CN101063113B - 一种新的植酸酶的克隆和表达 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种新的植酸酶、编码这个酶的基因及其生产菌株无丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacter amalonaticus B-52)。该植酸酶具有如下性质：比活高达3548±34U/mg，良好的pH稳定性和热稳定性，最适pH4.5，最适温度55℃，强的蛋白酶抗性，且易于工业化发酵生产。本发明也涉及含有所述基因的重组载体，含有所述载体的宿主细胞，利用基因工程方法产生植酸酶的方法。而且，本发明还涉及植酸酶在制备饲料添加剂中的用途以及相应的饲料添加剂。此外，本发明还提供了一种全新的分离植酸酶基因的方法。

Description

一种新的植酸酶的克隆和表达

技术领域

本发明属于微生物工程领域，具体涉及一种具有高稳定性和高活性的植酸酶、其生产菌株的筛选、植酸酶基因的克隆分离、植酸酶基因在宿主细胞(如毕赤酵母)中的表达纯化及其酶学性质的研究。

技术背景

在动物日粮中，植酸磷占总磷量的50-70％，甚至更高。但是，单胃动物缺乏分解植酸的酶，因此磷的利用率非常低。在通过消化道时植酸磷不能被动物吸收。大量的植酸排泄到环境中，导致土壤和水中磷的富积，造成环境污染。另外，植酸还可以与大量必要离子结合，抑制了这些元素的吸收。同时植酸还可以与其他营养物质结合，降低了饲料的利用率。

显然磷是生长所必需的，因此为了动物的正常生长添加无机磷(磷酸二氢钙、去氟磷酸盐)或动物性产品(肉骨粉、鱼粉)是非常必要的，但是价格比较昂贵。

植酸酶是能够将谷物中磷的储存形式的植酸(肌醇六磷酸)(E Graf，KL Empson and JW Eaton.Phytic acid.A natural antioxidant.J.Biol.Chem.，Vol.262，Issue 24，11647-11650，Aug，1987)水解为无机磷和肌醇的一类酶的总称。植酸酶广泛地存在于动物、植物和微生物之中。根据不同来源植酸酶的性质特征的差异，微生物来源的植酸酶倍受关注。作为饲料添加剂，微生物植酸酶大量提高了单胃动物日粮中植酸磷的生物学活性(Cromwell，et al.Efficacy of phytase in improving the bioavailability ofphosphorus in soybean meal and corn-soybean meal diets for pigs.J AnimSci.1993 Jul；71(7)：1831-40)。结果降低了动物饲料中无机磷的添加量，同时减少了环境中磷的排放(Kornegay，et al.Replacement of inorganic phosphorus by microbial phytase for young pigs fed on amaize-soyabean-meal diet.Br J Nutr.1996 Oct；76(4)：563-78)。一方面，随着基因工程技术的发展，越来越多的微生物植酸酶被分离纯化。例如，“来源于Klebsiella terrigena的植酸酶纯化与性质测定”(Greiner et al.Purification and characterization of a phytase from Klebsiella terrigena.Arch Biochem Biophys.1997May 15；341(2)：201-6)，“来源于芽孢杆菌种DS11的热稳定性植酸酶的纯化与性质测定”(Kim et al.Purification andproperties of a thermostable phytase from Bacillus sp.DS11.EnzymeMicrob Technol，1998 Jan，22(1)，2-7)，“Citrobacterbraakii来源的植酸酶分离及性质测定”(Kim et al.Isolation and characterization of a phytasewith improved properties from Citrobacter braakii.Biotechnol Lett.2003Aug；25(15)：1231-4)，“来源于Obesumbacteriumproteus的新型植酸酶的基因克隆表达及性质测定”(Zinin et al.Gene cloning，expression andcharacterization of novel phytase from Obesumbacterium proteus.FEMSMicrobiol Lett.2004 Jul 15；236(2)：283-90)；另一方面，还通过直接定点突变或基因改组，对已有的植酸酶进行性质改良。例如，“植酸酶phyA^m基因结构延伸突变改善酶的热稳定性”(陈惠等，生物工程学报，2005年11月，21卷6期，983-987)，“大肠杆菌植酸酶的定点突变”(US patent6,841,370，Lei XG，Site-directed mutagenesis of Escherichia coli phytase.2005)。所以微生物来源的植酸酶的价格大幅度的降低。由于这些优点，部分植酸酶在饲料行业被广泛的接受应用。

但是，在这些已广泛使用的植酸酶中，仍然存在着一些缺陷。因为这些植酸酶作为饲添加剂，并不能发挥它的理想作用。例如，大部分植酸酶在饲料制粒加工的过程中就已经高温变性失活了，所以在肠道中不能发挥降解植酸的作用。不同的植酸酶在饲料中不能真正发挥作用的原因，主要是由于，这些酶的稳定性比较差(pH稳定性、热稳定性、抗蛋白酶降解的稳定性以及在储存运输过程中的稳定性)和在胃肠道环境中活性比较低的缘故。

由于目前使用的植酸酶存在的这些缺陷，因此，人们希望能够找到这样一种新的植酸酶：其具有非常好的稳定性，在动物胃肠道中有非常高的活性，并且该植酸酶还能够通过发酵技术大量生产，这样可以使其成本大幅度的降低，从而能够进一步推广该植酸酶的使用。

另外，现有技术中分离植酸酶的手段有限，主要是通过构建基因组文库，或直接从纯化蛋白入手。但是，这两种方式都比较耗费时间和劳力，效率非常的低，并且也非常昂贵。而且，鉴于不同物种中植酸酶基因的同源性很低，难以通过简单的PCR直接筛选到新的植酸酶基因。因此，本领域也急需发展新的简便有效的植酸酶分离方法

发明概述

首先，本发明提供了一株产高活性高稳定性植酸酶的菌株无丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacter amalonaticus)B-52，其已于2006年4月25目保藏在位于中国北京市海淀区中关村北一条13号中国科学院微生物研究所内的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC 1696。

本发明也提供了一种新的植酸酶基因，其包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列或其衍生序列。

本发明还提供了具有如下性质的植酸酶，其理论分子量46.5kDa，最适pH在4-5之间，最适温度在50-60℃之间，理论pI值为6.2，比活在3000U/mg以上，且在pH 1-10之间都具有良好的pH稳定性。所述植酸酶可分离自柠檬酸杆菌属微生物，优选为无丙二酸柠檬酸杆菌。

本发明也涉及一种分离的多肽，其选自：

a)包含SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽；

b)由SEQ ID NO：2所示的多肽序列经过1-10氨基酸的取代、缺失和/或插入衍生且具有植酸酶活性的多肽；

c)由SEQ ID NO：1所示的核酸分子或其简并序列所编码的多肽；

d)由在严谨条件下与SEQ ID NO：1所示核酸分子的互补链杂交的核酸编码且具有植酸酶活性的多肽；

e)由SEQ ID NO：1所示核酸分子的等位基因或天然变体所编码且具有植酸酶活性的多肽；或

f)与SEQ ID NO：2所示的多肽序列具有至少70％同源性且具有植酸酶活性的多肽。

特别地，本发明还提供了一种简单有效的从基因组DNA中克隆分离植酸酶的基因的方法。所述方法包括：

a)基于植酸酶保守序列RHGXRXP和HD设计一对简并引物；

b)利用所述引物通过PCR扩增部分植酸酶序列；和

c)进一步通过TAIL-PCR获取植酸酶的全序列。

另外，本发明还提供了在宿主细胞(例如，包括但不限于毕赤酵母)中产生和表达重组植酸酶蛋白的方法。从而，本发明提供了所述基因操作中涉及的重组载体、宿主细胞。

进一步地，本发明还涉及所述植酸酶在制备饲料添加剂中的用途，以及相应的饲料添加剂，所述饲料添加剂以所述植酸酶多肽、表达植酸酶多肽的宿主细胞、或者本发明筛选到的无丙二酸柠檬酸杆菌B-52作为有效成分。

附图说明

图1：纯化的蛋白及其脱糖基化处理。泳道1为分子量标准，泳道2为纯化的植酸酶，泳道3为脱糖基化处理的植酸酶。

图2：重组酶的最适pH和pH稳定性。纵坐标表示相对活力(％)，以活性最高的和未处理的作为100％。

图3：A：最适温度，B：温度稳定性。纵坐标表示相对活力(％)，以活性最高的和未处理的作为100％。

图4：蛋白酶的稳定性

关于生物材料的保藏说明

本发明所用的无丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacter amalonaticus)B-52已于2006年4月25日保藏在位于中国北京市海淀区中关村北一条13号中 国科学院微生物研究所内的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为：CGMCC 1696。

序列简述

序列1：新植酸酶的核酸序列

序列2：新植酸酶的氨基酸序列

序列3：正向简并引物FI的序列

序列4：反向简并引物RI的序列

发明详述

以下详细描述本发明的各个方面，其中列举的数值或范围(比如分子量、pH值、同源性)应理解为是大约的数值或范围，即可在所述数值或数值范围的上下左右浮动，而不仅仅局限于具体的点值。

首先，该发明提供了一株产高活性高稳定性植酸酶的菌株。通过硫酸亚铁钼蓝法检测植酸酶活性，对本实验室贮存的6株柠檬酸杆菌(即3株弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、2株未定种名的柠檬酸杆菌(Citrobacter sp.)、1株无丙二酸拧檬酸杆菌(Citrobacter amalonaticus))中进行筛选，发现已知的这株无丙二酸拧檬酸杆菌能够在细胞内检测到高植酸酶活性，其为格兰氏阴性、棒状、兼性厌养，最适的产植酸酶条件为30℃，最适的生长温度也为30℃。由于该菌株在本室的编号为B-52，所以被命名为C.amalonaticus B-52。已于2006年4月25日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为：CGMCC1696。

本发明也涉及具有CGMCC 1696的生物学特征和产植酸酶活性的柠檬酸杆菌纯培养物。优选为无丙二酸拧檬酸杆菌的纯培养物。

另一方面，本发明涉及具有如下性质的植酸酶，其理论分子量46.5kDa；最适pH在4-5之间，优选pH 4.5；最适温度在50-60℃之间，优选55℃；理论pI值为6.2；在37℃，pH 4.5时对植酸(盐)的比活在3000U/mg以上，优选3300U/mg以上，如3400，3500，3600，3700，3800，3900 或4000U/mg；此酶在pH1-10之间具有良好的稳定性，且对胃蛋白酶、胰蛋白酶具有非常强的抗性。所述植酸酶可分离自柠檬酸杆菌属微生物，优选为无丙二酸柠檬酸杆菌。

本发明的植酸酶蛋白包含SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽。优选地，本发明的植酸酶是由SEQ ID NO：1所示的核酸分子或其简并序列所编码的多肽。在另一个实施方案中，本发明也提供了SEQ ID NO：2所示多肽的衍生物，其可由SEQ ID NO：2所示的多肽序列经过一个或多个(例如，一个或几个，包括具体的点值，可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，或者是处于中间的任一范围，如2-3个、7-8个等等)氨基酸的取代、缺失和/或插入获得，并仍然具有植酸酶活性。例如，一个常见的策略是保守氨基酸取代，即将氨基酸残基用具有相似侧链的氨基酸残基替换。具有相似侧链的氨基酸残基在本领域已有明确定义。这些包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，在植酸酶蛋白中用来自同一侧链类的另一氨基酸残基替换一个或几个位点，将不会在实质上影响其植酸酶活性。再如，本领域技术人员公知，在基因的克隆操作中，常常需要设计合适的酶切位点，这势必在所表达的蛋白末端引入了一个或多个不相干的残基，而这并不影响目的蛋白的活性。又如，在重组蛋白的表达策略中，为构建融合蛋白、令重组蛋白分泌到胞外、增强其表达、便于纯化或纯化后与融合部分分离等目的，常常需要将一些氨基酸添加至重组蛋白的N-末端、C-末端或其它合适区域内，例如，包括但不限于，接头肽、信号肽、前导肽、末端延伸、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白、蛋白A、6His标签、Flag标签、或蛋白水解酶(如Xa因子、凝血酶、肠激酶)识别位点等等。

又在一个实施方案中，本发明的植酸酶蛋白具有这样的氨基酸序列，该氨基酸序列由与本发明SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列杂交，例如在严谨条件下杂交的核苷酸序列编码。如本文所用，术语“在严谨条件下杂交”是用来描述杂交和洗涤条件，在此条件下，相互间至少60％同源的核苷酸序列一般仍可相互杂交。优选地，严谨条件为这样的条件，在此条件下相互间具有至少约65％，更优选地至少约70％，且甚至更优选地至少约75％或更高同源性的序列一般仍可相互杂交。此严谨条件为本领域普通技术人员所公知，可在Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley &Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中找到。严谨杂交条件的一个优选、非限制性实例为：在6×SSC中于约45℃杂交，然后在0.2×SSC，0.1％SDS中于50-65℃洗涤一次或多次。本领域技术人员能够理解，高度严谨条件可通过提高杂交温度，例如至50℃、55℃、60℃或65℃来实现。

另外，本领域普通技术人员将会理解：由于自然变异所致的遗传多态性可在群体中的个体间存在。此类自然变异所产生的等位基因或天然变体一般可在植酸酶基因核苷酸序列中导致1-5％的差异。任何这种自然变异产生的等位基因或天然变体所编码的相应植酸酶蛋白活性不改变的此类氨基酸多态性也在本发明的范围之内。也就是说，本发明也涉及由SEQ IDNO：1所示核酸分子的等位基因或天然变体所编码的具有植酸酶活性的多肽。

又在另一优选的实施方案中，植酸酶蛋白为这样的活性多肽，其包含优选地至少69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，或79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，更优选地至少89％，90％，91％，92％，93％，94％，甚至更优选地至少95％，96％，97％，98％，99％或更高地同源于本发明SEQ ID NO：2所示的全长氨基酸序列的氨基酸序列，且其具有植酸酶活性。除上述具体点值之外，上述值中间的范围和同一性值(例如，69-99％同源性或80-95％同一性)也包括在本发明中。例如，也包括使用任一上述值作为上限和/或下限组合而成的同一性值范围。在两个序列间比较序列并确定百分同源性为本领域公知的技术， 可利用任何数学算法完成，既有作为软件可商购获得的，也有整合在公共数据库中的，例如多序列比对程序CLUSTAL W和模块分析程序BLOCKS，或NCBI的GenBank中所采用的BLAST服务器http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST等。本领域普通技术人员将明了针对所分析的具体序列如何优化各程序中相应的参数设置(如分值、字长、缺口罚分、权重等等)，可以获得预期的同源性或同一性比对结果。利用GenBank中BLAST的缺省参数设置，本发明植酸酶蛋白与其它已知家族成员的序列比对结果如下：

表1：本发明植酸酶蛋白与已知植酸酶蛋白的同源性比较结果

来源	Genbank登录号	同源性
			Citrobacter freundii	AAR89622	68.9％
Escherichia coli	AAN28334	61.1％

另一方面，本发明涉及分离的核酸分子，即包含SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的植酸酶基因。本发明还包括这样的核酸分子，其由于遗传密码的简并性而不同于本发明的核苷酸序列之一，但其与本发明SEQ ID NO：1所示核苷酸序列编码相同的植酸酶蛋白。在一个实施方案中，本发明也涉及由在严谨条件下与SEQ ID NO：1所示核酸分子的互补链杂交的核酸。优选是由于天然变异所致的等位基因或天然变体。另外，本发明的分离核酸分子也可以具有这样的核苷酸序列，其编码的蛋白质具有如序列表中SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。在另一实施方案中，本发明的核酸分子编码全长的谷氨酸棒状杆菌蛋白质，而该蛋白质实质上同源于本发明的氨基酸序列。例如，所述同源多肽可以是由SEQ ID NO：2所示的多肽序列经过一个或多个氨基酸的取代、缺失和/或插入而衍生的多肽，或者是与SEQ ID NO：2所示的多肽序列具有至少69-99％或更高数值范围中任一点值或中间范围的同源性的多肽。这样的核酸分子可以是例如与SEQ ID NO： 1具有至少71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，更优选至少80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％或90％，91％，92％，93％，94％，甚至更优选地至少95％，96％，97％，98％，99％或更高地同源于本发明的核苷酸序列，其中包括使用任一上述点值作为上限和/或下限组合而成的同源性或同一性值范围。利用GenBank中BLAST的缺省参数设置，本发明植酸酶基因与其它已知家族成员的序列比对结果如下：

表2：本发明植酸酶基因与已知植酸酶基因的同源性比较结果

来源	Genbank登录号	同源性
			Citrobacter freundii	AY390262	70.1％
Escherichia coli	AF537219	57.5％

又在一个方面，本发明涉及与所述植酸酶基因克隆和表达相关的重组载体和宿主细胞。术语“载体”是指这样的核酸分子，其可转运与其连接的另一核酸，例如质粒、病毒、噬菌体、粘粒等。本发明的重组表达载体以适于在宿主细胞中表达核酸的形式包含本发明的核酸，这就是说重组表达载体包括一个或多个与目的核酸有效连接的调节序列。其中，“有效连接”是指目的核苷酸序列与调节序列以允许该核苷酸序列表达(例如，在体外转录/翻译系统中，或当载体导入宿主细胞后在宿主细胞中表达)的方式连接。术语“调节序列”包括启动子、阻遏物结合位点、激活物结合位点、增强子和其它表达调控元件(例如，终止子、多聚腺苷酸化信号、或具有mRNA二级结构的其它元件)。本领域普通技术人员将了解到表达载体的设计可取决于如对欲转化的宿主细胞的选择、所需的蛋白质表达水平等因素。可以将本发明的表达载体导入宿主细胞，以产生由此处所述核酸所编码的植酸酶蛋白质，包括融合蛋白。

本发明的重组表达载体可设计用于在原核或真核细胞中表达植酸酶蛋白。例如，植酸酶基因可在细菌细胞如大肠杆菌、酵母(如毕赤酵母、 黑曲霉)、昆虫细胞(如Sf9细胞、家蚕细胞，例如使用杆状病毒表达载体)或植物细胞(如拟南芥、烟草、玉米等，如使用农杆菌载体)中表达。从而，本发明的另一方面涉及已导入本发明的重组表达载体的宿主细胞。宿主细胞可为任何原核或真核细胞，其包括但不限于上述的那些宿主细胞。优选毕赤酵母细胞。巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是一种甲醇酵母，能够以甲醇作为唯一碳源进行代谢。这个系统因为具有非常高的异源蛋白表达能力而闻名。作为一个真核表达系统，它具有非常多的优点，特别是后加工处理方面。如今已有许多的植酸酶基因在其中成功地表达，同样本发明提供的新的植酸酶基因也得到成功表达。在摇瓶水平，诱导48h后在培养基上清植酸酶活性达到352U/mL，因此在发酵罐水平大量生产该植酸酶将会比较容易。同时本发明也提供了一个生产该植酸酶的毕赤酵母工程菌株。

载体DNA可通过常规转化或转染技术导入原核或真核细胞中。如此处所用，术语“转化”和“转染”、“接合”和“转导”意指本领域内公知的各种将外源核酸(例如，线性DNA或RNA(例如，线性化载体或无载体的单独的基因构建物)或载体形式的核酸(例如，质粒、粘粒、噬菌体、噬粒、噬菌粒、转座子或其它DNA)导入宿主细胞的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖-介导的转染、脂转染、天然感受态、化学介导的转移或电穿孔。转化或转染宿主细胞的合适方法可在Sambrook等人(分子克隆：实验室手册第二版，冷泉港实验室出版社，NY，1989)和其它实验室手册中找到。

本发明的宿主细胞(如培养的原核或真核宿主细胞)可用于产生(即表达)植酸酶蛋白。因此，本发明还提供了使用本发明的宿主细胞来产生植酸酶蛋白的方法。在一个实施方案中，该方法包括在适于植酸酶表达的条件下，在合适的培养基中培养本发明的宿主细胞(其中已导入了编码植酸酶蛋白的重组表达载体，或其基因组中已导入了编码野生型或改变的植酸酶蛋白的基因)，直至产生植酸酶蛋白。在另一实施方案中，该方法还包括从培养基或宿主细胞分离植酸酶蛋白。

所以，本发明提供了在毕赤酵母中表达的重组植酸酶。为了测定该重组植酸酶的性质，表达的植酸酶经过了一系列的方法纯化，最终达到电泳纯。纯的未经脱糖基处理的重组植酸酶分子量在52-59kDa，对植酸(盐)底物具有高达3548±34U/mg活性。该重组酶的最适pH在4-5之间，最适温度在50-60℃。此酶在pH1-10之间都具有良好稳定性，在pH3.5-10都非常稳定，处理一小时后还保留有85％以上的活性。在pH1.0-3.0时稳定性略差点，处理一小时后还保留有40％以上的活性。此重组酶对胃蛋白酶、胰蛋白酶也具有非常强的抗性。同时离子影响方面：Na⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、EDTA对酶活有促进作用；而Zn²⁺、Cr³⁺、Cu²⁺、Fe²⁺有抑制作用；SDS完全抑制该重组酶的活性。以上性质决定了该植酸酶将会有一个较好的应用前景。

进一步地，本发明还涉及所述植酸酶在制备饲料添加剂中的用途，以及相应的饲料添加剂，所述饲料添加剂的有效成分可以是所述植酸酶多肽、表达植酸酶多肽的宿主细胞、或者本发明筛选到的无丙二酸柠檬酸杆菌B-52。所述饲料添加剂可制备为干粉或液体制剂，并且可额外地包括一种或多种酶制品，包括但不限于：角蛋白酶、脂解酶(如脂肪水解酶)、淀粉酶、磷酸酶、麦芽糖酶、转化酶、木聚糖酶、羧甲基纤维素酶等等。除了植酸酶和/或产植酸酶微生物，本发明的饲料添加剂还可额外包括其它非致病性的有益微生物，例如包括但不限于：益生菌乳酸菌、双歧杆菌等，有助于消化和饲料吸收的酵母菌，有助于增重的米曲霉菌，能够产生有益蛋白酶的枯草芽孢杆菌等等。

特别地，本发明提供了一个从靶生物体基因组DNA中简便有效的获取植酸酶基因的方法。传统的获取植酸酶的基因主要由两种方式：一种方法是通过构建基因组文库，另一种是直接从纯化蛋白入手。但是，这两种方式都比较耗费时间和劳力，效率非常的低，并且也非常昂贵。而且，鉴于不同物种中植酸酶基因的同源性很低，难以通过简单的PCR直接筛选到新的植酸酶基因。为了解决这个问题，我们试着去发展了一个新的简便有效的方法，该方法包括a)基于植酸酶保守序列RHGXRXP和HD设计 一对简并引物；b)利用所述引物通过PCR扩增部分植酸酶序列；和c)进一步通过TAIL-PCR获取植酸酶的全序列。

具体而言，我们利用BLOCKS程序[http://blocks.fhcrc.org/blocks/make_blocks.html]通过分析大量组氨酸酸性磷酸家族的植酸酶的蛋白质序列，找到了两个比较保守的序列RHGXRXP和HD，并设计了一对简并性引物：FI(Forward Primer)，5’-GTKSTKAWWKTSAGYCGCCA-3’(20mer)(SEQ ID NO：3)和RI(Reverse Primer)，5’-TWKGCMAKRTTRGTATCRTG-3’(20mer)(SEQ ID NO：4)，用于扩增部分植酸酶基因(其中碱基缩写的含义如下表3所示)。这个部分序列在已知的组氨酸酸性磷酸酶序列中大小约为900bp，可以根据大小对所扩增的序列进行筛选。并对所获得的900bp的序列进行测序和BLAST分析。从分析结果我们可以很简单的知道，所获序列是否是植酸酶的序列。如果通过分析所获的900bp的序列有可能是植酸酶基因，接下来通过TAIL-PCR(Liu et al.，Thermal asymmetric interlaced PCR：automatableamplification and sequencing of insert end fragments from P1 and YACclones for chromosome walking.Genomics.1995 Feb.10；25(3)：674-81)获取这900bp上下游的序列，从而得到完整的植酸酶基因。通过这种方法我们目前已经成功地获得了两个植酸酶基因(分别来自本申请描述的Citrobacter amalonaticus和申请人另一发明中描述的Yersinia intermedia和)，这两个物种之间的植酸酶基因的相似性只有40.8％，因此说明该方法是可行的。通过比较该新方法比传统的方法，简单、有效、便宜、方便。

表3

具体实施方式

以下结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细的说明，而并不旨在以任何方式限制本发明。

实施例1：产植酸酶的柠檬酸杆菌的初步筛选

以本实验室保藏的共6株柠檬酸杆菌(包括3株弗氏柠檬酸杆菌、2株未定种名的柠酸杆菌、1株无丙二酸拧檬酸杆菌)为出发菌株，产酶培养基使用LB培养基，其成分为：0.5％的酵母粉、1％的蛋白胨、1％的氯化钠、pH为7。培养条件：接种适量柠檬酸杆菌到5mL的LB培养基中，30℃，200r/min试管培养14-16h。培养液通过离心分离，分别对上清液和菌体破碎液进行植酸酶酶活性的测定。植酸酶的测定方法采用了硫酸亚铁钼蓝法，具体操作步骤参照下文实施例3-3所述进行。植酸酶活性单位(u)定义为：在37℃下，每分钟分解植酸钠释放出1μM无机磷酸所需要的酶蛋白的量为1U。从而确定6株柠檬酸杆菌中的无丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacter amalonaticus)有高的植酸酶活性，该菌株在本实验室的编号为B-52，并按照专利法的相关规定送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)予以保藏，保藏号为CGMCC 1696。

实施例2：Citrobacter amalonaticus B-52植酸酶基因的克隆

通常，同一家族的基因在蛋白和核酸序列上通过比对，可以找到部分比较保守的序列。所以在获取同一家族的其他希望所获得的基因序列时，相似性克隆是一种非常有效简单的方法。

根据植酸酶的分类，可以得到大部分细菌来源的植酸酶都属于组氨酸酸性磷酸酶家族。通过多序列比对程序CLUSTAL W和模块分析程序BLOCKS(http://blocks.fhcrc.org/blocks/make_blocks.html)，在对大量组氨酸酸性磷酸酶进行分析时，我们找到了组氨酸酸性磷酸酶蛋白序列中两个保守区域RHGXRXP和HD区域。基于这两个保守区域，我们设计了 如<2-1>所述的简并引物用于从无丙二酸柠檬酸杆菌基因组DNA中扩增部分植酸酶序列。

<2-1>部分植酸酶基因序列的获得

我们根据上述两个保守区域RHGXRXP和HD、部分旁侧序列以及密码子偏好性，设计合成了如下的简并性引物：

FI，5’-GTKSTKAWWKTSAGYCGCCA-3’(20mer)(SEQ ID NO：3)和

RI，5’-TWKGCMAKRTTRGTATCRTG-3’(20mer)(SEQ ID NO：4)，

并以无丙二酸柠檬酸杆菌基因组DNA作为模板，进行PCR扩增。对于整个PCR成分而言，除了简并引物和模板DNA自基因合成公司定制之外，其他的成分均购于TIANGEN BIOTECH CO.，LTD。通过对PCR条件的优化，我们确定了最佳的退火温度50℃。整个PCR的反应条件为：1个循环，95℃，2分钟；30个循环，95℃，30秒/退火温度，30秒/72℃，1分钟；最后在72℃延伸5分钟。通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，发现一系列的片段，即这些简并引物扩增出了许多片段。接下来对这些条带进行分析，通过TaKaRa的琼脂糖凝胶回收试剂盒，回收与估计目的条带大小(900bp左右)相符的片段，并用单引物对该回收的片段进行检测，确信该片段是由双引物所扩增出来的片段，再将其连结pGEMTeasy(Promega)载体，接着转化大肠菌感受态细胞JM109。筛选转化子，并对转化子进行质粒提取检测，并将含有目的片段的转化子进行DNA序列的测定。结果确定了901bp的DNA序列为目标片段。

<2-2>完整的植酸酶序列的克隆

为了获得完整的植酸酶基因序列，以上所获得的901bp目的片段上游和下游的序列，分别通过热不对称交错PCR(TAIL-PCR)克隆得到。因为TAIL-PCR是一种非常强大的用于揭示已知序列两端的未知序列的工具，并且这也是非常简单、快速、便宜、有效的方法，用于获得已知序列 两端的未知序列。根据以上所获得的901bp目的片段的DNA序列，设计了用于TAIL-PCR的巢式特异性引物，它们分别为：

上游特异性引物(usp，up special primer)：

usp1(5’-GCAAATCCAGCCAGAAATGCCTCACCGG-3’)；

usp2(5’-GCAATAACTGCCACCTGTTCTGGTGACGG-3’)；

usp3(5’-ATCCCATTGCGGCCAATGG-3’)；

下游特异性引物(dsp，down special primer)：

dsp1(5’-GGTTGCGTGGGGGCGAATTCATGGGGAG-3’)；

dsp2(5’-GAACTCCCGAAGTTGCCCGCAGCAGAGC-3’)；

dsp3(5’-CCGTCTCATTATTGTTTATTGCTGG-3’)。

另外一端的非特异性引物(AD，arbitrary degenerate primers)包括：

AD3(5’-WGTGNAGWANCA NAGA-3’)；

AD5(5’-AGWGNAGWANCA WAGG-3’)，

这些非特异性引物是TAIL-PCR成败的关键。

上游特异性引物和下游非特异性引物一起用于PCR扩增，这两条引物分别设计不同的退火温度。TAIL-PCR的反应条件基本与Liu et al.1995(Liu et al.，Thermal asymmetric interlaced PCR：automatableamplification and sequencing of insert end fragments from P1 and YACclones for chromosome walking.Genomics.1995 Feb.10；25(3)：674-81)相同，故在此不再赘述。在整个循环过程中交错的使用高的、低的退火温度，产物的一端是特异性引物，而另一端是AD引物。通过琼脂糖凝胶电泳分析TAIL-PCR的产物，结果表明：已知的901bp的上游我们获得一段850bp的片段。通过对TAIL-PCR条件的优化，同样在已知片段的下游我们也获得了一段约950bp的片段。所获得的这两条片段，分别通过TaKaRa的琼脂糖凝胶回收试剂盒进行纯化回收，并将所回收的片段连接到pGEMTeasy(Promega)载体。接着转化大肠菌感受态细胞JM109。筛选转化子，并对转化子进行质粒提取检测，并将含有目的片段的转化子进行DNA序列分析。

以上所获得的两条片段序列和已知的片段序列都被输入DNASTAR软件，并通过序列拼接程序，将以上三条序列拼接成一条完整的序列。再使用ORF find程序找到完整的植酸酶开放阅读框。该阅读框由1311bp组成，含有一段信号肽序列和成熟蛋白序列。

<2-3>所获得完整序列的分析

所获得的完整片段全长2527bp，含有一个1311bp的开放阅读框(SEQID NO：1)。该开放阅读框编码一段22aa的信号肽序列和411aa的成熟蛋白序列。通过Signal P程序[http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/]，预测了信号肽，其最可能的切除位点在N端Ala22-Glu23之间。N端信号肽序列的确定，对于蛋白质在异源表达系统中表达，并得到有活性的蛋白非常重要。利用PeptideMass程序[http://cn.expasy.org/tools/peptide-masshtml]，还预测了除信号肽之外的成熟蛋白的分子量。成熟蛋白的预测分子量为46.3kDa，归属于组氨酸酸性磷酸酶家族。在NCBI的GenBank中利用BLAST服务器[http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST]，对该基因序列进行了相似性研究。结果表明：该蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)与GenBank中所有的蛋白质序列相比，同源性最高的是来源于弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)的植酸酶，同源性为70.1％。同时核酸序列也于GenBank中的核酸序列进行了比对，相似性最高的也是来源于弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)的植酸酶基因，同源性为68.9％。因此可以确定这个来源于无丙二酸柠檬酸杆菌的开放阅读框编码了一个新的植酸酶，所获得的植酸酶基因为新的基因。和其他的植酸酶一样，该植酸酶被命名为AppA(Acid PhosPhatase A)。

实施例3：植酸酶AppA在毕赤酵母中的表达

<3-1>表达载体的构建

为了获得成熟蛋白的编码区，设计合成了引物(BmF和BmR)。带有EcoRI和NotI限制性酶切位点的引物BmF和BmR的序列在表4中列 出。成熟蛋白的编码区用引物BmF和BmR自无丙二酸柠檬酸杆菌的基因组DNA中扩增。扩增结果通过琼脂糖凝胶电泳检测，表明目的大小的DNA片段被扩增，并将该条带回收纯化。通过EcoRI和NotI酶切位点连接进入表达载体pPIC9(Invitrogen，San Diego，Calif.)，构建成酵母表达载体pPIC9-AppA。连接产物用于转化大肠杆菌感受态细胞JM109。阳性转化子进行DNA测序，测序表明序列正确的转化子用于制备重组质粒。表达质粒载体DNA进一步用于转化毕赤酵母。

表4：扩增成熟蛋白全长的引物。

引物名称	引物序列	酶切位点
			BmF	5’-CATTATACGTAGAAGTGCCAGATGACATGAAGC-3’	SnaB I
BmR	5’-ACGGCGGCCGCTTAACGGTTTACATCAGCCATC-3’	Not I

<3-2>转化酵母及表达

用YPD培养基培养毕赤酵母菌株GS115(Invitrogen)，根据毕赤酵母表达操作手册，制备感受态细胞GS115。约8微克的表达质粒载体用限制性内切酶BglII进行线性化，线性化的表达载体中加入80μL感受态细胞GS115，混合均匀，用Bio-Rad GenePulser电击仪电击。电击结束后立即加入1mL浴冷的1M的山梨醇，取300μL涂布于RDB培养基上。通过RDB平板筛选在基因组中插入了HIS4的转化子。RDB平板上没有组氨酸，GS115中HIS4也被破坏了，所以只有在GS115插入了HIS4的转化子才能在RDB平板上生长。在RDB平板上培养3天后，转化子被接种到BMGY培养基培养48小时。接着培养的菌体转移到BMMY进行诱导表达植酸酶。

<3-3>转化子植酸酶活性的检测

通过硫酸亚铁钼蓝法，总共72个转化子进行了植酸酶活性的检测。其测定过程如下：在950μL的底物溶液(4μM的植酸钠，溶解在0.25M的乙酸钠缓冲液中，pH为4.5)加入50μL稀释的酶，并混合均匀，在37℃反应30分钟。接着在以上反应体系中加入1mL 10％的TCA(三氯乙 酸)使酶蛋白变性，终止以上反应。对于空白对照而言，在酶液中先加入1mL 10％的TCA，使酶蛋白失活，接着在加入950μL的底物溶液，37℃放置30分钟。等反应终止后，再加入2mL的显色液(0.576摩尔的硫酸，1％的钼酸铵，7.32％的七个结晶水硫酸亚铁。配置新鲜的使用)放置10分钟。在700nm下检测吸光值，最后通过标准曲线计算出酶活单位。一个酶活单位指37℃时，1分钟释放1μM无机磷所需的酶蛋白的量。经过两天的甲醇诱导后，72个转化子中有40转化子被检测到植酸酶活性，在培养基上清的酶活单位范围约在40-200U/mL之间。明显以上所获得的开放阅读框为一个新的有功能的植酸酶基因，编码一个新的具有植酸酶活性的蛋白。这个由以上开放阅读框编码的在酵母中表达的蛋白，被命名为r-AppA。

实施例4：重组植酸酶r-AppA的制备和纯化

为了纯化酵母表达的重组植酸酶r-AppA，上清液酶活为200U/mL的转化子在较优的的培养和诱导条件下通过摇瓶培养。经过两天的诱导之后，利用实施例4所描述的方法检测植酸酶活性，上清液的酶活达到352unit/mL。经过12000g离心10分钟，含有植酸酶蛋白的上清液被收集，酵母菌体被去除。用0.22μm的滤膜对上清液进行抽真空处理，去掉上清液中其他的杂质。对处理过的上清进行硫酸铵沉淀，硫酸铵粉末被加入到上清液中，到达80％的饱和度，搅拌过夜。离心收集沉淀，沉淀用0.1M，pH5.0的乙酸钠缓冲液溶解。对溶解的沉淀溶液，再次离心，除去其中一些不溶的物质。将所获得的溶液装入透析带中，透析带悬浮在0.1M，pH5.0的乙酸钠缓冲液中，过夜处理，除去大量的盐离子。接下来，使用截流分子量为10kDa的超滤管浓缩透析后的溶液，最终体积浓缩致约为500μL。最后，将得到的500μL浓缩液通过Sephacryl S-200(Pharmacia Biotech)进行分离。用0.1M，pH5.0的乙酸钠缓冲液做为洗脱溶液，收集目的峰尖的洗脱液3mL。将收集液电泳检测，表明目的蛋白已被纯化。

实施例5：重组植酸酶r-AppA酶学性质分析

<5-1>重组植酸酶r-AppA分子量的确定以及脱糖基处理

纯化的重组植酸酶r-AppA分子量，通过SDS-PAGE电泳进行测定。电泳结果图1：泳道1为标准分子量；泳道2为纯化的重组植酸酶r-AppA；泳道3为脱糖基处理的r-AppA。根据电泳检测的结果，纯化的r-AppA的分子量被确定为52-59kDa，比理论分子量46.5kDa大(图1)。通过NetNglyc(预测N糖基化位点的程序)程序，我们对r-AppA的蛋白质序列进行了分析，发现该蛋白有4个潜在的N-糖基化位点(Asn-Xaa-Ser/Thr)。分子量比理论值偏大很有可能就是由于糖基化的原故，所以对该重组蛋白用脱糖基化酶endo H进行脱糖基处理。从以上电泳结果表明，该重组蛋白确实存在糖基化作用，用endo H处理后分子量变小了点，但从电泳图上看，还差不多有49kDa，比理论分子量还稍偏大，可能是因为脱糖基化不彻底，也有可能是因为还存在其他的修饰等。其结果还有待进一步的研究。

<5-2>重组植酸酶r-AppA的最适pH和pH稳定性

在不同的温度和pH条件下，对经Sephacryl S-200纯化的重组植酸酶r-AppA进行了植酸酶活性研究。PH值对植酸酶的影响被确定了利用以下缓冲液：甘氨酸-盐酸pH1.5-3.5；乙酸钠-乙酸pH3.5-6.0；Tris-盐酸pH6.0-8.5；和甘氨酸-氢氧化钠pH8.5-10。所有这些对纯化的植酸酶溶液进行稀释的缓冲液中都含有0.05％BSA和0.05％Triton。取50μL稀释好的酶液，分别在pH2.0-10.0测定酶活。如图2所示植酸酶的活性随pH值的变化而变化，计算相对酶活确定最适pH。测定条件下，重组酶的最适pH为4.0-5.0，pH4.5时酶活达到最大值。pH2.0-8.0之间都可检测到活性。

重组植酸酶的pH稳定性如图2所示。将纯化的重组植酸酶稀释到一定浓度，取10μL在pH1-10的缓冲液中，37℃放置1h。然后再在37℃、pH4.5的条件下测定酶活，通过计算相对酶活来比较重组酶对pH的稳定性。该酶在pH3.5-10都非常稳定，处理一小时后还保留有85％以上的活性。在pH1.0-3.0时稳定性略差点，处理一小时后还保留有40％以上的活 性。

<5-3>重组植酸酶r-AppA的最适温度和热稳定性

将纯化的重组酶r-AppA稀释到所示浓度，取50μL分别在10、20、30、40、45、50、55、60、70、80℃温度下测定酶活，计算相对酶活，以确定该酶的最适温度。其结果如图3A所示，该酶的最适温度在50-60℃之间，优选55℃。在20-70℃之间保持较好的活性。

将纯化的重组酶r-AppA纯酶稀释到所示浓度，取2mL分别在70℃、80℃保温。接着分别在5、10、15、20、30、60、120min取出100μL酶液稀释到所示浓度。在37℃，pH4.5的条件下测定酶活，以未处理的原酶液作为100％的对照，其测定结果如图3B所示。

<5-3>金属离子及抑制剂对重组植酸酶r-AppA活性的影响

金属离子及抑制剂对重组植酸酶r-AppA活性的影响在最适pH条件下进行了测定。取50μL稀释好的酶液，在37℃，pH4.5的条件下，反应体系中加入终浓度为1mM金属离子或抑制剂，进行活性测定。计算相对酶活力，以未处理的做为对照100％。其结果如表5所示，Na⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、EDTA对酶活有促进作用；而Zn²⁺、Cr³⁺、Cu²⁺、Fe²⁺有抑制作用；SDS完全抑制该重组酶的活性。

<5-4>蛋白酶对重组植酸酶r-AppA活性的影响

为了确定蛋白酶对重组植酸酶r-AppA活性的影响，纯化的重组酶(0.2mg/mL)与0.1mg/ml的胃蛋白酶和胰蛋白酶等体积混合，保温在37℃。接着分别在5、10、20、30、60、90、120min取样。在37℃，pH4.5的条件下测定酶活性。以未用蛋白酶处理酶液做为100％的对照，计算相对酶活力。其结果如图4所示，该重组植酸酶r-AppA对胃蛋白酶和胰蛋白酶都有很强的抗性。因此，该植酸酶能够稳定的在动物胃肠道中存在，不会被肠道蛋白酶降解。

表5金属离子及抑制剂对重组植酸酶活性的影响

Na	119
		K	109
Ca	119
		Li	106
Co	119
		Cr	89
Ni	122
		Cu	67

Mg	121
		Fe	32
Mn	117
		Zn	16
EDTA	118
		SDS	0
Ag	31
		未处理	100

<5-5>重组植酸酶r-AppA比活的测定

为了确定该植酸酶r-AppA的比活，首先通过Lowry方法确定了纯化的重组酶r-AppA的酶蛋白的浓度。并且重组酶r-AppA酶活力单位，在37℃，pH4.5的条件下，通过硫酸亚铁钼蓝法确定。通过计算，该重组植酸酶r-AppA的比活为3548±34U/mg，这是如今报道的比活最高的植酸酶。

<5-6>植酸酶pI值的预测

此外，经Vector NTI 7.0程序预测，该酶的理论pI值为6.2左右。实施例6：重组植酸酶的饲喂效果

<6-1>材料与方法

植酸酶：重组植酸酶r-APPA，最适PH为4.5

试验动物：选择健康的1日龄商品雏鸡500只，用正对照组日粮饲养至6日龄。选取体重一致的健康雏鸡400只，随机分成5个处理，每个处理80只，分4群饲养。

日粮配方：试验用玉米豆粕型日粮，参照NR^C营养需要，结合现场生 产实际设计日粮配方。处理组在负对照组日粮基础上每公斤添加250U、500U和750U的植酸酶。

试验设计：试验采用完全随机设计。试验鸡设5个处理，每个处理80只，分为4个重复，每个重复20只。负对照组日粮中不添加磷酸氢钙，为基础日粮，正对照组日粮中添加磷酸氢钙；试验组在负对照组日粮基础上每公斤添加250U、500U和750U的植酸酶。

<6-2>结果

饲养试验结果见表5。结果指出，玉米豆粕型日粮中添加250、500和750U/kg植酸酶能提高肉仔鸡增重和摄食量。添加植酸酶较负对照提高增重，差异极显著(p＜0.01)，而与正对照差异不显著。

表5.日粮添加植酸酶对肉鸡生长的影响(单位：g)

	正对照组	负对照组	250U/kg组	500U/Ug组	750U/kg组
						起始重  0-20日总增重  料重比	122.9±7.4  923.0±58.6b  1.80	121.1±8.0  570.5±62.4a  1.78	118.5±14.3  926.9±63.5b  1.81	120.2±6.6  922.9±58.3b  1.81	121.0±8.2  932.2±71.8b  1.80

肉仔鸡胫骨中钙磷含量分析表明(表6)，添加植酸酶能提高肉仔鸡骨骼钙磷含量，与负对照组的差异显著(p＜0.01)，与正对照组骨骼钙磷含量差异不显著。

表6.肉鸡胫骨中钙磷含量

	Ca％	P％
			正对照组  负对照组  250U/kg组  500U/kg组  750U/kg组	10.29±0.70b  5.69±0.73a  9.89±0.95b  10.31±0.69b  10.28±0.63b	4.42±0.52b  2.38±0.54a  4.18±0.42b  4.40±0.21b  4.46±0.36b

添加植酸酶显著降低肉仔鸡粪便中的氮磷含量如下(表7)：

表7.试验肉鸡粪便中钙磷含量

	P％	N％	Ca％
				1.64％CaHPO4组  0U/kg组  250U/kg组  500U/kg组  750U/kg组	1.13  0.54  0.46  0.40  0.37	6.63  6.45  6.16  4.96  4.96	2.45  2.85  2.44  2.37  2.35

工业化应用

根据以上所述，我们所发明的新的植酸酶具有以下几个优点：高比活，合适的作用pH，良好的热稳定性，强的蛋白酶抗性，容易发酵生产。所有这些优点都意味着新发明的植酸酶作为饲料添加剂，将会更有应用价值比以前所报道的植酸酶。第一，高比活意味着生产同样量的酶蛋白，可以降解更多的植酸。即降解同样量的植酸所需的酶蛋白量更少，成本也将更低。第二，合适的作用pH意味着该植酸酶可以更好的在动物肠道内发挥作用。第三，良好的热稳定性意味着该酶在制粒加工的过程中不容易失活。第四，强的蛋白酶抗性意味着该植酸酶在动物肠道内可以稳定的存在，而不被蛋白酶降解。最后，容易发酵生产说明，可以通过简单的工业发酵大量生产该植酸酶，并用于饲料行业。我们所发明的来源于Citrobacteramalonaticus B-52新的植酸酶可以克服通常所使用的植酸酶的缺陷。因此，我们所发明的植酸酶将会带来比较大的商业价值。

序列表 

<110>中国农业科学院饲料研究所 

<120>一种新的植酸酶的克隆和表达 

<130>PF060010CNI 

<140>2006100765403 

<141>2006-04-30 

<160>4 

<170>PatentIn version 3.3 

<210>1 

<211>1311 

<212>DNA 

<213>无丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacter amalonaticus) 

<400>1 

atgaatacgc tactttttcg attaataatg tttatattca tgtttggttc tttcccatta     60 

caggcggaag tgccagatga catgaagcta gaacgagttg tgatagtaag tcgccacggt    120 

gtaagagcac caacaaagtt caccccattg atgcaggaaa tcacacctta ctattggccg    180 

caatgggatg ttcccctggg ctggttgacg gctcggggtg gtgagctcgt caccgaaatg    240 

ggacgatatc aacaaaaagt attaatcgat aacggcgttc tggaaagtaa tgtatgtccg    300 

tcaccagaac aggtggcagt tattgccgat accgatcagc gcactcgtaa aaccggtgag    360 

gcatttctgg ctggatttgc gccgggatgt aaaaataagg ttcattatca aaaagatcac    420 

gataaaaaag atcctctttt taatccagta aaaatggggg tgtgcgcttt taatgtacaa    480 

aaaactcagg aagcgattct gacacgtgcg gaaggaaaca ttgaacggta cactcagcgt    540 

tatgactctg cattccgtac tctggaacag gttctcaatt tctcccggtc agcagcatgc    600 

cgatcagcaa gccagtctgg ttgcacgcta ccaggaacct taccttcaga actcagggtt    660 

tctgcggata ccgtttcctt atctggcgcg tggagtcttt cttccatgct gacggaaata    720 

tttctattgc aagaggcgca gggaatgcca gaggttgcgt gggggcgaat tcatggggag   780 

aaagaatgga cagcgttatt aagtctgcat aatgctcagt ttgacctttt gcaaagaact   840 

cccgaagttg cccgcagcag agcaacacca ttactcgatt tgatcagcga agcattagtg   900 

agtaatgggt caacagaaaa tcattacgga attaaattac ccgtctcatt attgtttatt   960 

gctggtcatg ataccaatct tgcaaatctc agtggggtat ttgatcttaa ctggtctcta  1020 

cctgggcagc cagataatac acctcctggc ggggagctgg ttttcgaaag atggacgcga  1080 

gtgagtgata acactgactg gattcaaatt tcgtttgttt ttcagactct tcaacaaatg  1140 

cgtaagttta aacctttttc atcttcgtct ctcccaaaca agattgtgct tacgttgccc  1200 

tcttgccagg ataaaaatcc tgagggtatg tgtccattaa agcattttat tgacattgtg  1260 

cagacagcac gtattccaca atgtgcagtg atggctgatg taaaccgtta a           1311 

<210>2 

<211>436 

<212>PRT 

<213>无丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacter amalonaticus) 

<400>2 

Met Ash Thr Leu Leu Phe Arg Leu Ile Met Phe Ile Phe Met Phe Gly 

1               5                   10                  15 

Ser Phe Pro Leu Gln Ala Glu Val Pro Asp Asp Met Lys Leu Glu Arg 

            20                  25                  30 

Val Val Ile Val Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Phe Thr 

        35                  40                  45 

Pro Leu Met Gln Glu Ile Thr Pro Tyr Tyr Trp Pro Gln Trp Asp Val 

   50                   55                  60 

Pro Leu Gly Trp Leu Thr Ala Arg Gly Gly Glu Leu Val Thr Glu Met 

65                  70                  75                  80 

Gly Arg Tyr Gln Gln Lys Val Leu Ile Asp Asn Gly Val Leu Glu Ser 

                85                  90                  95 

Asn Val Cys Pro Ser Pro Glu Gln Val Ala Val Ile Ala Asp Thr Asp 

            100                 105                 110 

Gln Arg Thr Arg Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Phe Ala Pro 

        115                 120                 125 

Gly Cys Lys Asn Lys Val His Tyr Gln Lys Asp His Asp Lys Lys Asp 

    130                 135                 140 

Pro Leu Phe Asn Pro Val Lys Met Gly Val Cys Ala Phe Asn Val Gln 

145                 150                 155                 160 

Lys Thr Gln Glu Ala Ile Leu Thr Arg Ala Glu Gly Asn Ile Glu Arg 

                165                 170                 175 

Tyr Thr Gln Arg Tyr Asp Ser Ala Phe Arg Thr Leu Glu Gln Val Leu 

            180                 185                 190 

Asn Phe Ser Arg Ser Ala Ala Cys Arg Ser Ala Ser Gln Ser Gly Cys 

        195                 200                 205 

Thr Leu Pro Gly Thr Leu Pro Ser Glu Leu Arg Val Ser Ala Asp Thr 

    210                 215                 220 

Val Ser Leu Ser Gly Ala Trp Ser Leu Ser Ser Met Leu Thr Glu Ile 

225                 230                 235                 240 

Phe Leu Leu Gln Glu Ala Gln Gly Met Pro Glu Val Ala Trp Gly Arg 

                245                 250                 255 

Ile His Gly Glu Lys Glu Trp Thr Ala Leu Leu Ser Leu His Asn Ala 

            260                 265                 270 

Gln Phe Asp Leu Leu Gln Arg Thr Pro Glu Val Ala Arg Ser Arg Ala 

        275                 280                 285 

Thr Pro Leu Leu Asp Leu Ile Ser Glu Ala Leu Val Ser Asn Gly Ser 

    290                 295                 300 

Thr Glu Asn His Tyr Gly Ile Lys Leu Pro Val Ser Leu Leu Phe Ile 

305                 310                 315                 320 

Ala Gly His Asp Thr Asn Leu Ala Asn Leu Ser Gly Val Phe Asp Leu 

                325                 330                 335 

Asn Trp Ser Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Glu 

            340                 345                 350 

Leu Val Phe Glu Arg Trp Thr Arg Val Ser Asp Asn Thr Asp Trp Ile 

        355                 360                 365 

Gln Ile Ser Phe Val Phe Gln Thr Leu Gln Gln Met Arg Lys Phe Lys 

    370                 375                 380 

Pro Phe Ser Ser Ser Ser Leu Pro Asn Lys Ile Val Leu Thr Leu Pro 

385                 390                 395                 400 

Ser Cys Gln Asp Lys Asn Pro Glu Gly Met Cys Pro Leu Lys His Phe 

                405                 410                 415 

Ile Asp Ile Val Gln Thr Ala Arg Ile Pro Gln Cys Ala Val Met Ala 

            420                 425                 430 

Asp Val Asn Arg 

        435 

<210>3 

<211>20 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220> 

<223>正向简并引物 

<400>3 

gtkstkawwk tsagycgcca    20 

<210>4 

<211>20 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<220> 

<223>反向简并引物 

<400>4 

twkgcmakrt trgtatcrtg    20 

Claims (15)

1.一种分离的植酸酶蛋白，其选自：

a)SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽；或

b)由SEQ ID NO：1所示的核酸分子或其简并序列所编码的多肽。

2.如权利要求1所述的多肽，其来自柠檬酸杆菌属微生物。

3.如权利要求2所述的多肽，其来自无丙二酸柠檬酸杆菌。

4.一种分离的核酸分子，其编码如权利要求1至3中任一项所述的蛋白。

5.一种DNA构建体或重组载体，其含有如权利要求4中所述的核酸分子。

6.一种宿主细胞，其含有如权利要求4中所述的核酸分子或如权利要求5中所述的DNA构建体或重组载体。

7.如权利要求6中所述的宿主细胞，其为真核生物细胞。

8.如权利要求6或7中所述的宿主细胞，其为毕赤酵母细胞。

9.无丙二酸柠檬酸杆菌Citrobacter amalonaticus B-52，其保藏号为CGMCC 1696。

10.一种饲料添加剂，其含有选自如下的有效成分：

a)如权利要求1至3中任一项所述的蛋白；或

b)如权利要求6至8中任一项所述的宿主细胞；或

c)如权利要求9中所述的无丙二酸柠檬酸杆菌。

11.如权利要求10所述的饲料添加剂，其还含有一种或多种选自角蛋白酶、脂解酶、淀粉酶、磷酸酶、麦芽糖酶、转化酶、木聚糖酶、羧甲基纤维素酶的酶制品。

12.如权利要求1至3中任一项所述的多肽，或如权利要求6至8中任一项所述的宿主细胞，或如权利要求9中所述的无丙二酸柠檬酸杆菌在制备饲料添加剂中的用途。

13.一种产生植酸酶的方法，包括在适于植酸酶产生的条件下，培养如权利要求6至8中任一项所述的宿主细胞。

14.一种从靶生物体中分离编码如权利要求1中所述的植酸酶蛋白的植酸酶基因的新方法，包括：

a)基于植酸酶保守序列RHGXRXP和HD设计一对简并引物；

b)利用所述引物通过PCR扩增部分植酸酶序列；和

c)进一步通过TAIL-PCR获取植酸酶的全序列。

15.如权利要求14所述的方法，其中所述的简并引物对是SEQ ID NO：3和4所示的序列。

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