CN101368175B - 一种新的植酸酶及其编码基因以及包含该酶的细胞和饲料添加剂 - Google Patents

Abstract

本发明微生物涉及工程领域，具体涉及一种具有高稳定性和高水解功效的植酸酶及其编码基因以及包含该酶的宿主细胞和饲料添加剂。该植酸酶具有如下性质：比活高达3456±97U/mg，良好的pH稳定性和热稳定性，最适pH 4.5，最适温度55℃，强的蛋白酶抗性，且易于工业化发酵生产。本发明也涉及含有所述基因的重组载体，含有所述载体的宿主细胞，利用基因工程方法产生植酸酶的方法。

Description

一种新的植酸酶及其编码基因以及包含该酶的细胞和饲料添加剂

技术领域

本发明属于微生物工程领域，具体涉及一种具有高稳定性和高水解功效的植酸酶及其编码基因以及包含该酶的宿主细胞和饲料添加剂。

背景技术

全世界的动物生产都是以植物性日粮为基础，而植物性日粮中都存在大量的植酸，其中植酸磷占总磷量的50-70％，甚至更高。由于在消化道中植酸酶的活性过低，因此单胃动物如鸡和猪、以及人类都不能利用植酸磷。这些未消化的植酸螯合各种离子，如Ca²⁺、Fe²⁺、Zn²⁺和Mg²⁺，降低了这些重要矿物元素的吸收利用。同时消化道中的植酸还与摄取的蛋白质、淀粉等营养物质形成复合物，阻碍相关消化酶的作用，影响这些营养物质的消化吸收。此外，在畜牧业生产集中的领域，大多数未被消化的植酸磷排泄到周围环境中会污染水源和其他生态系统，带来了严重的环境问题。

植酸酶(肌醇六磷酸酶；EC 3.1.3.8和3.1.3.26)是一类能够从植酸中水解释放无机磷的酶的总称。为了充分利用植酸磷和被植酸螯合的养分，微生物来源植酸酶首次被添加到以玉米、豆粕为基础的鸡的日粮中，用于水解植酸，解除植酸的抗营养作用，并且取得了明显的效果。然后，大量的实验表明，向单胃动物日粮中添加微生物来源的植酸酶，可提高磷的利用率，提高动物的生长速率。同时，补充植酸酶也提高矿物元素的活性，减少磷的排泄量高达50％，这将有助于对环境的保护。

动物实验已阐明了动物的胃是真菌和细菌植酸酶从植酸中释放无机磷的主要功能部位。为了提高植酸磷的利用，饲料中的植酸酶必须具有强的催化活性，然而，在胃内，pH值从摄入食物后，先是急剧上升至5.5，其后慢慢减低到2.0。胃蛋白酶的前体在酸性条件下会被分泌的盐酸激活，具有强的蛋白水解能力。因此，植酸酶必须抵制酸性条件下的变性，蛋白质的水解，并且在生理温度和酸性条件需要具有高的活性。

目前，黑曲霉植酸酶和大肠杆菌植酸酶已被广泛地应用于饲料工业，以改善磷的利用率，减少磷对环境的污染。然而在消化道中的水解能力，它们与“理想植酸酶”还有一段差距。为了接近“理想植酸酶”，商业酶的性能，如在酸性pH值下的催化功效和稳定性，以及胰蛋白酶抗性等，都需要通过蛋白质工程的方法加以改进优化，或者找一些性质更优良的植酸酶取而代之。在过去十年中，已有多种微生物的植酸酶被分离定性。此外，在植酸酶的研究中的一个重要趋势是筛选分离性质更优良的植酸酶。

由于目前使用的植酸酶存在的一些缺陷，不能真正在胃肠道中充分发挥功能，因此，人们希望能够找到这样一种新的植酸酶：其具有非常好的稳定性，在动物胃肠道中有非常高的活性，并且该植酸酶还能够通过发酵技术大量生产，这样可以使其成本大幅度的降低，从而能够进一步推广该植酸酶的使用。

发明内容

本发明的发明人为了解决上述问题提出并完成了本发明。

本发明的目的是提供一种具有高稳定性和高水解功效的植酸酶。

本发明的再一目的是提供编码上述植酸酶的基因。

本发明的再一目的是提供含有上述基因的DNA重组载体。

本发明的再一目的是提供含有上述基因的宿主细胞。

本发明的再一目的是提供含有上述酶的饲料添加剂。

根据本发明的植酸酶，其具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，其理论分子量46.1kDa，最适pH在4-5之间，最适温度在50-60℃之间，比活在2400U/mg以上，在pH 1.5～5.5之间都具有高的活性，且在pH 1～10之间都具有良好的pH稳定性。在人工胃液中具有良好的稳定性和强的植酸水解能力。所述植酸酶可分离自耶尔森菌属微生物(Yersinia)，优选为罗氏耶尔森菌(Yersinia rohdei)。

本发明还提供了编码上述植酸酶的基因，优选地，其具有如SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列。

因此，本发明提供的植酸酶可以是：

a)具有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的多肽；或

b)由SEQ ID NO.1所示的多肽序列经过1～10氨基酸的取代、缺失和/或插入衍生且具有植酸酶活性的多肽；或

c)由SEQ ID NO.2所示的核酸分子或其简并序列所编码的多肽；或

d)由在严谨条件下与SEQ ID NO.2所示核酸分子的互补链杂交的核酸编码且具有植酸酶活性的多肽；或

e)与SEQ ID NO.1所示的多肽序列具有至少70％同源性且具有植酸酶活性的多肽。

具体地，本发明的植酸酶可由SEQ ID NO.1所示的多肽序列经过一个或多个(例如，一个或几个，包括具体的点值，可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，或者是处于中间的任一范围，如2-3个、7-8个等等)氨基酸的取代、缺失和/或插入获得，并仍然具有植酸酶活性。例如，一个常见的策略是保守氨基酸取代，即将氨基酸残基用具有相似侧链的氨基酸残基替换。具有相似侧链的氨基酸残基在本领域已有明确定义。再如，本领域技术人员公知，在基因的克隆操作中，常常需要设计合适的酶切位点，这势必在所表达的蛋白末端引入了一个或多个不相干的残基，而这并不影响目的蛋白的活性。又如，在重组蛋白的表达策略中，为构建融合蛋白、令重组蛋白分泌到胞外、增强其表达、便于纯化或纯化后与融合部分分离等目的，常常需要将一些氨基酸添加至重组蛋白的N-末端、C-末端或其它合适区域内，例如，包括但不限于，接头肽、信号肽、前导肽、末端延伸、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白、蛋白A、6His标签、Flag标签、或蛋白水解酶(如Xa因子、凝血酶、肠激酶)识别位点等等。

另外，本领域普通技术人员将会理解：由于自然变异所致的遗传多态性可在群体中的个体间存在。此类自然变异所产生的等位基因或天然变体一般可在植酸酶基因核苷酸序列中导致1～5％的差异。任何这种自然变异产生的等位基因或天然变体所编码的相应植酸酶蛋白活性不改变的此类氨基酸多态性也在本发明的范围之内。也就是说，本发明也涉及由SEQ ID NO.2所示核酸分子的等位基因或天然变体所编码的具有植酸酶活性的多肽。

另外，植酸酶蛋白可以为这样的活性多肽，优选地，其包含至少83％、84％、85％、86％、87％、88％、或89％、90％、91％、92％、93％、94％，更优选地，包含至少95％、96％、97％、98％、99％或更高地同源于本发明SEQ ID NO.1所示的全长氨基酸序列的氨基酸序列，且其具有植酸酶活性。除上述具体点值之外，上述值中间的范围和同一性值也包括在本发明中。例如，也包括使用任一上述值作为上限和/或下限组合而成的同一性值范围。在两个序列间比较序列并确定百分同源性为本领域公知的技术，可利用任何数学算法完成，既有作为软件可商购获得的，也有整合在公共数据库中的，例如多序列比对程序CLUSTAL W和模块分析程序BLOCKS，或NCBI的GenBank中所采用的BLAST服务器http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST等。本领域普通技术人员将明了针对所分析的具体序列如何优化各程序中相应的参数设置(如分值、字长、缺口罚分、权重等等)，可以获得预期的同源性或同一性比对结果。利用GenBank中BLAST的缺省参数设置，本发明植酸酶蛋白与其它已知家族成员的序列比对结果如下：

表1：本发明植酸酶蛋白与已知植酸酶蛋白的一致性比较结果

来源	Genbank登录号	一致性
			Yersinia intermedia	ABI95370	82.4％
Escherichia coli	AAN28334	41.5％

另一方面，本发明涉及包含SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的植酸酶基因。本发明还包括这样的核酸分子，其由于遗传密码的简并性而不同于本发明的核苷酸序列之一，但其与本发明SEQ ID NO.2所示核苷酸序列编码相同的植酸酶蛋白。本发明也涉及由在严谨条件下与SEQ ID NO.2所示核酸分子的互补链杂交的核酸。优选是由于天然变异所致的等位基因或天然变体。另外，本发明的核酸分子也可以具有这样的核苷酸序列，其编码的蛋白质具有如序列表中SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。本发明的核酸分子可以是例如与SEQ ID NO.2具有至少77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％，更优选至少85％、86％、87％、88％、89％或90％、91％、92％、93％、94％，甚至更优选地至少95％、96％、97％、98％、99％或更高地同源于本发明的核苷酸序列，其中包括使用任一上述点值作为上限和/或下限组合而成的同源性或同一性值范围。利用GenBank中BLAST的缺省参数设置，本发明的植酸酶基因与其它已知家族成员的序列比对结果如下：

表2：本发明植酸酶基因与已知植酸酶基因的一致性比较结果

来源	Genbank登录号	一致性
			Yersinia intermedia	DQ986462	76.8％
Escherichia coli	AF537219	52.0％

本发明还提供了含有上述植酸酶编码基因的DNA重组载体。术语“载体”是指这样的核酸分子，其可转运与其连接的另一核酸，例如质粒、病毒、噬菌体、粘粒等。本发明的重组表达载体以适于在宿主细胞中表达核酸的形式包含本发明的核酸，这就是说重组表达载体包括一个或多个与目的核酸有效连接的调节序列。其中，“有效连接”是指目的核苷酸序列与调节序列以允许该核苷酸序列表达(例如，在体外转录/翻译系统中，或当载体导入宿主细胞后在宿主细胞中表达)的方式连接。术语“调节序列”包括启动子、阻遏物结合位点、激活物结合位点、增强子和其它表达调控元件(例如，终止子、多聚腺苷酸化信号、或具有mRNA二级结构的其它元件)。本领域普通技术人员将了解到表达载体的设计可取决于如对欲转化的宿主细胞的选择、所需的蛋白质表达水平等因素。可以将本发明的表达载体导入宿主细胞，以产生由此处所述核酸所编码的植酸酶蛋白质，包括融合蛋白。

本发明的重组表达载体可设计用于在原核或真核细胞中表达植酸酶蛋白。例如，植酸酶基因可在细菌细胞如大肠杆菌、酵母(如毕赤酵母、黑曲霉)、昆虫细胞(如Sf9细胞、家蚕细胞，例如使用杆状病毒表达载体)或植物细胞(如拟南芥、烟草、玉米等，如使用农杆菌载体)中表达。

从而，本发明的另一方面涉及已导入本发明的重组表达载体的宿主细胞。宿主细胞可为任何原核或真核细胞，其包括但不限于上述的那些宿主细胞。优选毕赤酵母细胞。巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是一种甲醇酵母，能够以甲醇作为唯一碳源进行代谢。这个系统因为具有非常高的异源蛋白表达能力而闻名。作为一个真核表达系统，它具有非常多的优点，特别是后加工处理方面。如今已有许多的植酸酶基因在其中成功地表达，同样本发明提供的新的植酸酶基因也得到成功表达。在摇瓶水平，诱导48h后在培养基上清植酸酶活性达到429U/mL，因此在发酵罐水平大量生产该植酸酶将会比较容易。同时本发明也提供了一个生产该植酸酶的毕赤酵母工程菌株。

本发明的宿主细胞可以为真核生物细胞、优选毕赤酵母细胞，或原核生物细胞、优选大肠杆菌细胞。

本发明的宿主细胞(如培养的原核或真核宿主细胞)可用于产生(即表达)植酸酶蛋白。因此，本发明还提供了使用本发明的宿主细胞来产生植酸酶蛋白的方法。该方法包括在适于植酸酶表达的条件下，在合适的培养基中培养本发明的宿主细胞(其中已导入了编码植酸酶蛋白的重组表达载体，或其基因组中已导入了编码野生型或改变的植酸酶蛋白的基因)，直至产生植酸酶蛋白。该方法还包括从培养基或宿主细胞分离植酸酶蛋白。

所以，本发明提供了在毕赤酵母中表达的重组植酸酶。为了测定该重组植酸酶的性质，表达的植酸酶经过了一系列的方法纯化，最终达到电泳纯。纯的重组植酸酶分子量在46kDa，对植酸(盐)底物具有高达2456±97U/mg活性。该重组酶的最适pH在4-5之间，最适温度在50-60℃。此酶在pH 2～10之间都具有良好稳定性，处理一小时后还保留有95％以上的活性。此重组酶对胃蛋白酶、胰蛋白酶也具有非常强的抗性。以上性质决定了该植酸酶将会有一个较好的应用前景。

进一步，本发明的发明人将得到的罗氏耶尔森氏菌植酸酶基因连接到pGEM-T easy载体上，并转化进入大肠杆菌JM109中，从而获得含有上述罗氏耶尔森氏菌植酸酶基因的大肠杆菌菌株，该大肠杆菌E.coli JM109-Y9已于2007年7月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为：CGMCC No.2121。

本发明还提供一种饲料添加剂，其包含上述植酸酶和/或宿主细胞，因此，本发明还涉及所述植酸酶在制备饲料添加剂中的用途，以及相应的饲料添加剂，所述饲料添加剂以所述植酸酶多肽、表达植酸酶多肽的宿主细胞作为有效成分。所述饲料添加剂的有效成分可以是所述植酸酶多肽、表达植酸酶多肽的宿主细胞。所述饲料添加剂可制备为干粉或液体制剂，并且可额外地包括一种或多种酶制品，如角蛋白酶、脂解酶(如脂肪水解酶)、淀粉酶、磷酸酶、麦芽糖酶、转化酶、木聚糖酶、羧甲基纤维素酶等等。除了植酸酶和/或产植酸酶微生物，本发明的饲料添加剂还可额外包括其它非致病性的有益微生物，例如益生菌乳酸菌、双歧杆菌等，有助于消化和饲料吸收的酵母菌，有助于增重的米曲霉菌，能够产生有益蛋白酶的枯草芽孢杆菌等等。

根据以上所述，本发明所提供的新的植酸酶具有以下几个优点：高比活，合适的作用pH，强的植酸水解能力，良好的热稳定性，强的蛋白酶抗性，容易发酵生产。所有这些优点都意味着新发现的植酸酶作为饲料添加剂，比以前所报道的植酸酶将会更有应用价值。第一、高比活和强的植酸水解能力意味着生产同样量的酶蛋白，可以降解更多的植酸，即降解同样量的植酸所需的酶蛋白量更少，成本也将更低。第二、合适的作用pH意味着该植酸酶可以更好的在动物肠道内发挥作用。第三、良好的热稳定性意味着该酶在制粒加工的过程中不容易失活。第四、强的蛋白酶抗性意味着该植酸酶在动物肠道内可以稳定的存在，而不被蛋白酶降解。最后，容易发酵生产说明，可以通过简单的工业发酵大量生产该植酸酶，并用于饲料行业。我们所发明的来源于Yersinia rohdei新的植酸酶可以克服通常所使用的植酸酶的缺陷。因此，我们所发明的植酸酶将会带来比较大的商业价值。

附图说明

图1说明了重组酶的最适pH和pH稳定性，纵坐标表示相对活力(％)，以活性最高的和未处理的作为100％。

图2说明了重组酶的A：最适温度和B：温度稳定性，纵坐标表示相对活力(％)，以活性最高的和未处理的作为100％。

图3说明了蛋白酶的稳定性。

图4说明了蛋白酶人工胃液中的稳定性。

图5：人工胃液中降解豆粕植酸。

本发明所提供的携带罗氏植酸基的菌株(E.coli JM109-Y9)已于2007年7月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所100101)，保藏编号为：CGMCC No.2121。

具体实施方式

以下结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细的说明，而并不旨在以任何方式限制本发明。

实施例1 Yersinia rohdei植酸酶基因的克隆

通常，同一家族的基因在蛋白和核酸序列上通过比对，可以找到部分比较保守的序列。所以在获取同一家族的其他希望所获得的基因序列时，相似性克隆是一种非常有效简单的方法。

根据植酸酶的分类，可以得到大部分细菌来源的植酸酶都属于组氨酸酸性磷酸酶家族。通过多序列比对程序CLUSTAL W和模块分析程序BLOCKS(http://blocks.fhcrc.org/blocks/make_blocks.html)，在对大量组氨酸酸性磷酸酶进行分析时，我们找到了组氨酸酸性磷酸酶蛋白序列中两个保守区域RHGXRXP和HD区域。基于这两个保守区域，我们设计了如<1-1>所述的简并引物用于从罗氏耶尔森氏菌基因组DNA中扩增部分植酸酶序列。

<1-1>部分植酸酶基因序列的获得

我们根据上述两个保守区域RHGXRXP和HD、部分旁侧序列以及密码子偏好性，设计合成了如下的简并性引物：

FI，5′-GTKSTKAWWKTSAGYCGCCA-3′(20mer)和RI，5′-TWKGCMAKRTTRGTATCRTG-3′(20mer)，并以罗氏耶尔森氏菌基因组DNA作为模板，进行PCR扩增。整个PCR的反应条件为：1个循环，95℃，2分钟；30个循环，95℃，30秒/退火温度，44℃，30秒/72℃，1分钟；最后在72℃延伸5分钟。通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，发现一系列的片段，即这些简并引物扩增出了许多片段。接下来对这些条带进行分析，通过TaKaRa.的琼脂糖凝胶回收试剂盒，回收与估计目的条带大小(900bp左右)相符的片段，并用单引物对该回收的片段进行检测，确信该片段是由双引物所扩增出来的片段，再将其连结pGEM Teasy(Promega)载体，接着转化大肠菌感受态细胞JM109。筛选转化子，并对转化子进行质粒提取检测，并将含有目的片段的转化子进行DNA序列的测定。结果确定了901bp的DNA序列为目标片段。

<1-2>完整的植酸酶序列的克隆

为了获得完整的植酸酶基因序列，以上所获得的901bp目的片段上游和下游的序列，分别通过热不对称交错PCR(TAIL-PCR)克隆得到。根据以上所获得的目的片段序列，设计了用于TAIL-PCR的巢式特异性引物，它们分别为：

上游特异性引物(usp，up special primer)：

usp1(5′-CTACCCCATCAAGAAAGGCCTGCCCTG-3′)；

usp2(5′-CGGGTTCGCTGATCTATGTCTGCTTG-3′)；

usp3(5′-CTCTGGGCGTTAAATACCCGGC-3′)；

下游特异性引物(dsp，down special primer)：

dsp1(5′-GTTGCCTGGCACCGCCTGAGTGGTG-3′)；

dsp2(5′-CGCCCGCCATAAAGGCACTCCTTTGC-3′)；

dsp3(5′-CCAAAGTGCTTTTCCTTGGTG-3′)。

另外一端的非特异性引物(AD，arbitrary degenerate primers)序列如下：AD1(5′-NTCGASTWTSGWGTT-3′)；AD6(5′-CAWCGICNGAIASGAA-3′)。

TAIL-PCR的反应条件基本与Liu et al.1995(Liu，Y.G.，and R.F.Whittier.1995.Thermal asymmetric interlaced PCR：automatable amplification and sequencing of insert endfragments from P1 and YAC clones for chromosome walking.Genomics 25：674-681)相同，故在此不再赘述。在整个循环过程中交错地使用高的、低的退火温度，产物的一端是特异性引物，而另一端是AD引物。通过琼脂糖凝胶电泳分析TAIL-PCR的产物，结果表明：已知的901bp的上游我们获得一段650bp的片段，下游我们也获得了一段约780bp的片段。所获得的这两条片段，分别通过TaKaRa的琼脂糖凝胶回收试剂盒进行纯化回收，并将所回收的片段连接到pGEM-Teasy(Promega)载体。接着转化大肠菌感受态细胞JM109。筛选转化子，并对转化子进行质粒提取检测，并将含有目的片段的转化子进行DNA序列分析。

以上所获得的两条片段序列和已知的片段序列都被输入DNASTAR软件，并通过序列拼接程序，将以上三条序列拼接成一条完整的序列。再使用ORF find程序找到完整的植酸酶开放阅读框。该阅读框由1326bp组成，含有一段信号肽序列和成熟蛋白序列。

<1-3>所获得完整序列的分析

所获得的完整片段全长中含有一个完整的开放阅读框1326bp(SEQ IDNO.2)。该开放阅读框编码一段24aa的信号肽序列和417aa的成熟蛋白序列。通过Signal P程序[http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/]，预测了信号肽，其最可能的切除位点在N端Ala24-Pro25之间。利用PeptideMass程序[http://cn.expasy.org/tools/peptide-mass html]，还预测了除信号肽之外的成熟蛋白的分子量。成熟蛋白的预测分子量为46.1kDa，归属于组氨酸酸性磷酸酶家族。在NCBI的GenBank中利用BLAST服务器[http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST]，对该基因序列进行了相似性研究。结果表明：该蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO.1)与GenBank中所有的蛋白质序列相比，一致性最高的是来源于中间型耶尔森氏菌(Yersinia intermedia)的植酸酶，一致性为82.4％。同时核酸序列也于GenBank中的核酸序列进行了比对，一致性最高的也是来源于中间型耶尔森氏菌(Yersinia intermedia)的植酸酶基因，一致性为76.8％。因此可以确定这个来源于罗氏耶尔森氏菌的开放阅读框编码了一个新的植酸酶，所获得的植酸酶基因为新的基因。和其他的植酸酶一样，该植酸酶被命名为AppA(Acid PhosPhatase A)。

本发明的植酸酶及其编码基因的序列分别为：

SEQ ID NO.1

MTVASYRLRLPALALMLSSFALGAAPVITAPAGYTLERVVILSRHGVRSPTKQT

QLMNEVTPDKWPQWPVKAGYLTPRGAQLVTLLGAFYGEYFRSQGLLPAGCPP

EGTVYAQADIDQRTRLTGQAFLDGVAPGCGLEVHYQADLKKTDPLFHPVEAG

VCKVDLAQTRQAVEQRLGGPLTTLSQRYAKPFAQMGEVLNFAESPFCKSLQQK

GKTCDFATFAANEIDVNKDGTKISLTGPLALSSTLAEIFLLQNSQAMPDVAWHR

LSGAENWVSLLSLHNAQFDLMAKTPYIARHKGTPLLQQINTALVLQRDAQGQT

LPLSPQTKVLFLGGHDTNIANIAGMLGANWQLPQQPDNTPPGGGLVFELWQHP

DNHQRYVAVKMFYQTMDQLRNVEKLNLTTNPAGIIPIAVEGCENMGDDKLCQ

LETFEKKIAQVIEPACHI

SEQ ID NO.2

ATGACAGTAGCAAGTTATCGTCTGCGATTACCCGCGCTAGCCTTAATGTTAA

GTAGTTTTGCTCTTGGTGCGGCCCCGGTGATAACCGCACCGGCCGGTTATAC

TTTGGAGCGCGTGGTTATTTTGAGTCGTCATGGTGTTCGTTCCCCGACGAAA

CAAACACAGTTAATGAATGAGGTAACACCTGATAAATGGCCACAATGGCCG

GTAAAAGCCGGGTATTTAACGCCCAGAGGCGCGCAATTAGTTACCCTGTTG

GGGGCATTCTATGGTGAATACTTCCGCAGTCAGGGGTTATTGCCCGCCGGTT

GCCCGCCAGAAGGTACGGTTTATGCACAAGCAGACATAGATCAGCGAACCC

GCCTAACAGGGCAGGCCTTTCTTGATGGGGTAGCACCAGGTTGCGGCCTGG

AGGTACATTATCAAGCTGATTTGAAAAAAACTGACCCGCTATTCCACCCGGT

GGAAGCGGGTGTTTGTAAGGTAGATTTAGCCCAAACTCGTCAGGCCGTTGA

GCAACGGTTGGGAGGGCCTTTAACCACATTGAGCCAGCGTTATGCCAAACC

TTTTGCTCAGATGGGAGAAGTGCTGAATTTTGCTGAATCTCCTTTTTGTAAG

TCACTACAACAGAAGGGGAAAACCTGTGATTTTGCCACCTTTGCGGCCAAT

GAAATIGACGTGAATAAAGACGGGACAAAAATCTCGCTAACGGGGCCGCTG

GCGCTGTCATCAACCTTGGCTGAGATTTTCTTGTTACAAAACTCGCAGGCCA

TGCCGGATGTTGCCTGGCACCGCCTGAGTGGTGCGGAAAATTGGGTTTCATT

ATTATCGCTGCATAATGCCCAATTTGATTTAATGGCCAAAACGCCTTATATC

GCCCGCCATAAAGGCACTCCTTTGCTGCAACAGATTAATACCGCATTGGTAT

TGCAGCGCGATGCTCAGGGGCAAACATTGCCTTTATCACCGCAGACCAAAG

TGCTTTTCCTTGGTGGCCATGATACCAATATTGCCAATATTGCAGGGATGTT

GGGGGCGAATTGGCAATTACCACAACAACCGGATAATACCCCGCCAGGTGG

GGGGTTGGTATTTGAGCTTTGGCAGCACCCGGATAACCATCAGCGGTATGT

GGCAGTGAAAATGTTTTATCAAACAATGGATCAGCTACGGAATGTTGAGAA

ATIAAACCTGACAACTAATCCTGCCGGGATTATTCCCATTGCGGTTGAAGGT

TGTGAAAACATGGGTGATGACAAGCTTTGTCAGCTTGAGACTTTCGAAAAG

AAAATAGCCCAAGTGATAGAGCCAGCCTGCCATATTTAA

<1-4>含植酸酶基因的菌种保藏

罗氏耶尔森氏菌植酸酶基因的完整序列连接到pGEM-Teasy中，并转化到大肠杆菌JM109中。该重组菌株被命名为Y9(Escherichia coli JM109-Y9)。已于2007年7月25日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为：CGMCC No.2121。

实施例2 植酸酶AppA在毕赤酵母中的表达

<2-1>表达载体的构建

为了获得成熟蛋白的编码区，设计合成了引物(YmF和YmR)。带有EcoRI和NotI限制性酶切位点的引物YmF和YmR的序列在表4中列出。成熟蛋白的编码区用引物YmF和YmR自罗氏耶尔森氏菌基因组DNA中扩增。通过EcoRI和NotI酶切位点连接进入表达载体pPIC9(Invitrogen，SanDiego)，构建成酵母表达载体pPIC9-AppA。连接产物用于转化大肠杆菌感受态细胞JM109。阳性转化子进行DNA测序，测序表明序列正确的转化子用于制备重组质粒。表达质粒载体DNA进一步用于转化毕赤酵母。

    表4：扩增成熟蛋白全长的引物

引物名称	引物序列	酶切位点
			YmF	5′-CTT<u>GAATTC</u>GCCCCGGTGATAACCGCACC-3′	EcoR I
YmR	5′-GTA<u>GCGGCCGC</u>TTAAATATGGCAGGCTGGCTC-3′	Not I

<2-2>转化酵母及表达

用YPD培养基培养毕赤酵母菌株GS115(Invitrogen)，根据毕赤酵母表达操作手册，制备感受态细胞GS115。约8微克的表达质粒载体用限制性内切酶BglII进行线性化，线性化的表达载体中加入80μL感受态细胞GS115，混合均匀，用Bio-Rad GenePulser电击仪电击。电击结束后立即加入1mL浴冷的1M的山梨醇，取300μL涂布于RDB培养基上。通过RDB平板筛选在基因组中插入了HIS4的转化子。RDB平板上没有组氨酸，GS115中HIS4也被破坏了，所以只有在GS115插入了HIS4的转化子才能在RDB平板上生长。在RDB平板上培养3天后，转化子被接种到BMGY培养基培养48小时。接着培养的菌体转移到BMMY进行诱导表达植酸酶。

<2-3>转化子植酸酶活性的检测

通过硫酸亚铁钼蓝法，总共120个转化子进行了植酸酶活性的检测。其测定过程如下：在950μL的底物溶液(4μM的植酸钠，溶解在0.25M的乙酸钠缓冲液中，pH为4.5)加入50μL稀释的酶，并混合均匀，在37℃反应30分钟。接着在以上反应体系中加入1mL 10％的TCA(三氯乙酸)使酶蛋白变性，终止以上反应。对于空白对照而言，在酶液中先加入1mL 10％的TCA，使酶蛋白失活，接着在加入950μL的底物溶液，37℃放置30分钟。等反应终止后，再加入2mL的显色液(0.576摩尔的硫酸，1％的钼酸铵，7.32％的七个结晶水硫酸亚铁，配置新鲜的使用)放置10分钟。在700nm下检测吸光值，最后通过标准曲线计算出酶活单位。一个酶活单位指37℃时，1分钟释放1μM无机磷所需的酶蛋白的量。经过两天的甲醇诱导后，120个转化子中有53转化子被检测到植酸酶活性，在培养基上清的酶活单位范围约在41-429U/mL之间。明显以上所获得的开放阅读框为一个新的有功能的植酸酶基因，编码一个新的具有植酸酶活性的蛋白。这个由以上开放阅读框编码的在酵母中表达的蛋白，被命名为r-AppA。

实施例3 重组植酸酶r-AppA的制备和纯化

为了纯化酵母表达的重组植酸酶r-AppA，上清液酶活为429U/mL的转化子在较优的培养和诱导条件下通过摇瓶培养。经过两天的诱导之后，利用实施例4所描述的方法检测植酸酶活性，上清液的酶活达到927U/mL。经过12000g离心10分钟，含有植酸酶蛋白的上清液被收集，酵母菌体被去除。用0.22μm的滤膜对上清液进行抽真空处理，去掉上清液中其他的杂质。对处理过的上清进行硫酸铵沉淀，硫酸铵粉末被加入到上清液中，到达80％的饱和度，搅拌过夜。离心收集沉淀，沉淀用0.1M、pH8.0的Tris-HCl缓冲液溶解。对溶解的沉淀溶液，再次离心，除去其中一些不溶的物质。将所获得的溶液装入透析袋中，透析袋悬浮在0.1M、pH8.0的Tris-HCl缓冲液中，过夜透析处理，除去大量的盐离子。透析后的样品通过PEG8000进一步浓缩处理后，2ml的浓缩液通过阴离子交换HiTrap Q Sepharose XL FPLC column(Amersham Pharmacia Biotech，Sweden)进一步纯化。0.1M、pH8.0的Tris-HCl含有1M NaCl进行梯度洗脱，收集目的峰尖的洗脱液5mL。将收集液电泳检测，表明目的蛋白已被纯化。

实施例4 重组植酸酶r-AppA酶学性质分析

<4-1>重组植酸酶r-AppA的最适pH和pH稳定性

在不同的温度和pH条件下，对纯化的重组植酸酶r-AppA进行了植酸酶活性研究。pH值对植酸酶的影响被确定了利用以下缓冲液：甘氨酸-盐酸pH 1.5-3.5；乙酸钠-乙酸pH 3.5-6.0；Tris-盐酸pH 6.0-8.5；和甘氨酸-氢氧化钠pH 8.5-10。所有这些对纯化的植酸酶溶液进行稀释的缓冲液中都含有0.05％BSA和0.05％Triton。取50μL稀释好的酶液，分别在pH 1.5-10.0测定酶活。如图1所示植酸酶的活性随pH值的变化而变化，计算相对酶活确定最适pH。测定条件下，重组酶的最适pH为4.0-5.0，pH 4.5时酶活达到最大值。pH 2.0-8.0之间都可检测到活性。

重组植酸酶的pH稳定性如图1所示。将纯化的重组植酸酶稀释到一定浓度，取10μL在pH 1-10的缓冲液中，37℃放置1h。然后再在37℃、pH 4.5的条件下测定酶活，通过计算相对酶活来比较重组酶对pH的稳定性。该酶在pH 2-10都非常稳定，处理一小时后还保留有95％以上的活性。该酶具有极好的pH稳定性，即使在pH 1.0时仍然具有约80％的活性，即在动物偏酸的条件下，pH对该酶的稳定性没有影响。

<4-2>重组植酸酶r-AppA的最适温度和热稳定性

将纯化的重组酶r-AppA稀释到所示浓度，取50μL分别在10、20、30、40、45、50、55、60、70、80℃温度下测定酶活，计算相对酶活，以确定该酶的最适温度。其结果如图2A所示，该酶的最适温度在50-60℃之间，优选55℃。在20-70℃之间保持较好的活性。

将纯化的重组酶r-AppA纯酶稀释到所示浓度，取2mL在80℃保温。接着分别在2、4、6、8、10min取出100μL酶液稀释到所示浓度。在37℃，pH 4.5的条件下测定酶活，以未处理的原酶液作为100％的对照，其测定结果如图2B所示。

<4-3>蛋白酶对重组植酸酶r-AppA活性的影响

为了确定蛋白酶对重组植酸酶r-AppA活性的影响，纯化的重组酶(0.1mg/mL)与0.01mg/ml的胃蛋白酶和胰蛋白酶等体积混合，保温在37℃。接着分别在5、10、20、30、60、90、120min取样。在37℃，pH4.5的条件下测定酶活性。以未用蛋白酶处理酶液做为100％的对照，计算相对酶活力。其结果如图3所示，该重组植酸酶r-AppA对胃蛋白酶和胰蛋白酶都有很强的抗性。因此，该植酸酶能够稳定的在动物胃肠道中存在，不会被肠道蛋白酶降解。

<4-4>重组植酸酶r-AppA比活的测定

为了确定该植酸酶r-AppA的比活，首先通过Lowry方法确定了纯化的重组酶r-AppA的酶蛋白的浓度。并且重组酶r-AppA酶活力单位，在37℃，pH 4.5的条件下，通过硫酸亚铁钼蓝法确定。通过计算，该重组植酸酶r-AppA的比活为2456±97U/mg。

实施例5 比较重组植酸酶r-AppA与商业化的植酸酶

为了比较该植酸酶r-AppA与商业化的植酸酶，大肠杆菌植酸酶、黑曲霉植酸酶以及该重组植酸酶在毕赤酵母中表达后，分别进一步被纯化达到电泳纯。因为胃是植酸酶主要发挥水解植酸释放无机磷的部位，在胃液中的活性可以正确的反映植酸酶的水解能力。因此，被纯化的酶蛋白进一步分别研究了在人工胃液中的稳定性及水解植酸的能力。

<5-1>在人工胃液中的稳定性比较

相同单位的植酸酶分别加入到人工胃液中，植酸酶的终浓度为1U/ml人工胃液，在37℃处理20分钟后，分别在最适pH条件下检测剩余的植酸酶活性。结果表明罗氏耶尔森氏菌植酸酶剩余的植酸酶活性最高，达到75％的活性；大肠杆菌植酸酶只剩下30％的活性；黑曲霉植酸酶仅剩下最初酶活的20％左右(图4)。因此，该植酸酶能够更能稳定的存在于单胃动物的胃终存在，因为能够抵抗强的酸性条件下的变性作用，同时又能抵抗高浓度的蛋白酶的水解作用。

<5-2>在人工胃液中水解植酸能力的比较

一克豆粕日粮溶解在9ml的人工胃液中，37℃振荡20分钟后，加入1ml用人工胃液稀释好的植酸酶溶液(整个稀释操作在冰上，以防止植酸酶在人工胃液中的降解)，37℃振荡反应1小时。通过检测释放的无机磷来衡量植酸酶的水解能力。为了进一步模拟胃中的作用环境，同时做了pH梯度累积效果试验。结果表明罗氏耶尔森氏菌植酸酶释放的无机磷是黑曲霉植酸酶的10.7倍，是大肠杆菌植酸酶的3.2倍(图5)。罗氏耶尔森氏菌植酸酶释放的无机磷都明显大大高于目前两个重要的商品化的植酸酶。因此，在强酸性和高蛋白酶浓度下该植酸酶对植酸有非常强的水解能力。

                序列表

Claims (10)

1.一种新的植酸酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.编码权利要求1所述植酸酶的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.一种DNA重组载体，其特征在于，包含权利要求2所述的基因。

5.一种宿主细胞，其特征在于，包含如权利要求2所述的基因或如权利要求4所述的DNA重组载体。

6.如权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为真核生物细胞或原核生物细胞。

7.如权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为毕赤酵母细胞。

8.如权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌细胞。

9.如权利要求5所述的宿主细胞，其保藏号为CGMCCNo.2121。

10.一种饲料添加剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的植酸酶和/或权利要求5所述的宿主细胞。

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