FI104380B - Mikrobifytaasin kloonaus ja ilmentäminen - Google Patents

Description

104380

Mikrobifytaasin kloonaus ja ilmentäminen Tämä keksintö koskee fytaasin tuottamista geeniteknises-5 ti.

Fosfori on välttämätön alkuaine kaikkien organismien kasvulle. Karjankasvatuksessa rehuun on lisättävä epäorgaanista fosforia, jotta saataisiin aikaan hyvä kasvuteho 10 yksimahaisilla eläimillä (esim. sioilla, siipikarjalla ja kaloilla).

Sitävastoin epäorgaanista fosfaattia ei tarvitse lisätä lainkaan märehtijäeläinten rehuihin. Pötsin mikro-orga-15 nismit tuottavat entsyymejä, jotka katalysoivat fytaatin (myo-inositoliheksakis-fosfaatin) muuntumisen inositolik-si ja epäorgaaniseksi fosfaatiksi.

Fytaattia esiintyy varastofosforilähteenä käytännön ises-20 ti katsoen kaikissa rehuaineissa, jotka ovat peräisin kasveista (katso kokoomajulkaisu: Phytic acid, chemistry and applications, E. Graf (ed.), Pilatus Press; Minneapolis, MN, U.S.A. (1986)). Fytaattia esiintyy 1-3 % kaikissa pähkinöissä, viljakasveissa, hernekasveissa, öljysie-25 menissä, itiöissä ja siitepölyssä. Fytiinihapon (fytic acid) kompleksisuoloja nimitetään fytiiniksi. Fytiinihapon ei katsota olevan ravintotekijä, koska se kelatoi mineraaleja, kuten kalsiumia, sinkkiä, magnesiumia, rautaa, ja se voi myös reagoida proteiinien kanssa, mikä 30 alentaa proteiinin ja ravinteellisten tärkeiden mineraalien biologista käyttökelpoisuutta.

Fytaatin sisältämä fosfori läpäisee yksimahaisten eläinten ruoansulatuskanavan ja erittyy lannan mukana. Vaikka 35 fytaatin hydrolysoitumista esiintyy jonkin verran paksus-sasuolessa, siten vapautuneella epäorgaanisella fosforilla ei ole ravinnearvoa, koska epäorgaaninen fosfori imeytyy vain ohutsuolessa. Tästä syystä yksimahaisilla 2 104380 ^ eläimillä jää käyttämättä merkittävä määrä ravinteelli- sesti tärkeätä fosforia, huolimatta sen läsnäolosta rehussa.

5 Fytaattifosforin erittyminen lantaan tuo lisäseuraamuk-sia. Laajaperäinen karjankasvatus on lisääntynyt valtavasti kuluneiden vuosikymmenten aikana. Tuotetun lannan määrä on siis lisääntynyt vastaavasti ja aiheuttanut ympäristöongelmia eri puolilla maailmaa. Tämä johtuu 10 osaksi lannan fosfaatin kertymisestä pintavesiin, mikä on aiheuttanut rehevöitymistä.

Mikro-organismien tuottamat entsyymit, jotka katalysoivat fytaatin muuntumisen inositoliksi ja epäorgaaniseksi 15 fosforiksi, tunnetaan laajalti fytaaseina. Fytaasia tuottavat mikro-organismit käsittävät bakteereja, kuten Bacillus subtilis (V.K. Paver ja V.J. Jagannathan (1982) J. Bacteriol. 151. 1102-1108) ja Pseudomonas (D.J. Cosgrove (1970) Austral. J. Biol. Sei. 23, 1207-1220); hiivoja, 20 kuten Saccharomvces cerevisiae (N.R. Nayini ja P. Marka-kis (1984) Lebensmittel Wissenschaft und Technologie 17. 24-26); ja sieniä, kuten Aspergillus terreus (K. Yamada, Y. Minoda ja S. Yamamoto (1986) Agric. Biol. Chem. 32. 1275-1282). Monen muun eri Asperaillus-laiin tiedetään 25 tuottavan fytaasia, joista Aspergillus ficuumin tuottamalla fytaasilla on määritetty olevan yksi korkeimmista spesifisistä aktiivisuustasoista, samoin kuin parempi lämmönkestävyys kuin fytaaseilla, joita muut mikro-organismit ovat tuottaneet (julkaisemattomia havaintoja).

30

Ajatusta mikrobifytaasin lisäämisestä yksimahaisten 1 eläinten rehuihin on kuvattu aikaisemmin (Ware, J.H.,

Bluff, L. ja Shieh, T.R. (1967) US-patentti n:o 3 297 548; Nelson, T.S., Shieh, T.R., Wodzinski, R.J. ja Ware, 35 J.H. (1971) J. Nutrition 101, 1289-1294). Tähän mennessä tämän ajatuksen käyttöön soveltaminen ei kuitenkaan ole ollut kaupallisesti mahdollista johtuen mikrobientsyymi- 3 104380 tuotannon korkeista kustannuksista (Y.W. Hän (1989) Animal Feed Sei. & Tecnol. 24, 345-350). Epäorgaanista fosforia lisätään yhä taloudellisista syistä yksimahaisten eläinten rehuihin.

5

Mikrobifytaaseilie on löydetty myös muita teollisia käyttösovellutuksia. Tyypillinen esimerkki sellaisista käyttösovellutuksista on teollinen tärkkelyksen tuotantoprosessi viljakasveista kuten maissista ja vehnästä.

10 Jätetuotteet, jotka käsittävät esim. maissigluteenirehuja sellaisesta märkäjauhatusprosessista, myydään eläinten rehuksi. Fytaasia voidaan lisätä liotusprosessin aikana. Olosuhteet (t * 50°C ja pH = 5,5) ovat ihanteelliset sienten fytaaseille (katso esim. eurooppalainen patentti-15 hakemus 0 321 004, Alko Oy). Tämän prosessin jätetuot- teista saadut eläinrehut sisältävät edullisesti fosfaattia fytaatin sijasta.

On myös arveltu, että fytaaseja voidaan käyttää soijan 20 prosessoinnissa (katso Alkon Finase™ Enzymes, Alko Oy:n. Rajamäki, Suomi, julkaisema tuoteinformaatioesite). Soijapapu jauhe sisältää suuria määriä ravinteellisesti huonoa fytaattia, joka tekee tästä proteiinilähteestä sopimattoman käytettäväksi vauvan ruoissa ja kalojen, vasi-25 koiden ja muiden ei-märehtijöiden rehuissa. Tämän arvokkaan proteiinilähteen laadun entsymaattinen kohottaminen lisää tämän aineen ravinteellista ja kaupallista arvoa.

Muut tutkijat ovat kiinnostuneet karakterisoimaan parem-30 min erilaisia fytaaseja ja parantamaan näiden fytaasien tuotantomenetelmiä ja käyttöä. Ullah on julkaissut menetelmän fytaasin puhdistamiseksi villityyppisestä Aspergillus ficuumista, samoin kuin määrittänyt useita tällä puhdistusmenetelmällä saadun tuotteen biokemiallisia 35 parametreja (Ullah, A. (1988a) Preparative Biochem. 18.

443-458). Ullahin saamia asiaan liittyviä tuloksia esitetään taulukossa 1 jäljempänä.

4 104380

Ullah on kahdesti tuonut esille A. ficuumin fytaasiprote-iinin N-pään aminohapposekvenssin, Ullah, A. (1987) Enzyme and Engineering conference IX, lokakuun 4-8., 1987, Santa Barbara, California (posteriesitys); ja Ullah, A.

5 (1988b) Prep. Biochem. 18, 459-471. Ullahin saamat amino- happosekvenssitulokset esitetään kuviossa IA, sekvenssi E, jäljempänä.

Useita kiinnostavia havaintoja voidaan tehdä Ullahin Julio kaisuista. Ennen kaikkea, Ullahin (1988a ja 1988b) kuvailema "puhdistettu" valmiste muodostaa kaksi pro-teiinivyöhykettä SDS-PAGE:11a. Keksinnön mukaan on kuitenkin havaittu, että A. ficuumista puhdistettu fytaasi sisältää kontaminantin, ja että yksi SDS-PAGE:11a tode-15 tuista vyöhykkeistä, jotka Ullah identifioi fytaasiksi, saa alkunsa tästä kontaminantista.

Tämä eroavuus selviää myös Ullahin (1987, 1988b; vertaa kuvio IA, sekvenssejä A ja B sekvenssiin C) julkaisemista 20 aminohapposekvensointituloksista. Keksinnön mukaisesti on r itse asiassa määritetty, että yksi Ullahin kuvaileman fy- taasin sisäisten peptidien aminohapposekvensseistä (katso kuvio IB, sekvenssi E) tosiaankin kuuluu kontaminoivalle 100 kDa proteiinille (kuvio 1C), jota on läsnä valmis-25 teessä, joka on saatu Ullahin kuvaileman menetelmän avul-* la, ja nähdään yhtenä kahdesta vyöhykkeestä SDS-PAGE:11a (Ullah, 1988a ja 1988b). Ullah ei tunnista sellaisen kontaminoivan proteiinin läsnäoloa, ja sen sijaan identifioi sen toiseksi fytaasimuodoksi. Sellaisen kontaminaa-30 tion läsnäolo vuorostaan lisää vaikeutta valittaessa ja ... eristettäessä varsinaista nukleotidisekvenssiä, joka ’ koodaa fytaasiaktiivisuutta. Sen lisäksi kontaminaation läsnäolo alentaa testatun proteiinin spesifistä aktiivisuutta.

Tarkastelemalla edelleen Ullahin julkaisemaa sekvenssiä tulisi huomata, että aminohappotähde paikassa 12 on Ulla- i 35 5 104380 hin toimesta esitetty glysiiniksi. Keksinnön mukaisesti on vastaavasti todettu, käytettäessä proteiinin ja DNA:n sekvensointimenetelmiä, että tämä tähde ei ole glysiini, vaan tosiasiassa kysteiini (katso kuviot 6 ja 8).

5

Lopuksi Ullah esittää, että fytaasi on 85 kDa proteiini, jonka molekyylipaino deglykosylaation jälkeen on 61,7 kDa (Ullah, 1988b). Tämä luku, joka on paljon alhaisempi kuin aikaisemmin esille tuotu 76 kDa proteiini (Ullah, A. ja 10 Gibson, D. (1988) Prep. Biochem. 17(1). 63-91), perustui hydrolyysissä vapautuneiden hiilihydraattien suhteelliseen määrään ja natiivin proteiinin näennäiseen molekyy-lipainoon SDS-PAGE:11a. Keksinnön mukaan on kuitenkin todettu, että glykosyloidulla fytaasilla on yksi 85 kDa 15 näennäinen molekyylipaino, kun taas deglykosyloidun proteiinin näennäinen molekyylipaino on alueella 48 - 56,5 kDa, riippuen deglykosylaatioasteesta.

Mullaney et ai. (Filamentous Fungi Conference, huhtikuus-20 sa 1987, Pacific Grove, California (posteriesitys) tuovat myös esille fytaasin karakterisoinnin A. ficuumista. Tämä raportti sisältää kuitenkin myös maininnan kahdesta pro-teiinivyöhykkeestä SDS-PAGE:11a, toinen 85 kDa ja toinen 100 kDa, jotka olivat läsnä "puhdistetussa" proteiinival-25 misteessa. Tekijät identifioivat molemmat näistä prote-* iinivyöhykkeistä fytaasimuodoiksi. Menetelmä mikrobi- isäntien transformoimiseksi ehdotetaan, mutta sitä ei ole selostettu. Fytaasia koodittavan DNA-sekvenssin kloonausta ja eristämistä ei ole kuvailtu.

30

Tulee ymmärtää, että taloudellisesta menetelmästä fytaa-’ sin tuottamiseksi tulee olemaan merkittävää hyötyä muun muassa eläinrehuteollisuudelle. Eräs menetelmä taloudellisemman fytaasin tuottamiseksi olisi yhdistelmä-DNA-tek-35 niikan käyttäminen entsyymin ilmenemistasojen kohottamiseksi eri mikro-organismeissa, joiden tiedetään tuottavan suuria määriä ilmentyneitä peptidejä tai proteiineja.

6 104380 Tähän mennessä ei kuitenkaan ole julkaistu fytaasia koo-daavan DNA-sekvenssin eristämistä ja kloonausta.

Tämä keksintö koskee puhdistettua ja eristettyä DNA-sek-5 venssiä, joka koodaa sieniperäistä fytaasia, joka katalysoi ainakin yhden epäorgaanisen fosfaatin vapauttamista myoinositolifosfaatista, jolle on tunnusomaista että kyseinen DNA-sekvenssi a) sisältää nukleotidisekvenssin, joka koodaa kuviossa 8 esitetyn aminohapposekvenssin 10 asemia -23 - 444 tai asemia +1 - 444, b) sisältää kuviossa 6 tai kuviossa 8 esitetyn nukleotidisekvenssin tai c) hybridisoituu melko lievissä olosuhteissa (6 x SSC, 50 °C yön yli, pesu 6 x SSC huoneenlämmössä) DNA-fragmen-tin, joka vastaa kuviossa 6 esitetyn nukleotidisekvenssin 15 asemien 210 - 1129 cDNA:ta, kanssa. Tämän fytaasia koo-daavan DNA-sekvenssin eristäminen ja kloonaus on saatu aikaan käyttämällä spesifisiä oligonukleotidikoettimia, jotka kehitettiin erityisesti tätä keksintöä varten. Edullisia fytaaseja koodaavia DNA-sekvenssejä on saata-20 vissa Aspergillus-suvun rihmasienistä.

Tämän keksinnön toisena kohteena on saada aikaan vektori, joka sisältää ekspressiorakenteen, joka edelleen sisältää vähintään yhden kopion vähintään yhtä, edullisesti homo-25 logista fytaasia koodaavaa DNA-sekvenssiä, joka on toiminnallisesti kytketty sopivaan säätelyalueeseen, joka kykenee ohjaamaan fytaasin korkeaa ilmenemistasoa sopivassa ekspressioisännässä.

30 Tämän keksinnön käyttöön antama ekspressiorakenne voidaan liittää vektoriin, edullisesti plasmidiin, joka kykenee • transformoimaan mikrobi-isäntäsolun ja kiinnittymään genomiin.

j 35 Tämän keksinnön kohteena on lisäksi sieni-isäntä, joka on ] transformoitu vektorilla, jota kuvailtiin edellisessä kappaleessa. Tämän keksinnön mukaiset transformoidut i 7 104380 isännät ovat Aspergillus- ja Trichoderma-suku1en rih-masieniä, Kluweromvces- ja Saccharomvces-sukujen hiivoja. Erityisen edullisia ekspressioisäntiä ovat Aspergillus- suvun rihmasienet. Transformoidut isännät kykenevät 5 tuottamaan korkeita rekombinanttifytaasitasoja taloudellisessa, teollisessa mitassa.

Keksintö koskee myös menetelmää fytaasin valmistamiseksi, jolle on tunnusomaista se, että edellä mainittua trans-10 formoitua sieni-isäntäsolua viljellään olosuhteissa, jotka edistävät fytaasin tuotantoa.

Ullahilta saadun puhdistetun, villityyppisen A. ficuum-fytaasin biokemiallisten parametrien vertaaminen toiseen 15 puhdistettuun, villityyppiseen A. ficuum-fytaasiin, joka on saatu tämän keksinnön mukaisesti, esitetään taulukossa 1 jäljempänä. Erityisen merkille pantavia ovat tulokset spesifisestä aktiivisuudesta, jossa yhteydessä osoitetaan, että keksinnön mukaisesti saadun puhdistetun prote-20 iinin spesifinen aktiivisuus on kaksinkertainen Ullahin julkaisemaan spesifiseen aktiivisuuteen nähden.

Tässä hakemuksessa kuvataan lisäksi nukleotidisekvenssejä, jotka koodittavat proteiineja, joissa on fytaasiak-25 tiivisuutta, samoin kuin näiden proteiinien aminohap- posekvenssejä. Aikaansaatuja sekvenssejä voidaan käyttää oligonukleotidikoettimien konstruointiin, joita vuorostaan voidaan käyttää hybridisaatioseulontatutkimuksissa fytaasigeenien identifioimiseksi muista lajeista, erityi-30 sesti mikrobilajeista, jotka voidaan sen jälkeen eristää ja kloonata.

m Tämän keksinnön avulla tuotettuja sekvenssejä voidaan käyttää myös lähtöaineina "toisen sukupolven" fytaasien 35 konstruointiin. "Toisen sukupolven" fytaasit ovat fy-taaseja, muunnettuina mutatointitekniikoiden avulla (esim. paikkakohdennettu mutatointi), joilla on ominai- 8 104380 suuksia, jotka poikkeavat villityyppiSten fytaasien tai rekombinanttifytaasien, jollaisia tämän keksinnön mukaisesti on tuotettu, ominaisuuksista. Esimerkiksi lämpötilaa tai pH-optimia, spesifistä aktiivisuutta tai subst-5 raattiaffiniteettia voidaan muuttaa niin, että ne sopivat paremmin käytettäväksi määrätyssä prosessissa.

Tämän keksinnön yhteydessä ilmaisu fytaasi käsittää ent-syymiperheen, jotka katalysoivat reaktioita, jotka käsit-10 tävät epäorgaanisen fosforin poistamisen erilaisista myoinositolifosfaateista.

Fytaasiaktiivisuus voidaan määrittää muutamalla määrityksellä, joiden valinta ei ole ratkaisevaa tämän keksinnön 15 kannalta. Fytaasiaktiivisuus voidaan määrittää esimerkiksi määrittämällä entsyymimäärä, joka vapauttaa epäorgaanista fosforia 1,5 mM natriumfytaatista nopeudella 1 pmol/min 37 °C:ssa ja pH:ssa 5,50.

20 Tulisi huomata, että ilmaisuun "fytaasi", johon viitataan kauttaaltaan tämän selityksen tekstissä, on tarkoitus sisällyttää kaikki peptidit ja proteiinit, joissa on fytaa-siaktiivisuutta. Tätä kohtaa valaistaan kuviossa IA, jossa verrataan sekvenssejä A ja B (sekvenssejä, jotka on 25 saatu tämän työn kuluessa) sekvenssiin C (Ullahin jul-' kaisema, 1988b). Kuva osoittaa, että proteiineja voidaan saada aikaan tämän keksinnön avulla, joista puuttuu A. ficuumin valmiin fytaasiproteiinin neljä ensimmäistä aminohappoa (sekvenssin A proteiinista puuttuu seitsemän 30 ensimmäistä aminohappoa). Näissä proteiineissa kuitenkin on jäljellä fytaasiaktiivisuutta. Fytaasiproteiinin täydellinen aminohapposekvenssi, johdettuna vastaavasta nukleotidisekvenssistä, esitetään kuviossa 8.

35 Tämän keksinnön avulla tuotettuja fytaaseja voidaan käyt-| tää useassa eri prosessissa, joissa tarvitaan fytaatin muuntamista inositoliksi ja epäorgaaniseksi fosfaatiksi.

9 104380

Fytaasituotanto tämän keksinnön mukaisesti alentaa esimerkiksi mikrobifytaasien tuotantokustannuksia, mikä mahdollistaa sen taloudellisen käytön eläinrehussa, mikä lopulta johtaa in vivo hinta/teho-suhteeseen, joka on 5 kilpailukykyinen epäorgaanisen fosfaatin kanssa. Lisäetuna lannan fosforipitoisuus alenee tuntuvasti.

Tulee ymmärtää, että epäorgaanisen fosfaatin hinnan kanssa kilpailukykyisenä saatavien fytaasien käyttö lisää 10 rehuseosteollisuuden mahdollisuuksia tuottaa korkealaatuista rehua. Kun rehuun esimerkiksi lisätään fytaasia, epäorgaanisen fosfaatin lisääminen voidaan jättää pois, ja erilaisten fytaattia sisältävien raaka-aineiden pitoisuutta voidaan lisätä.

15

Eläinrehuissa ja soijan prosessoinnissa käytön lisäksi, joita edellä on käsitelty, tämän keksinnön mukaisesti saatua fytaasia voidaan käyttää myös monenlaisissa teollisissa käyttösovellutuksissa kuten esimerkiksi: 20 - nestemäisessä rehussa sioille ja siipikarjalle. On tullut yleiseksi käytännöksi liottaa rehua useita tunteja ennen ruokkimista. Tämän jakson aikana entsyymin on mahdollista muuttaa fytaatti inositoliksi ja epäorgaaniseksi fosfaatiksi; 25 - teollisessa prosessissa inositolin tai inositolifos- faattien tuottamiseksi fytaatista; - muissa teollisissa prosesseissa, joissa käytetään substraatteja, jotka sisältävät fytaattia, kuten esimerkiksi tärkkelysteollisuudessa ja fermentointiteollisuuksissa 30 kuten panimoteollisuudessa. Fytaatin aiheuttama metalli- .. ionien kelatoituminen voi aiheuttaa sen, ettei näitä « * • mineraaleja ole saatavilla mikro-organismituotannossa.

Fytaatin entsymaattinen hydrolyysi ehkäisee nämä ongelmat.

Nämä ja muut tämän keksinnön mukaiset kohteet ja edut selviävät seuraavasta yksityiskohtaisesta kuvauksesta.

35 i 10 104380

Kuvio 1. A. N-terminaaliset aminohapposekvenssit määritettynä puhdistetulle fytaasille. Ailia ja Billä merkityt aminohapposekvenssit on aikaansaatu tämän keksinnön avulla ja saavat alkunsa fytaasin alamuodoista, joiden iso-5 elektriset pisteet ovat 5,2 ja vastaavasti 5,4. Sekvenssi C on siteerattu Ullahilta (1987, 1988b, supra). Sekvenssien A ja B paikassa 12 sijaitseva aminohappotähde ei tämän keksinnön mukaisesti määritettynä ole glysiinitäh-de. [* tarkoittaa yksiselitteistä identifiointia. ** 10 tarkoittaa ettei tähdettä ole havaittu.] B. CNBr-katkaistujen sisäisten fytaasifragmenttien N-ter-minaaliset aminohapposekvenssit. Ailia ja Billä merkityt aminohapposekvenssit (näennäisiltä molekyylipainoiltaan suunnilleen 2,5 kDa ja vastaavasti 36 kDa peptidejä) on 15 aikaansaatu tämän keksinnön avulla. Sekvenssit C - E on siteerattu Ullahilta (1988b, supra).

C. 100 kDa proteiinin N-terminaalinen aminohapposekvenssi, jonka on tämän keksinnön mukaisesti havaittu olevan läsnä fytaasin raakanäytteissä.

20

Kuvio 2. A. Oligonukleotidikoettimet, jotka on konstruoitu tulosten pohjalta kuviosta IA, peptidit A - E.

B. Oligonukleotidikoettimet, jotka on konstruoitu tulosten pohjalta kuviosta IB, peptidit A ja B.

25 • Kuvio 3. Hapanta fosfataasia koodittavan geenin eristyk seen käytetyt oligonukleotidikoettimet.

Kuvio 4. Restriktiokartta bakteriofagista lambda AF201, 30 joka sisältää A. ficuumin fytaasilokuksen. Nuoli osoittaa fytaasigeenin paikan ja kopiointisuunnan. Klooni # osoittaa subkloonit, jotka on saatu osoitetuilla restriktio-entsyymeillä fagista AF201 pAN 8-lissä (pAF 28-1in osalta) ja pUC19:ssa (kaikkien muiden subkloonien osalta).

Ί 35 11 104380

Kuvio 5. pAF 1-1:n fysikaalinen kartta. 10 ke BamHI-frag-mentti, liitettynä pUC19:iin, sisältää koko geenin, joka koodittaa hapanta fosfataasia A. ficuumista.

5 Kuvio 6. Kooste nukleotidisekvensseistä koskien plasmide-ja pAF 2-3, pAF 2-6 ja pAF 2-7, joka käsittää kromosomaa-lisen fytaasigeenilokuksen. Fytaasin koodausalue sijaitsee nukleotidipaikasta 210 paikkaan 1713; introni on läsnä kromosomaalisessa geenissä nukleotidipaikasta 254 10 paikkaan 355. Asiaankuuluvat yksityiskohdat, kuten rest-riktiokohdat, fytaasin aloitus- ja lopetuskodonit ja int-ronikohta osoitetaan.

Kuvio 7. Yksityiskohtainen fysikaalinen kartta sekvensoi-15 dusta fytaasin kromosomaalisesta lokuksesta; nuolet osoittavat fytaasia koodaavan alueen kahden eksonin sijainnin.

Kuvio 8. Fytaasin cDNA-fragmentin luetun alueen nukleoti-20 disekvenssi ja fytaasiproteiinin johdettu aminohapposekvenssi; valmiin fytaasiproteiinin alku osoitetaan paikkana +1. 36 kDa sisäisen proteiinifragmentin aminopää sijaitsee aminohappopaikassa 241, kun taas 2,5 kDa prote-iinifragmentti alkaa aminohappopaikassa 390.

25

Kuvio 9. Fytaasin ekspressiokasetin pAF 2-2S fysikaalinen kartta. Nuolet osoittavat geenien kopiointisuunnan.

Kuvio 10. IEF-PAGE tuloskuvio fytaasin liikailmenemisestä 30 A. ficuum NRRL 3135 -transformantissa. Yhtä suuret tila-.. vuudet A. ficuumin (kaista 1) ja transformantin pAF 2-2S

* SP7 (kaista 2) kasvustojen supernatanteista, joita oli kasvatettu identtisissä olosuhteissa, analysoitiin Phast-System (Pharmacia) IEF-PAGE-geelillä pH-alueella 4,5-6.

35 Vertailun vuoksi mukaan sisällytettiin näyte A. ficuumin fytaasista, puhdistettuna homogeeniseksi, joko erikseen (kaista 4) tai sekoitettuna kasvuston supernatantin kans- 12 104380 sa (kaista 3). Geelit värjättiin joko tekstissä kuvaillulla fosfataasivärlllä (A) tai yleisellä proteiinivärillä (Coomassie Brilliant Blue, B). Fytaasivyöhykkeet osoitetaan tähdellä.

5

Kuvio 11. IEF-PAGE tuloskuvio fytaasin liikaiImentyrni-selle A. nioer CBS 513.88 -transformanteissa. Yhtä suuret tilavuudet A. nioer -lähtökannan (kaista 1) tai transfor-manttien pAF 2-2S #8 (kaista 2), pFYT3 #205 (kaista 3) & 10 #282 (kaista 4) kasvustojen supernatanteista analysoitiin IEF-PAGE:n avulla kuten kuvion 10 kuvaselityksessä on kuvailtu. Geelit värjättiin joko yleisellä fosfataasiak-tiivisuusvärillä (A) tai yleisellä proteiinivärillä (B). Fytaasivyöhykkeet osoitetaan tähdellä.

15

Kuvio 12. pAB 6-1:n fysikaalinen kartta. 14,5 ke Hindlll DNA-insertti pUC19:ssa sisältää koko glukoamylaasi (AG)-lokuksen A. niaeristä.

20 Kuvio 13. Kaavakuva AG-promoottori/fytaasigeeni -fuusioiden muodostamisesta polymeraasiketjureaktion (PCR) avulla. Kaikkien käytettyjen oligonukleotidialukkeiden sekvenssit esitetään tekstissä.

25 Kuvio 14. Fysikaalinen kartta fytaasin ekspressiokasetis-‘ ta pAF 2-2SH.

Kuvio 15. Fysikaaliset kartat välirakenteista pXXFYTl, pXXFYT2 ja fytaasin ekspressiokasetista pXXFYT3, joissa 30 XX ilmaisee ohjaussekvenssin (L). pl8FYT#:ssa ja vastaa-.. vasti p24FYT#:ssa 18 aa ja 24 aa AG-ohjaussekvenssit ovat ’ liitettyinä, kun taas pFYT#:ssa käytetään fytaasin oh- jaussekvenssiä.

35 Kuvio 16. Plasmidin pFYT3AamdS fysikaalinen kartta.

!

Kuvio 17. Plasmidin pFYT3lNT fysikaalinen kartta.

13 104380

Kuvio 18. Fytaasi/AG-vaihtovektorin pREPFYT3 fysikaalinen kartta.

Kuvio 19. Autoradiogranunit kromosomaalisesta DNA:sta, 5 pilkottuna PvuIIrlla (A) ja BamHI:llä (B) ja hybridisoi-tuna 32P-leimatun koettimena olevan A. ficuumin fytaasin cDNA:n kanssa mikrobilajeista S. cerevisiae (kaista 2); B. subtilis (kaista 3); K. lactls (kaista 4); P. chrvso-aenum (kaista 5); P. aeruolnosa (kaista 6); S. livldans 10 (kaista 7); A. nioer 1 pg (kaista 8); A. nioer 5 pg (kaista 9); sokea (kaista 10); C. thermocellum (kaista 11). Kaista 1: markkeri-DNA.

Geenien kloonaus, jotka koodaavat mikro-organismin tuot-15 tamia valikoituja proteiineja, voidaan saada aikaan usealla eri tavalla. Eräs menetelmä käsittää sen, että puhdistetaan kiinnostuksen kohteena oleva proteiini, määritetään sen jälkeen sen N-terminaalinen aminohapposekvenssi ja seulotaan mainitun mikro-organismin geeni-20 kirjasto käyttäen DNA-oligonukleotidikoetinta, joka pohjautuu mainittuun N-terminaaliseen aminohapposekvenssiin. Esimerkkejä tämän menetelmän onnistuneesta soveltamisesta ovat Cephalosporium acremoniumin isopenisilliini N-synte-taasi -geenin kloonaus (S.M. Samson et ai. (1985) Nature 25 318. 191-194) ja Aspergillus oryzaen TAKA-amylaasia koo- daavan geenin eristäminen (Boel et ai. (1986) EP-A-0238023).

Tätä menetelmää käyttäen on yritetty eristää Aspergillus 30 ficuumin geeni, joka koodaa fytaasia. Proteiini on perusteellisesti puhdistettu ja useita biokemiallisia parametreja on määritetty. Saatuja tuloksia on verrattu Ulla-hin (1988a) julkaisemiin tuloksiin. Molemmat tulossarjat esitetään taulukossa 1 jäljempänä.

35 14 104380

Taulukko 1

Puhdistetun villitwppisen A. ficuumln fvtaasln biokemiallisia parametreja 5 Parametri Tämä keksintö Ullah

Spesifinen aktiivisuus* 100 U/mg proteiinia 50 U/mg proteiinia Puhtaus: SDS-PAGE 85 kDa 85/100 kDa 10 IEF-PAGE 3 tai 4 vyöhykettä ei tehty

Km /affiniteetti- vakio) 250 μΜ 40 μΜ 15 Spesifisyys:

Inositoli-l-P:lie ei aktiivinen ei aktiivinen

Inositoli-2-P:lie Km = 3,3 mM 5 %:n aktiivi suus 20 pH-optimi 2,5 ja 5,5 2,5 ja 5,5 Lämpöt.optimi (°C) 50 58 MW (KDa)** 85 85 ja 100 25 MW (glykosyloimaton) 56,5 61,7

Isoelektrinen piste*** 5,0-5,4 4,5 * Ullah mittaa fytaasiaktiivisuuden 58 °C:ssa mieluummin 30 kuin 37 °C:ssa. Fytaasiaktiivisuusyksikkö määritellään siksi määräksi entsyymiä, joka vapauttaa epäorgaanista fosforia 1,5 mM natriumfytaatista nopeudella 1 pmoolia/min. 37 °C:ssa ja pH:ssa 5,50. Fermentointisaanto-jen ja spesifisten aktiivisuuksien vertailemiseksi Ulla-35 hin julkituomat aktiivisuudet korjattiin lämpötilaeron osalta. Korjaus perustuu eroavuuteen fytaasiaktiivisuu- i • 15 104380 dessa mitattuna 37 °C:ssa ja 58 °C:ssa kuten, Ullahin taulukossa lii on esitetty (1988b).

** Näennäinen molekyylipaino määritettynä SDS-PAGE:11a.

5 *** Määritettynä IEF-PAGE:n avulla.

Fytaasia koodaavan geenin eristämiseksi konstruoitiin ensimmäinen oligonukleotidikoetinsarja edellä kuvaillun 10 menetelmän mukaisesti (kuvio 2A). Näiden koettimien konstruointi perustui aminohapposekvenssituloksiin. Kontrollina koko menettelylle suoritettiin samanlaiset vaiheet hapanta fosfataasia koodittavan geenin eristämiseksi, käyttäen siinä yhteydessä Ullahin ja Cumminsin 15 ((1987) Prep. Biochem. 17, 397-422) julkaisemia prote iini tuloksia. Happamen fosfataasin osalta vastaava geeni on eristetty ilman vaikeuksia. Fytaasin kohdalla tilanne näytti kuitenkin olevan erilainen. Monista yrityksistä huolimatta, joissa käytettiin N-terminaalisesta aminohap-20 posekvenssistä saatuja koettimia, genomisesta kirjastosta ei voitu eristää yhtään genomista DNA-fragmenttia tai kloonia, jotka voitaisiin positiivisesti identifioida fytaasia koodaavan geenin sisältäväksi. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Tämän ongelman voittamiseksi puhdistettu fytaasi saatet 2 tiin CNBr-ohjattuun katkaisuun ja tuloksena olevat prote- 3 iinifragmentit eristettiin. Näiden fragmenttien N-ter- 4 minaaliset aminohapposekvenssit määritettiin (kuvio IB), 5 ja uusia oligonukleotidikoettimia konstruoitiin, jotka 6 pohjautuivat uusiin lähtökohtiin (kuvio 2B). Uudet oli- 7 gonukleotidikoettimet tunnistivat yllättäen spesifisiä 8 DNA-fragmentteja ja olivat sopivia yksiselitteisesti 9 tunnistamaan klooneja genomisesta kirjastosta. Yhtään 10 ristihybridisaatiota ei havaittu uusien kloonien tai 11 niistä eristettyjen DNA-fragmenttien ja ensimmäisen oli-gonukleotidikoetinsarjan tai ensimmäistä koetinsarjaa . käyttämällä eristettyjen kloonien välillä.

16 104380

Tulee ymmärtää, että myös tätä toista koetinsarjaa voidaan käyttää läheisesti yhteen kuuluvien fytaasien koodi-tussekvenssien identifioimiseksi.

5 Vasta eristettyjä klooneja käytettiin koettimina Northern blot -hybridisaatioissa. Erillistä mRNA:ta voitiin detek-toida vain, kun mRNA eristettiin fytaasia tuottavasta rihmastosta. Hybridisaatiosignaalia ei havaittu, kun fytaasia tuottamattomasta rihmastosta peräisin olevaa 10 RNA:ta kokeiltiin. mRNA:n koko on noin 1800 emästä, mikä tuottaa teoreettisesti proteiinia, jonka maksimaalinen molekyylipaino on noin 60 kDa. Tämä arvo vastaa molekyy-lipainoa, joka on määritetty glykosyloimattomalle proteiinille, ja molekyylipainoa DNA-sekvenssistä johdettulle 15 proteiinille.

Sen lisäksi, siirrettäessä sienisoluun transformaation avulla, voitiin osoittaa lisääntymistä fytaasiaktiivisuu-dessa. Tämä osoittaa ratkaisevasti, että fytaasia koodit-20 tava nukleotidisekvenssi on todella eristetty. Aminohapposekvenssit, jotka on määritetty puhdistetulle fy-taasientsyymille ja siitä saaduille CNBr-fragmenteille, ovat yhteneväiset aminohapposekvenssin kanssa, joka on johdettu sekvenssistä, joka määritettiin kloonatulle 25 geenille. Nukleotidisekvenssi ja johdettu aminohapposek- * venssi esitetään kuvioissa 6 ja 8, ja ne valaisevat edelleen fytaasia koodittavaa kloonattua sekvenssiä.

Fytaasia koodittavan nukleotidisekvenssin eristäminen 30 mahdollistaa fytaasin taloudellisen tuotannon teollisessa mitassa soveltamalla käytäntöön uudenaikaista rekombi- nantti-DNA-tekniikkaa kuten geenin monistamista, säätely- elementtien vaihtoa kuten esimerkiksi promoottorien, erityssignaalien tai niiden yhdistelmien.

Tämä keksintö käsittää sen mukaisesti myös transformoidun ekspressioisännän, joka kykenee tehokkaasti ilmentämään 35 17 104380 korkeita peptidi- tai proteiinitasoja, joissa on fytaasiaktiivisuutta, ja tarvittaessa tehokkaasti ilmentämään myös happamia fosfataaseja. Kiinnostuksen kohteena olevat ekspressioisännät ovat rihmasieniä, jotka valikoi-5 daan suvuista Aspergillus ja Trichoderma. hiivoja, jotka valitaan suvuista Kluvveromvces ja Saccharomvces. Edullisesti valitaan ekspressioisäntä, joka kykenee erittämään tehokkaasti endogeenisiä proteiinejaan.

10 Erityisen kiinnostavia ovat teolliset Asperqillus-kannat. erityisesti niger, ficuum, awamori tai orvzae. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää mikrobeja Trichoderma reesei tai Saccharomvces cerevisiae.

15 Ekspressiorakenne sisältää nukleotidisekvenssejä, jotka koodaavat ilmennettävää haluttua entsyymituotetta, ja sisältää tavallisesti signaalisekvenssin, joka on isännässä toimiva ja huolehtii peptidi- tai proteiinituotteen erityksestä.

20

Useita eri signaalisekvenssejä voidaan käyttää tämän keksinnön mukaisesti. Signaalisekvenssiä, joka on homologinen ilmennettävän kloonatun nukleotidisekvenssin suhteen, voidaan käyttää. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää signaa-25 lisekvenssiä, joka on homologinen tai olennaisesti homologinen isännän kohdelokuksessa olevan geenin signaalisekvenssin kanssa homologisen rekombinaation helpottamiseksi. Lisäksi voidaan myös käyttää signaalisekvenssejä, jotka on konstruoitu aikaansaamaan parannettu eritty-30 minen valikoidusta ekspressioisännästä. Katso esimerkiksi von Heyne (1983) Eur. J. Biochem. 133. 17-21; ja Perlman ja Halverson (1983) J. Mol. Biol. 167. 391-409. Signaalisekvenssiä koodaava DNA-sekvenssi voidaan yhdistää suoraan prosessointisignaalia (katkaisun tunnistuskohta) 35 koodaavan sekvenssin välityksellä sekvenssiin, joka koo-daa haluttua proteiinia, tai lyhyen, tavallisesti vähem- . män kuin kymmenen kodonia, sillan välityksellä.

* 18 104380 Tämän keksinnön piirissä käytettäväksi tarkoitetut sekre-tionaaliset signaalisekvenssit ovat signaalisekvenssejä, jotka ovat homologisia ilmennettävän kloonatun nukleoti-disekvenssin suhteen, 18 aminohappoa käsittävä glukoamy-5 laasin (AG) signaalisekvenssi ja 24 aminohappoa käsittävä glukoamylaasin (AG) signaalisekvenssi, kahden jälkimmäisen ollessa joko homologisia tai heterologisia ilmennettävän nukleotidisekvenssin suhteen.

10 Ekspressiotuote tai kiinnostuksen kohteena oleva nukle-otidisekvenssi voi olla DNA, joka on homologinen tai heterologinen ekspressioisännän suhteen.

"Homologinen" DNA määritellään tässä yhteydessä DNArksi, 15 joka on peräisin samasta suvusta. Esimerkiksi, Aspergillus transformoidaan Aspergilluksen DNA:11a. Tällä tavalla on mahdollista parantaa sienisuvun jo olemassa olevia ominaisuuksia tuottamatta uusia ominaisuuksia, joita suvussa ei aikaisemmin ollut läsnä.

20 "Heterologinen” DNA määritellään DNArksi, joka on peräisin useammasta kuin yhdestä suvusta, so., kuten edellisen kappaleen esimerkistä seuraa, DNA:ta, joka on peräisin muusta suvusta kuin Aspergillus. joka sen jälkeen ilmen-25 netään Aspergilluksessa.

Fytaasia koodittavat nukleotidisekvenssit saadaan sieni-lähteestä. Edullisia ovat fytaasia koodittavat nukleotidisekvenssit, jotka saadaan Asperoillus-suvusta. Edul-30 lisimmat sekvenssit saadaan lajeista Aspergillus ficuum ^ tai Aspergillus niger.

Alue, joka on 5'-puolella avointa lukukehystä kiinnostuksen kohteena olevassa nukleotidisekvenssissä, sisältää 35 transkriptionaalisen aloituksen säätelyalueen (eli promoottorin). Mitä tahansa isännässä toiminnallista aluetta voidaan käyttää, mukaanlukien promoottori, joka on homo- * 19 104380 loginen Ilmennettävän fytaasia koodaavan nukleotidisek-venssln suhteen. Käytettävä alue on suurimmaksi osaksi kuitenkin homologinen kohdelokuksen alueen kanssa. Tämän vaikutuksesta kohdelokuksen ekspressiotuote korvautuu 5 kiinnostuksen kohteena olevalla ekspressiotuotteella.

Sillä tasolla, jossa kohdelokuksen koodittaman proteiinin ilmenemisen ja erittymisen taso saa aikaan tehokkaan tuotannon, tämä kopioinnin aloituksen säätelyalue todetaan tavallisesti riittäväksi. Joissain tapauksissa kui-10 tenkin voidaan haluta korkeampaa kopiointitaspa kuin kohdelokuksen geenillä, tai voidaan haluta indusoituva ilmeneminen käyttäen erityistä indusoivaa ainetta. Sellaisissa tapauksissa käytetään transkriptionaalista aloituksen säätelyaluetta, joka poikkeaa alueesta kohdelokus-15 geenissä. Suuri määrä transkriptionaalisia aloituksen säätelyalueita tunnetaan, jotka ovat toiminnallisia rih-masienissä. Näihin alueisiin lukeutuvat alueet geeneistä, jotka koodaavat glukoamylaasia (AG), sieniamylaasia, hapanta fosfataasia, GAPDH:ta, TrpC:tä. AmdSrää, AlcArta, 20 AldA:ta, histoni H2A:ta, Pvr4;ää. PvrG:tä. isopenisillii-ni N-syntetaasia, PGK:ta, hapanta proteaasia, asyyli-transferaasia ja vastaavia.

Kohdelokus koodaa edullisesti voimakkaasti ilmentyneen 25 proteiinin geeniä, so., geeniä, jonka ilmentymistuote ilmenee vähintään noin 0,1 g/1 pitoisuuteen fermentointi-prosessin lopussa. Tämän prosessin kestoaika voi vaihdella muun muassa halutun proteiinituotteen mukaan. Valaisevana esimerkkinä sellaisesta geenistä on glukoamy-30 laasia (AG) koodaava geeni. Muita kiinnostavia geenejä ovat sienten a-amylaasi, hapan fosfataasi, proteaasi, « ·’ hapan proteaasi, lipaasi, fytaasi ja sellobiohydrolaasi.

Erityisen edullisia kohdelokuksia ovat A. nigerin gluko-amylaasigeeni, A. orvzaen sieniamylaasigeeni, T. reesein 35 sellobiohydrolaasigeenit, Mucor miehein happamen proteaa-sin geeni, Kluvveromvces lactiksen laktaasigeeni tai . Saccharomvces cerevisiaen invertaasigeeni.

20 104380

Transkriptionaalinen lopetuksen säätelyalue voi olla kiinnostuksen kohteena olevasta geenistä, kohdelokuksesta tai inistä tahansa sopivasta sekvenssistä. Silloin kun rakenne sisältää kiinnostavia lisäsekvenssejä kiinnostuk-5 sen kohteena olevan geenin alapuolella (kopiointisuunnas-sa), transkriptionaalisen lopetuksen säätelyalueen, ollessaan homologinen kohdelokuksen kanssa, tulisi olla olennaisesti pienempi kuin homologinen geeninviereinen alue.

10

Tavallisesti käytetään valintamarkkeria, joka voi olla osa ekspressiorakennetta tai erillään ekspressioraken-teesta siten, että se voi kiinnittyä kohdassa, joka on eri kuin kiinnostuksen kohteena olevan geenin. Koska 15 keksinnön mukaiset rekombinanttimolekyylit transformoidaan edullisesti isäntäkantaan, jota voidaan käyttää teolliseen tuotantoon, valintamarkkerit transformaation seuraamiseksi ovat edullisesti dominoivia valintamarkke-reita, so., isäntäkantaan ei tarvitse tuottaa mutaatiot-" 20 ta, jotta kyettäisiin käyttämään näitä valintamarkkerei- ta. Esimerkkejä näistä ovat markkerit, jotka mahdollistavat transformanttien kasvun määrätyillä ravintolähteillä (esim. A. nidulansin amdS-geeni mahdollistaa A. niger-transformanttien kasvun asetamidi ainoana typenlähteenä), 25 tai markkerit, jotka antavat resistenssin antibiootteja vastaan (esim., ble-geeni antaa resistenssin fleo-mysiinille tai hph-geeni antaa resistenssin hygromysiini B:tä vastaan).

30 Valintageenillä on omat transkriptionaaliset ja transla-tionaaliset aloituksen ja lopetuksen säätelyalueet, mikä '· mahdollistaa markkerin itsenäisen ilmenemisen. Suuri määrä transkriptionaalisia aloituksen säätelyalueita tunnetaan kuten aikaimmin on kuvailtu, ja niitä voidaan 35 käyttää merkkigeenin yhteydessä. Silloin kun käytetään antibioottiresistenssiä, valikointiin käytettävän antibi- j : 21 104380 ootin pitoisuus vaihtelee riippuen antibiootista, vaihdellen yleensä noin 30 - 300 pg antibioottia /ml.

Eri sekvenssejä voidaan yhdistää tunnettujen menetelmien 5 mukaisesti, kuten restriktion avulla, yhdistämällä komplementaariset restriktiokohdat ja ligatoimalla, tekemällä tasapäiseksi täyttäen esiintyöntyvät päät ja tasapääli-gatoimalla, Bal31-resektion avulla, alukekorjauksella, in vitro -mutatoimalla tai vastaavasti. Polylinkkereitä ja 10 adaptoreja voidaan käyttää, kun se on tarkoituksenmukaista, ja liittää tai poistaa tunnetuilla menetelmillä, jotta ekspressiorakenteen helppo kokoaminen olisi mahdollista. Rakenteen synteesin jokaisessa vaiheessa fragmentti voidaan kloonata, analysoida restriktioentsyymin avul-15 la, sekvensoimalla tai hybridisoimalla tai vastaavasti. Suuri määrä vektoreita on saatavissa kloonausta varten, ja erityinen vaihtoehto ei ole ratkaiseva tämän keksinnön kannalta. Kloonaus tapahtuu normaalisti E. colissa. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Geenin viereiset alueet voivat sisältää vähintään osan 2 kohdelokuksen avoimesta lukukehyksestä, erityisesti sig- 3 naalisekvenssin, säätelyalueet kohdelokuksen geenin 5'- 4 ja 3' puolella, tai ne voivat ulottua säätelyalueiden 5 toiselle puolelle. Viereinen alue käsittää tavallisesti 6 100 emäsparia (ep), tavallisesti vähintään 200 ep ja voi 7 käsittää 500 ep tai enemmän. Viereiset alueet valitaan 8 siten, että kohdegeenistä tulee epäjatkuva (useassa osas 9 sa oleva) ja sen ilmeneminen estyy. Tämä voidaan saada 10 aikaan liittämällä ekspressiokasetti (joka sisältää il- 11 mennettävän nukleotidisekvenssin ja sisältää valinnaises 12 ti lisäelementtejä, kuten signaalisekvenssin, transkrip- 13 tionaalisen aloituksen säätelyaluesekvenssin ja/tai tran- 14 skriptionaalisen lopetuksen säätelyaluesekvenssin) avoi 15 meen lukukehykseen 5'-alueen lähelle proksimaalisesti, 16 korvaamalla kaikki tai osa kohdegeenistä ekspressioraken-teella tai sijoittamalla ekspressiorakenne kohdelokuksen . kohdalla olevan transkriptionaalisen aloituksen säätely- 22 104380 alueen ja avoimen lukukehyksen väliin. Kuten jo on osoitettu, silloin kun lopetuksen säätelyalue on homologinen kohdelokuksen kohdalla olevan alueen kanssa, 3'-puolen viereisen alueen tulisi olla olennaisesti suurempi kuin 5 rakenteessa läsnä oleva lopetuksen säätelyalue.

Hakemuksessa kuvataan myös lähtömateriaalia 'toisen sukupolven' fytaasien konstruoimiseksi, so. fytaasientsyymi-en, joiden ominaisuudet eroavat tässä yhteydessä eriste-10 tyn entsyymin ominaisuuksista. Toisen sukupolven fy-taaseilla voi olla muuttunut lämpötila- tai pH-optimi, muuttunut spesifinen aktiivisuus tai affiniteetti subst-raattejaan kohtaan, tai mikä tahansa muuttunut ominaisuus, mikä tekee entsyymistä soveliaamman käytettäväksi 15 määrätyssä prosessissa. E. coli on paras isäntä sellaiseen mutatointiin (esim. paikkakohdennettu mutatointi). Koska E. colista puuttuu silmukointisysteemi intronien poistamiseksi, joita saattaisi olla läsnä fytaasigeenis-sä, fytaasin cDNA-klooni on vaihtoehtosekvenssi ilmennet-20 täväksi E. colissa. Tämä cDNA-sekvenssi voidaan helposti mutatoida alalla hyvin tunnetuilla menetelmillä, minkä jälkeen mutatoitu geeni voidaan liittää haluttuihin eks-pressiorakenteisiin.

25 Rakenne voidaan transformoida isäntään kloonausvektoris- t sa, joko lineaarisessa tai rengasmaisessa, tai se voidaan poistaa kloonausvektorista haluttaessa. Kloonausvektori on edullisesti plasmidi. Plasmidi linearisoidaan tavallisesti noin 1 kep kiinnostuksen kohteena olevan geenin 30 alueella. Ekspressiorakenne tämän keksinnön mukaisten \ fytaasien tuottamiseksi kiinnitetään edullisesti vali- ! ’· koidun ekspressioisännän genomiin.

Useita eri menetelmiä on olemassa rihmasienten transfor- 35 moimiseksi. Näihin menetelmiin lukeutuvat protoplasti-fuusio tai -transformaatio, elektroporaatio ja mikroam-, musammunta (microprojectile firing) soluihin. Protoplas- i 23 104380 titransformaation on todettu olevan menestyksekäs ja sitä voidaan käyttää edullisesti.

Kiinnostuksen kohteena olevan sienikannan rihmasto muute-5 taan ensin protoplasteiksi soluseinän entsymaattisella hajotuksella osmoottisesti stabiloivan aineen kuten KCl:n tai sorbitolin, läsnäollessa. Protoplastien DNA:n sisäänottoa helpotetaan lisäämällä CaCl2:a ja väkevöityä polyetyleeniglykoliliuosta, jälkimmäisen aineen aiheutta-10 essa protoplastien yhteenkasautumisen, jonka menettelyn yhteydessä transformoiva DNA sisältyy aggregaatteihin ja siirtyy protoplasteihin. Protoplastien annetaan sen jälkeen regeneroitua kiinteällä alustalla, joka sisältää osmoottisesti stabiloivaa ainetta, ja kun on tarkoituk-15 senmukaista, valikoivaa ainetta, jolle transformoiva DNA koodaa resistenssin.

Transformanttien valikoinnin jälkeen kiinnostavan geenin läsnäolo voidaan määrittää usealla eri tavalla. Käyttä-20 mällä vasta-aineita, kun ekspressiotuote on heterologinen isännän suhteen, kiinnostavan geenin ilmenemisen läsnäolo voidaan ilmaista. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää Southern- tai Northern-blotteja kiinnittyneen geenin tai sen kopiointituotteen läsnäolon ilmaisemiseksi.

25

Kiinnostuksen kohteena olevan nukleotidisekvenssin tai ekspressiorakenteen monistaminen voidaan saada aikaan va-kiomenetelmillä, kuten liittämällä transformoivaan vektoriin moninkertaisia rakennekopioita tai käyttämällä amdS-30 geeniä valikoivana markkerina (esim. Weinans et ai.

(1985) Current Genetics, 9, 361-368). Monistettava DNA-·' sekvenssi voi sisältää DNA:ta, joka on homologista tai heterologista ekspressioisännän suhteen kuten edellä on kuvailtu.

Soluja voidaan sen jälkeen kasvattaa sopivassa ravinto-alustassa. Voidaan käyttää pieniä pitoisuuksia proteaasi- 35 24 104380 inhibiittoria, kuten fenyylimetyylisulfonyylifluoridia, a2-makroglobuliineja, pepstatiinia tai vastaavia. Pitoisuus on tavallisesti alueella noin 1 yg/ml - 1 mg/ml. Proteaasigeeni(t) voidaan inaktivoida, jotta väitettä!-5 siin tai vähennettäisiin halutun proteiinin hajoamista.

Transformantteja voidaan kasvattaa joko panostyyppisissä tai jatkuvatoimisissa fermentointireaktoreissa, joista kasvualusta eristetään ja haluttu tuote uutetaan.

10

Erilaisia menetelmiä tuotteen puhdistamiseksi, jos se on tarpeen, voidaan käyttää, kuten kromatografiaa (esim., HPLC), liuotin-liuotin-uuttamista, elektroforeesia, niiden yhdistelmiä tai vastaavia menetelmiä.

15

Hakemuksessa kuvataan myös jälkikäsittelymenetelmää, jossa fermentoinnin liemi (valinnaisesti puhdistettu) suodatetaan, jota seuraa toinen mikrobisuodatus, minkä jälkeen suodatettu liuos väkevöidään. Siten saatua neste-20 mäistä konsentraattia voidaan käyttää seuraavasti: a) Fytaasi ja muut proteiinit voidaan saostaa nestemäisestä konsentraatista lisäämällä asetonia lopputilavuu-teen 60 % (tilavuus/tilavuus) jatkuvassa sekoituksessa.

25 Saostuma voidaan kuivata alipaineessa 35°C:ssa. Sen jäi-keen kun kuiva jauhe on jauhettu, entsyymituotetta voidaan käyttää sellaisenaan käyttösovellutuskokeisiin. Talteenottosaannot ovat noin 90 %.

30 b) Nestemäinen konsentraatti voidaan spraykuivata (sumu-tuskuivata) käyttäen tavanomaista spraykuivaustekniikkaa.

* ’ ’ Talteenottosaannot vaihtelevat 80 - 99 %.

c) Nestemäinen konsentraatti voidaan sekoittaa kantaja-35 aineiden kuten vehnäleseiden, kanssa. Siten saatu seos voidaan kuivata spraytornissa tai leijupedissä.

25 104380 d) Nestemäinen konsentraatti voidaan stabiloida osmoottisesti lisäämällä esim. sorbitolia. Säilöntäainetta, kuten bentsoehappoa, voidaan lisätä mikrobikontaminaation estämiseksi.

5

Kaikki neljä formulaatiota voidaan myydä esisekoiteval-mistajille, rehuseosteollisuudelle, muille jakelijoille ja maanviljelijöille.

10 Esimerkit esitetään tässä yhteydessä valaisemisen vuoksi eikä niitä ole mitenkään tarkoitettu keksinnön piiriä rajoittaviksi. Alaa tunteville käy selväksi, että keksinnön mukaista fytaasigeeniä voidaan käyttää heterologisissa hybridisaatiokokeissa, jotka on kohdistettu fytaasia koo-15 daavien geenien eristämiseen muista mikro-organismeista.

Esimerkki 1 A. ficuum NRRL 3135:n fermentolnti 20 Aspergillus ficuum -kanta NRRL 3135 saatiin yrityksestä the Northern Region Research Lab, USDA, 1815 North University Street, Peoria, Illinois, USA. Sieni-itiövalmis-teet tehtiin noudattaen vakiomenetelmiä. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Itiöitä ja sen jälkeen soluja siirrettiin panosfermentaa- 2 tiosarjan kautta erlenmeyerpulloissa 10 l:n fermentoriin.

3

Panosviljelmänä kasvatuksen jälkeen tämän fermentorin si 4 sältöä käytettiin siirroksena lopulliseen 500 l:n panos- 5 fermentaatioon.

6 7

, Käytetty alusta sisältää: 91 g/1 maissitärkkelystä (BDH

8

Chemicals Ltd.); 38 g/1 glukoosi.H20:ta; 0,6 g/1 9

MgS04.7H20:ta; 0,6 g/1 KCl:a; 0,2 g/1 FeS04.7H20:ta ja 12 10 g/1 KN03:a. pH pidettiin tasossa 4,6 ± 0,3 automaattisesti 11 titraten joko 4 N NaOH:lla tai 4 N H2S04:llä.

26 104380

Soluja kasvatettiin 28°C:ssa automaattisesti säädellyssä liuenneen hapen pitoisuudessa 25 % kyllästettyä ilmaa. Fytaasituotanto saavutti maksimitason 5-10 U/ml 10 fer-mentointipäivän jälkeen.

5

Esimerkki 2 A. flcuumln fvtaasin puhdistaminen 1a karakterisointi A. Fvtaaslaktlivisuuden määritys 10 100 μΐ liemisuodosta (laimennettuna tarvittaessa) tai su- pernatanttia tai 100 μΐ demineralisoitua vettä vertailuna lisätään inkubointiseokseen, jolla on seuraava koostumus: - 0,25 M natriumasetaattipuskuri pH 5,5, tai 15 - glysiini-HCl-puskuri pH 2,5 - 1 mM fytiinihappo, natriumsuola - demivedellä 900 piiksi

Tuloksena olevaa seosta inkuboidaan 30 minuutin ajan 37 20 °C:ssa. Reaktio pysäytetään lisäämällä 1 ml 10%lista TCArta (trikloorietikkahappo). Kun reaktio on päättynyt, lisätään 2 ml reagenssia (3,66 g FeS04.7H20: ta 50 ml:ssa ammoniummolybdaattiliuosta (2,5 g (NH4)6Mo7024.4H20:ta ja 8 ml H2S04:ää, laimennettuna 250 mltksi demivedellä)).

25

Sinisen värin intensiteetti mitataan spektrofotometrises-ti 750 nm:ssä. Mittaukset ilmaisevat vapautuneen fosfaatin määrän suhteessa fosfaatin kalibrointikäyrään alueella 0 - 1 mmoolia/1.

30 «« i 4 27 104380

Fosfataasiväri

Fosfataasiaktiiviset komponentit ilmaistiin isoelektri-sellä fokusoinnilla käyttäen yleistä fosfataasiväriä.

5 Geeliä inkuboitiin liuoksessa, joka sisälsi a-naftyyli-fosfaattia ja Fast Garnet GBC -suolaa (Sigma, 0,1 & vastaavasti 0,2 % (paino/tilavuus) 0,6 M natriumasetaatti-puskurissa pH 5,5. Reaktio, joka johtaa mustan saostuman ilmaantumiseen, päätettiin joko metanoli:etikkahapolla 10 (30:10 %, tilavuus/tilavuus), tai, tarvittaessa lisäksi fytaasiaktiivista proteiinia, huuhtelemalla tislatulla vedellä.

B. A. ficuumln fytaasin puhdistaminen 15

Fytaasi puhdistettiin homogeeniseksi A. ficuum NRRL 3135:n kasvuliemestä. Liemi suodatettiin ensin mikrobiva-paaksi. Tuloksena olevaa kasvusuodosta väkevöitiin sen jälkeen edelleen Filtronin ultrasuodatusyksikössä 30 kD 20 raja-arvoisilla kalvoilla. Näytteen pH ja ionivahvuus säädettiin puhdistustoimenpidettä varten pesemällä näytettä 10 mM natriumasetaattipuskurilla pH 4,5. Loppupi-toisuus tässä ultrasuodatusoperaatiossa oli suunnilleen 20-kertaisesti pienentynyt.

25 Näyte sijoitettiin sen jälkeen kationinvaihtimeen (S-Sepharose Fast-Flow HR 16/10 20 ml:n kolonnissa, molemmat saatuina Pharmacialta) Waters Preparative 650 Advanced Protein Purification Systemissä. Sitoutuneet proteiinit 30 eluoitiin 0-1 M natriumkloridigradientin avulla nat- riumasetaattipuskurissa. Fytaasi eluoitui suunnilleen 250 ·' mM NaCl:n kohdalla. Fytaasiaktiivisuutta sisältävät frak tiot koottiin yhteen, väkevöitiin ja niistä poistettiin suola ultrasuodatuksella. Tuloksena oleva liuos sijoitet-35 tiin anioninvaihtimeen (Q-Sepharose Fast-Flow HR 16/10 20 ml:n kolonnissa, Pharmacia), ja proteiinit eluoitiin jälleen 0-1 M natriumkloridigradientin avulla asetaatti- 28 104380 puskurissa, kuten edellä on kuvailtu. Fytaasi eluoitui tästä kolonnista suunnilleen 200 mM NaClrn kohdalla.

Tuloksena näistä puhdistusvaiheista on osittain puhdis-5 tettu fytaasivalmiste, jonka spesifinen aktiivisuus on suunnilleen 40-50 U/mg proteiinia, mikä osoittaa 25-ker-taista puhdistumista.

Osittain puhdistetun fytaasin puhtausanalyysi osoitti 10 huomattavan epäpuhtauden läsnäolon, jonka molekyylipaino oli suunnilleen 100 kDa (kuvio IB, sekvenssi E). Isoelek-trinen fokusointi osoitti, että läsnä oli muutama fosfa-taasiaktiivisuutta sisältävä entsyymi, mukaanlukien 3-4 fytaasin alamuotoa (isoelektriset pisteet vaihtelivat 15 5,0-5,4) (kuvio IA, sekvenssit A ja B).

Homogeenisen fytaasivalmisteen saamiseksi suoritettiin kaksinkertainen lisäpuhdistus erottamalla seuraavaksi osittain puhdistetun fytaasin komponentit isoelektrisen 20 fokusoinnin avulla LKB Multiphor Systemissä Ampholine PAG -maljoilla (pH-alue 4-6,5). Fosfataasiaktiiviset proteiinit (mukaanlukien fytaasi) ilmaistiin edellä kuvaillun yleisen fosfataasivärjäysmenetelmän avulla. Kiinnostavat vyöhykkeet leikattiin sen jälkeen geelistä, ja aktiivinen 25 proteiini eluoitiin inkuboimalla geeliliuskoja 16 tuntia 10 mM natriumasetaattipuskurissa pH 5,5. Proteiinifraktiot analysoitiin spesifisessä fytaasiaktii-visuusmäärityksessä, kuten esimerkissä 2 on kuvailtu, erottamalla siten fytaasifraktiot muista happamista fos-30 fataaseista. Lopullinen puhdistustekijä fytaasille oli suunnilleen 60-kertainen (lopullisen valmisteen spesifi-nen aktiivisuus oli 100 U/mg proteiinia). Tässä lopullisessa puhdistusvaiheessa oli myös mahdollista eristää fytaasin eri alamuodot (kuvio IA, sekvenssit A ja B).

35 A. ficuumin fytaasia vastaan kohdistettuja monoklonaali-sia vasta-aineita valmistettiin, mikä sai aikaan tehok- ni Γ1ΐ 29 104380 kaan puhdistusmenetelmän. Vasta-aine liitettiin syano-geenibromidi-aktivoituun Sepharose 4B:hen (5 mg/ml geeliä), ja tätä matriisia käytettiin immunoaffiniteettiko-lonnissa. Matriisi näytti sitovan suunnilleen 1 mg:n 5 fytaasia ml:aa kohti. Fytaasi voitiin eluoida affiniteet-tikolonnista puskurilla pH 2,5 (100 mM glysiini-HCl, 500 mM NaCl) menettämättä aktiivisuutta. Tätä menettelyä voidaan käyttää homogeenisen fytaasin eristämiseksi raa-' asta kasvusuodoksesta yhdessä ainoassa vaiheessa tallo teenoton ollessa 80 % ja puhdistuksen 60-kertainen.

C. Fytaasin dealykosvlaatio A. ficuumin fytaasia (70 pg proteiinia) inkuboitiin 2,5 U 15 N-Glycanasen (Genzyme) kanssa liuoksessa, joka sisälsi 0,2 M natriumfosfaattipuskuria pH 8,6 ja 10 mM 1,10-fe-nantroliinia kokonaistilavuudessa 30 μΐ.

Deglykosylaation edistymisaste tarkistettiin 16 tunnin 20 jälkeen 37 °C:ssa elektroforeesin avulla (Phast System, Pharmacia). Fytaasin näennäisen molekyylipainon havaittiin laskevan 85 kDa:sta suunnilleen 56,5 kDa:iin. Jaksollisella happamella Schiffin (PAS) sokerivärjäyksellä, joka identifioi natiivin fytaasin glykoproteiinina, ei 25 kyetty ilmaisemaan proteiiniin kiinnittyneitä jäännöshii- « lihydraatteja. Hiilihydraatin täydellinen poistuminen vahvistettiin lisäksi herkällä lektiiniblottausmenetel-mällä. Natiivia ja deglykosyloitua fytaasia (molempia 1,5 pg) ajettiin standardilla SDS-PAGE-geelillä ja siirret-30 tiin elektroforeettisesti PVDF-membraanille (Immobilon, Millipore) 25 mM Tris-glysiini-puskurissa pH 8,3, 20 % metanolia (tilavuus/tilavuus), 16 tunnin ajanjakson kuluessa 30 V jännitteessä.

35 Membraania inkuboitiin sen jälkeen l%:isen (paino/tila-vuus) naudan seerumin albumiinin kanssa fosfaattipusku-roidussa suolaliuoksessa ja inkuboitiin konkanavaliini A- 30 104380 peroksidaasin kanssa (Sigma, 10 pg/ml fosfaattipusku-roidussa suolaliuoksessa). Peroksidaasi värjättiin sen jälkeen 4-kloori-l-naftolilla (Sigma).

5 Myöskään tällä herkällä menetelmällä ei kyetty ilmaisemaan deglykosyloituun fytaasiin kiinnittynyttä jään-nöshiilihydraattia.

Deglykosylaation jälkeen fytaasi on kokonaan menettänyt 10 aktiivisuutensa, johtuen luultavasti entsyymin ryhmittymisestä.

Esimerkki 3

Fvtaasin aminohapposekvenssin määrittäminen 1a olioonuk-15 leotidikoettimien konstruointi A. N-termlnaalisen aminohapposekvenssin määrittäminen

Fytaasi siirrettiin elektroforeettisesti SDS-PAGE:lta tai IEF-PAGE:lta PVDF-blottausmembraanille (Immobilon, Milli-20 pore). Elektroblottaus suoritettiin 10 mM CAPS (3-syklo-heksyyliamino-propaanisulfonihappo) -puskurissa pH 11,0, 10%:isen (tilavuus/tilavuus) metanolin kanssa, 16 tunnin aikana 30 V jännitteessä ja 4 °C:ssa. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Proteiini paikannettiin Coomassie Brilliant Blue -vär- 2 - * . · 3 jäyksellä. Kiinnostava vyöhyke leikattiin irti, väri ] poistettiin edelleen metanolissa ja suoritettiin kaasu- 4 faasinen sekvensointi. Toimenpide on suoritettu useita 5 kertoja käyttäen useita yksittäisiä valmisteita. Saadut 6 tulokset esitetään kuviossa IA (sekvenssit A ja B).

7 • 8

Aminohapposekvenssi on määritetty myös 100 kDa proteiinin 9 osalta, jota oli läsnä raakavalmisteissa. Tälle prote 10 iinille saadut tulokset esitetään kuviossa 1C. Tämä sek- 11 venssi on huomattavan homologinen happamen fosfataasin kanssa, joka on eristetty Aspergillus nigeristä (MacRae et ai. (1988) Gene 71, 339-348).

31 104380 B. Sisäisten aminohapposekvenssien rtiäärittäminen Proteiinin pilkkoutuminen svanoaeenibromldln avulla

Homogeeniseksi puhdistettu fytaasi siirrettiin 100 mM 5 NaHC03:een ultrasuodatuksen avulla (Microconcentrator

Centricon 30, Amicon). Proteiini lyofilisoitiin sen jälkeen, liuotettiin 70%:iseeh trifluorietikkahappoon (ti-lavuus/tilavuus), ja inkuboitiin 6 tunnin ajan suunnilleen 300-kertaisen molaarisen CNBr-ylimäärän kanssa.

10 Reaktio pysäytettiin laimentamalla seosta vedellä. Tuloksena olevat fragmentit lyofilisoitiin jälleen. Näyte liuotettiin sitten SDS-PAGE-näytepuskuriin, joka sisälsi DTT:tä (ditiotreitoli), ja pilkkoutumisaste määritettiin PAGE :11a. Analyyttinen PAGE suoritettiin Pharmacian 15 Phast-Systemillä, 20%:isillä SDS-PAGE-geeleillä. Geelejä esiajettiin yhtenäisen puskurisysteemin muodostamiseksi pienten peptidien erottumisen parantamiseksi (käsikirjan mukaisesti). Peptidit ilmaistiin käyttäen alalla tunnettua hopeavärjäystekniikkaa, koska Coomassie Brilliant 20 Bluella ei kyetty ilmaisemaan pienintä peptidiä. Menettelyn tuloksena oli fytaasin täydellinen hajoaminen peptideiksi, joiden molekyylipainot olivat <2,5 kDa, 36 kDa, 57 kDa ja 80 kDa.

25 Peptidit eristettiin kaasufaasista sekvensointia varten SDS-Tricine-PAGE:n avulla kuten Schagger & Jagow ovat kuvailleet (1987) Anal. Biochem. 166. 368-379, jota seurasi elektroblottaus kuten edellä on kuvailtu. 1 2 3 4 5 6 57 kDa fragmentin N-pää on identtinen Ullahin (1988b, 2 suora) määrittämän fytaasin N-pään kanssa, lukuun otta- 3 ·' matta neljää ensimmäistä aminohappoa, jotka puuttuvat 4 (kuvio IA, sekvenssi B). 2,5 kDa ja 36 kDa peptidien N- 5 terminaaliset sekvenssit esitetään kuviossa IB sekvens- 6 seinä A ja B.

32 104380 C. Olicronukleotidikoettimet

Oligonukleotidikoettimia on konstruoitu, jotka pohjautuvat kuvioissa IA ja IB esitettyihin aminohapposekvenssei-5 hin, ja niitä valmistettiin käyttäen Applied Biosystemsin ABI 380B DNA:n synteesilaitetta. Nämä oligonukleotidit esitetään kuvioissa 2A ja 2B.

Esimerkki 4 10 Genomlsten blottien 4a oenomisten kirjastojen hybridisaatio ensimmäisen oliaonukleotidikoetinsarlan kanssa

Genomista DNA:ta A. ficuum:sta on eristetty hiertämällä rihmastoa nestetypessä, käyttäen standardimenetelmiä 15 (esim. Yelton et ai. (1984) Proc. Natl. Acad. Sei.

U.S.A., 1470-1474). Genominen kirjasto konstruoitiin bakteriofagivektorissa lambda EMBL3, käyttäen A. ficuum NRRL 3135:n kromosomaalisen DNA:n osittaista Sau3A-hvdro-lysaattia standardimenetelmien mukaisesti (esim. Maniatis 20 et ai. (1982) Molecular cloning, a laboratory manual,

Cold Spring Harbor Laboratory, New York). Siten saatu genominen kirjasto sisälsi 60-70 kertaisesti A. ficuumin genomin. Kirjastosta tarkistettiin plakkien esiintyminen ilman inserttiä hybridisaation avulla lambda EMBL3:n 25 täytefragmentin kanssa. Alle 1 %:n plakeista havaittiin < · hybridisoituvan lambda EMBL3-koettimeen. Insertln koko oli 13 - 17 kiloemästä (ke).

Olosuhteiden ja koettimien identifioimiseksi, jotka oli-30 vat sopivia genomisen kirjaston seulontaan, genomista • DNA:ta pilkottiin useilla restriktioentsyymeillä, erotet- * * tiin agaroosigeeleillä ja blotattiin Genescreen plus-kantajaan, valmistajan ohjeiden mukaisesti. Blotit hybri-disoitiin kaikkien oligonukleotidikoettimien kanssa.

35 Hybridisaatio suoritettiin käyttäen vaihtelevankovuisia olosuhteita (6 x SSC, 40 - 60 °C hybridisaatiolle; 0,2 x SSC saakka, 65 °C pesulle). Koettimet 1068 ja 1024 (kuvio 2A) valittiin genomisen kirjaston seulontaan, vaikka yhtään yhteistä DNA-fragmenttia ei voitu identifioida, 33 104380 jotka hybridisoituisivat spesifisesti kummankin koettimen kanssa. Happamen fosfataasin koetin 1025 (kuvio 3) antoi spesifisen ja erillisen hybridisaatiosignaalin, ja tästä johtuen tämä koetin valittiin genomisen kirjaston seulon-5 taan happamen fosfataasin geenin osalta.

Kaikkia kolmea koetinta käyttämällä voitiin identifioida hybridisoituvia plakkeja genomisessa kirjastossa. Hybri-disaatiosignaali, joka vastasi koetinta 1025, oli voima-10 kas ja toistettavissa. Vahvuudeltaan vaihtelevia hybri-disaatiosignaaleja havaittiin käyttäen koettimia 1024 ja 1068 (fytaasi). Ristihybridisaatiota kahden sarjan välillä ei havaittu. Kaikki kolme plakkisarjaa seulottiin uudelleen ja DNA:ta eristettiin kahdeksasta erillisestä, 15 positiivisesti hybridisoituvasta plakista (Maniatis et ai., supra). Kussakin sarjassa voitiin identifioida klooneja, jotka sisälsivät identtisiä hybridisoituvia fragmentteja, mikä osoitti, että mainittujen kloonien inser-tit liittyvät läheisesti toisiinsa ja luultavasti peittä-20 vät saman genomisen DNA-alueen. Taaskaan ei voitu osoittaa ristihybridisaatiota käyttäen kahta fytaasispesifistä sarjaa (koettimet 1024 ja 1068), mikä osoitti, että vaikka molemmat koettimet, joita käytettiin kahden kloonisar-jan eristämiseen, saatiin proteiinin N-terminaalisesta 25 aminohapposekvenssistä, erilaiset genomiset DNA-fragmen- * tit oli identifioitu ja kloonattu.

Kaikki kolme kloonisarjaa hybridisoitiin Northern-blot-tien kanssa, jotka sisälsivät mRNA:ta, jota oli eristetty 30 indusoidusta ja indusoimattomasta rihmastosta (esimerkki . 6). Hapan fosfataasi -spesifiset kloonit, samoin kuin * • · näiden kloonien eristetty sisäinen 3,1 ke Sali-fragmentti, hybridisoituivat yksinomaan indusoitujen mRNA-näyt-teiden kanssa. Hapan fosfataasi -spesifisillä koettimilla 35 identifioitu mRNA on pituudeltaan noin 1800 emästä, mikä sopii yhteen proteiinin tunnetun koon kanssa (68 kDa, Ullah ja Cummins (1987) Prep. Biochem. 12, 397-422).

34 104380

Fytaasispesifisten kloonien hybridisaatiota spesifisten mRNA-molekyylien kanssa ei voitu osoittaa. Keksinnön mukaisesti on siten päätelty, että edellä kuvailtu menetelmä oli tulokseton fytaasia koodittavan geenin kloo-5 nauksessa. Voidaan edelleen päätellä, että tämä epäonnistuminen ei johdu viasta käytetyssä menetelmässä, koska menetelmää on onnistuneesti käytetty hapanta fosfataasia koodittavan geenin identifioimiseen. Lambda-klooni, joka sisälsi happamen fosfataasin geenin, talletettiin 24.

10 huhtikuuta 1989 talletuslaitokseen the Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Baarn, Hollanti, ja sille on annettu talletusnumero CBS 214.89. 10 ke BamHI-fragmentti on eristetty fagi Zl:stä ja subkloonattu pUC19:ään. Tämä subklooni sisältää koko hapanta fosfataasia koodittavan 15 geenin. Subklooni pAF 1-1 (kuvio 5) talletettiin 24. huhtikuuta 1989 tunnuksella CBS 213.89.

Esimerkki 5

Fytaasia koodaavan geenin eristäminen käyttäen toista 20 oliaonukleotidikoetlnsarlaa

Koettimia on konstruoitu käyttäen CNBr-synnytettyjen fragmenttien N-terminaalista aminohapposekvenssiä (kuvio 2B, koettimet 1295, 1296 ja 1297) ja hybridisoitu genomi-25 sen DNA:n kanssa kuten edellä on kuvailtu. Näiden koetti-mien käytön sopivuus fytaasia koodittavan geenin eristämisessä tutkittiin jälleen genomisten blottien Southern-ϊ hybridisaatiolla koettimien kanssa. Tällä kertaa voitiin

S

identifioida vastaavanpituisia hybridisoituvia fragment-30 teja käyttäen kaikkia kolmea koetinta huolimatta siitä tosiseikasta, että koettimet on saatu toisiaan peittämät- r » · tömiltä alueilta. Hybridisaatiota ei voitu havaita uuden koetinsarjan ja kloonien välillä, jotka on eristetty käyttäen ensimmäistä koetinsarjaa (esimerkki 4). Genomi-35 nen kirjasto seulottiin sen vuoksi uudelleen käyttäen kaikkia kolmea koetinta erillisissä kokeissa. Kloonien alaryhmä (lambda AF201, 219, 241 ja 243), jotka oli eris- 104380 tetty kunkin yksittäisen koettimen avulla, hybridisoitui myös molempien muiden koettimien kanssa, mikä osoitti, että tässä tapauksessa, käytettäessä kolmea erilaista koetinta, kloonit eristettiin yhdestä genomisesta aluees-5 ta. Vasta eristettyjä klooneja yritettiin hybridisoida koettimien 1024 ja 1068 kanssa. Kummassakaan tapauksessa hybridisaatiota ei havaittu vasta eristettyjen kloonien kanssa olosuhteissa, joissa kumpikin koettimista oli onnistuneesti hybridisoitunut klooneihin, jotka eristet- 10 tiin käyttämällä näitä koettimia (katso esimerkki 4).

Tämä osoittaa, että vasta eristetyillä klooneilla ei ole homologiaa koettimien suhteen, jotka on eristetty puhdistetun fytaasin N-päästä.

15 Lambda EMBL3-kloonille, joka hybridisoituu kaikkiin kolmeen koettimeen (1295-1297) annettiin nimeksi lambda AF201 (kuvio 4), ja se talletettiin 9. maaliskuuta, 1989 tunnuksella CBS 155.89. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 35

Lambda AF201:n 5,1 ke BamHI-fragmenttia (subkloonattu 2 pUC19:ään ja nimetty pAF 2-3:ksi, katso kuvio 4), joka 3 hybridisoitui kaikkiin kolmeen oligonukleotidikoettimeen, 4 käytettiin Northern-blotin tunnistamiseen. Tässä tapauk 5 sessa identifioitiin erillinen mRNA, jonka koko oli 1800 6 emästä. Tätä mRNA:ta todettiin vain indusoidussa rihmas 7 tossa. Samanlaisia tuloksia saatiin, kun oligonukleotide- 8 jä käytettiin koettimina. Siitä johtuen, käyttäen uutta 9 koetinsarjaa, yhteinen DNA-fragmentti on identifioitu, 10 joka hybridisoituu spesifisesti indusoituun mRNA:hän.

11 Tämän mRNA:n pituus (1800 emästä) on riittävä kooditta-maan noin 60 kDa proteiinia, mikä on suunnilleen glyko-: syloimattoman proteiinin koko. Eristetyt fragmentit si sältävät epäilemättä ainakin osan fytaasia koodaavasta geenistä.

104380

Esimerkki 6 "Indusoidun" ia "indusoimattoman" mRNA:n eristäminen

Kirjallisuudesta tiedetään, että A. flcuumln fytaasisyn-5 teesi on voimakkaan fosfaattisäätelyn alainen (Hän ja

Callagher (1987) J. Indust. Microbiol. 1, 295-301). Siitä johtuen osoituksen siitä, että eristetty geeni on samanlaisessa säätelyssä, voidaan katsoa tukevan näyttöä siitä, että geeni on kloonattu.

10 mRNA:n eristämiseksi, joka on syntetisoitu sekä tuottavissa että ei-tuottavissa olosuhteissa, A. ficuum NRRL 3135:ttä kasvatettiin seuraavasti. Itiöitä kasvatettiin ensin yli yön ei-indusoivalla alustalla. Seuraavana päi-15 vänä rihmasto kerättiin talteen, pestiin steriilillä vedellä ja siirrostettiin joko indusoivaan tai ei-indusoivaan alustaan. Käytetty alusta sisältää (litraa kohti): 20 g maissitärkkelystä; 7,5 g glukoosia; 0,5 g MgS04.7H20:ta; 0,2 g FeS04.7H20:ta; ja 7,2 g KN03:a. Fytaa-20 sin indusoimiseksi alustaan lisättiin 2 g/1 saakka maissin liotusvettä, kun taas ei-indusoiva alusta sisältää 2 g/1 K2HP04:ää. Rihmastoa kasvatettiin vielä vähintään 100 tuntia. Näytteitä otettiin valikoituina aikaväleinä. Fytaasituotantoa seurattiin fytaasimäärityksen avulla, 25 jota kuvailtiin esimerkissä 2A. Denaturoitunut mRNA ero-tettiin elektroforeesin avulla ja blotattiin Genescreen plus-kantajaa. Blotit hybridisoitiin 32P-leimatun pAF 2-3:n kanssa tai pAF l-l:stä eristetyn 3,1 ke:n Sall-frag-. mentin kanssa (hapan fosfataasi), ks. esimerkki 4. Tulok- 1 30 set esitetään taulukossa 2.

i : Fytaasispesifisen 5,1 ke:n BamHI-fragmentin ja hapan fos- fataasispesifisen 3,1 ke:n Sali-fragmentin positiivista hybridisaatiota eristetyn mRNA:n kanssa havaitaan ainoas-35 taan, kun soluja kasvatetaan olosuhteissa, joiden tiedetään indusoivan fytaasin ja happamien fosfataasien synteesiä. Näistä tuloksista on päätelty, että eristetyt 37 104380 geenit ovat säädeltyjä kuten odotettiin fytaasin ja happamien fosfataasien osalta.

Taulukko 2 5

Northern-blottien hybridisaatio käyttäen fytaasispesifis-tä 5,1 ke:n BamHI-fragmenttia (A) tai hapan fosfataasis-pesifistä 3,1 ke:n Sali-fragmenttia (B) koettimena; + osoittaa 1800 emäksisen fytaasin mRNArn läsnäolon tai 10 1800 emäksisen happamen fosfataasin mRNA:n läsnäolon.

Suhteellinen fytaasiaktiivisuus määritettiin 24 tuntisten näytteiden osalta; indusoiduissa viljelmissä on 10 kertaa enemmän fytaasiaktiivisuutta kuin ei-indusoiduissa viljelmissä.

15

Aika siirrostuksen Indusoitu Ei-indusoitu jälkeen 20 A 24 tuntia + B 24 tuntia +

Esimerkki 7 25 Näyttö fvtaasiaeenin kloonauksesta

Ehdottoman todisteen saamiseksi onnistuneesta fytaasia koodittavan geenin eristämisestä ja kloonatun geenin ilmenemisen lisäämisen soveltuvuuden tutkimiseksi fytaasi-30 geeni subkloonattiin sopivaan vektoriin ja transformoitiin A. niger 402:een (ATCC 9092). Tämän saavuttamiseksi : fytaasigeeni eristettiin lambdakloonista AF201 10 ke;n

NruI-fragmenttina ja kloonattiin vektorin pAN 8-1 (Mat-tern, I.E. ja Punt, P.J. (1988) Fungal Genetics Newslet-35 ter 35, 25) Stul-kohtaan. joka sisältää ble-geenin (antaa resistenssin fleomysiinille) valikoivana markkerina. Tuloksena olevaa rakennetta nimitettiin pAF 28-1:ksi 38 104380 (kuvio 4), ja se transformoitiin A. niaer 402:een esimerkissä 9 kuvaillun menetelmän mukaisesti sillä poikkeuksella, että protoplastit maljättiin Aspergilluksen mini-maalialustalle, johon oli lisätty 30 pg fleomysiiniä/ml, 5 ja joka oli jähmetetty 0,75 %:illa agaria. Yksittäiset transformantit puhdistettiin ja eristettiin, ja niiden tuotanto testattiin ravistelupulloissa kuten esimerkeissä 1 ja 2 kuvailtiin. Kontrolleina testattiin myös transformantit, joilla oli vain vektori, samoin kuin transformoi-10 maton isäntä (taulukko 3). Ainoastaan A. niaer 402, joka sisälsi pAF 28-1:n, näytti tuottavan fytaasia, joka reagoi spesifisen monoklonaalisen vasta-aineen kanssa, joka oli kohdennettu A. ficuumin fytaasia vastaan. Tämän monoklonaalisen vasta-aineen kanssa reagoiva fytaasi voitiin 15 eluoida immunoaffiniteettipylväästä pH:ssa 2,5, ja sen osoitettiin olevan identtinen molekyylipainon, glyko-sylaatioasteen, isoelektrisen pisteen ja spesifisen aktiivisuuden osalta A. ficuumin fytaasin kanssa. Tämä havainto todistaa selvästi, että pAF 28-1:llä transfor-20 moidut A. niaer 402 -solut ilmentävät fytaasia, joka on tosiasiassa identtinen A. ficuumin fytaasin kanssa. Samanlaista ilmenemistä ei havaittu kummassakaan kontrol-lisolutyypissä.

. 25

Taulukko 3

Kanta Fytaasi/aktii- % fytaasiaktiivi- visuus U/ml suutta adsorboitu nut immunoaffini- 30 teettipylvääseen m » • A. niaer 402 0,5 0 A. niaer 402 pAF 28-1 0,7 10 35 A. niaer 402 pAN 8-1 0,5 0 i 39 104380

Kantoja kasvatettiin indusoiduissa olosuhteissa (esimerkki 6). Näytteet otettiin 96 kasvutunnin kuluttua.

5 Esimerkki 8

Fvtaasiaeenin karakterisointi

Fytaasigeenin sisältämät lambdakloonit on analysoitu pilkkomalla eri restriktioentsyymeillä. Kartta genomialu-10 eesta, joka sisältää fytaasigeenin, esitetään kuviossa 4. Määrättyjä restriktiofragmentteja on subkloonattu kloo-nausvektoriin pUC19, kuten kuviossa 4 on osoitettu.

Aikaisemmin on esitetty (esimerkki 5), että 5,1 ke:n Bam-15 HI-fragmentti, joka on läsnä pAF 2-3:ssa, sisältää aina kin osan fytaasigeenistä. Sen lisäksi oligonukleotidi-koettimien 1295 ja 1297 (kuvio 2B) osoitettiin hybri-disoituvan Sall-inserttiin pAF 2-7:stä (pAF 2 -kloonien paikat esitetään kuviossa 4), kun taas koetin 1296 ulot-20 tuu Sali-kohdan yli fragmenttien välissä pAF 2-6:ssa ja pAF 2-7:ssä. Näiden kokeiden tulokset osoittavat, että fytaasia koodaava sekvenssi sijaitsee pAF 2-3:n BamHI-insertin vasemmanpuoleisessa osassa.

25 Plasmidien pAF 2-3, pAF 2-6 ja pAF 2-7 inserttien nukleo-tidisekvenssit on myöhemmin määritetty kokonaan käyttäen dideoksi-ketjunpysäytysmenetelmää (Sanger et ai. (1977) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74, 5463-5467) ja "haulikko"-kloonauksia, jota Messing et ai. on kuvaillut (1981, 30 Nucl. Acids Res. 9, 309-321). Lisäksi syntetisoitiin spesifisiä oligonukleotidejä, jotka pohjautuivat sekven-"s sointimenettelyn aikana saatuihin nukleotidisekvenssitie toihin.

35 Kloonien pAF 2-3, pAF 2-6 ja pAF 2-7 täydellinen nukleotidisekvenssi, joka sisältää kromosomaalisen fy- 40 104380 taasigeenilokuksen, on koottuna kuviossa 6, graafinen esitys esitetään kuviossa 7.

Analyysi koko sekvenssin proteiinia koodittavasta kapasi-5 teetista osoitti, että valmiin proteiinin N-terminaalinen aminohapposekvenssi kooditettiin alkaen nukleotidipaikas-ta 381 (Ullahin esille tuoma N-pää sijaitsee paikassa 369). Sen lisäksi sisäisten 36 kDa ja 2,5 kDa peptidi-fragmenttien N-terminaalisen aminohapposekvenssin (katso 10 kuvio IB - sekvenssit B ja A) todettiin koodautuvan nuk-leotidipaikoissa 1101 ja vastaavasti 1548. Avoin lukukehys loppuu nukleotidipaikassa 1713.

Nämä havainnot todistavat selvästi karakterisoidun kromo-15 somaalisen lokuksen identtisyyden fytaasia koodaavan DNA-sekvenssin sisältäväksi.

Suoraan valmista fytaasiproteiinia koodaavan kromosomaa-lisen sekvenssin yläpuolella ei voida havaita ATG-aloi-20 tuskodonia lukukehyksen alueella, joka on valmiin proteiinin avoimen lukukehyksen vieressä; käyttämällä introni-eksoni rajatunnusmerkkejä intronin voidaan olettaa olevan nukleotidipaikkojen 254 ja 355 välissä, mikä tuo ATG-kodonin nukleotidipaikkaan 210 oikeassa lukukehyksessä 25 valmista fytaasia koodaavan avoimen lukukehyksen kanssa.

1 < Tämän N-terminaalisen jatkeen johdettu aminohapposekvenssi sopii tarkoin von Heynen (1983, Eur. J. Biochem. 133. 17-21) julkaisemiin sääntöihin koskien erityssignaalisek-venssiä.

30 Näiden hypoteesien varmistamiseksi fytaasin cDNA eristet-' tiin PCR-monistamisen avulla spesifisten fytaasialukkei- den kanssa ja templaattina olevan mRNA/cDNA-kokonaispopu-laation kanssa jäljempänä kuvailtavien menettelyjen mu-35 kaisesti.

41 104380 poly A* RNA:n eristäminen Aspergillus ficuumlsta

Kokonais-RNA eristettiin A. ficuum NRRL 3135:stä, jota oli kasvatettu indusoivissa olosuhteissa, joista mainit-5 tiin esimerkissä 6. Kuiva rihmasto jäädytettiin nestety-pen kanssa ja hierrettiin. Jauhe homogenoitiin sen jälkeen Ultra-Turrax-laitteella (täysi nopeus 1 minuutin ajan) 3 M LiClrssa, 6 M ureassa 0 °C:ssa, ja pidettiin yli yön 4 °C:ssa kuten Auffrey & Rougeon ovat kuvailleet (Eur. 10 J. Biochem., 107. 303-314, 1980). Solun kokonais-RNA saatiin sentrifugoinnin jälkeen 16 000 g 30 minuutin ajan, ja kahden perättäisen uuttamisen jälkeen fenoli:-kloroformi:isoamyylialkoholilla (50:48:2). RNA seostettiin etanolilla ja liuotettiin 1 ml:aan 10 mM Tris-HCl:ää 15 (pH 7,4), 0,5% SDS:ää. poly A*:n valikoimiseksi kokonais-RNA-näytettä kuumennettiin 5 minuutin ajan 60°C:ssa, säädettiin 0,5 M NaCl:n suhteen ja sijoitettiin sen jälkeen oligo(dT)-selluloosapylvääseen. Usean pesun jälkeen liuoksella, joka sisälsi 10 mM Tris-HCl:ää, pH 7,4, 0,5 % 20 SDS:ää ja 0,1 M NaCl:ia, poly A* RNA kerättiin talteen eluoimalla 10 mM Tris-HCl:n pH 7,4, ja 0,5%:isen SDS:n kanssa.

mRNA/cDNA-kompleksin valmistaminen 25

Ensimmäisen cDNA-juosteen synteesiä varten 5 pg poly A* RNA:ta liuotettiin 16,5 pl:aan H20:ta ja seuraavat komponentit lisättiin: 2,5 pl RNasiinia (30 U/μΙ); 10 μΐ puskuria, joka sisälsi 50 mM Tris-HCl:ää pH 7,6, 6 mM MgCl2:a 30 ja 40 mM KCl:a; 2 μΐ 1 M KCl:a; 5 μΐ 0,1 M DTT:tä; 0,5 μΐ « oligo (dT)12_18:aa (2,5 mg/ml); 5 μΐ 8 mM dNTP-seosta; 5 μΐ : BSA:ta (1 mg/ml) ja 2,5 μΐ Moloneyn MLV käänteistran- skriptaasia (200 U/ml). Seosta inkuboitiin 30 minuutin ajan 37°C:ssa, ja reaktio pysäytettiin lisäämällä 10 μΐ 35 0,2 M EDTA:ta ja 50 μΐ H20:ta. Uuttaminen suoritettiin kloroformin kanssa, ja sentrifugoinnin jälkeen superna-. tenttiin lisättiin perättäisesti 110 μΐ 5 M NH4Ac:tä ja 42 104380 440 μΐ etanolia. mRNA/cDNA-kompleksin saostaminen suoritettiin kuiva jää/etanoli-liuoksessa 30 minuutin aikana. mRNA/cDNA otettiin talteen sentrifugoimalla, pestiin sen jälkeen 70%:isella jääkylmällä etanolilla ja liuotettiin 5 20 pl:aan H20:ta.

Fvtaasin cDNA-fragmenttien kloonaus cDNA-kooditteisten fytaasisekvenssien eristäminen suori-10 tettiin polymeraasiketjureaktion (PCR) avulla kahdella fragmentilla. Neljä synteettistä oligonukleotidialuketta konstruoitiin perustuen genomiseen fytaasisekvenssiin, kuten kuviossa 6 esitetään 15 Oligo 1: 5-'GGG.TAG.AAT.TCA.AAA.ATG.GGC.GTC.TCT.GCT.GTT.-CTA-3'

Oligo 2: 5'-AGT.GAC.GAA.TTC.GTG.CTG.GTG.GAG.ATG.GTG.TCG.-3'

Oligo 3: 5'-GAG.CAC.CAA.GCT.GAA.GGA.TCC.-3' 20 Oligo 4: 5'-AAA.CTG.CAG.GCG.TTG.AGT.GTG.ATT.-GTT.TAA.AGG.G-3'

Oligo 1 sisältää nukleotidisekvenssin fytaasin ATG-aloi-tuskodonin alapuolella (paikat 210-231), jonka vieressä 25 5'-rajalla on EcoRI-kohta; oligo 2 sisältää nukleotidi- sekvenssin välittömästi Sali-kohdan yläpuolella (paikat 1129-1109), jota myös vierustaa ylimääräinen EcoRI-kohta; oligo 3 sisältää nukleotidisekvenssin BamHI-kohdan vieressä (paikat 845-865), ja oligo 4 sisältää nukleotidi-

S

I 30 sekvenssin, joka sijaitsee fytaasin lopetuskodonin (pai- ] ,· kat 1890-1867) alapuolella ylimääräisen PstI-kohdan vie- ressä.

Polymeraasiketjureaktiot suoritettiin Taq-polymeraasin 35 toimittajan (Cetus) mukaisesti. Templaattina käytettiin liuosta (1,5 μΐ), joka sisälsi mRNA/cDNA-hybridejä (kuvattu edellä), ja alukkeina käytettiin 0,3 pg kumpaakin 43 104380 oligoista 1 ja 2 reaktiossa fytaasin N-terminaalisen cDNA-osan monistamiseksi, ja oligoja 3 ja 4 reaktiossa fytaasin C-terminaalisen cDNA-osan monistamiseksi (katso kuvio 8). Denaturoimisen (7 minuuttia 100 °C:ssa) ja 2 U 5 Taq-polymeraasin lisäämisen jälkeen reaktioseokset monistettiin 25 syklissä (jokainen: 2' 55 °C:ssa, 3' 72°C:ssa, 1' 94°C:ssa) Perkin-Elmer/Cetusin DNA-monistuslaitteessa. Viimeisessä syklissä denaturaatiovaihe jätettiin pois. Pilkkomisen jälkeen (EcoRI N-terminaaliselle cDNA-osalle 10 ja BamHI ja PstI C-terminaaliselle cDNA-osalle), molemmat cDNA-fragmentit kloonattiin pTZ18R:n (Promega) sopiviin kohtiin.

Kummankin saadun PCR-fragmentin nukleotidisekvenssi mää-15 ritettiin dideoksi-ketjunpysäytystekniikalla (Sanger, supra) käyttäen synteettisiä oligonukleotidejä, jotka oli konstruoitu kromosomaalisen fytaasigeenisekvenssin jälkeen, alukkeina ja monistettua kokonais-DNA:ta samoin kuin kloonattuja cDNA-fragmentteja templaattina. Fy-20 taasiproteiinia koodaavan cDNA-alueen sekvenssi ja fy-taasiproteiinin johdettu aminohapposekvenssi esitetään kuviossa 8.

cDNA-sekvenssi varmisti edellä oletetun intronin sijain-25 nin ja osoitti, että muita introneita ei ollut läsnä kromosomaalisen geenisekvenssin alueella.

Fytaasigeeni koodittaa 467 aminohappoa sisältävää primaarista translaatiotuotetta (MP 51091); primaarisen trans-30 laatiotuotteen prosessointi leikkaamalla pois signaali-. peptidi johtaa toimintavalmiiseen 444 (Mp. 48851) tai 448 (sisältää neljä ensimmäistä N-terminaalista aminohappoa kuten Ullah on julkaissut, Mp. 49232) aminohappoa sisältävään fytaasiproteiiniin.

35 104380

Esimerkki 9

Fvtaasin liikallmentäminen Asperoilluksissa ottamalla käyttöön lisäkoploita fvtaasln aenomisesta DNA:sta Ekspressiovektorin pAF 2-2S konstruointi 5

Kaikki rakenteet tehtiin käyttäen molekyylibiologisia standardimenetelmiä kuten Maniatis gt gJL. on kuvaillut, (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.

10

Ekspressiovektori pAF 2-2S valmistettiin subkloonaamalla 6 ke:n PvuII DNA-fragmentti fytaasin genomisesta kloonista lambda AF201 pUC19:n Smal-kohtaan. Saatua plasmidia merkittiin tunnuksella pAF 2-2 (kuvio 4). Valikoivana 15 markkerina Aspergilluksen transformaatiolle, plasmidin pGW325 (Wernars K. (1986), Thesis, Agriculture University, Wageningen, Hollanti) EcoRI/Kpnl DNA-fragmentti, joka sisälsi Aspergillus nidulansin homologisen amdS-geenin, liitettiin pAF 2-2:n EcoRI/Kpnl-kohtiin. Tuloksena ollut- j 20 ta ekspressiovektoria merkittiin tunnuksella pAF 2-2S, ja se esitetään kuviossa 9.

A. Fvtaasin liikailmentvminen A. flcuum NRRL 3135:ssä 25 Plasmidi pAF 2-2S siirrettiin A. ficuum NRRL 3135:een käyttäen transformaatiomenetelmiä, joita Tilburn, J. et ai., (1983) Gene 26., 205-221 ja Kelly, J. & Hynes, M. (1985) EMBO J., 4, 475-479 ovat kuvailleet seuraavin muunnelmin: 30 - rihmastoa kasvatettiin Aspergilluksen minimaalialustal-la (Cove, D. (1966) Biochem. Biophys. Acta, 113. 51-56), joka sisälsi täydennyksenä 10 mM arginiinia ja 10 mM proliinia, 16 tunnin ajan 30 °C:ssa pyöriväliikkeisessä 35 ravistelijassa nopeudella 300 rpm; - protoplastien muodostukseen käytettiin vain Novozym .. 234:ää (NOVO Industri) eikä lainkaan helikaasia; 45 104380 - 90 minuutin protoplastimuodostuksen jälkeen lisättiin 1 tilavuus STC-puskuria (1,2 M sorbitoli, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM CaCl2) protoplastisuspensioon ja sentrifu-goitiin 2500 g 4 °C:ssa 10 minuutin ajan kääntyväkuppises- 5 sa roottorissa. Protoplastit pestiin ja suspendoitiin taas STC-puskuriin pitoisuudessa 108 solua/ml - plasmidi-DNA:ta lisättiin 10 μ1:η tilavuudessa TE-pus-kurissa (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,1 mM EDTA) 100 pl:aan protoplastisuspensiota; 10 - DNA-protoplastisuspension inkuboinnin jälkeen 0°C:ssa 25 minuutin ajan 200 μΐ PEG-liuosta lisättiin pisaroit-tain (25%:inen PEG 4000 (Merck), 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM CaCl2). Seuraavaksi lisättiin hitaasti 1 ml PEG-liuosta (60%:inen PEG 4000 10 mM Tris-HCl:ssä, pH 7,5, 15 50 mM CaCl2:ssa) sekoittaen putkia toistuvasti. Huoneen lämmössä inkuboinnin jälkeen suspensiot laimennettiin STC-puskurilla, sekoitettiin kääntelemällä ja sentrifu-goitiin nopeudella 2000 g 4 °C:ssa 10 minuutin ajan. Protoplastit suspendoitiin varovasti uudelleen 200 pl:aan 20 STC-puskuria ja maljattiin Asperoilluksen minimialustal-le, joka sisälsi 10 mM asetamidia ainoana typenlähteenä, 15 mM CsClra, 1 M sakkaroosia, jähmetettiin bakteriologisella agarilla #1 (Oxoid) pitoisuudessa 0,75 %. Kasvatus suoritettiin 33 °C:ssa 6-10 päivän aikana.

25 ·· Yksittäisiä transformantteja, merkittyinä SP4, SP7 ja SP8, eristettiin, puhdistettiin ja testattiin fy-taasituotannon suhteen ravistelupulloissa käyttäen prosessia, jota kuvailtiin esimerkeissä 1 ja 2. Kontrolleina 30 testattiin transformantteja, joissa oli vain vektori (amdS-geeni pUC19:ssa), samoin kuin transformoimatonta isäntää.

Kantoja kasvatettiin indusoivissa olosuhteissa (katso 35 esimerkki 6), ja näytteitä otettiin 96 tunnin kasvatuksen jälkeen. Analyysit suoritettiin mittaamalla fytaasiaktii- • 1 46 104380 visuus (taulukko 4) ja isoelektrinen fokusointi polyak-ryyliamidigeelielektroforeesin (IEF-PAGE) avulla.

Tilavuudeltaan yhtä suuria näytteitä otettiin A. ficuumin 5 ja A. ficuum pAF 2-2S SP7:n fermentoinneista, joita oli kasvatettu identtisissä olosuhteissa, ja ne sijoitettiin IEF-PAGE-geelille (pH-alue 4,5 - 6, Phast-System, Pharmacia). Elektroforeesi suoritettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti. Geelit värjättiin sen jälkeen joko yleisellä 10 proteiinivärillä Coomassie Brilliant Bluella (kuvio 10B) tai yleisellä fosfataasiaktiivisuusvärjäyksellä, jota on kuvailtu esimerkissä 2 (kuvio 10A).

A. ficuumin fytaasinäyte, joka oli puhdistettu homogeeni-15 seksi (immunoaffiniteettikromatografiän avulla, jota kuvailtiin esimerkissä 7), applikoitiin myös joko yksin tai sekoitettuna kasvuston supernatantin kanssa.

Fytaasia esiintyy erilaisissa näytteissä joinakin isomuo-20 töinä (osoitettu tähdellä), kuten tässä keksinnössä on mainittu. Kaksi tärkeintä isoentsyymiä on selvästi näkyvissä puhdistetussa fytaasissa kaistoilla 3 ja 4 molemmilla värjäysmenetelmillä (A ja B). Fytaasivyöhykkeet näkyvät heikosti A. ficuum -lähtökannassa, mutta merkit-25 tävästi selvemmin pAF 2-2S SP7 -transformanttikannassa.

Taulukko 4

Fytaasituotannon lisääntyminen A. ficuum NRRL 3135:n transformaation avulla.

30

Kanta Fytaasiaktiivisuus (U/ml) A. ficuum 0,6 A. ficuum + kontrolliplasmidi 0,6 35 A. ficuum pAF 2-2S SP8 7,6 A. ficuum pAF 2-2S SP7 6,7 A. ficuum pAF 2-2S SP4 4,3 ] ’ 47 104380 B. Fvtaasin lilkallmentvminen A. nioer CBS 513.88;ssa

Ekspressiovektori pAF 2-2S siirrettiin myös A. niaer CBS 5 513.88:aan transformaatiotoimenpiteillä kuten A. ficuumin osalta kuvailtiin. Yksittäisiä transformantteja eristettiin, puhdistettiin ja testattiin fytaasituotannon osalta ravistelupulloissa indusoiduissa kasvatusolosuhteissa kuten esimerkissä 6 kuvailtiin.

10

Joidenkin transformanttien (merkinnöillä A. nioer pAF 2-2S # 8, # 20 ja # 33) ja kontrollikantojen fytaasin il-mentymistasot määritettiin kuten esimerkissä 9A on kuvailtu, ja ne esitetään taulukossa 5.

15 A. nlaerln transformanttien fytaasin ilmentymistasot ovat vertailukelpoiset A. ficuumin transformanttien tasojen kanssa. Tämä tulos osoittaa lisäksi, että A. ficuumin fytaasin promoottori on aktiivinen A. nioerissä.

20

Lisäanalysointia suoritettiin transformantin pAF 2-2S #8 kasvualustalla elektroforeesin avulla IEF-PAGE-geelillä pH-alueella 4,5-6 Phast-Systemillä (Pharmacia), jota edellä on kuvailtu. Yhtä suuret tilavuudet A. niaerin 25 lähtökannan ja transformantin pAF 2-2S #8 kasvustojen ·· supernatantteja, joita kantoja oli kasvatettu identtisis sä olosuhteissa, sijoitettiin geelille. Geelit ajettiin ja värjättiin sen jälkeen kuten edellä.

30 A. niaerin lähtökanta tuottaa hyvin pienen määrän fytaa-. siä, jota ei voitu ilmaista geelielektroforeesin avulla.

Kanta pAF 2-2S #8 tuottaa suunnilleen 90 kertaa enemmän fytaasia, ja tämä ero on selvästi näkyvissä kuviossa 11.

35 Useita fytaasientsyymin isomuotoja havaitaan (osoitettu tähdellä). Yleinen proteiiniväri osoittaa, että fytaasi-proteiinivyöhykkeiden intensiteetti lisääntyy dramaatti- 48 104380 sesti, vaikka muita tärkeitä proteiinivyöhykkeitä ei tule näkyviin.

Taulukko 5 5 Fytaasituotanto transformoitaessa A. niger CBS 513.88 pAF 2-2S:llä.

Kanta Fytaasiaktiivisuus (U/ml) 10 A. niger 0,2 A. niger + kontrolliplasmidi 0,2 A. niger pAF 2-2S #8 14 A. niger pAF 2-2S #33 5 A. niger pAF 2-2S #20 4 15

Esimerkki 10

Fvtaasin ilmentyminen A. nigerissä. loka on transformoitu ekspressiovektoreilla, jotka sisältävät A. ficuumin fv-20 taasigeenin yhdistettynä A. nioerin amyloolukosidaasi (AG) geenin promoottoriin 1a/tai signaalisekvensseihin Ekspressiovektoreiden konstruoinnit

Fytaasin liikailmentymisen aikaansaamiseksi A. nigerissä. 25 uusia ekspressiokasetteja kehitellään, joissa A. ficuumin fytaasigeeni on A. nigerin amyloglukosidaasi (AG) -promoottorin ohjauksessa yhdessä eri signaalisekvenssien kanssa. pl8FYT3:ssa ja p24FYT3:ssa vastaavat 18 ja 24 aminohappoa (AA) sisältävät AG-geenin ohjaussekvenssit A. 30 nigeristä yhdistetään valmista proteiinia koodattavaan ; fytaasigeeni-fragmenttiin. Ekspressiokasetissa pFYT3 AG- promoottorisekvenssi on liittynyt yhteen fytaasia koodaa-van sekvenssin kanssa, joka sisältää fytaasin ohjausse-kvenssin.

• · i 49 104380 p!8FYT3:n konstruointi AG-promoottorin ja 18 aa AG-ohjaussekvenssln yhdistäminen valmista proteiinia koodittavaan fytaasisekvenssiin suo-5 ritettiin polymeraasiketjureaktiomenetelmällä. PCR-reak-tioissa käytettiin kahta eri templaattia: pAF 2-2S, joka sisälsi koko fytaasigeenin kuten edellä on kuvailtu, ja pAB6-l, plasmidi, joka sisältää koko AG-lokuksen A. niae-ristä, joka eristettiin A. nigerin plasmidikirjastosta, 10 joka sisältää 13-15 ke HindIII-fragmentteja pUC19:ssa. Eristämistä varten käytettiin AG-spesifisiä oligoja: AG-1: 5'-GACAATGGCTACACCAGCACCGCAACGGACATTGTTTGGCCC-3’ AG-2: 5'-AAGCAGCCATTGCCCGAAGCCGAT-3' 15 joista kumpikin pohjautui A. nigerille julkaistuun nukle-otidisekvenssiin (Boel gt gl. (1984), EMBO J. 3, 1097-1102; Boel gt ai. (1984), Mol. and Cell. Biol. 4, 2306-2315). Oligonukleotidit saatiin sekvenssistä, joka ympä-20 röi introni 2:ta; oligo AG-1 sijaitsee 3'-puolella intro-nia ja sen polaarisuus on identtinen AG mRNA:n suhteen, ja oligo AG-2 tavataan introni 2:n yläpuolella ja sitä ei pidetä rinnastettavana AG mRNA:han. Plasmidi pAB6-l sisältää AG-geenin 14,5 ke HindiII-fragmentissa (katso 25 kuvio 12).

Alukkeiksi PCR-monistuksiin konstruoitiin neljä synteettistä oligonukleotidiä, joilla oli seuraavat sekvenssit: 30 Oligo 1: 5’-CTCTGCAGGAATTCAAGCTAG-3' (AG-spesifinen : sekvenssi EcoRI-kohdan ympärillä suunnilleen 250 ep ATG- aloituskodonin yläpuolella).

Oligo 18-2: 5'-CGAGGCGGGGACTGCCAGTGCCAACCCTGTGCAGAC-3’ 35 valmis fytaasi < > 18 AA AG-ohjain

Oligo 18-3: 5’-GTCTGCACAGGGTTGGCACTGGCAGTCCCCGCCTCG-3' 104380 , 50 } 18 AA AG-ohjain < > valmis fytaasi

Oligo 4: 5'-GGCACGAGGATCCTTCAGCTT-3' (fytaasi-spesi- finen sekvenssi, joka sijaitsee BamHI-kohdassa paikassa 5 861) PCR suoritettiin kuten Saiki et ai. ovat kuvannut, (1988), Science 239. 487-491, vähäisin muunnoksin (katso esimerkki 8).

10 AG-sekvenssien yhdistämiseksi fytaasia koodittaviin sek-vensseihin suoritettiin kaksi erillistä PCR:ää: ensimmäinen reaktio pAB6-l templaattina ja oligot 1 ja 18-2 aluk-keina 300 ep DNA-fragmentin monistamiseksi, joka sisälsi 15 3'-osan AG-promoottorista ja 18 aa AG-ohjaussekvenssin fytaasigeenin vieressä 3'-rajalla, ja toinen reaktio pAF 2-2S templaattina ja oligot 18-3 ja 4 alukkeina 600 ep DNA-fragmentin monistamiseksi, joka sisälsi 5' osan fy-taasigeenistä AG-signaalipeptidin 18 nukleotidin vieressä 20 5'-rajalla. Kaaviokuva näistä monistuksista esitetään kuviossa 13.

Kaksi muodostettua DNA-fragmenttia puhdistettiin geelie-lektroforeesin avulla ja etanolisaostuksella ja käytet-25 tiin templaatteina kolmannessa PCR:ssä oligot 1 ja 4 alukkeina AG-fytaasi-fuusion muodostamiseksi. Saatu DNA-fraktio pilkottiin EcoRI:llä ja BamHI:llä ja subkloonat-] tiin pTZ18R:ään. Tuloksena oleva fuusio sekvensoitiin ja merkittiin tunnuksella pl8FYTl.

30 ; Jäljelle jäänyt (3,5 ke) AG-promoottorin yläpuolinen alue saatiin pilkkomalla pAB6-l Kpnl:llä ja osittain EcoRI:llä ja liitettiin pl8FYTl:n 1,1 ke:n EcoRI/BamHI-fragmenttiin ja kloonattiin sen jälkeen pTZ18R:n Kpnl/BamHI-kohtiin.

35 Siten saatu plasmidi pl8FYT2 esitetään kuviossa 15. 1 t« t 104380 51

Uusi Hindlll-restriktlokohta otettiin käyttöön liittämällä synteettinen fragmentti: 5’ AATTCAAGCTTG 3' 5 3' GTTCGAACTTAA 5' pAF 2-2S:n EcoRI-kohtaan (amdS-geenin vieressä). Saatua plasmidia merkittiin tunnuksella pAF 2-2SH (kuvio 14), ja sitä käytetään lähtöplasmidina fytaasin promoottorisek-10 venssien vaihtamiseksi PCR AG-fytaasi-fuusio-DNA-frag-mentteihin.

Konstruoinnin viimeisessä vaiheessa pl8FYT2 ja pAF 2-2SH pilkottiin Kpnl:llä ja osittain BamHIrllä. pl8FYT2:n 4,6 15 ke:n DNA-fragmentti ja pAF 2-2SH:n li ke:n DNA-fragmentti eristettiin ja puhdistettiin geelielektroforeesin avulla, ligoitiin sen jälkeen ja siirrettiin E. soliin. Saatua ekspressiokasettia merkittiin tunnuksella pl8FYT3 (kuvio 15).

20 p24FYT3:n konstruointi AG-promoottorin ja 24 aa AG-ohjaussekvenssin yhdistäminen valmista fytaasia koodaavaan sekvenssiin suoritettiin 25 PCR-monistamisen avulla kuten edellä on kuvailtu pl8FYT3:n konstruoinnin osalta lukuun ottamatta käytettyjä alukkeita. Kaksi uutta aluketta syntetisoitiin seuraa-villa sekvensseillä: 30 Oligo 24-2: 5'-CGAGCCGGGGACTGCCAGGCGCTTGGAAATCACATT-3' : valmis fytaasi < > 24 AA AG-ohjain

Oligo 24-3: 5 1-AATGTGATTTCCAAGCGCCTGGCAGTCCCCGCCTCG-3' 24 aa AG-ohjain < > valmis fytaasi • · 35 52 104380

Kaksi erillistä PCR:ää suoritettiin: ensimmäinen reaktio pAB 6-1 templaattina Ja oligot 1 ja 24-2 alukkeina 318 ep:n DNA-fragmentin monistamiseksi, joka sisälsi 3'-osan AG-promoottorista ja 24 aa AG-ohjaussekvenssin fy-5 taasigeenin 18 nukleotidin vieressä 3'-rajalla, ja toinen reaktio pAF 2-2S templaattina ja oligot 24-3 ja 4 alukkeina DNA-fragmentin monistamiseksi, joka sisälsi fy-taasigeenin 5'-osan 24 aa AG-ohjaussekvenssin 18 nukleotidin vierustamana 5'-rajalla. Kaaviokuva näistä monis-10 tuksista esitetään kuviossa 13.

Lopullisen ekspressiokasetin p24FYT3 konstruoimiseksi väliplasmidien p24FYTl ja p24FYT2 kautta käytettiin samaa kloonausreittiä/menettelyä, jota kuvailtiin pl8FYTl:lle 15 ja pl8FYT2:lle ekspressiokasetin pl8FYT3 saamiseksi (kuvio 15).

PFYT3:n konstruointi 20 AG-promoottorin yhdistäminen fytaasigeenin sekvenssiin (joka sisälsi fytaasin ohjaussekvenssin) suoritettiin myös PCR-monistamisen avulla kuten edellä on kuvailtu pl8FYT3:n osalta, lukuun ottamatta käytettyjä alukkeita. Kaksi uutta aluketta syntetisoitiin seuraavin sekvens-25 sein:

Oligo fyt-2: 5'-AACAGCAGAGACGCCCATTGCTGAGGTGTAATGATG-3' fytaasin ohjain < > AG-promoottori 30 Oligo fyt-3: 5'-CATCATTACACCTCAGCAATGGGCGTCTCTGCTGTT-3' ; AG-promoottori < > fytaasin ohjain

Kaksi erillistä PCR:ää suoritettiin: ensimmäinen reaktio 35 pAB 6-1 templaattina ja oligot 1 ja fyt-2 alukkeina 282 ' ep DNA-fragmentin monistamiseksi, joka sisälsi AG-pro- J moottorin 3'-osan ja jonka vieressä oli fytaasin ohjaus- i 4 53 104380 sekvenssin 18 nukleotidiä 3'-rajalla, ja toinen reaktio pAF 2-2S templaattina ja oligot fyt-3 ja 4 alukkeina DNA-fragmentin monistamiseksi, joka sisälsi £ytaasigeenin (mukaanlukien fytaasin ohjain) 5'-osan, ja jonka vieressä 5 oli AG-promoottorin 18 nukleotidiä 5'-rajalla. Kaaviokuva näistä monistamisista esitetään kuviossa 13.

Lopullisen ekspressiokasetin pFYT3 konstruoimiseksi väli-plasmidien pFYTl ja pFYT2 kautta käytettiin samaa kloo-10 nausreittiä/menettelyä, Jota kuvailtiin pl8FYTl:lle ja pl8FYT2:lle ekspressiokasetin pl8FYT3 saamiseksi (kuvio 15).

Fvtaasiaeenin ilmentyminen AG-promoottorin ohjauksessa A. 15 niaerlssä E. coli -sekvenssit poistettiin edellä kuvailluista fytaasin ekspressiokaseteista Hindlll;11a pilkkoen. A. nioerin kanta CBS 513.88 (talletettu 10. lokakuuta, 1988) 20 transformoitiin jälkeenpäin 10 yg:n DNA-fragmentilla esimerkissä 9 kuvatuilla menetelmillä. Yksittäisiä A. niaer -transformantteja kustakin ekspressiokasetista eristettiin, ja itiöitä levitettiin selektiivisille aset-amidiagarmaljoille. Jokaisen transformantin itiöitä ke-25 rättiin talteen soluista, joita oli kasvatettu 3 päivän ajan 37 °C:ssa 0,4 % peruna-dekstroosiagarmaljoilla (Oxoid, Englanti). Fytaasituotanto testattiin ravistelu-pulloissa seuraavissa kasvuolosuhteissa: 30 Suunnilleen 1 x 108 itiötä siirrostettiin 100 ml:aan esi-; viljelyalustaa, joka sisälsi (litraa kohti): 1 g KH2P- 04:ää; 30 g maltoosia; 5 g hiivauutetta; 10 g kaseiinihyd-rolysaattia; 0,5 g MgS04.7H20: ta ja 3 g Tween 80:aa. pH säädettiin arvoon 5,5.

Yön yli kestäneen kasvatuksen jälkeen 34 °C:ssa pyörivä-liikkeisessä ravistelijassa 1 ml kasvavaa viljelmää siir- 35 54 104380 rostettiin 100 ml:aan pääviljelyalustaa, joka sisälsi (litraa kohti): 2 g KH2P04:ää? 70 g maltodekstriiniä (Maldex MD03, Amylum); 12,5 g hiivauutetta; 25 g kaseiini-hydrolysaattia; 2 g K2S04:ää; 0,5 g MgS04.7H20:ta; 0,03 g 5 ZnCl2:ta; 0,02 g CaCl2:ta; 0,05 g MnS04.4H20:ta ja FeS04:ää. pH säädettiin arvoon 5,6.

Rihmastoa kasvatettiin vähintään 140 tuntia. Fytaasituotanto mitattiin kuten esimerkissä 2 kuvailtiin. 10 Kustakin ekspressiokasetista saadun usean, sattumanvaraisen transformantin tuotantotulokset esitetään taulukossa 6.

• · i j ( 55 104380

Taulukko 6

Usean A. niaer CBS 513.88 -kannan fytaasltuotanto, jotka on transformoitu plasmideilla, jotka sisältävät A. ficuu-min fytaasigeenin A. niaerln AG-promoottorin ohjauksessa 5 yhdessä eri ohjaussekvenssien kanssa.

Ekspressiokasetti Transformantti # Fytaasi- aktiivisuus (U/ml) 10 ___ P18FYT3 pl8FYT3 # 240 82 (AG-promoottori/ pl8FYT3 # 242 84 18 aa AG-ohjain) pl8FYT3 # 243 62 P18FYT3 # 244 43 15 pl8FYT3 # 245 80 P18FYT3 # 246 82 P18FYT3 # 250 110 p24FYT3 P24FYT3 # 256 8 20 (AG-promoottori/ p24FYT3 # 257 30 24 aa AG-ohjain) p24FYT3 # 258 13 p24FYT3 # 259 33 P24FYT3 # 260 17 P24FYT3 # 261 28 25 p24FYT3 # 262 18 : p24FYT3 # 265 12 pFYT3 pFYT3 # 205 50 (AG-promoottori/ pFYT3 # 282 280 30 fytaasin ohjain) pFYT3 # 299 96 , pFYT3 # 302 220 pFYT3 #303 175 pFYT3 # 304 150 pFYT3 # 305 150 35 pFYT3 # 312 140 • · 56 104380

Tulokset osoittavat selvästi fytaasin korkeita ilmenty-mistasoja A. niaer -transformanteissa, jotka sisältävät fytaasigeenin A. niaerin AG-promoottorin ohjauksessa. Tulokset osoittavat myös, että korkein fytaasituotanto 5 saavutetaan pFYT3-ekspressiovektorilla, joka sisältää fytaasin ohjaussekvenssin. Samanlaiset ekspressiovekto-rit, jotka sisälsivät intronittoman fytaasigeenin A. nioeriin transformoinnin jälkeen, johtivat fytaasin il-mentyrnistasoihin, jotka olivat vertailukelpoisia A. niae-10 rin pFYT3-transformanttien kanssa.

Elektroforesointi IEF-PAGE-geelillä pH-alueella 4,5-6 suoritettiin lisäksi transformanttien pFYT3 #205 ja #282 kasvustojen supernatanteilla. Yhtä suuret tilavuudet A.

15 niaerin lähtökannan ja kummankin transformantin kasvustojen supernatanteista, jotka kannat olivat kasvaneet identtisissä olosuhteissa, sijoitettiin geelille, ajettiin ja sen jälkeen värjättiin kuten esimerkissä 9 on kuvailtu. A. niaerin lähtökanta tuottaa hyvin pieniä 20 fytaasimääriä, jota ei havaita tässä kokeessa. Kannat - pFYT3 #205 ja #282 tuottavat suunnilleen 250 ja 1400 kertaa enemmän fytaasia (vertaa fytaasitasoja taulukoissa 4 ja 5), ja tämä ero on selvästi näkyvissä kuviossa 11. Useita fytaasientsyymin isomuotoja havaitaan (osoitettu 25 tähdellä). Yleinen proteiiniväri osoittaa, että fytaasi-proteiinivyöhykkeiden intensiteetti lisääntyy dramaattisesti, kun taas muita huomattavia proteiinivyöhykkeitä ei ilmaannu. 1 ; 35 m

Esimerkki 11

Fytaasin liikailmentyminen A, ficuumissa 1a A. nigerissä, : joita on kasvatettu teollisessa mitassa A. A. ficuum

Kantoja A. ficuum pAF 2-2S #4 ja A. ficuum NRRL 3135 kasvatettiin kuten esimerkissä 1 on kuvailtu. Transfor- 57 104380 mäntti tuotti suunnilleen 50 kertaa enemmän fytaasia verrattuna villityypin kantaan.

Taulukko 7 5

Fytaasin liikailmentyminen A. ficuumin transformantilla, joka sisältää multippeleja fytaasigeenejä. Soluja kasvatettiin kuten esimerkissä 1 on kuvailtu.

10 Tunteja siirros- Fytaasiaktiivisuus (U/ml fermen- tuksen jälkeen A. ficuum NRRL 3135 tointilientä) A.ficuum pAF 2-2S #4 15 0 0 0 24 0 0 92 2 142 141 5 270 20 B. A. niaer

Kantaa A. niaer pAF 2-2S #8, A. niaer -kannan CBS 513.88 25 transformanttia, ja itse A. niaerin lähtökantaa kasvatettiin kuten esimerkissä 1 on kuvailtu. Transformantti tuotti suunnilleen 1000 kertaa enemmän fytaasia verrattuna alkuperäiseen A. niaerin lähtökantaan (taulukko 8). 1 r · * 58 104380

Taulukko 8

Fytaasin liikäilmentyminen A. niaerin transformantilla (CBS 513.88), joka sisälsi multippeleja fytaasigeenejä.

5 Soluja kasvatettiin kuten esimerkissä 1 on kuvailtu.

Tunteja siirros- Fytaasiaktiivisuus (U/ml fermentoin-tuksen jälkeen A. nlaer CBS 513.88 tilientä) A. nlger pAF 2.2 #8 10 _ 0 0 0 24 0 5 92 0,1 65 141 0,1 95 15

Esimerkki 12

Vektorin pREPFYT3 konstruoimiseksi, jolla saavutetaan sa-20 manaikainen fytaasin ilmentyminen ja AG-geenin vaihto, pFYT3 pilkotaan Kpnl:llä. Saadulla lineaarisella Kpnl DNA-fragmentilla suoritetaan kaksi erillistä ligaatiota.

Ligaatio 1 Kpnl-HindiII-adaptorin kanssa: 25 5' CGGGGA -3' 3’-CATGGCCCCTTCGA-5'

Kpnl Hindlll 1 «

Ligaatio 2 Kpnl-HindiII2-adaptorin kanssa, jossa Hindlll-restriktiokohta ei jää jäljelle ligaation jälkeen: - ·« 5'- CGGGGG -3' 3'-CTAGGCCCCCTCGA-5' '35 Koni HindiII2 2 59 104380

Ligaatio 1 pilkotaan osittain sen jälkeen Hindlll:11a. amdS-aeenin sisältävän fragmentin poistamisen jälkeen geelielektroforeesin avulla, jäljellä oleva DNA-fragmentti tehdään jälleen renkaanmuotoon ligoimalla ja siirre-5 tään E. coliin. Saatu plasmidi merkitään tunnuksella pFYT3AamdS (katso kuvio 16).

Ligaatio 2 pilkotaan myös Hindlll:11a ja 4 ke HindIII/Hi-ndlll* DNA-fragmentti, joka sisältää amdS-qeenin. eriste-10 tään geelielektroforeesin avulla, liitetään sen jälkeen

Hindlll:11a osittain pilkottuun pFYT3ÄamdS:iin ja siirretään E. coliin. Plasmidi, joka sisältää amdS-geenin fy-taasigeenin 3'-päässä, merkitään tunnuksella pFYT3INT (katso kuvio 17).

15 pAB 6-1:n suunnilleen 6 ke:n Sall/Hindlll DNA-fragmentin lisäämiseksi, joka sisältää 3'-viereisen AG-sekvenssin, pFYT3INT pilkotaan osittain Hindlll:11a, ligoidaan ensin adaptoriin: 20 5'-AGCTAGGGGG -3' 3 ' -_TCCCCCAGCT-5 '

Hindlll* Sali ; 25 (jossa HindiII*-restriktiokohta ei jää jäljelle ligaation jälkeen) ja sen jälkeen pAB 6-1:n Sali/HindiII-fragmentin kanssa. E. coliin transformoinnin jälkeen saadaan haluttu plasmidi pREPFYT3, joka sisältää 3'-pään viereisen AG-sekvenssin oikeassa paikassa (kuvio 18).

30

Fvtaasin ilmentyminen A. nioerlssä AG-oeenin vaihdon vh-: tevdessä

Ennen A. niaerln transformointia pREPFYT3:lla, E. colln 35 sekvenssit plasmidissa poistetaan pilkkomalla Hindlll:11a ja geelielektroforeesin avulla. A. nigerin kanta CBS : 513.88 transformoidaan 10 pg:lla DNA-fragmenttia menetel- 60 104380 millä, joita on kuvailtu esimerkissä 9. Valikointi ja transformanttien kasvatus suoritetaan kuten esimerkissä 9 on kuvailtu. Vain vähäinen osa valikoiduista transforman-teista menettää AG-aktiivisuuden (suunnilleen 20 %).

5 Kromosomaalisen DNA:n Southern-analyysi suoritetaan AG-negatiivisilla ja fytaasipositiivisilla transformanteilla sen varmistamiseksi, että AG-geeni todella on vaihdettu fytaasigeeniin.

10 Esimerkki 13

Fvtaaslaeenin säilyminen eri lajeissa

Sen määrittämiseksi, onko fytaasigeeni hyvin säilynyt mikrobilajien joukossa, suoritettiin Southern-analyysejä 15 kymmenen eri lajin kromosomaalisesta DNA:sta A. flcuumln fytaasin cDNA koettimena.

Nämä kromosomaalisen DNA:n analyysit suoritettiin rihma-sienten, hiivojen ja bakteerien lajeilla. Esimerkiksi va-20 Iittiin vain rajoitettu määrä kustakin ryhmästä: rih- masienten osalta, Penicillium chrvsoaenum ja Aspergillus niger; hiivojen osalta, Saccharomvces cerevisiae ja Klu-vveromvces lactis; ja prokaryoottisten organismien osalta gram-positiiviset lajit Bacillus subtills. Clostridium 25 thermocellum. ja Streptomvces lividans. ja esimerkkinä gram-negatiivisesta bakteerista Pseudomonas aeruginosa.

Näiden lajien suurimolekyylipainoista kromosomaalista DNA:ta pilkottiin erikseen PvuII:11a ja BamHI:llä ja 30 elektroforesoitiin sen jälkeen 0,7%:isella agaroosigee-lillä.

Nitroselluloosasuodattimille siirtämisen jälkeen hybridisaatio suoritettiin yli yön melko lievissä olosuhteissa 35 (6 x SSC; 50°C) 32P-leimatun 5’-fytaasi-cDNA-fragmentin kanssa (kuvailtu esimerkissä 8). Blotit pestiin 6 x 61 104380 SSCrssä huoneen lämpötilassa ja altistettiin röntgensäteillä 18 tunnin ajan.

Kuten kuvioissa 19 a ja b on esitetty, erillisiä vyöhyk-5 keitä havaitaan melkein joka kaistalla, mikä viittaa fy-taasigeenin korkeaan homologia-asteeseen mikrobilajien välillä.

• · «

Claims (14)

104380

1. Puhdistettu ja eristetty DNA-sekvenssi, joka koodaa sieniperäistä fytaasia, joka katalysoi ainakin yhden epä- 5 orgaanisen fosfaatin vapauttamista myoinositolifosfaatis-ta, tunnettu siitä, että kyseinen DNA-sekvenssi a) sisältää nukleotidisekvenssin, joka koodaa kuviossa 8 esitetyn aminohapposekvenssin asemia -23 - 444 tai asemia +1 - 444, 10 b) sisältää kuviossa 6 tai kuviossa 8 esitetyn nukleotidisekvenssin tai c) hybridisoituu melko lievissä olosuhteissa (6 x SSC, 50 eC yön yli, pesu 6 x SSC huoneenlämmössä) DNA-fragmentin, joka vastaa kuviossa 6 esitetyn nukleotidisekvenssin 15 asemien 210 - 1129 cDNArta, kanssa.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen puhdistettu ja eristetty DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että sekvenssi on peräisin Aspergillus-lähteestä. 20

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen puhdistettu ja eristetty DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että sekvenssi on peräisin Aspergillus ficuum- tai Aspergillus niger -lähteestä. 25

4. Ekspressiorakenne, tunnettu siitä, että jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen DNA-sekvenssi on toiminnal- j lisesti kytketty säätelyalueeseen, joka kykenee ohjaamaan fytaasin ilmentymistä sopivassa ekspressioisännässä. 30

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen ekspressiorakenne, tun- : nettu lisäksi siitä, että DNA-sekvenssi sisältää myös eritysohjaussekvenssin fytaasin erittämistä varten. ^ 35 6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen ekspressiorakenne, tun- ^ nettu lisäksi siitä, että eritysohjaussekvenssiä koodaava sekvenssi on homologinen DNA-sekvenssin kanssa. :;.3M 63 104380

7. Patenttivaatimuksen 5 mukainen ekspressiorakenne, tunnettu lisäksi siitä, että eritysohjaussekvenssiä koodaava sekvenssi on DNA-sekvenssi, joka koodaa 18 tai 24 aminohappoa sisältävää glukoamylaasin signaalisekvenssiä. 5

8. Jonkin patenttivaatimuksista 5-7 mukainen ekspressiorakenne, tunnettu lisäksi siitä, että eritysohjaussekvenssiä koodaava sekvenssi on kytketty fytaasia koodaa-vaan DNA-sekvenssiin lyhyen sillan välityksellä. 10

9. Jonkin patenttivaatimuksista 4-8 mukainen ekspressiorakenne, tunnettu siitä, että säätelyalue on peräisin glukoamylaasia, fytaasia, amylaasia, hapanta fosfataasia tai GAPDHita koodaavasta geenistä. 15

10. Isäntäsolun transformointiin kykenevä vektori, tunnettu siitä, että vektori sisältää jonkin patenttivaatimuksista 4-9 mukaisen ekspressiorakenteen.

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen vektori, tunnettu lisäksi siitä, että vektori on plasmidi.

12. Transformoitu sieni-isäntäsolu, tunnettu siitä, että sieni-isäntäsolu on transformoitu patenttivaatimuksen 10 25 tai 11 mukaisella vektorilla.

13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen transformoitu sieni-isäntäsolu, tunnettu siitä, että se on Aspergillus. Trichoderma. Kluvveromvces tai Saccharomyces. edullisesti

30 Aspergillus niger. Aspergillus ficuum. Aspergillus ory- zae. Trichoderma reesei. K1uweromvces lactis tai Saccha- • romvces cerevisiae. 1 Menetelmä fytaasin valmistamiseksi, tunnettu siitä, 35 että patenttivaatimuksen 12 tai 13 mukaista transformoitua isäntäsolua viljellään olosuhteissa, jotka edistävät fytaasin tuotantoa. 64 104380