、生理和16S rDNA的研究结果，我们可以确定此菌为新的中间型耶尔森氏菌(Yersinia intermedia)。

根据以上结果和研究过程中使用的记录号，此菌株被命名为“中间型耶尔森氏菌H-27”，并在2006年4月25日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)予以保藏，保藏号为CGMCC 1702。

实施例3：植酸酶基因的克隆

当蛋白的基因为多基因家族的已知成员时，同源克隆是非常有效简单。

明显地，根据植酸酶的分类，大部分细菌源的植酸酶都属于组氨酸酸性磷酸酶(HAP)家族。通过多序列比对程序CLUSTAL W和BLOCKS(http://blocks.fhcrc.org/blocks/make_blocks.html)分析HAP家族的各种序列，我们发现HAP酶中具有两个保守区域，即RHGXRXP和HD区域。基于这两个保守区域，能够设计一对简并引物，从而通过PCR从中间型耶尔森菌(Yersinia intermedia)基因组DNA中扩增部分植酸酶序列。

<3-1>部分植酸酶基因序列的获得

根据两个保守区域设计简并引物，并使用DNA合成仪合成。以中间型耶尔森菌(Yersinia intermedia)基因组DNA作为模板进行PCR扩增。除了简并引物和基因组DNA模板外，其他用于PCR扩增的试剂都购自TIANGEN BIOTECH CO.，LTD。通过优化PCR参数，我们确定了PCR退火温度为50℃，并且PCR的反应条件为：1个循环，95℃，2分钟；30个循环，95℃，30秒/退火温度，30秒/72℃，1分钟；最后在72℃延伸5分钟，PCR产物保存于4℃。通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，发现一系列由简并引物扩增的片段。使用适当的DNA标准分子量，能够选择期望大小(900bp)的条带。结果，通过TaKaRa的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收约900bp的DNA条带大小，再将其克隆至pGEMTeasy载体(Promega)，然后转化大肠菌JM109。分离具有靶DNA片段的转化菌株，并提取含靶DNA片段的质粒，测序约900bpDNA序列。结果确定了901bp的DNA序列为部分植酸酶基因。

<3-2>完整的植酸酶序列的克隆

为了获得完整的植酸酶基因序列，通过热不对称交错PCR(TAIL-PCR)(Liu et al.，1995)分别克隆以上所获得的901bp片段的上游和下游区域。TAIL-PCR是一种非常强大的用于揭示已知序列两端的未知序列的工具，并且是非常简单、快速、便宜、有效的方法。根据以上所获得的901bp片段的DNA序列，设计了用于TAIL-PCR的巢式特异性引物，它们分别为：

usp1(5’-CTATTCCATCAAGGAATGCCTGCCCCG-3’)(up special primer)，

usp2(5’-CGCGTTCGTTGATCAACATCGGCCtg-3’)，

usp3(5’-GGGTTAAGTATCCTGCGGCG-3’)，

dsp1(5’-GTTGCCTGGCATCGGTTAACGGGAG-3)(down special primer)，

dsp2(5’-CGCTCGTCATAAGGGCACACCGTTGC-3’)，

dsp3(5’-CCGTCTCATTATTGTTTATTGCTGG-3’)。

另外一端的任意简并引物((AD，arbitrary degenerate primers)包括：AD6(5’-CAWCGICNGAIASGAA-3’)；AD9(5’-WCAGNTGWTNGTNCTG-3’))是TAIL-PCR成功扩增的关键。巢氏特异性引物和AD引物一起使用，他们的区别在于其退火温度不同。TAIL-PCR扩增的程序和Liu(Liu et al.，Thermal asymmetric interlacedPCR：automatable amplification and sequencing of insert end fragments from P1 andYAC clones for chromosome walking.Genomics.1995 Feb 10；25(3)：674-81)相同，此处通过引用包含其全部内容。交替高、低温退火温度循环产生在一端具有特异性引物、在另一端具有AD引物的特异性产物。通过琼脂糖凝胶电泳分析TAIL-PCR的产物，我们获得已知序列的约900bp的上游DNA，并且，通过优化TAIL-PCR参数，也获得已知片段的约650bp的下游DNA。通过TaKaRa的琼脂糖凝胶回收试剂盒分别纯化回收两个片段，并将所回收的片段连接到pGEMTeasy载体(Promega)。，然后转化大肠菌感受态细胞JM109。两个片段被分别测序。

三个序列都被输入DNASTAR软件，并通过序列拼接程序组装，这样确定开放阅读框。该1326bp阅读框含有一段信号肽序列和活性蛋白。

<3-3>所获得完整序列的分析

所获得的完整片段全长2354bp，含有一个通过ORF查找程序在Vector NTI中发现的1326bp的开放阅读框(SEQ ID NO.2)。该阅读框编码了一段信号肽和一个成熟蛋白，通过Signal P程序[http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/]和多序列比对，确定信号肽N端的可能的切割位点为Ser23-Ala2。该关于成熟活性蛋白的N端位置的数据对于蛋白质在异源表达系统中表达是必要的。利用PeptideMass程序[http://cn.expasy.org/tools/peptide-mass html]确定了成熟蛋白的分子量。成熟蛋白的预测分子量为45.5kDa，它和SDS-PAGE的结果(图1)基本一样。通过Vector NT预测该成熟蛋白的理论等电点约为7.7。

在NCBI的GenBank中利用BLAST服务器[http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST]进行相似性分析。结果表明：ORF的氨基酸序列(SEQ ID NO.3)显示与变形肥杆菌(Obesumbacterium proteus)的已知植酸酶的低一致性(54％)，并且具有与大肠杆菌植酸酶的低一致性(45％)。因此可以确定这个来源于耶尔森氏菌的开放阅读框编码了一个新的植酸酶。和其他植酸酶一样，该开放阅读框的氨基酸序列被命名为AppA。尽管与来源于中间型耶尔森菌ATCC 29909的一个假定蛋白具有较高的一致性，但是该假定蛋白是通过自动的计算机分析而由注释基因组序列(NZ AALF01000052)推测获得的，没有验证酶活性或任何关于生理或化学特性的信息。实施例4：植酸酶AppA在毕赤酵母中的表达

<4-1>表达载体的构建

为了获得成熟蛋白的编码区，设计合成了引物，yermF：5’-GCGGAATTCGCCGCGCCGGTTGCCATA-3’(27mer)，和yermR：5’-GTAGCGGCCGCTTAAATATGGCAAGCAGGTTC-3’(32mer)。利用引物yermF和yermR，成熟蛋白的编码区被扩增。扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳检测，切下预计大小的条带，并用TaKaRa琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒提取DNA。如厂商说明所述，纯化的DNA插入表达载体pPIC9(Invitrogen，San Diego，Calif.)的EcoRI和NotI酶切位点处。构建体被转化至涂覆于含100μg amp/mL的LB培养基上的JM109细胞内。阳性转化子被测序，并生长用于酵母转化的DNA的制备。

<4-2>转化酵母及表达

根据厂商说明，用YPD培养基培养毕赤酵母菌株GS115(Invitrogen)，并准备用于转化。使用DraI线性化约8μg的表达质粒pPIC9DNA然后通过电击转化到毕赤酵母中。将转化的细胞涂布于RDB培养基上，以筛选HIS4基因整合到宿主染色体DNA中。含有转化的HIS4基因的转化子才能在RDB平板上生长。在RDB平板上培养3天后，转化子在含甘油的基础培养基(BMGY培养基)上培养48小时，然后旋转(2500g，5分钟)收集细胞，并在0.5％甲醇培养基(BMMY)中悬浮，以诱导植酸酶表达。

<4-3>转化子植酸酶活性的检测

通过硫酸亚铁钼蓝法分析了总共72个转化子的植酸酶活性。其测定过程如下：在950μL的底物溶液(4mM的植酸钠，溶解在0.25M的乙酸钠缓冲液中，pH为5.0)被加至50μL稀释的酶溶液中，并混合均匀，在37℃反应30分钟。接着向以上反应体系中加入1mL 10％的TCA(三氯乙酸)，终止反应。作为对照，在酶液中先加入1mL 10％的TCA，使酶蛋白失活，接着在加入底物溶液，37℃放置30分钟。反应终止后，再加入2mL的显色液(0.576M的硫酸，1％的钼酸铵，7.32％的七个结晶水硫酸亚铁)，放置10分钟。在700nm下检测吸光值，并测定酶溶液和对照的活性。一个酶活单位指37℃时，1分钟释放1μM无机磷所需的酶蛋白的量。经过两天的甲醇诱导后，72个转化子中有11转化子被检测到植酸酶活性，酶活单位范围约在48-270U/mL之间。明显地，以上所获得的开放阅读框为一个新的有功能的植酸酶基因，其编码具有植酸酶活性的蛋白。这个由以上开放阅读框的成熟区域编码的具植酸酶活性的多肽被命名为r-AppA。

实施例5：重组植酸酶r-AppA的纯化

为了纯化酵母表达的重组植酸酶r-AppA，上清液酶活为270U/mL的转化子在较优的培养和诱导条件下培养。经过两天的甲醇诱导之后，利用与实施例4所述相同的方法检测植酸酶活性，上清液的酶活达到389U/mL。经过12000g离心10分钟，含有植酸酶蛋白的上清液被收集，酵母菌体被去除。

硫酸铵粉末被加入到上清液中，到达80％的饱和度，然后以12000g离心10分钟收集沉淀。沉淀用0.1M，pH5.0的乙酸钠缓冲液溶解，以12000g离心10分钟。然后，获得上清液，并使用相同的缓冲液进行透析。接下来，使用具有10kDa截留滤器的的超滤装置浓缩所得渗析液。最后，浓缩液通过Sephacryl S-200(PharmaciaBiotech)进行分离纯化。最后，用相同缓冲液通过Sephacryl S-200纯化植酸酶。实施例6：重组植酸酶r-AppA酶学性质分析

<6-1>重组植酸酶r-AppA分子量的确定以及脱糖基处理

纯化的重组植酸酶r-AppA分子量通过SDS-PAGE电泳进行测定。电泳结果图1：泳道1为标准分子量；泳道2为纯化的重组植酸酶r-AppA；泳道3为脱糖基的r-AppA。根据电泳检测的结果，纯化的r-AppA被证实其分子量约为45kDa。通过NetNglyc(预测N糖基化位点的程序)程序，预测了r-AppA的蛋白质序列。该蛋白没有潜在的N-糖基化位点(Asn-Xaa-Ser/Thr)。因为纯化的酶和经脱糖基化的酶的分子量一样，所以同样的结果在图1中也能看到。

<6-2>重组植酸酶r-AppA的温度和pH特性

在不同的温度和pH条件下，研究经Sephacryl S-200纯化的重组植酸酶r-AppA的酶活性。利用以下缓冲液确定pH值对植酸酶的影响：甘氨酸-盐酸pH 1.5-3.5；乙酸钠-乙酸pH 3.5-6.0；Tris-盐酸pH 6.0-8.5；和甘氨酸-氢氧化钠pH 8.5-10。所有用于稀释的缓冲液都含有0.05％ BSA和0.05％ Triton。如图2所示，植酸酶的活性随pH值的变化而变化。重组酶的最适pH为4.5，在pH 2.5时仍有70％的酶活性，在pH 5.5时仍有65％的酶活性。明显地，现有植酸酶相比，重组的植酸酶r-APPA在pH2.0-6.0的适宜范围内有更高的酶活性。图2显示了该酶具有较好的稳定性，当该酶放置在37℃，pH2.5-10.0处理2小时后，仍有超过85％的酶活性存在。在pH1.0-2.0处理后也有超过70％的活性保留。

图3A显示了酶活性随温度的变化关系。在最适pH4.5下测定了20℃到80℃范围内的酶活性，结果表明最适温为55℃。如图3B所示，酶液在80℃处理10分钟时，仍保留超50％的酶活性，在80℃处理1小时，仍保留40％的酶活性。与在饲料工业中被广泛用作饲料添加剂的大肠杆菌植酸酶相比，r-AppA在高温下具有更好的热稳定性。

根据对r-AppA的温度和pH测试，以及与其他常规的植酸酶相比，本发明的植酸酶r-APPA被认为是非常适于单胃动物的饲料添加剂。因为与常规使用的植酸酶相比，本发明提供的植酸酶具有宽的pH稳定性和高温稳定性，所以该植酸酶，r-APPA具有非常好的商业应用价值的应用潜力。

<6-3>金属离子及抑制剂对重组植酸酶r-AppA活性的影响

金属离子及抑制剂对重组植酸酶r-AppA活性的影响在最适pH(pH 4.5)下进行。

如表4所示，在各种金属离子中，酶活受浓度为1mM的许多金属离子的抑制较弱，Fe²⁺，Zn²⁺和Cu²⁺明显抑制酶活性。Mn²⁺对酶活性有弱的增强作用。作为抑制剂，SDS对酶活性有强的抑制作用，但是EDTA对酶活性基本没有影响。

表4 金属离子及抑制剂对重组植酸酶活性的影响

 

Na	95％
		K	99％
Ca	98％
		Li	95％
Co	93％
		Cr	88％
Ni	98％
		Cu	61％
Mg	94％
		Fe	47％
Mn	104％
		Zn	44％
EDTA	101％
		SDS	9％
Ag	84％
		对照	100％

<6-4>蛋白酶对重组植酸酶r-AppA活性的影响

为了确定蛋白酶抗性，纯化的重组酶(0.025mg/ml)与0.1mg/ml的胃蛋白酶和胰蛋白酶在37℃孵育。然后，分别在5、10、20、30、60、和120分钟时取样。如图4所示，该重组植酸酶r-AppA对胃蛋白酶和胰蛋白酶都有很强的抗性。该植酸酶显示高于任何其它曾报道的植酸酶的蛋白酶抗性。结果暗示该植酸酶因其对胃肠中存在的胃蛋白酶和胰蛋白酶具有抗性，从而可以提高植酸酶在单胃动物体内的水解效率。

<6-5>重组植酸酶r-AppA比活的测定

为了确定该植酸酶r-AppA的比活，首先通过Lowry方法确定了通过SephacrylS-200纯化的重组酶r-AppA的酶蛋白的浓度。并且在pH 4.5的条件下，通过硫酸亚铁钼蓝法确定重组酶r-AppA的酶活。结果，该重组植酸酶r-AppA的比活为3960±248U/mg，这是至今报道的比活最高的植酸酶。

工业应用

根据以上所述，本发明的新的植酸酶具有以下几个优点：高比活，合适的作用pH，良好的热稳定性，强的蛋白酶抗性，容易发酵生产。所有这些优点都意味着该植酸酶作为饲料添加剂，比以前所报道的植酸酶将会更有应用价值。第一，高比活意味着生产同样量的酶蛋白，可以降解更多的植酸。即降解同样量的植酸所需的酶蛋白量更少，成本也将更低。第二，合适的作用pH意味着该植酸酶可以更好的在动物肠道内发挥作用。第三，良好的热稳定性意味着该酶在制粒加工的过程中不容易失活。第四，强的蛋白酶抗性意味着该植酸酶在动物肠道内可以稳定的存在，而不被蛋白酶降解。最后，容易发酵生产说明，可以通过简单的工业发酵大量生产该植酸酶，并用于饲料行业。基于以上优良特性，任何本领域的普通技术人员都知道，本发明所提供的植酸酶作为饲料添加剂将发挥重要的作用。这一新的分离于Yersiniaintermedia的植酸酶已经克服了现有技术的缺点，因此有着极大的商业价值。

参考文献

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序列表

<110>中国农业科学院饲料研究所

<120>一种新的植酸酶的克隆和表达

<130>PF060009PCT

<160>5

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1440

<212>DNA

<213>中间型耶尔森氏菌

<400>1

<210>2

<211>1326

<212>DNA

<213>中间型耶尔森氏菌

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1326)

<400>2

<210>3

<211>441

<212>PRT

<213>中间型耶尔森氏菌

<400>3

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向简并引物

<400>4

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向简并引物

<400>5

Claims (15)

1、一种分离的具有如下特征的植酸酶蛋白：

a)理论分子量45.5kDa；

b)最适pH在4-5之间；

c)最适温度在50-60℃之间；

d)理论pI值为7.2；

e)比活在3000U/mg以上；且

f)对胃蛋白酶、胰蛋白酶具有高抗性。

2、一种分离的蛋白，其选自：

a)包含SEQ ID NO.3所示氨基酸序列的多肽；

b)由SEQ ID NO.2所示的多核苷酸或其简并序列所编码的多肽；

c)由在严谨条件下与SEQ ID NO.2所示多核苷酸的互补链杂交的多核苷酸编码的具有植酸酶活性的多肽；

d)由SEQ ID NO.2所示多核苷酸的等位基因或天然突变体所编码的具有植酸酶活性的多肽；或

e)由SEQ ID NO.3所示的多肽序列经过一个或多个氨基酸的取代、缺失和/或插入衍生的具有植酸酶活性的多肽；或

f)与SEQ ID NO.2所示氨基酸具有至少60％，优选65％，70％，75％，80％，85％，或至少90％，特别优选95％一致性的具有植酸酶活性的多肽。

3、如权利要求1或2所述的蛋白，其来自耶尔森氏菌属微生物，优选中间型耶尔森氏菌。

4、一种分离的核酸分子，其编码如权利要求1至3中任一项所述的蛋白。

5、一种DNA构建体或重组载体，其含有如权利要求4中所述的核酸分子。

6、一种宿主细胞，其含有如权利要求5中所述的DNA构建体或重组载体，或已整合至其基因组内的如权利要求4中所述的核酸分子。

7、如权利要求6所述的宿主细胞，其为真核生物细胞。

8、如权利要求7所述的宿主细胞，其为毕赤酵母细胞。

9、中间型耶尔森氏菌H-27，其保藏号为CGMCC 1702。

10、一种产生植酸酶的方法，包括在适于植酸酶表达的条件下，培养如权利要求6至8中任一项所述的宿主细胞。

11、一种饲料添加剂，其含有选自如下的有效成分：

a)如权利要求1至3中任一项所述的蛋白；和/或

b)如权利要求6至8中任一项所述的宿主细胞。

12、如权利要求11所述的饲料添加剂，其还含有一种或多种选自包含以下组分的酶制品：角蛋白酶、脂解酶、淀粉酶、磷酸酶、麦芽糖酶、转化酶、木聚糖酶、羧甲基纤维素酶的。

13、如权利要求1至3中任一项所述的多肽/或如权利要求6至8中任一项所述的宿主细胞在制备饲料添加剂中的用途。

14、一种从靶生物体中分离植酸酶基因的新方法，包括：

a)基于植酸酶保守序列RHGXRXP和HD设计一对简并引物；

b)利用所述引物通过PCR扩增部分植酸酶序列；和

c)进一步通过TAIL-PCR获取植酸酶的全序列。

15、如权利要求14所述的方法，其中所述的简并引物对如SEQ ID NO.4和5所示。

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